CN116783303A - 基于体积分布分析液滴的方法、计算机装置及存储介质 - Google Patents

基于体积分布分析液滴的方法、计算机装置及存储介质 Download PDF

Info

Publication number
CN116783303A
CN116783303A CN202180090546.9A CN202180090546A CN116783303A CN 116783303 A CN116783303 A CN 116783303A CN 202180090546 A CN202180090546 A CN 202180090546A CN 116783303 A CN116783303 A CN 116783303A
Authority
CN
China
Prior art keywords
droplet
volume
drop
droplets
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180090546.9A
Other languages
English (en)
Inventor
夏贇
赵霞
席阳
韦毅
陈芳
蒋慧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MGI Tech Co Ltd
Original Assignee
MGI Tech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MGI Tech Co Ltd filed Critical MGI Tech Co Ltd
Publication of CN116783303A publication Critical patent/CN116783303A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
    • G01N21/85—Investigating moving fluids or granular solids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
    • G01N21/85—Investigating moving fluids or granular solids
    • G01N2021/8557—Special shaping of flow, e.g. using a by-pass line, jet flow, curtain flow
    • G01N2021/8564—Sample as drops
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请提供了一种基于体积分布分析液滴的方法，包括：利用含有目标分子的样品配制待乳化体系，获取该样品的总体积V；将所述待乳化体系乳化为液滴，对乳化获得的液滴实施执行扩增反应所需要的条件与操作，使得含有所述样品的液滴发生扩增反应，获得液滴体系；获取所述液滴体系的液滴图像信息，基于所述液滴图像信息获得液滴总数n；基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息；统计所述n个液滴中的阴性液滴数j或阳性液滴数n‑j；根据所述总体积V、液滴总数n、液滴体积分布信息，以及所述阴性液滴数j或阳性液滴数n‑j，对所述目标分子作定量分析。本申请消除了对单个液滴体积数据获取的依赖，同时降低技术相关软硬件成本，有效提高计算效率及提升液滴分析的准确性。本申请还提供一种计算机装置及存储介质。

Description

基于体积分布分析液滴的方法、计算机装置及存储介质 技术领域
本申请涉及生物信息分析及生化检测技术领域，具体涉及一种基于体积分布分析液滴的方法、计算机装置及存储介质。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)是在体外或试管中快速大量复制目标核酸分子的重要方法，可用于放大扩增特定的DNA片段，实现核酸等生化分析物的定性定量检测。数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种针对传统PCR定量检测技术的改进方法，是将含有待测模板(也即目标分子)的样品稀释到一定比例，并通过物理分区的方法，将模板随机分配到几十个到几百万个若干反应分区中发生扩增反应，再对处于反应终点的每个分区的指示信号进行采集及处理，最后通过直接计数或泊松分布原理完成统计分析，计算出样品中待测模板含量及浓度。数字PCR物理分区主要分为液滴分区与固相分区两种形式，其中基于液滴分区的液滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)已发展为目前数字PCR商用产品的主流形式，如Bio-Rad、Stilla、Raindance等厂商都已推出基于相关技术的核心产品，如QX200 TM、Naica TM、RainDrop TM等。
随机乳化液滴数字PCR是液滴数字PCR的一种特殊形式，它采用机械振荡等简单驱动方式使得样品的液滴分区过程得以简化，形成的液滴具有随机大小体积与随机总数。这种方法摆脱了数字PCR技术对微流控系统或固相微芯片的依赖，并且具有成本低、易操作、空间占用少、检读负荷低、动态范围宽、检测通量高等技术优势。然而随机乳化液滴数字PCR目前的定量模型及计算方法需要对每个液滴的精确体积进行一一测量，如果测量数据准确度或精密度不足，测量数据将会对定量计算结果造成较大误差。因此随机乳化液滴数字PCR分析方法对光学检测设备及配套图像处理算法提出了更高的技术要求，往往需要依赖较为复杂的光学系统(如共聚焦显微系统或光片荧光显微系统)来获取液滴的连续剖切面图像数据，再通过图像算法将液滴三维重建以获取准确体积信息，这无疑给此方法增加了额外的软硬件成本。因此急需能有效克服以上技术弊端的定量分析新方法，消除对液滴体积精确测量数据的依赖，简化随机乳化液滴数字PCR软硬件系统与操作流程，降低用户使用成本。
发明内容
鉴于以上内容，有必要提出一种基于体积分布分析液滴的方法、计算机装置及存储介质，能够简化现有的随机乳化液滴定量模型，消除该模型对单个液滴体积数据获取的依赖，提高计算效率，同时降低技术相关软硬件成本。
本申请第一方面提供一种基于体积分布分析液滴的方法，包括：利用含有目标分子的样品配制待乳化体系，获取该含有目标分子的样品的总体积V；将所述待乳化体系乳化为液滴，对乳化获得的液滴实施执行扩增反应所需要的条件与操作，使得含有所述样品的液滴发生扩增反应，获得液滴体系；获取所述液滴体系的液滴图像信息，基于所述液滴图像信息获得所述液滴体系所包括的液滴总数n；基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息；统计所述n个液滴中的阴性液滴数j或阳性液滴数n-j；根据所述含有目标分子的样品的总体积V、 所述液滴总数n、所述液滴体积分布信息，以及所述阴性液滴数j或阳性液滴数n-j，对所述目标分子作定量分析。
本申请第二方面提供一种计算机装置，所述计算机装置包括存储器和处理器，所述存储器用于存储至少一个计算机可读指令，所述处理器用于执行所述至少一个计算机可读指令以实现以下步骤：获取含有目标分子的样品的总体积V；获取液滴体系的液滴图像信息，基于所述液滴图像信息获得所述液滴体系所包括的液滴总数n，其中，获取所述液滴体系的步骤包括：将所述含有目标分子的样品所配制得到的待乳化体系乳化为液滴，对乳化获得的液滴实施执行扩增反应所需要的条件与操作，使得含有所述样品的液滴发生扩增反应；基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息；统计所述n个液滴中的阴性液滴数j或阳性液滴数n-j；根据所述含有目标分子的样品的总体积V、所述液滴总数n、所述液滴体积分布信息，以及所述阴性液滴数j或阳性液滴数n-j，对所述目标分子作定量分析。
本申请第三方面提供一种非易失性可读存储介质，所述非易失性可读存储介质存储有至少一个计算机可读指令，所述至少一个计算机可读指令被处理器执行时实现以下步骤：获取含有目标分子的样品的总体积V；获取液滴体系的液滴图像信息，基于所述液滴图像信息获得所述液滴体系所包括的液滴总数n，其中，获取所述液滴体系的步骤包括：将所述含有目标分子的样品所配制得到的待乳化体系乳化为液滴，对乳化获得的液滴实施执行扩增反应所需要的条件与操作，使得含有所述样品的液滴发生扩增反应；基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息；统计所述n个液滴中的阴性液滴数j或阳性液滴数n-j；根据所述含有目标分子的样品的总体积V、所述液滴总数n、所述液滴体积分布信息，以及所述阴性液滴数j或阳性液滴数n-j，对所述目标分子作定量分析。
本申请实施例中所述的基于体积分布分析液滴方法、计算机装置及存储介质，能够简化现有的随机乳化液滴定量模型，消除该模型对单个液滴体积数据获取的依赖，提高计算效率，同时降低技术相关软硬件成本准确分析液滴。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1示意了本申请较佳实施例提供的液滴分析方法的流程图。
图2示意了液滴体积分段频率法原理示意图。
图3示意了根据平均分段的方式来划分液滴体积分布区间。
图4示意了根据对数分段的方式来划分液滴体积分布区间。
图5示意了根据分位数将液滴分组，以及分布参数的获取。
图6示意了基于模拟的定量算法验证所述液滴分析方法的可行性的流程图。
图7示意了是单次模拟生成的液滴体积区间及分子坐标示意图。
图8示意了将目标分子总数m分别设置为不同数值的模拟结果以及极大似然估计数值解 或M MLE与基于液滴体积对数正态分布的数值解M LogN的横向比较。
图9示意的是加载到测序芯片里的随机乳化液滴图像。
图10示意的是从随机乳化液滴图像提取液滴数据信息示意图。
图11示意的是将目标分子总数m分别设置为不同数值的模拟结果以及极大似然估计数值解 或M MLE与基于液滴体积对数正态分布的数值解M LogN的横向比较。
图12示意的是基于MGI测序芯片的准二维液滴荧光显微成像以及数字等温扩增的图像处理。
图13是本申请较佳实施例提供的液滴分析系统的运行环境图。
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本申请。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本申请的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施例对本申请进行详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
图1是本申请较佳实施例提供的液滴分析方法的流程图。
在本实施例中，所述液滴分析方法可以应用于计算机装置(例如图13所示的计算机装置3)中，对于需要进行液滴分析的计算机装置，可以直接在计算机装置上集成本申请的方法所提供的用于液滴分析的功能，或者以软件开发工具包(Software Development Kit，SDK)的形式运行在计算机装置上。
如图1所示，所述液滴分析方法具体包括以下步骤，根据不同的需求，该流程图中步骤的顺序可以改变，某些步骤可以省略。
步骤S1，利用含有目标分子的样品配制待乳化体系，获取该含有目标分子的样品的总体积V。
在一个实施例中，所述目标分子可以为核酸、蛋白质、多糖、金属离子以及小分子等生物分子。
在一个实施例中，可以在利用所述含有目标分子的样品配制待乳化体系时，通过移液器读数确定所述含有目标分子的样品的总体积V。在一个实施例中，计算机装置可以响应用户的输入，获得所述含有目标分子的样品的总体积V。例如可以由用户根据移液器读数手动输入所述含有目标分子的样品的总体积V。
步骤S2，利用所述含有目标分子的样品配制待乳化体系，将所述待乳化体系乳化为液滴，对乳化获得的液滴实施执行扩增反应所需要的条件与操作，使得含有所述样品的液滴充分发生扩增反应，获得液滴体系。
具体地，可以在所述待乳化体系加入乳化油及乳化剂预混液，使得所述待乳化体系在乳化剂预混液的作用下随机乳化为液滴，对液滴实施执行核酸扩增反应所需要的条件与操作，使得含有所述目标分子的液滴发生扩增反应，获得所述液滴体系。
步骤S3，计算机装置获取所述液滴体系的液滴图像信息，基于所述液滴图像信息获得所述液滴体系所包括的液滴总数n。
在一个实施例中，在基于所述液滴图像信息获取所述液滴总数n之前还可以对所述液滴图像进行处理，包括，但不限于，重建、拼接、校正、增强、降噪、配准等操作。
在一个实施例中，可以采用PCT/CN2020/075309中所记载的方法来获取所述液滴体系的液滴图像信息，以及处理所述液滴图像信息获得所述液滴体系所包括的液滴总数n。
在一个实施例中，所述获取所述液滴体系的液滴图像信息包括：将所述液滴体系采用预设的方法在双/多通道波长条件下，分别激发对应不同波长的指示剂染料，并拍摄对应所述指示剂的通道的荧光图像，从而获得所述液滴体系的液滴图像信息。
具体地，可以在配制所述待乳化体系时加入特定浓度的至少两种指示剂染料。所述至少两种指示剂染料分别对应不同激发波长。所述至少两种指示剂染料包括工作染料和参比染料。
具体地，可以采用所述预设的方法在双/多通道波长条件下分别激发所述液滴体系中的工作染料和参比染料，拍摄对应所述工作染料的通道的荧光图像，以及拍摄对应所述参比染料的通道的荧光图像，由此获得所述液滴体系的液滴图像信息。
在一个实施例中，所述预设的方法包括，但不限于，连续计数法、平面扫描法或连续剖切面三维重建法。
步骤S4，计算机装置基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息。
在一个实施例中，所述液滴体系的液滴体积分布信息包括，但不限于，液滴体积累积分布函数、液滴体积概率密度函数，及/或液滴体积分布的期望与方差。
在第一实施例中，所述基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息包括(a1)-(a7)：
(a1)基于所述液滴图像信息，从所述n个液滴中确定最小液滴和最大液滴。
在第一实施例中，所述从所述n个液滴中确定最小液滴和最大液滴包括(a11)-(a12)：
(a11)基于所述液滴图像信息，根据液滴边界位置信息确定所述n个液滴中的每个液滴所包括的像素的数目。
本实施例中，所述边界位置信息是指液滴的边缘坐标，具体可通过图像边缘提取算法获得液滴的边缘坐标。
本实施例中，可以通过遍历图像所有像素，将落在某个液滴边缘坐标范围内的像素的总数作为该某个液滴的像素总数。所述某个液滴为所述n个液滴中的任意一个液滴。
(a12)按照每个液滴所包括的像素的数目的大小对所述n个液滴进行排序，将包括像素最少的液滴作为所述最小液滴，以及将包括像素最多的液滴作为所述最大液滴。
在第二实施例中，所述从所述n个液滴中确定最小液滴和最大液滴包括(a111)-(a112)：
(a111)基于所述液滴图像信息，确定所述n个液滴中的每个液滴在空间坐标系中的空间坐标和边界位置信息，根据每个液滴的空间坐标和边界位置信息确定每个液滴在该空间坐标系的极小点与极大点，并基于每个液滴对应的极小点与极大点计算获得每个液滴的边界极差。
在一个实施例中，所述空间坐标系可以为一维坐标系、二维坐标系，或者三维坐标系。
在一个实施例中，可对所述液滴图像信息进行断层扫描重建三维坐标。所述边界位置信息是指液滴的边缘坐标，具体可通过图像边缘提取算法获得液滴的边缘坐标。
所述极小点是指液滴边缘坐标的某一维度(例如经度)的最小值。对应地，所述极大点是指液滴边缘坐标的该某一维度的最大值。所述边界极差为极大值减去极小值所获得的值。
(a12)根据每个液滴的所述边界极差的大小对所述n个液滴进行排序，将具有最小边界极差的液滴作为所述最小液滴，以及将具有最大边界极差的液滴作为所述最大液滴。
(a2)获取所述最小液滴的体积与所述最大液滴的体积。
在一个实施例中，可以根据最小液滴在所述液滴图像信息中所占区域的像素点总数以及预先确定的图像像素长度换算比例来获取最小液滴的体积。
同样地，可以根据最大液滴在所述液滴图像信息中所占区域的像素点总数以及预先确定的图像像素长度换算比例来获取最大液滴的体积。
在一个实施例中，确定所述图像像素长度换算比例的方法包括：在一预设的显微镜放大倍率下，利用显微镜对预设的正方形拍摄一张图像；计算所拍摄的图像中该正方形的边长所包括的像素总数；及基于所计算得到的所述正方形的边长所包括的像素总数以及该正方形的边长的实际长度计算得到所述图像像素长度换算比例。
举例而言，假设所拍摄的图像中该正方形的边长所包括的像素总数为1150个像素点，该正方形的边长的实际长度为2mm，那么得到所述图像像素长度换算比例则为1.73660264μm/pixel。
需要说明的是，所述预设的显微镜放大倍率是指显微镜拍摄所述液滴图像信息时所采用的放大倍率。
(a3)将所述最小液滴的体积作为上边界，以及将所述最大液滴的体积作为下边界，获得液滴体积分布区间。
(a4)按照预设的划分方式将所述液滴体积分布区间划分为预设数量的子区间。
(a5)判断所述n个液滴中的每个液滴所落入的子区间。
(a6)统计落入所述预设数量的子区间中的每个子区间的液滴的数目，得到所述液滴体系的液滴体积频率分布，根据所述液滴体系的液滴体积频率分布获得所述液滴体系的液滴体积分布的期望与方差。
(a7)基于所述液滴体系的液滴体积分布的期望与方差得到所述液滴体系的液滴体积概率密度函数(例如参阅图2所示)。
在一个实施例中，所述预设的划分方式包括，但不限于，平均分段、对数分段、人为分段等。
为清楚说明本申请，下面以所述预设的划分方式是指平均分段的方式为例说明。
例如，乳化形成的50个液滴中最小液滴的体积为0.182(粗略值)，最大液滴的体积为10.201(粗略值)，于是确定液滴体积分布区间为[0.182,10.201](参图3中的A所示)。假设设置所述预设数量nbins为25，划分方式设置为平均分段(参图3中的B所示)，于是可将[0.182,10.201]的等间距划分为25个子区间 即
需要说明的是，所述预设数量nbins的值设置的越少，简化程度越高，对液滴精确体积数据依赖越低；反之越高。
然后再根据所述液滴图像信息或液滴排序信息，统计每个子区间液滴出现的频率(参图3中的C所示)，从而将各液滴归类。最后按照统计得到的液滴体积区间的频率分布[即各子区间平均体积数值(每个子区间的平均体积数值也即是每个子区间的上下边界处对应体积的数值之和除以2，如第一个子区间平均体积数值为0.181620124794223与0.582386838100861之和除以2等于0.382003481447542)：
以及频率数值：(3 7 9 5 6 4 2 1 2 0 1 1 1 2 0 0 1 2 2 0 0 0 0 0 1)]，按照特定分布模型例如对数正态分布对该频率分布进行拟合(例如最小二乘拟合)，从而确定液滴体积概率密度函数f(v)的拟合曲线及对应分布参数(例如液滴体积分布的期望E[v]及方差D(v)(参图3中的D所示)。
需要说明的是，每个子区间液滴出现的频率也即是落入该每个子区间的液滴的数目。所述频率数值即指落入每个子区间的液滴的数目。
为清楚说明本申请，下面以所述预设的划分方式是指对数分段的方式为例说明。
例如乳化形成的100个液滴中最小液滴体积为0.182(粗略值)，最大液滴的体积为11.268(粗略值)，于是确定液滴体积分布区间为[0.182,11.268](参图4中的A)。假设设置所述预设数量nbins为25，所述划分方式设置为对数分段(参图4中的B)，于是将液滴体积分布区间[0.182,11.268]的按照对数间距划分为25个子区间即
如前面所述，所述预设数量nbins的值设置的越少，简化程度越高，对液滴精确体积数据依赖越低；反之越高。
然后再根据所述液滴图像信息或液滴排序信息，统计每个子区间液滴出现的频率(参图4中的C)，从而将各液滴归类。最后按照统计得到的液滴体积区间的频率分布[即各子区间平均体积数值：
以及频率数值：(2 1 1 0 5 2 3 9 6 7 9 8 6 7 5 9 6 5 3 2 1 0 1 1 1)]，按照特定分布模型(例如对数正态分布)对该频率分布进行拟合(例如最小二乘拟合)，从而确定液滴体积概率密度函数f(v)的拟合曲线及对应的分布参数(例如液滴体积分布的期望E[v]及方差D(v))(参图4中的D)。
在第二实施例中，所述基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息包括(b1)-(b7)：
(b1)基于所述液滴图像信息获取每个液滴的体积，按照每个液滴的体积大小对所述n个液滴进行排序。
具体地，可以采用上述获取最大液滴的体积和最小液滴的体积的方法获取每个液滴的体积。
(b2)基于所述n个液滴的排列顺序将所述n个液滴分成t个组。
在一个实施中，所述t个组中的每个组所包括的液滴数目相同。
(b3)获取每组中体积最大或者最小的液滴的体积值从而获得t个体积值。
例如，选取所述t个组中的每组中的体积最大的液滴的体积值来获得所述t个体积值；或者选取所述t个组中的每组中的体积最小的液滴的体积值来获得所述t个体积值。
(b4)基于所述t确定分位数q，以及基于分位数q和所述t个体积值获得期望μ的多个估计值和方差σ 2的多个估计值。
(b5)基于预设的评价函数(例如最小二乘拟合)从所述期望μ的多个估计值中选取期望μ的最佳估计值，以及从所述方差σ 2的多个估计值中选取方差σ 2的最佳估计值。
所述期望μ的最佳估计值和所述方差σ 2的最佳估计值是所述评价函数的极值或者是最接近极值的值。
(b6)根据对数正态分布的特征，基于所述期望μ的最佳估计值和所述方差σ 2的最佳估计值得到所述液滴体系的液滴体积概率密度函数f(v)。
为清楚说明本申请，举例而言，乳化形成了100个液滴，将该100个液滴按照体积从小到大排序后，按照每5个液滴1组将所述100个液滴划分为20组(即t＝20)，由此第一组包括的液滴为排列在前面的5个液滴，第二组包括的液滴为排列在第 6到第10的液滴，第三组包括的液滴为排列在第11到第15的液滴，以此类推，最后一组包括的液滴为排列在第96到第100的液滴(参阅图5中的A所示)。假设液滴体积累积分布函数为F(v)，并且已知该分布为对数正态分布，且具有未知参数期望μ和方差σ 2。获取每组的一个最大液滴的体积值，例如20组共获得20个体积值
将这20个体积值依次记为 其中q为分位数，得到以下关于分位数q与液滴体积累积分布函数F(v)的方程：
…，…，…，…，(方程四至十九)
求解以上方程一至二十的方程组，可得到期望μ的多个估计值和方差σ 2的多个估计值(参图5中的B所示)。然后利用预设的评价函数例如最小二乘拟合，从所述期望μ的多个估计值中选取期望μ的最佳估计值，以及从所述方差σ 2的多个估计值中选取方差σ 2的最佳估计值。例如可以通过求解使得以下残差平方和SSE取得最小值时的μ和σ 2分别作为所述期望μ的最佳估计值和所述方差σ 2的最佳估计值：
由此可根据对数正态分布的特征，得到所述液滴体积概率密度函数f(v)。
步骤S5，计算机装置统计所述n个液滴中的阴性液滴数j或阳性液滴数n-j。
在一个实施例中，可以根据所述液滴图像信息，基于液滴信号阈值判定算法，确定所述液滴体系所包括的阴性液滴数j或阳性液滴数n-j。
具体地，可根据每个液滴是否包括待测模板(也即所述目标分子)来判定每个液滴为阳性液滴或阴性液滴，进而统计阴性液滴数j或阳性液滴数n-j。
在一个实施中，可以首先计算每个液滴的相对光强(Droplet Relative Intensity)I Rela。当任一液滴的相对光强I Rela大于一个预设的阈值时，计算机装置可以确定该任一液滴包括所述目标分子，以及确定所述任一液滴为阳性液滴。反之，当任一液滴的相对光强小于或者等于所述预设的阈值时，确定该任一液滴不包括所述目标分子，以及确定所述任一液滴为阴性液滴。
步骤S6，计算机装置根据所述含有目标分子的样品的总体积V、所述液滴体系的液滴总数n、所述液滴体系的液滴体积分布信息、所述液滴体系的所包括的阴性液滴数j或阳性液滴数n-j，对所述目标分子作定量分析。
在一个实施例中，所述对所述目标分子作定量分析包括，但不限于，计算所述目标分子的总数m，以及计算所述目标分子的浓度。
在一个实施例中，所述对所述目标分子作定量分析包括(c1)-(c1)：
(c1)所述液滴体系的液滴体积概率密度函数f(v；μ,σ 2)，且，
其中，v代表液滴体积，μ代表期望值，σ代表标准差；E[v]代表所述液滴体系的液滴体积分布的期望；D[v]代表所述液滴体系的液滴体积分布的方差。
(c2)每个液滴为阴性液滴的概率p(v)与每个液滴的体积v之间的函数关系满足p(v)＝e -mv/V，其中，V代表所述含有目标分子的样品的总体积，m代表所述目标分子的总数。
(c3)将所述液滴体系的液滴体积概率密度函数f(v；μ,σ 2)在体积区间[0,∞]的被积表达式f(v；μ,σ 2)dv，表示为体积为v的液滴在所述n个液滴中的数量的占比，则体积为v的液滴的数量的期望为nf(v；μ,σ 2)dv，体积为v的阴性液滴的数目的期望为np(v)f(v；μ,σ 2)dv，v取值范围为[0,∞]，对np(v)f(v；μ,σ 2)dv在全体液滴(即所述n个液滴)的每个液滴的体积区间求积分得到全体液滴中的阴性液滴的数目C 0的期望为：
(c4)将所述阴性液滴数j的值作为E[C 0]的值，由此计算得到所述目标分子的总数m；以及根据所述含有目标分子的样品的总体积V以及所述目标分子的总数m得到所述目标分子的浓度。
在本实施例中，为了验证本申请提供的所述基于体积分布分析液滴的方法的可行性，以下提供三个实施例来对本申请提供的所述基于体积分布分析液滴的方法的可行性进行验证。
实施例1：基于模拟的定量算法验证。具体是基于模拟执行服从对数正态分布分布的分散液滴来实现数字扩增绝对定量检测的验证方法。该验证方法应用于计算机装置中。具体方法步骤参阅图6所示。
步骤S21、设置目标分子总量m，其中，m为大于或等于0的整数。
步骤S22、设置分散液滴的总数n，根据设置的分散液滴的总数n，形成n个服从对数正态分布的分散液滴体积数值v i，其中，v i表示第i个分散液滴的体积数值，i＝1，2，3，...，n，其中，n为大于1的整数。
步骤S23、根据n个分散液滴的各自的体积数值v i，计算出乳化体系的总体积
V。
步骤S24、根据乳化体系的总体积V，随机产生m组坐标数值集合，其中坐标数值集合中元素的取值范围不超过乳化体系的总体积V。
步骤S25、根据坐标数值集合的维度，将各分散液滴的体积表示为具有维度的依据预设次序连接的n个数值区间。
步骤S26、确定n个数值区间中每个数值区间所包含的坐标数值的数量。
步骤S27、统计出包含坐标数量为零的数值区间的总个数，并将统计出的总个数作为不包含目标分子的分散液滴的数量C 0。
步骤S28、设置分散液滴的体积分布区间，将n个分散液滴中的最小液滴的体积v min与最大液滴的体积v max分别作为上边界和下边界，由此确定液滴体积分布区间，确定划分数量nbins，并按照某种划分方式(例如平均划分、对数划分，或者人为设置等)将液滴体积分布区间划分为nbins个子区间。
步骤S29、统计nbins个子区间内的每个子区间的液滴数目/个数HistData，根据各子区间的液滴体积的平均值和液滴个数HistData计算得到液滴体积分布的期望E[v]和方差D[v]。根据液滴体积分布的期望E[v]和方差D[v]得到全体液滴的体积频率分布函数函f(v)。
步骤S30、根据每个液滴为阴性液滴的概率p(v)与每个液滴的体积v之间的函数关系p(v)＝e -mv/V，计算目标分子总量m的数值解M LogN。比较设置的目标分子的总数m与目标分子总量的数值解M LogN之间的差值是否在预设误差范围内，如果差值在预设误差范围内，则确定本申请提供的所述基于体积分布分析液滴的方法可以用于对目标分子的定量分析。
步骤S31、根据如下两个公式中的任意一个公式计算目标分子的总数m的极大似然估计数值解 或M MLE，并将 或M MLE与M LogN进行横向比较。其中，当M LogN与 相近或者M LogN与M MLE相近时，则代表本申请提供的所述基于体积分布分析液滴的方法可行。
其中，n代表液滴总数(n为大于1的整数)，该n个液滴的体积分别为v i，i＝1，2，3，…，n，阴性液滴的数目为j，阴性液滴的体积分别为v q，q＝1，2，3，…，j，阳性液滴的体积分别为v p，p＝1，2，3，…，n-j。
需要说明的是，由于步骤S30和S31均是用于确定本申请提供的所述基于体积分布分析液滴的方法是否可以用于对目标分子的定量分析，在其他实施例中，也可以不包括步骤S31。
可结合图7、如下表格以及图8来清楚理解本申请提供的所述验证方法。图7示意的是单次模拟生成的液滴体积区间及分子坐标示意图。图7中的A示意的是从0到2016.1755体积区间之间的分子坐标位置分布。图7中B示意了体积区间局部放大。如下表格示意的是模拟生成的液滴体积和分子坐标数据。图8示意的是设置液滴数目/个数为1024，体积分布区间划分子区间数量nbins为25；设置目标分子总数m分别为10、100、1000及10000的模拟结果以及极大似然估计数值解 或M MLE与基于液滴体积对数正态分布的数值解M LogN的横向比较。
实施例2：基于随机乳化液滴的实验模拟验证方法
具体地，本实施例将一定浓度的荧光染料(例如25μM钙黄绿素)溶液进行涡旋振荡形成随机乳化分散液滴，再加载到测序芯片通道中形成准二维液滴平面，在显微成像设备上获取液滴的荧光图像。通过对液滴荧光图像进行处理分析，获取了液滴的相关数据信息，并对本申请提出的所述基于体积分布分析液滴的方法的可行性进行了计算验证。本实施例的流程与实施例1类似，区别在于步骤22-23中关于液滴的数据包括分散液滴数量n，液滴体积v i(包括最小体积v min与最大体积v max)，乳化液滴总体积V都是通过实验获取的液滴荧光图像处理分析计算得到。而实施例1中的液滴数据为采用服从对数正态分布的随机数模拟得到。具体实验数据及模拟数据结果如图9至图11所示。其中，图9示意的是加载到测序芯片里的随机乳化液滴图像。图10示意的是从随机乳化液滴图像提取液滴数据信息示意图。图11示意的是液滴个数为1595，体积变异系数为2.3575，体积分布区间划分子区间数量nbins为50；设置目标分子总数m分别为10、100、1000及10000的模拟结果以及极大似然估计数值解 或M MLE与基于液滴体积对数正态分布的数值解M LogN的横向比较。
实施例3：基于随机乳化液滴的数字环介导等温扩增实验验证方法
在本实施例中，采用数字等温扩增实验方法，将含有一定浓度的核酸模板的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification)溶液进行涡旋振荡形成随机乳化分散液滴，再加载到测序芯片通道中形成准二维液滴平面，对芯片施加扩增所需的温度条件并持续1小时，完成后在显微成像设备上获取芯片中液滴的荧光图像。通过对液滴荧光图像进行处理分析，获取了液滴的相关数据信息，并对本申请提出的所述基于体积分布分析液滴的方法的可行性进行了计算验证。具体地，按照以下表格配方制备待乳化体系混合液：
将上述混合液混匀并室温静置5分钟，取混合液和乳化剂按照1:10的体积比进行混合，混合方式：手动振荡或涡旋仪振荡2次，每次3秒钟，形成随机的多体积液滴的乳化体系。其中加入的两种染料，SYTO-9为工作染料，ROX为参比染料。将乳化体系加载到BGISEQ-500芯片上，用PCR封板膜封装好两端进样孔与出样孔，转移芯片至水浴锅中加温，温度设置为67摄氏度。充分反应1个小时后取出芯片，置于奥林巴斯SZX16体视荧光显微镜下拍摄芯片图像，分别在480nm/535nm与540nm/605nm进行荧光激发和发射，拍摄SYTO-9与ROX两种染料通道的荧光图像。
分别对这两个通道的荧光图像进行光度不均匀背景校正操作，可得到背景均匀的液滴图像。对参比染料通道背景校正图像进行增强，采用块匹配三维滤波降噪(BM3D)算法对增强图像进行降噪处理。读取参比染料通道降噪图像，通过watershed水坝方法获取灰度地形图像的分水岭分割线，从而将图像中的邻近液滴区域分割。将每个不同区域用bwlabel方法标记上不同的标签值。以参比染料通道背景校正图像为固定基准，将工作染料通道图像采用二次配准方法校正图像，同时将配准后图像不均匀边缘留白填充为前景色。读取二次配准后的校正图像以及前述参比染料通道图像分割不同区域标签值，根据标签值计算每个分割区域在二次配准校正图像上的平均光强I Abs，同样地根据标签值计算每个分割区域在参比染料通道背景校正图像上的平均光强I Ref，进而计算出每个分割区域即每个液滴的相对光强I Rela＝I Abs/I Ref。根据标签值计算每个分割区域的像素总数，然后确定图像放大倍率计算出每个液滴的体积。另外再根据每个液滴的相对平均光强判定每个液滴反应后的状态及相关内含物信息，并据此将液滴进行分类。进一步根据液滴总数量、各液滴体积及分类结果计算内含物定量结果。经过二次配准计算得到的液滴可根据相对光强分为阴性液滴和阳性液滴两类，具体步骤及结果如图12所示。图12示意的是基于MGI测序芯片的准二维液滴荧光显微成像以及数字等温扩增的图像处理。可参申请号为PCT/CN2019/122068、PCT/CN2020/075309的记载。
根据以上液滴荧光图像的处理分析，获取液滴的相关数据信息，统计出全体液滴的数量n，并根据光强信号阈值将每个液滴判断成阴性液滴或阳性液滴，并统计对应液滴数。根据液滴图像，确定液滴最小体积v min与最大体积v max，由此确定液滴体积分布区间[v min,v max]。根据体系乳化前总体积V(例如25μL)以及液滴总数n，可得到液滴体积均值E[v]＝V/n。将液滴体积分布区间[v min,v max]平均划分为25个子区间，并对每个液滴逐一判定其落入的子区间，统计25个子区间内液滴出现的频率，并根据实施例1中所提供的的方法得到液滴体积分布的方差D[v]。根据对数正态分布规律，将E[v]及D[v]作为分布函数f(v)的期望与方差，并根据如下公式计算液滴体系中待测分子总数m的数值解M LogN(单位：拷贝)，从而计算出待测分子浓度为M LogN/V(单位：拷贝/毫升)。
其中，v代表液滴体积，μ代表期望值，σ代表标准差；V代表所述体系乳化前的总体积，m代表目标分子的总数。
参阅图13所示，是本申请较佳实施例提供的液滴分析系统的运行环境图。
本实施例中，液滴分析系统30运行于计算机装置3中，用于基于图像对液滴进行分析，例如分析液滴的相对光强等。本实施例中，计算机装置3包括，但不限于，存储器31、处理器32，以及至少一条通讯总线33。
本领域技术人员应该了解，图3示出的计算机装置的结构并不构成本申请实施例的限定，既可以是总线型结构，也可以是星形结构，所述计算机装置3还可以包括比图示更多或更少的其他硬件或者软件，或者不同的部件布置。
在一些实施例中，所述计算机装置3包括一种能够按照事先设定或存储的计算机可读指令，自动进行数值计算和/或信息处理的终端，其硬件包括但不限于微处理器、专用集成电路、可编程门阵列、数字处理器及嵌入式设备等。
需要说明的是，所述计算机装置3仅为举例，其他现有的或今后可能出现的计算机装置如可适应于本申请，也应包含在本申请的保护范围以内，并以引用方式包含于此。
在一些实施例中，所述存储器31用于存储程序代码和各种数据，例如安装在所述计算机装置3中的液滴分析系统30，并在计算机装置3的运行过程中实现高速、自动地完成程序或数据的存取。所述存储器31包括只读存储器(Read-Only Memory，ROM)、可编程只读存储器(Programmable Read-Only Memory，PROM)、可擦除可编程只读存储器(Erasable Programmable Read-Only Memory，EPROM)、一次可编程只读存储器(One-time Programmable Read-Only Memory，OTPROM)、电子擦除式可复写只读存储器(Electrically-Erasable Programmable Read-Only Memory，EEPROM)、只读光盘(Compact Disc Read-Only Memory，CD-ROM)或其他光盘存储器、磁盘存储器、磁带存储器、或者任何其他能够用于携带或存储数据的非易失性的可读存储介质。
在一些实施例中，所述至少一个处理器32可以由集成电路组成，例如可以由单个封装的集成电路所组成，也可以是由多个相同功能或不同功能封装的集成电路所组成，包括一个或者多个中央处理器(Central Processing unit，CPU)、微处理器、数字处理芯片、图形处理器及各种控制芯片的组合等。所述至少一个处理器32是所述计算机装置3的控制核心(Control Unit)，利用各种接口和线路连接整个计算机装置3的各个部件，通过运行或执行存储在所述存储器31内的程序或者模块，以及调用存储在所述存储器31内的数据，以执行计算机装置3的各种功能和处理数据，例如执行基于体积分布分析液滴的功能(如图1的描述)。
在一些实施例中，所述至少一条通信总线33被设置为实现所述存储器31以及所述至少一个处理器32等之间的连接通信。
尽管未示出，所述计算机装置3还可以包括给各个部件供电的电源(比如电池)，优选地，电源可以通过电源管理装置与所述至少一个处理器32逻辑相连，从而通过电源管理装置实现管理充电、放电、以及功耗管理等功能。电源还可以包括一个或一个以上的直流或交流电源、再充电装置、电源故障检测电路、电源转换器或者逆变器、电源状态指示器等任意组件。所述计算机装置3还可以包括多种传感器、蓝牙模块、Wi-Fi模块等，在此不再赘述。
应该了解，所述实施例仅为说明之用，在专利申请范围上并不受此结构的限制。
在一些实施例中，所述液滴分析系统30可以包括多个由程序代码段所组成的功能模块。所述液滴分析系统30中的各个程序段的程序代码可以存储于存储 器(例如计算机装置3的存储器31)中，并由至少一个处理器(例如处理器32)所执行，以实现基于体积分布分析液滴的功能(如图1所记载)。
本实施例中，所述液滴分析系统30根据其所执行的功能，可以被划分为多个功能模块。所述功能模块可以包括：获取模块301、执行模块302。本申请所称的模块是指一种能够被至少一个处理器(例如处理器32)所执行并且能够完成固定功能的一系列计算机可读指令段，其存储在存储器(例如计算机装置3的存储器31)中。
所述获取模块301获取所述含有目标分子的样品的总体积V。当将所述待乳化体系乳化为液滴，对乳化获得的液滴实施执行扩增反应所需要的条件与操作，使得含有所述样品的液滴发生扩增反应，获得液滴体系后，所述执行模块302获取所述液滴体系的液滴图像信息，基于所述液滴图像信息获得所述液滴体系所包括的液滴总数n。所述执行模块302还基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息；以及统计所述n个液滴中的阴性液滴数j或阳性液滴数n-j。所述执行模块302还根据所述含有目标分子的样品的总体积V、所述液滴总数n、所述液滴体积分布信息，以及所述阴性液滴数j或阳性液滴数n-j，对所述目标分子作定量分析。
本实施例中，以软件功能模块的形式实现的集成的单元，可以存储在一个非易失性可读存储介质中。上述软件功能模块包括若干计算机可读指令用以使得一台计算机装置或处理器(processor)执行本申请各个实施例的方法的部分，例如图1所示的基于体积分布分析液滴的方法。
在进一步的实施例中，结合图12，所述至少一个处理器32可执行所述计算机装置3的操作装置以及安装的各类应用程序(如所述的液滴分析系统30)、程序代码等，例如，上述的各个模块。
所述存储器31中存储有程序代码，且所述至少一个处理器32可调用所述存储器31中存储的程序代码以执行相关的功能。例如，图3中所述液滴分析系统30的各个模块是存储在所述存储器31中的程序代码，并由所述至少一个处理器32所执行，从而实现所述各个模块的功能以达到基于体积分布分析液滴的目的(详见对图1的描述)。
在本申请的一个实施例中，所述存储器31存储多个计算机可读指令，所述多个计算机可读指令被所述至少一个处理器32所执行以实现基于体积分布分析液滴的目的。具体地，所述至少一个处理器32对上述计算机可读指令的具体实现方法详见对图1的描述。
需要说明的是，在本申请所提供的几个实施例中，应该理解到，所揭露的非易失性可读存储介质，装置和方法，可以通过其它的方式实现。例如，以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，例如，所述模块的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式。
所述作为分离部件说明的模块可以是或者也可以不是物理上分开的，作为模块显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。
另外，在本申请各个实施例中的各功能模块可以集成在一个处理单元中，也可以是各个单元单独物理存在，也可以两个或两个以上单元集成在一个单元中。上述集成的单元既可以采用硬件的形式实现，也可以采用硬件加软件功能模块的形式实现。
对于本领域技术人员而言，显然本申请不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本申请的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本申请。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本申请的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化涵括在本申请内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。此外，显然“包括”一词不排除其他单元或，单数不排除复数。装置权利要求中陈述的多个单元或装置也可以由一个单元或装置通过软件或者硬件来实现。第一，第二等词语用来表示名称，而并不表示任何特定的顺序。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本申请进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本申请技术方案的精神和范围。

Claims (20)

  1. 一种基于体积分布分析液滴的方法，其特征在于，所述方法包括：
    利用含有目标分子的样品配制待乳化体系，获取该含有目标分子的样品的总体积V；
    将所述待乳化体系乳化为液滴，对乳化获得的液滴实施执行扩增反应所需要的条件与操作，使得含有所述样品的液滴发生扩增反应，获得液滴体系；
    获取所述液滴体系的液滴图像信息，基于所述液滴图像信息获得所述液滴体系所包括的液滴总数n；
    基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息；
    统计所述n个液滴中的阴性液滴数j或阳性液滴数n-j；
    根据所述含有目标分子的样品的总体积V、所述液滴总数n、所述液滴体积分布信息，以及所述阴性液滴数j或阳性液滴数n-j，对所述目标分子作定量分析。
  2. 如权利要求1所述的基于体积分布分析液滴的方法，其特征在于，所述液滴体系的液滴体积分布信息包括：所述液滴体系的液滴体积累积分布函数、所述液滴体系的液滴体积概率密度函数，或者所述液滴体系的液滴体积分布的期望与方差。
  3. 如权利要求2所述的基于体积分布分析液滴的方法，其特征在于，所述基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息包括：
    基于所述液滴图像信息，从所述n个液滴中确定最小液滴和最大液滴；
    获取所述最小液滴的体积以及所述最大液滴的体积；
    将所述最小液滴的体积作为上边界，以及将所述最大液滴的体积作为下边界，获得液滴体积分布区间；
    将所述液滴体积分布区间划分为预设数量的子区间；
    判断所述n个液滴中的每个液滴所落入的子区间；
    统计落入每个子区间的液滴的数目，得到所述液滴体系的液滴体积频率分布，根据所述液滴体系的液滴体积频率分布获得所述液滴体系的液滴体积分布的期望与方差；及
    基于所述液滴体系的液滴体积分布的期望与方差得到所述液滴体系的液滴体积概率密度函数。
  4. 如权利要求3所述的基于体积分布分析液滴的方法，其特征在于，所述从所述n个液滴中确定最小液滴和最大液滴包括：
    基于所述液滴图像信息，根据液滴边界位置信息确定所述n个液滴中的每个液滴所包括的像素的数目；
    按照每个液滴所包括的像素的数目的大小对所述n个液滴进行排序，将包括像素最少的液滴作为所述最小液滴，以及将包括像素最多的液滴作为所述最大液滴。
  5. 如权利要求3所述的基于体积分布分析液滴的方法，其特征在于，所述从所述n个液滴中确定最小液滴和最大液滴包括：
    基于所述液滴图像信息，确定所述n个液滴中的每个液滴在空间坐标系中的空间坐标和边界位置信息，根据每个液滴的空间坐标和边界位置信息确定每个液滴在该空间坐标系的极小点与极大点，并基于每个液滴对应的极小点与极大点计算获得每个液滴的边界极差；及
    根据每个液滴的所述边界极差的大小对所述n个液滴进行排序，将具有最小边界极差的液滴作为所述最小液滴，以及将具有最大边界极差的液滴作为所述最大液滴。
  6. 如权利要求2所述的基于体积分布分析液滴的方法，其特征在于，所述基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息包括：
    基于所述液滴图像信息获取每个液滴的体积，按照每个液滴的体积大小对所述n个液滴进行排序；
    基于所述n个液滴的排列顺序将所述n个液滴分成t个组；
    获取每组中体积最大或者最小的液滴的体积值从而获得t个体积值；
    基于所述t确定分位数q，以及基于分位数q和所述t个体积值获得期望μ的多个估计值和方差σ 2的多个估计值；
    基于预设的评价函数从所述期望μ的多个估计值中选取期望μ的最佳估计值，以及从所述方差σ 2的多个估计值中选取方差σ 2的最佳估计值；及
    根据对数正态分布的特征，基于所述期望μ的最佳估计值和所述方差σ 2的最佳估计值得到所述液滴体系的液滴体积概率密度函数。
  7. 如权利要求2所述的基于体积分布分析液滴的方法，其特征在于，所述对所述目标分子作定量分析包括：
    所述液滴体系的液滴体积概率密度函数f(v；μ,σ 2)，其中，
    其中，v代表液滴体积，μ代表期望值，σ代表标准差；E[v]代表所述液滴体系的液滴体积分布的期望；D[v]代表所述液滴体系的液滴体积分布的方差；
    每个液滴为阴性液滴的概率p(v)与每个液滴的体积v之间的函数关系满足p(v)＝e -mv/V，其中，V代表所述含有目标分子的样品的总体积，m代表所述目标分子的总数；
    将所述液滴体系的液滴体积概率密度函数f(v；μ,σ 2)在体积区间[0,∞]的被积表达式f(v；μ,σ 2)dv，表示为体积为v的液滴在所述n个液滴中的数量的占比，则体积为v的液滴的数量的期望为nf(v；μ,σ 2)dv；体积为v的阴性液滴的数目的期望为np(v)f(v；μ,σ 2)dv，v取值范围为[0,∞]，对np(v)f(v；μ,σ 2)dv在全体液滴的体积区间求积分得到全体液滴中的阴性液滴的数目C 0的期望为：
    将所述阴性液滴数j的值作为E[C 0]的值，由此计算得到所述目标分子的总数m；根据所述含有目标分子的样品的总体积V以及所述目标分子的总数m得到所述目标分子的浓度。
  8. 如权利要求1所述的基于体积分布分析液滴的方法，其特征在于，所述将所述待乳化体系乳化为液滴，对乳化获得的液滴实施执行扩增反应所需要的条件与操作，使得含有所述样品的液滴发生扩增反应，获得液滴体系包括：
    在所述待乳化体系加入乳化油及乳化剂预混液，使得所述待乳化体系在乳化剂预混液的作用下随机乳化为液滴，对液滴实施执行核酸扩增反应所需要的条件与操作，由此使得含有所述目标分子的液滴发生扩增反应。
  9. 一种计算机装置，其特征在于，所述计算机装置包括存储器和处理器，所述存储器用于存储至少一个计算机可读指令，所述处理器用于执行所述至少一个计算机可读指令以实现以下步骤：
    获取含有目标分子的样品的总体积V；
    获取液滴体系的液滴图像信息，基于所述液滴图像信息获得所述液滴体系所包括的液滴总数n，其中，获取所述液滴体系的步骤包括：将所述含有目标分子的样品所配制得到的待乳化体系乳化为液滴，对乳化获得的液滴实施执行扩增反应所需要的条件与操作，使得含有所述样品的液滴发生扩增反应；
    基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息；
    统计所述n个液滴中的阴性液滴数j或阳性液滴数n-j；
    根据所述含有目标分子的样品的总体积V、所述液滴总数n、所述液滴体积分布信息，以及所述阴性液滴数j或阳性液滴数n-j，对所述目标分子作定量分析。
  10. 如权利要求9所述的计算机装置，其特征在于，所述液滴体系的液滴体积分布信息包括：所述液滴体系的液滴体积累积分布函数、所述液滴体系的液滴体积概率密度函数，或者所述液滴体系的液滴体积分布的期望与方差。
  11. 如权利要求10所述的计算机装置，其特征在于，所述基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息包括：
    基于所述液滴图像信息，从所述n个液滴中确定最小液滴和最大液滴；
    获取所述最小液滴的体积以及所述最大液滴的体积；
    将所述最小液滴的体积作为上边界，以及将所述最大液滴的体积作为下边界，获得液滴体积分布区间；
    将所述液滴体积分布区间划分为预设数量的子区间；
    判断所述n个液滴中的每个液滴所落入的子区间；
    统计落入每个子区间的液滴的数目，得到所述液滴体系的液滴体积频率分布，根据所述液滴体系的液滴体积频率分布获得所述液滴体系的液滴体积分布的期望与方差；及
    基于所述液滴体系的液滴体积分布的期望与方差得到所述液滴体系的液滴体积概率密度函数。
  12. 如权利要求11所述的计算机装置，其特征在于，所述从所述n个液滴中确定最小液滴和最大液滴包括：
    基于所述液滴图像信息，根据液滴边界位置信息确定所述n个液滴中的每个液滴所包括的像素的数目；及
    按照每个液滴所包括的像素的数目的大小对所述n个液滴进行排序，将包括像素最少的液滴作为所述最小液滴，以及将包括像素最多的液滴作为所述最大液滴。
  13. 如权利要求11所述的计算机装置，其特征在于，所述从所述n个液滴中确定最小液滴和最大液滴包括：
    基于所述液滴图像信息，确定所述n个液滴中的每个液滴在空间坐标系中的空间坐标和边界位置信息，根据每个液滴的空间坐标和边界位置信息确定每个液滴在该空间坐标系的极小点与极大点，并基于每个液滴对应的极小点与极大点计算获得每个液滴的边界极差；及
    根据每个液滴的所述边界极差的大小对所述n个液滴进行排序，将具有最小边界极差的液滴作为所述最小液滴，以及将具有最大边界极差的液滴作为所述最大液滴。
  14. 如权利要求10所述的计算机装置，其特征在于，所述基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息包括：
    基于所述液滴图像信息获取每个液滴的体积，按照每个液滴的体积大小对所述n个液滴进行排序；
    基于所述n个液滴的排列顺序将所述n个液滴分成t个组；
    获取每组中体积最大或者最小的液滴的体积值从而获得t个体积值；
    基于所述t确定分位数q，以及基于分位数q和所述t个体积值获得期望μ的多个估计值和方差σ 2的多个估计值；
    基于预设的评价函数从所述期望μ的多个估计值中选取期望μ的最佳估计值，以及从所述方差σ 2的多个估计值中选取方差σ 2的最佳估计值；及
    根据对数正态分布的特征，基于所述期望μ的最佳估计值和所述方差σ 2的最佳估计值得到所述液滴体系的液滴体积概率密度函数。
  15. 如权利要求10所述的计算机装置，其特征在于，所述对所述目标分子作定量分析包括：
    所述液滴体系的液滴体积概率密度函数f(v；μ,σ 2)，其中，
    其中，v代表液滴体积，μ代表期望值，σ代表标准差；E[v]代表所述液滴体系的液滴体积分布的期望；D[v]代表所述液滴体系的液滴体积分布的方差；
    每个液滴为阴性液滴的概率p(v)与每个液滴的体积v之间的函数关系满足p(v)＝e -mv/V，其中，V代表所述含有目标分子的样品的总体积，m代表所述目标分子的总数；
    将所述液滴体系的液滴体积概率密度函数f(v；μ,σ 2)在体积区间[0,∞]的被积表达式f(v；μ,σ 2)dv，表示为体积为v的液滴在所述n个液滴中的数量的占比，则体积为v的液滴的数量的期望为nf(v；μ,σ 2)dv；体积为v的阴性液滴的数目的期望为np(v)f(v；μ,σ 2)dv，v取值范围为[0,∞]，对np(v)f(v；μ,σ 2)dv在全体液滴的体积区间求积分得到全体液滴中的阴性液滴的数目C 0的期望为：
    将所述阴性液滴数j的值作为E[C 0]的值，由此计算得到所述目标分子的总数m；根据所述含有目标分子的样品的总体积V以及所述目标分子的总数m得到所述目标分子的浓度。
  16. 一种非易失性可读存储介质，其特征在于，所述非易失性可读存储介质存储有至少一个计算机可读指令，所述至少一个计算机可读指令被处理器执行时实现以下步骤：
    获取含有目标分子的样品的总体积V；
    获取液滴体系的液滴图像信息，基于所述液滴图像信息获得所述液滴体系所包括的液滴总数n，其中，获取所述液滴体系的步骤包括：将所述含有目标分子的样品所配制得到的待乳化体系乳化为液滴，对乳化获得的液滴实施执行扩增反应所需要的条件与操作，使得含有所述样品的液滴发生扩增反应；
    基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息；
    统计所述n个液滴中的阴性液滴数j或阳性液滴数n-j；
    根据所述含有目标分子的样品的总体积V、所述液滴总数n、所述液滴体积分布信息，以及所述阴性液滴数j或阳性液滴数n-j，对所述目标分子作定量分析。
  17. 如权利要求16所述的非易失性可读存储介质，其特征在于，所述液滴体系的液滴体积分布信息包括：所述液滴体系的液滴体积累积分布函数、所述液滴体系的液滴体积概率密度函数，或者所述液滴体系的液滴体积分布的期望与方差。
  18. 如权利要求17所述的非易失性可读存储介质，其特征在于，所述基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息包括：
    基于所述液滴图像信息，从所述n个液滴中确定最小液滴和最大液滴；
    获取所述最小液滴的体积以及所述最大液滴的体积；
    将所述最小液滴的体积作为上边界，以及将所述最大液滴的体积作为下边界，获得液滴体积分布区间；
    将所述液滴体积分布区间划分为预设数量的子区间；
    判断所述n个液滴中的每个液滴所落入的子区间；
    统计落入每个子区间的液滴的数目，得到所述液滴体系的液滴体积频率分布，根据所述液滴体系的液滴体积频率分布获得所述液滴体系的液滴体积分布的期望与方差；及
    基于所述液滴体系的液滴体积分布的期望与方差得到所述液滴体系的液滴体积概率密度函数。
  19. 如权利要求17所述的非易失性可读存储介质，其特征在于，所述基于所述液滴图像信息得到所述液滴体系的液滴体积分布信息包括：
    基于所述液滴图像信息获取每个液滴的体积，按照每个液滴的体积大小对所述n个液滴进行排序；
    基于所述n个液滴的排列顺序将所述n个液滴分成t个组；
    获取每组中体积最大或者最小的液滴的体积值从而获得t个体积值；
    基于所述t确定分位数q，以及基于分位数q和所述t个体积值获得期望μ的多个估计值和方差σ 2的多个估计值；
    基于预设的评价函数从所述期望μ的多个估计值中选取期望μ的最佳估计值，以及从所述方差σ 2的多个估计值中选取方差σ 2的最佳估计值；及
    根据对数正态分布的特征，基于所述期望μ的最佳估计值和所述方差σ 2的最佳估计值得到所述液滴体系的液滴体积概率密度函数。
  20. 如权利要求17所述的非易失性可读存储介质，其特征在于，所述对所述目标分子作定量分析包括：
    所述液滴体系的液滴体积概率密度函数f(v；μ,σ 2)，其中，
    其中，v代表液滴体积，μ代表期望值，σ代表标准差；E[v]代表所述液滴体系的液滴体积分布的期望；D[v]代表所述液滴体系的液滴体积分布的方差；
    每个液滴为阴性液滴的概率p(v)与每个液滴的体积v之间的函数关系满足p(v)＝e -mv/V，其中，V代表所述含有目标分子的样品的总体积，m代表所述目标分子的总数；
    将所述液滴体系的液滴体积概率密度函数f(v；μ,σ 2)在体积区间[0,∞]的被积表达式f(v；μ,σ 2)dv，表示为体积为v的液滴在所述n个液滴中的数量的占比，则体积为v的液滴的数量的期望为nf(v；μ,σ 2)dv；体积为v的阴性液滴的数目的期望为np(v)f(v；μ,σ 2)dv，v取值范围为[0,∞]，对np(v)f(v；μ,σ 2)dv在全体液滴的体积区间求积分得到全体液滴中的阴性液滴的数目C 0的期望为：
    将所述阴性液滴数j的值作为E[C 0]的值，由此计算得到所述目标分子的总数m；根据所述含有目标分子的样品的总体积V以及所述目标分子的总数m得到所述目标分子的浓度。
CN202180090546.9A 2021-01-13 2021-01-13 基于体积分布分析液滴的方法、计算机装置及存储介质 Pending CN116783303A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2021/071432 WO2022151025A1 (zh) 2021-01-13 2021-01-13 基于体积分布分析液滴的方法、计算机装置及存储介质

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116783303A true CN116783303A (zh) 2023-09-19

Family

ID=82447660

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180090546.9A Pending CN116783303A (zh) 2021-01-13 2021-01-13 基于体积分布分析液滴的方法、计算机装置及存储介质

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20240120030A1 (zh)
CN (1) CN116783303A (zh)
WO (1) WO2022151025A1 (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3075139C (en) * 2008-09-23 2022-04-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
US9428793B2 (en) * 2011-01-20 2016-08-30 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods and systems for performing digital measurements
CN110305941A (zh) * 2019-06-21 2019-10-08 苏州锐讯生物科技有限公司 一种基于微流控技术获取单样本遗传信息的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022151025A1 (zh) 2022-07-21
US20240120030A1 (en) 2024-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020284538B2 (en) Systems and methods for processing images to prepare slides for processed images for digital pathology
US11674883B2 (en) Image-based assay performance improvement
Wang Robust automated tumour segmentation on histological and immunohistochemical tissue images
US20060068375A1 (en) Method and apparatus for computer controlled rare cell, including fetal cell, based diagnosis
CN113227755A (zh) 测定准确度改善
EP2588835B1 (en) Apparatus, system, and method for increasing measurement accuracy in a particle imaging device
JP5694930B2 (ja) 分析システムの分類マトリックス内に分類領域を構成するための、及びアッセイの粒子を分類するための方法、記憶媒体及びシステム
US8189884B2 (en) Methods for assessing molecular expression of subcellular molecules
WO2020055543A1 (en) Image-based assay using intelligent monitoring structures
CN114729397B (zh) 随机乳化数字绝对定量分析方法及装置
CN116783303A (zh) 基于体积分布分析液滴的方法、计算机装置及存储介质
US20240112812A1 (en) Systems and methods for determining breast cancer prognosis and associated features
WO2021159479A1 (zh) 基于图像分析液滴的方法、计算机装置及存储介质
Zhang et al. Machine learning aided top-down proteomics on a microfluidic platform
NL1040872C2 (en) Method of analysing data from, computer program, computer readable medium and data analysis system.
US20230222653A1 (en) Systems and methods for processing electronic images using uncertainty estimation
Hunt Cell Type Deconvolution and Transformation of Microenvironment Microarray Data
WO2021058751A1 (en) Mulitidimensional microfluidic protein characterisation
Wise et al. Yeast through the Ages: a Statistical Analysis of Genetic Changes in Aging Yeast

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination