CN116769565A - 用于调控细胞内m6A甲基化修饰的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开用于调控细胞内m6A甲基化修饰的方法。利用弹性柱的弹性柔韧性，改变加压柱的形变量，为体外三维培养在水凝胶中的各细胞球提供可控制和可重复的静态应力变化，模拟组织力学异质性微环境，为检测力学调控牙胚发育提供了重要手段。同时，通过模拟计算得到加压柱形变下压的不同高度对水凝胶中细胞球所受的压力数值，从而实现精确调节细胞球所受到的力。此外，本发明的加压装置在撤销后，细胞可继续培养，亦可进行后续的分子生物实验，通过显微摄像以及计算机图像处理技术对细胞生长及形态变化进行观测与分析。本发明可广泛应用于生物力学、细胞力学及生物学研究领域。
Description
技术领域
本发明涉及分子修饰的调控，具体地涉及用于调控细胞内m6A甲基化修饰的方法。
背景技术
目前已报道了关于细胞力学环境调控细胞的研究，例如通过单细胞测量法等方法研究m6A修饰与力学信号的相互作用。然而，这些技术往往需要大量手动操作，操作难度大、工作效率低，且精度和稳定性存在局限性。同时，现有技术也难以完全模拟组织力学异质性微环境对细胞m6A甲基化修饰的影响，其结果也难以在实际生物学研究中得到广泛应用。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种用于调控m6A甲基化修饰的方法。具体地，其包括以下步骤：
(1) 使细胞包裹于具有三维结构的水凝胶内部；
(2) 通过作用于所述水凝胶的外部压力使所述水凝胶变形，由此向所述细胞施加压力来模拟组织力学异质性微环境，并在所述组织力学异质性微环境中培养细胞；和
(3) 收集细胞并检测细胞的m6A甲基化修饰。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其中，所述水凝胶的压缩模量为0.7-10kPa。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其中，所述水凝胶包括天然的亲水性高分子或超分子水凝胶和人工合成的亲水性高分子或超分子水凝胶中的至少一种。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其中，所述外部压力通过弹性材料作用于所述水凝胶。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其中，所述弹性材料包括聚二甲基硅氧烷。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其中，通过分析细胞内去甲基化酶和/或甲基化酶来检测m6A甲基化修饰。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其中，通过单细胞测量来检测m6A甲基化修饰。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其中，通过加压装置使外部压力作用于所述水凝胶。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其中，所述水凝胶设置于细胞培养孔板的至少一个培养孔内。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其中，所述加压装置包括底座和设置于所述底座的至少一个加压柱，所述加压柱设置为能够进出所述培养孔；优选地，所述加压装置的底座设置为能够盖住所述细胞培养孔板的上方，且设置有与培养孔数量和位置一致的加压柱；优选地，所述加压装置进一步包括夹具，其包括本体和紧固件。
现有技术公开了包括利用微流控技术制备细胞球，并通过荧光染色或其他方法对m6A修饰进行检测。然而，该技术的操作仍然较为繁琐，需要涉及多个步骤和仪器设备，且存在样本损失的问题。同时，该技术难以模拟组织力学异质性微环境对细胞m6A甲基化修饰的影响，其结果也存在偏差。相比之下，本发明通过弹性材料传导外力来模拟组织力学异质性微环境对细胞m6A甲基化修饰的影响，实现了对细胞的高通量处理和精确控制，具有更高的准确性和可靠性。
附图说明
图1 示例性细胞球照片。
图2 示例性细胞球在水凝胶中培养一天后伸展的图；
图3 示例性孔板中细胞球-水凝胶悬液固化后的图；
图4 示例性加压装置的结构图；
图5 示例性夹具的结构图；
图6 示例性加压装置实际使用时的状态图；
图7 加压柱下压1mm(对应于10-20kPa压力)时水凝胶内部受力模拟图；
图8 加压柱下压2mm(对应于20-40kPa压力)时水凝胶内部受力模拟图；
图9 不同机械强度凝胶受力时细胞球伸展程度与m6A甲基化修饰酶表达水平。
图10 加压前后甲基化转移酶的平均荧光强度变化趋势柱状图。每组柱中左侧柱为对照(Ctrl)，右侧柱为加力组(Force)。
图11 加压前后去甲基化酶的平均荧光强度变化趋势柱状图。每组柱中左侧柱为对照(Ctrl)，右侧柱为加力组(Force)。
附图标记说明：
100-加压装置、110-底座、120-加压柱、130-夹具、131-夹具本体、132-紧固件。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本文中，术语“m6A甲基化”指是RNA链的腺苷酸在甲基化酶等的作用下发生的N6甲基化。m6A甲基化与一系列疾病，包括肿瘤、神经性疾病、胚胎发育迟缓等密切相关。
本发明提供用于调控细胞内m6A甲基化修饰的方法，优选体外方法，其包括以下步骤：
(1) 使细胞包裹于具有三维结构的水凝胶内部；
(2) 通过作用于所述水凝胶的外部压力使所述水凝胶变形，由此向所述细胞施加压力来模拟组织力学异质性微环境，并在所述组织力学异质性微环境中培养细胞；和
(3) 收集细胞并检测细胞的m6A甲基化修饰。
步骤(1):
本发明的步骤(1)为使用水凝胶来模拟体内组织微环境，包括使细胞包裹于具有三维结构的水凝胶内部。本发明中水凝胶不特别限定，只要能够保持特定的机械强度，并且具有多孔结构或交联网络允许细胞生长和增殖所述的培养成分如水、氧等通过即可。能够满足上述机械强度的水凝胶优选具有一定的压缩模量，如0.7-10kPa的压缩模量。压缩模量的大小不限定，可根据需要在上述范围内自由选择，并可根据需要分组，如分为低压缩模量、中压缩模量和高压缩模量组。示例性的压缩模量为1kPa、2kPa、3kPa、4kPa、5kPa、6kPa、7kPa、8kPa、9kPa等。
本发明的水凝胶成分不特别限定，示例性的水凝胶成分包括天然的亲水性高分子或超分子水凝胶和人工合成的亲水性高分子或超分子水凝胶。天然的亲水性高分子的实例包括但不限于多糖类(淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸和壳聚糖等)和多肽类(胶原、聚L-赖氨酸和聚L-谷胺酸等)。人工合成的亲水性高分子的实例包括但不限于醇、丙烯酸及其衍生物类(聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚N-聚代丙烯酰胺等)。为了更好地模拟组织内的微环境，优选地，在水凝胶中进一步添加细胞外基质等成分。
在某些实施方案中，本发明的水凝胶为高分子水凝胶，其为通过化学交联的水凝胶。在某些实施方案中，本发明的水凝胶为超分子水凝胶，其为通过凝胶因子以非共价键结合包裹溶剂形成的凝胶。超分子水凝胶具有优异的动态响应性，即通过外部刺激可控制三维网络的形成与解离，实现由宏观静态的凝胶转变为具有流动态的溶胶状态。
本发明中的细胞不特别限定，优选是指参与牙胚发育的细胞，特别是干细胞如根尖牙乳头干细胞。水凝胶内部的细胞数量不限定，可以是一个，优选多个。在多个细胞的情况下，各细胞可以相互独立的状态分散于凝胶的关联网络内部，或者以多个细胞组成细胞团或细胞球存在于水凝胶的内部。细胞可以是相同类型的细胞，也可以是不同类型的细胞。对此不特别限定。
本发明的包裹方法不限定，可以使细胞进入具有三维网络的凝胶内部，或进一步进行细胞培养，从而形成细胞团或细胞球。示例性的方法包括使细胞与凝胶溶液混合，得到混合液。然后，通过固化使细胞或细胞球包裹于固化后的凝胶内部的方法。
步骤(2)：
本发明的步骤(2)为模拟组织力学异质性微环境，并在该环境中培养细胞的步骤，其包括通过作用于水凝胶的外部压力使水凝胶变形，由此向细胞施加压力，并在模拟的组织力学异质性微环境中培养细胞。
本发明中，优选通过弹性材料介导将外部压力传递至水凝胶，由此使水凝胶内部不同位置的细胞或细胞球受力更加均匀，并且可以精确地控制细胞或细胞球的压力大小。弹性材料的实例不限定，只要能够承受90kPa以下优选70kPa以下，更优选5-50kPa，如10kPa、15kPa、20kPa、25kPa、30kPa、35kPa、40kPa或50kPa的压强而不破损的材料即可。优选地，为化学惰性材料。示例性实例为聚二甲基硅氧烷材料，其具有弹性、疏水、透明、透气、化学惰性的性质。此外，还具有精细地高分辨率制造性能，表面张力低，脱模性佳，可用于模具准确外形尺寸制作。
本发明中，优选通过专用加压装置施加外部压力。其中加压装置中至少与水凝胶接触的部分为弹性材料。示例性的加压装置包括底座和设置底座的至少一个加压柱。优选地，底座具有与培养孔板相配套的结构，例如可以设计为能够盖住培养孔板上方。加压柱设置为能够自由地进出所述培养孔，优优选地，加压柱为圆柱状，且其直径略小于培养孔的直径。需要说明的是，加压柱的形状可以是任意形状，而不仅仅限定于圆柱状。加压柱的数量不限定，优选地，其数量与培养孔板中孔的数量一致，且加压柱在底座的位置设置为当底座加盖于培养孔板上方时，各加压柱能够分别对应于培养孔板中的一个孔。
在示例性实施方案中，加压装置进一步包括夹具，其包括夹具本体和紧固件。夹具本体包括第一夹板、第二夹板和设计于两夹板之间用于连接两者的连接板。第一夹板设置有通孔，用于使紧固件的至少一部分能够通过该通孔。紧固件和通孔之间分别设置有螺纹，并通过螺纹使紧固件相对于本体移动。优选地，紧固件的一端设置为平面状，从而有利于向底座均匀加压。夹具中通孔及其对应的紧固件数量不限，可以是一组，也可以是多组。另外，加压装置中夹具的数量不限定，可以根据需要而选择。示例性地，夹具的数量与培养孔板的数量一致。
在示例性实施方案中，加压装置与细胞培养孔板组成用于调控m6A甲基化修饰的装置，其特别适用于模拟发育中的力学作用，如模拟组织力学异质性微环境，进而检测力学调控牙胚发育。
步骤(3)：
本发明的步骤(3)为m6A甲基化修饰的检测，其包括收集细胞并检测细胞的m6A甲基化修饰。m6A甲基化修饰的检测可通过本领域已知的方法进行。示例性的检测方法中，包括检测m6A甲基化相关的酶来进行检测。m6A甲基化相关的酶包括但不限于去甲基化酶和/或甲基化酶。在另外的示例性检测方法中，通过免疫荧光染色来检测细胞球中细胞的伸展程度。
实施例
本实施例为用于模拟组织力学异质性微环境对细胞m6A甲基化修饰的影响的方法，具体包括以下步骤：
1、制备浓度为5%的甲基丙烯酰水凝胶（GelMA），（GleMA30压缩模量约1kPa，GleMA60压缩模量约3.5kPa，GleMA90压缩模量约5kPa），将细胞球均质培养于其中。细胞球的制备如下：
(1) 用Stemcell品牌的aggre well 24孔板（每个孔内有1200个微孔，每个微孔的尺寸约400μm）制备细胞球；每个孔内接种1.2×106个根尖牙乳头干细胞（SCAP），既一个微孔内约含1000个细胞，形成一个细胞球（图1）。
(2) 将37℃预热的浓度为10 % (w/v)的水凝胶溶液，与等体积细胞球悬液混匀，制备成5 % (w/v)细胞球-水凝胶悬液（图2）；
(3) 向24孔板内加入1ml细胞球-水凝胶悬液（图3）；
(4) 用405nm紫外光源照射悬液30s，交联固化形成具有一定强度的三维结构（图4）；
(5) 细胞球-凝胶块孔内加入新鲜的培养基，于37℃孵箱内，5% CO2环境下进行细胞培养。
2、利用加压装置（PDMS）施加所需的压力于凝胶中的细胞球。其中，加压装置的结构如图4和图5所示，示例性加压装置100包括底座110和设置于底座110一侧的6个加压柱120。加压柱120的数量跟培养孔板中孔的数量对应。并且每个加压柱120的直径能够自由进也对应的孔。此外，加压装置100还包括夹具130，其包括本体131和紧固件132。在本体131包括第一夹板和第二夹板以及用于连接两者的连接板。在第一夹板设置有允许紧固件132通过的通孔。紧固件的一端设置为平面状，从而有利于向底座110施加均匀的作用力。紧固件132与通孔之间通过螺纹联系，从而调控施加的作用力的大小。
通过调节加压柱的下压高度调节对细胞球-凝胶块的压力大小，力通过加压柱传递给凝胶块中的细胞球（图6）。
3、在施加压力的条件下，收集细胞球进行m6A甲基化修饰的检测，其包括：
(1) 按照免疫荧光的方法，对对照组和实验组的细胞球进行免疫荧光染色，检测不同机械强度（即培养在不同压缩模量的甲基丙烯酰化明胶中）受力中细胞球伸展程度与m6A甲基化修饰水平。结果如图9-11所示。
进一步本发明的方法包括通过数据分析，研究组织力学异质性微环境对细胞m6A甲基化修饰的影响。结果表明同样压缩模量的水凝胶中，加压组细胞球比不加压组伸展范围减小，去甲基化酶上调、甲基化酶下调。与此同时，比较低压缩模量、中压缩模量、高压缩模量水凝胶中细胞球，发现越高压缩模量水凝胶中的细胞球伸展范围减小，m6A甲基化修饰的去甲基化酶上调，甲基化酶下调。
本发明的方法可以用于研究组织力学异质性微环境对细胞增殖、分化等生物学过程的调控作用以及对细胞信号通路、分子机制等的影响。
本发明的方法中的数据分析步骤，包括利用多组学技术对细胞的m6A甲基化修饰进行测量，并通过统计学分析和计算机模拟等方法研究组织力学异质性微环境对细胞m6A甲基化修饰的影响。
本发明的细胞培养方法，培养模式可为静态压力培养，亦可改进为动态压力培养，培养时间可控，加力装置撤销后，细胞可继续培养，亦可进行后续的分子生物实验，通过显微摄像以及计算机图像处理技术对细胞生长及形态变化进行观测与分析。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (10)
1.一种用于调控m6A甲基化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 使细胞包裹于具有三维结构的水凝胶内部；
(2) 通过作用于所述水凝胶的外部压力使所述水凝胶变形，由此向所述细胞施加压力来模拟组织力学异质性微环境，并在所述组织力学异质性微环境中培养细胞；和
(3) 收集细胞并检测细胞的m6A甲基化修饰。
2.根据权利要求1所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其特征在于，所述水凝胶的压缩模量为0.7-10kPa。
3.根据权利要求1所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其特征在于，所述水凝胶包括天然的亲水性高分子或超分子水凝胶和人工合成的亲水性高分子或超分子水凝胶中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其特征在于，所述外部压力通过弹性材料作用于所述水凝胶。
5.根据权利要求4所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其特征在于，所述弹性材料包括聚二甲基硅氧烷。
6.根据权利要求1所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其特征在于，通过分析细胞内去甲基化酶和/或甲基化酶来检测m6A甲基化修饰。
7.根据权利要求1所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其特征在于，通过单细胞测量来检测m6A甲基化修饰。
8.根据权利要求1所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其特征在于，通过加压装置使外部压力作用于所述水凝胶。
9.根据权利要求8所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其特征在于，所述水凝胶设置于细胞培养孔板的至少一个培养孔内。
10.根据权利要求9所述的用于调控m6A甲基化修饰的方法，其特征在于，所述加压装置包括底座和设置于所述底座的至少一个加压柱，至少所述加压柱由弹性材料制成，且设置为能够进出所述培养孔。
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