CN116744972A - 用于治疗骨疾病的二糖 - Google Patents

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西尔韦斯特·图米厄
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克里斯托弗·杜苏伊
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French Institute Of Health And Medicine
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Universite de Picardie Jules Verne
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Abstract

本发明涉及药物组合物，所述药物组合物的特征在于其包含：作为活性成分的至少一种具有下式(I)的化合物和所述化合物的可药用盐：(I)其中R1选自H、SO3‑，R2选自H和COCH3，R3选自H、COCH3、苄基、SO3‑，除了其中R1＝SO3‑且R2＝COCH3且R3＝H的式(I)的化合物和所述化合物的钠盐之外；以及至少一种可药用赋形剂。本发明还涉及包含生物相容性介质的相关试剂盒。

Description

用于治疗骨疾病的二糖
技术领域
本发明涉及二糖型化合物，所述二糖型化合物能够增加成骨前细胞的钙产量，因此所述二糖型化合物可用于治疗某些骨疾病。
背景技术
骨折是常见的创伤，尽管由矫形外科医师进行了手术，但是骨固结的并发症仍构成医学问题。事实上，骨固结不是恒定的现象，确实存在10％的将导致非骨固结的骨折病例，并且这在不存在特定风险因素的情况下发生。相比之下，在技术错误(不充分的紧固、粗糙的旋转控制，特别是长骨的骨干骨折)的情况下，非固结的风险估计为50％。在这两个极端之间，非固结的风险取决于局部因素和一般因素的存在并且可以达到30％。在这些因素中，骨质疏松症、I型糖尿病、乙醇…与骨质疏松症有关的骨折影响50岁以上的50％的女性和20％的男性。其特征在于骨的品质和数量的劣化，这显著增加了患有骨折的风险。
目前治疗骨缺损的参照物为自体移植物。骨部分从松质区域、或者从皮质区域或甚至皮质-松质区域中采集。其允许添加矿物质级分、具有其胶原基质蛋白质和非胶原基质蛋白质的蛋白质级分。该细胞池足以使填充部位的骨生成过程顺利进行。
皮质区域中的松质自体移植物的血运重建花费约十五天。然后，根据物种，一至六个月的延迟对于其完全整合而言是必要的。该移植物具有为成骨的、诱导骨生成的、传导骨生成的优点。然而，该项技术具有显著的局限性，包括疼痛和有限的进入移植物部位，待被外科医生采集的大体积，以及采集部位处的发病率。这可能导致可变强度和持续时间的暂时性跛行。由于自体移植物的量受到限制，因此当时外科医生可以移植同种异体组织或骨替代材料。这些材料是传导骨生成的并且仅用作用于骨修复的被动支持物。然而，研究已经指向新的解决方案，例如BMP(bone morphogenic protein，骨形态发生蛋白)或经皮注射自体浓缩骨髓。后者包括引入为骨感受态细胞的起源的间充质干细胞。该项技术伴随着轻微的发病率，同时保留一定数量的骨诱导特性，这取决于干细胞的浓度。由于采集步骤，该解决方案仍然是限制性的。
BMP进而被引入可植入的生物相容性支持物上。这些是通常通过骨基质的酸化(再吸收)或者在骨折期间释放的骨诱导性内源性糖蛋白。它们将诱导间充质细胞的局部募集并允许触发导致骨形成的生物级联。它们也通过合成生物学来合成，并且作为与手术治疗相结合的以(BMP7)、/>和/>Bone Graft(BMP2)的名称销售的骨固结领域中的活性成分。这些药物将以溶液(活性成分+溶剂)的形式重构，然后被引入胶原蛋白支持物(I型牛胶原蛋白)上。在骨折固结手术期间，外科医生在缝合伤口之前将这种“经浸泡”的基质定位在骨折的骨上。由于其分析允许更好地评估这种类型的产品的实际有效性和适应症的对人进行的随机多中心研究，可以获得销售许可。主要研究集中在被钉住的腿的开放性骨折、长骨的假关节、脊柱关节固定术。还对股骨头的骨坏死和上颌窦的变厚进行了研究，这些不允许获得官方授权。由于它们的不利影响以及缺少用于制造支持物的良好实践，BMP2和BMP7的生产于2016年在欧洲停止。
技术问题
本发明提出的待解决的问题是提出可以用于治疗与骨密度的降低有关的疾病和/或用于治疗骨缺陷或骨折的外科手术方法的二糖型化合物。
特别地，本发明提出的待解决的另一个问题是提出为诱导骨生成的(也就是说它们能够诱导导致骨形成的生物学机制的级联)的二糖型化合物。
本发明的另一个目的是提出如上述的允许骨的较快再生的化合物。
本发明的另一个目的是提出如上述的防止骨的异位形成(也就是说骨的形成而不是另外的组织的形成)的化合物。
本发明的另一个目的是提出允许治疗骨缺损的试剂盒。
发明内容
本发明涉及药物组合物，其在特征上包含：作为活性成分的至少一种式(I)的化合物和这些化合物的可药用盐：
其中R1选自H、SO3 -，R2选自H和COCH3，R3选自H、COCH3、苄基、SO3 -，除了其中R1＝SO3 -且R2＝COCH3且R3＝H的式(I)的化合物和该化合物的钠盐之外，以及除了其中R1＝R3＝H且R2＝COCH3的式(I)的化合物之外；以及至少一种可药用赋形剂。
已证明这样的组合物容易增加成骨前细胞和人成骨细胞的钙产量。文献WO2009098400描述了具有下式的化合物：
在该文献中，将上述组合物用作杀虫剂。该文献还表明，上述化合物由于其抑制已知参与变态反应和哮喘的机理的壳多糖酶的活性而可以用作药物。
由C.Dussouy等撰写并在Chemistry a European journal(DOI：10.1002/chem.201200887)中发表的标题为“Strong aphicidal activity of GlcNAc(β->4)Glcdisaccharides：synthesis，physiological effects and chitinase inhibition”的出版物描述了本发明的某些化合物的合成以及当其与允许喂饲昆虫的食品组合物混合时其作为杀虫剂的用途。这些化合物中的一些具有抑制壳多糖酶的活性，但不是全部。
具体实施方式
关于可药用盐，其可以为钠盐、锂盐或钾盐，例如上述化合物的钠盐、锂盐或钾盐。
因此，本发明的药物组合物可以包含至少一种可药用盐，所述盐彼此独立地选自钠盐、钾盐和锂盐。
优选地，所述组合物包含一种钠盐或数种钠盐。
有利地，本发明的组合物包含仅一种或更多种钠盐作为活性成分。
有利地，本发明的组合物呈液体形式。因此，其可以被注射或用于浸渍支持物。
根据本发明，赋形剂没有限制，其可以选自蒸馏水、可注射的氯化钠水溶液，特别是包含9g/L的氯化钠的水溶液。
本发明的药物组合物可以通过注射、皮下、静脉内、通过注入骨中、经口、黏膜，特别是舌下或经鼻施用。特别地，其可以通过直接注入骨缺损中来使用。
根据一个特定实施方案，本发明的药物组合物包含其中R1＝H，R2＝H且R3＝COCH3的所述式(I)的化合物和其中R1＝H，R2＝COCH3且R3＝H的式(I)的第二化合物的混合物作为活性成分。发明人已证明由于第二化合物的溶剂化期间的重排而出现了第一上述化合物。
有利地，该混合物按重量计包含2/3的其中R3＝H的上述式I的化合物和1/3的第二化合物。
无论本发明的药物组合物的实施方案如何，本发明的药物组合物还可以包含能够被注入患者的体内并且能够在患者的体内固化的磷酸钙牙骨质，特别是在患者的骨或骨缺损中或者在低密度的骨区域中。
因此，可以通过将本发明的组合物注入骨缺损中以填充该缺损并且递送本发明的化合物，这将诱导骨的形成。
本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含：可在对象的体内植入的生物相容性支持物；和至少一种具有下式(I)的化合物和这些化合物的可药用盐：
其中R1选自H、SO3 -，R2选自H和COCH3，R3选自H、COCH3、苄基、SO3 -。
发明人确实证明了本发明的化合物能够诱导在支持物上产生骨量。
生物相容性支持物有利地为能够替代骨和/或传导骨生成的材料(也就是说能够覆盖有骨材料(骨))的支持物。
上述化合物还可以呈其赋形剂为例如可注射的氯化钠溶液的液体药物组合物的形式。根据本发明，所述生物相容性支持物有利地选自：多孔生物相容性支持物，特别是包含可生物降解聚合物，特别是PLA、聚乙醇酸、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、胶原蛋白、聚乙交酯、壳聚糖、聚己内酯或由可生物降解聚合物，特别是PLA、聚乙醇酸、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、胶原蛋白、聚乙交酯、壳聚糖、聚己内酯组成的支持物；包含陶瓷或由陶瓷组成的支持物；包含磷酸钙或由磷酸钙组成的支持物；包含骨的矿物质部分或者由骨的矿物质部分组成的支持物。
有利地，生物相容性支持物包含胶原蛋白或者由胶原蛋白组成。
支持物可以覆盖有根据本发明的至少一种化合物或者浸渍或覆盖有参照本发明的试剂盒包含以上所限定的化合物的药物组合物。
本发明还涉及具有下式(I)的化合物和这些化合物的可药用盐：
其中：
a)R1＝R3＝H且R2＝COCH3
b)R1＝SO3 -；R3＝H；R2＝COCH3
c)R1＝R2＝R3＝H
d)R1＝SO3 -：R2＝R3＝H
e)R1＝R2＝H且R3＝COCH3，
其单独或者以两者或更多者的组合用于在与骨密度的降低有关的病理，特别是骨质疏松症、骨质减少、骨软化症、成骨不全、糖尿病性骨痂形成、骨硬化病、骨佩吉特病(Paget′s disease ofbone)、骨肿瘤、癌性骨肿瘤方面的治疗中的用途；或者其单独或者以两者或更多者的组合用于在治疗骨缺损或骨折，特别是病理性骨折的外科手术方法中的用途。这些化合物可以与生物相容性支持物组合使用以形成本发明的试剂盒的特定实施方案。根据一个特定实施方案，上述a)和e)中所限定的化合物以组合用于治疗上述病理或者用于如上所述的外科手术方法。
本发明还涉及具有下式(I)的化合物：
其中R1＝R2＝H以及R3＝COCH3
通常，如由式(I)中的波浪线所示，式(I)的化合物的丙氧基取代基在α或β位置。在适用于本发明的所有实施方案的本发明的一个优选实施方案中，如下所示，式(I)的化合物的丙氧基取代基在α位置。
定义
在本发明的含义内，与骨密度的降低有关的疾病或病理指定骨密度的至少局部地降低作为症状而产生的病理性状态以及由骨密度的降低引起的病理性状态，例如骨折。骨肿瘤并且特别地癌性骨肿瘤导致骨脆性，这可以通过本发明的化合物来治疗。
病理性骨折被定义为由骨密度的降低导致的骨折。
根据本发明，骨缺损为在骨材料中具有缺陷的骨的区域；其可以为骨材料中的孔或者其中骨材料不太致密的区域。
在本发明的含义内，骨材料涵盖经固化的结缔组织或者正在固化的结缔组织。
术语“治疗”包括预防性治疗和治愈性治疗。
术语“活性成分”表示相关的活性化合物以足以获得药物效果的量存在。
附图说明
-图1表示在存在30μM的每种参照化合物DP2SNA、DP2NA、DP2K和DP2S的情况下在将这些细胞暴露于4mM的Pi(Pi＝磷酸肌醇3-激酶)(对照+Pi)和4mM的Pi 9天之后MC3T3-E1培养基中的钙剂量(以每孔μg/mg蛋白质计)；
-图2表示通过分别用二糖DP2和这些二糖的钠盐DP2NA对MC3T3-E1细胞进行处理而在D＝25时获得的相对于单独的矿化培养基的钙离子浓度的％增加；
-图3表示通过在存在15μM、30μM和50μM的DP2和DP2NA的情况下在矿化条件下对HOb细胞进行处理而在D＝14时获得的相对于单独的矿化培养基的钙离子浓度的百分比增加；
-图4表示通过在存在5μM、7.5μM、10μM、15μM、30μM和50μM的DP2和DP2NA的情况下在矿化条件下对HOb细胞进行处理而在D＝14时获得的相对于单独的矿化培养基的钙离子浓度的百分比增加；
-图5表示在存在5μM、7.5μM、10μM、15μM、30μM和50μM的DP2的情况下在矿化条件下对平滑肌细胞进行处理而在DP2的存在下由平滑肌细胞产生的钙的量(以μg计)；
-图6表示在存在30μM的DP2R0和100ng/ml的BMP-2或其混合物的情况下下在矿化条件下处理14天之后获得的HOb细胞的矿化百分比；
-图7表示在(7A)30μM的DP2R2和(7B)30μM的DP2R2或DP2’以及(7C)以95％纯度标记的DP2R2(DP2M9530μM)的情况下在矿化条件下处理14天的HOb细胞上获得的矿化百分比；
-图8表示针对以下获得的在MC3T3-E1和HOb细胞中的碱性磷酸酶的酶活性(U/L/ug的蛋白质)：(8A)与100ng/ml的BMP-2相比，在存在或不存在15μM、80μM和50μM的DP2R0的情况下在D＝13天时的MO3T3-E1细胞，(8B)与100ng/ml的BMP-2和BMP-7相比，在存在或不存在30μM的DP2R0的情况下通过矿化培养基在D＝7天时的HOb细胞，(8C)与100ng/ml的BMP-2和BMP-7相比，在存在或不存在30μM的DP2R2的情况下通过矿化培养基进行处理的在D＝7时的HOb细胞；
-图9表示利用MTT测试(9A)以及利用WST-1测试(9B)在D＝14时在30μM下对HOb细胞进行的DP2细胞毒性测试的结果。
实验部分
本发明的化合物的化学合成
所述化合物的合成如由C.Dussouy等撰写并在Chemistry a European journal(DOI：10.1002/chem.201200887)中发表的出版物“Strong aphicidal activity ofGIcNAc(β->4)Glc disaccharides：synthesis，physiological effects and chitinaseinhibition”中所描述的。
化合物DP2’的合成
从在将化合物DP2溶解在水中时形成的DP2-DP2’混合物中提取化合物DP2’。化合物DP2′已通过用水作为洗脱溶剂的制备型HPLC色谱法而分离。
发明人已观察到，当化合物DP2’在水中时，还存在乙酸根基团的离域，但是与DP2→DP2’反应相比具有非常慢的动力学。因此，保持静置的DP2’在水中的溶液在44天之后包含10％至15％的DP2。因此，DP2’单独保留在水中持续相当长的给定持续时间。因此，可以在水中测试溶液中DP2’的生物学效果。
类似地，发明人已观察到，DP2→DP2’反应的动力学使得还可以在提取所形成的化合物DP2’之后测试化合物DP2单独的生物活性。因此，两种化合物DP2和DP2’可以在水中共存或不共存给定的持续时间。
此外，在其他溶剂例如甲醇中，尚未观察到乙酸根基团的离域。因此，例如在甲醇中，化合物DP2是单独的。
所使用的参照物
以下参照物：DP2、DP2R0、DP2R2、DP2K对应于具有下式1的化合物正丙基，2-0-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖苷，4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)：
术语R0、R2和K是指DP2分子的生产批次。
参照物DP2’对应于具有下式1’的化合物正丙基，3-0-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖苷，4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)：
参照物DP2S对应于其中R1＝SO3 -且R2＝Ac的式(I)的化合物，例如正丙基，2-0-乙酰基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖苷，4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)，一钠盐。
参照物DP2NA对应于具有下式3的化合物正丙基，α-D-吡喃葡萄糖苷,4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)：
参照物DP2SNA对应于具有下式4的化合物正丙基,6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖苷，4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)，一钠盐：
体外实验
细胞培养
对于所有实验，均使用小鼠成骨前细胞系(MC3T3-E1，ATCC)和人初级成骨细胞(HOb，Promocell)。将小鼠成骨前细胞在容纳有包含10％胎牛血清(fetal calf serum，FCS)、1％青霉素/链霉素抗生素和1％谷氨酰胺的15mLα-MEM培养基(M4526，SIGMA)的75cm2烧瓶中培养。类似地，将人HOb细胞在容纳有15mL增殖培养基(人成骨细胞增殖培养基，PromoCell)的75cm2烧瓶中培养。将细胞保持在37℃的具有5％CO2和90％湿度的烘箱中。每三天更换培养基。
将MC3T3-E1细胞以63,700个细胞/孔接种在待处理的6孔板中以提取RNA或者用于碱性磷酸酶酶活性测定以及以5250个细胞/孔接种在48孔板中用于钙测定。将HOb细胞以182,000个细胞/孔接种在6孔板中用于RNA的提取或者用于碱性磷酸酶酶活性测定；以15,000个细胞/孔接种在48孔板中用于钙测定；以10,000个细胞/孔接种在48孔板中用于MTT测试或WST-1测试；以及以100,000个细胞/孔接种在6孔板中用于蛋白质提取或者用于荧光。
细胞处理
为了诱导矿化，用其中添加有10mMβ-甘油磷酸酯和50μg/mL抗坏血酸的包含5％FCS的α-MEM培养基对MC3T3-E1细胞进行处理。用“成骨细胞矿化培养基”(Promocell)对HOb细胞进行处理。根据条件，以不同的浓度添加DP2NA、DP2R0、DP2R2、DP2’、BMP-2或BMP-7。在过滤之后，用各自的培养基(48孔板的每孔500μL和6孔板的每孔2mL)对细胞进行处理。
本发明的化合物的促钙化活性
已研究了小鼠成骨前细胞(MC3T3-E1)的培养基中钙的释放。结果示于图1中：它们清楚地表明，与显著地抑制钙的表达的DP2S不同，3种DP2(DP2SNA；DP2NA；DP2K)具有增加MC3T3-E1细胞的钙产量的能力。
遵循这些结果，研究了关于用DP2NA和DP2R0处理25天的MC3T3-E1的促钙化活性。在存在15μM(40±2％)、30μM(28±18％)和50μM(40±28％)的DP2R0以及15μM(15±14％)、30μM(33±12％)和50μM(10±19％)的DP2NA的情况下，相对于矿化培养基，观察到钙化的增加(图2)。
还研究了关于人成骨细胞(HOb，PromoCell，Heidelberg，Germany)的钙化。它们是从股骨小梁骨组织中分离的。在矿化培养基(PromoCell)中进行14天处理之后，关于原代HOb细胞，在存在15μM(26±10％)、30μM(40±15％)的DP2以及30μM(44±7％)和50μM(35±8％)的DP2NA的情况下，相对于矿化条件，观察到钙化的显著增加(参见图3)。在存在50μM(8±17％)的DP2和15μM(45±42％)的DP2NA的情况下观察到增加，但由于标准偏差，增加不显著。
在用更低浓度(5μM、7.5μM和10μM)的DP2R0和DP2NA对HOb细胞进行处理之后，相对于单独的矿化培养基，观察到HOb细胞的矿化的减少(图4)。这表明低浓度的DP2对矿化不具有作用，并因此表明在一定距离下，与已在BMP的情况下描述的内容相反，在DP2的存在下将不存在异位骨的发育。
此外，图5中所示的结果表明，在非钙化对照条件中，DP2的存在对平滑肌细胞不具有促钙化作用。因此，这强化了DP2将不会诱导关于除成骨细胞之外的细胞的任何钙化的假设。
基于这些结果，通过选择DP2R0作为感兴趣的分子继续进行研究。图6中所示的结果表明，DP2R030μM和BMP-2100ng/ml分别使矿化增加181.573±9.155％和214.153±37.938％。这表明DP2R030μM具有与文献中所限定的浓度(100ng/ml)的BMP-2相同的数量级的活性。还研究了DP2和BMP-2对关于人成骨细胞的钙化的协同作用。图6中可见的结果表明，DP2R0和BMP-2(152,950±16，176％)似乎对人成骨细胞不具有协同作用。
服务提供商Roowin提供了被称为DP2R2的DP2分子(第二批生产)，因此以上所使用的名称DP2R0用于指定由LG2A实验室(UPJV，Amiens)生产的DP2。研究了该分子的促钙化活性并且结果示于下图7A中(DP2R2：15903±18719％)。
DP2R2水溶液的化学分析表明，化合物DP2R2(DP2)与水反应以得到化合物DP2’。对于1/3的DP2’，存在约2/3的DP2R2。化合物DP2’来自3OH位置上的乙酸根基团(R2)的迁移。化合物DP2’可以如先前所示进行分离和合成。当将化合物DP2’与水混合时，没有观察到导致形成DP2R2的逆反应，并且仅化合物DP2′存在于溶液中。还研究了该分子的促钙化活性，结果(图7B)表明30μM的DP2’似乎具有与30μM的DP2R2相同的数量级的活性(分别为143.806±36.657％和137.012±52.452％)。
为了研究我们的分子的细胞渗透的假设，将DP2R2偶联至荧光团：荧光素。因此，还测试了促钙化活性并且结果示于图7C中。对于DP2R230μM，矿化率为204.472％，以及对于以95％纯度标记的DP2R2(DP2M9530μM)，矿化率为260.479％。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)酶活性测定
ALP为由成骨细胞合成的酶。其使通过释放羟基和磷酸根来抑制矿化的磷酸酯水解。成骨细胞产生基质囊泡(碱性磷酸酶和离子的储存器)，基质囊泡在释放到细胞外培养基中时将通过促进钙离子和磷酸根的局部浓度来启动类骨质组织的矿化。对于MC3T3-E1，将细胞以63700个细胞/孔接种在6孔板中，以及对于HOb，将细胞以182000个细胞/孔接种在6孔板中。在使用BioVision碱性磷酸酶活性比色测定试剂盒(ALP测定缓冲液，pNPP片剂，碱性磷酸酶，终止溶液)对MC3T3-Et细胞处理13天以及对HOb细胞处理7天之后，对48孔板进行测定。
在PBS冲洗之后，向孔中添加50μl ALP测定缓冲液，刮去孔的底部，然后取50μl。进行以13000G离心3分钟以除去不溶性材料。在96孔板中，将10μl的各待测试样品与70μl ALP测定缓冲液和50μl的5mM pNPP溶液一起放置。同时，通过放置在相同的96孔板中来准备校准范围。将反应在25℃下避光孵育60分钟。通过添加20μl终止溶液使反应停止。在405nm处测量光密度。
在ALP酶活性测定之后，进行蛋白质测定以根据蛋白质的数量使ALP测定的结果归一化。为了测定蛋白质，使用用来自thermofisher的PierceTM BCA蛋白质测定试剂盒的比色法。在5mL管中，准备来自2mg/mL白蛋白溶液的标准范围。在96孔板中，分配5μL标准范围和待测试样品。然后向孔中添加200μL试剂盒试剂。将反应在56℃下孵育15分钟。在565nm处测量光密度以确定蛋白质的量。
碱性磷酸酶是在骨形成方面起到至关重要的作用的酶。在成骨细胞分化期间，成骨细胞的碱性磷酸酶的表达随时间而逐渐增加。
为此，研究了关于MC3T3-E1和HOb细胞的碱性磷酸酶活性。
在对MC3T3-E1进行13天后处理之后，相对于单独的矿化培养基(100％)，在存在15μM的DP2R0(118.907±10.466％)和30μM的DP2R0(148.833±15.761％)的情况下，酶活性稍微增加。在存在100ng/ml的BMP-2(307.645±30.440％：图8A)的情况下，这种增加更为显著。
更显著地，在对HOb进行7天后处理之后，相对于单独的矿化培养基(100％)，在存在30μM的DP2R0(210.494±14.979％)和100ng/ml的BMP-2(262.567±46.207％)的情况下，酶活性显著增加。与对于骨钙化观察到的结果类似，结果表明DP2和BMP-2似乎对人成骨细胞不具有协同作用(图8B)。
还确定了相对于单独的矿化培养基(100％)在存在DP2R230μM(149.749％)的情况下的ALP酶活性(图8C)。
细胞毒性测试
MTT测试
为了研究DP2的毒性，利用MTT测试(3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑)确定细胞生存力。将HOb细胞接种在48孔板(10,000个细胞每个孔)中，两天之后，用DP230μM对细胞进行处理并在D2、D4、D7和D14后处理之后进行MTT测试。
在将细胞用无苯酚红的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)洗涤之后，向每个孔中添加250μl经稀释的MTT溶液并用5％CO2将板在37℃下孵育1小时。甲中减少的MTT的量与活细胞成比例。将紫色甲/>晶体溶解在220μl DMSO中并在搅拌以使着色均匀化之后，测量在560nm处的吸光度(Envision，PerkinElmer)。通过比较对照组与实验组之间的细胞生存力来评估细胞毒性。
WST-1测试
还通过另一种细胞生存力测试WST-1(四唑盐)研究了DP2的毒性。将HOb细胞接种在48孔板(10,000个细胞每个孔)中，两天之后，用DP230μM对细胞进行处理并在D2、D4、D7和D14后处理之后进行WST-1测试。
在处理结束时，向每个孔中添加100μl经稀释的WST-1溶液(Roche Diagnostics)并用5％CO2将板在37℃下孵育1小时。细胞增殖诱导线粒体脱氢酶的活性的增加，这将四唑盐裂解成甲/>通过测量染料在450nm处的吸光度(Envision，PerkinElmer)来定量甲染料的量。结果表示为与未经处理的对照条件相比的生存力的百分比。
在确定我们的分子是否改变成骨细胞的存活之前，通过MTT和WST-1测试在HOb细胞上测试其细胞毒性。将细胞用30μM的DP2以及培养基(Ctrl)或矿化培养基(Min)处理2天、4天、7天和14天(D)。
如图9所示，对于4次测试在不同处理条件之间没有观察到显著差异。在D14之后观察到由于成骨细胞凋亡而引起的细胞生存力的降低，这与诱导的钙化有关。这些结果表明30μM的DP2对HOb细胞不具有毒性。
体内实验
动物
动物饲养和实验步骤已根据欧盟指令(2010/63/EU)进行并经来自皮卡第儒勒-凡尔纳大学(University ofPicardy Jules Verne，UPJV)的伦理委员会(CREMEAP，CEEA N°96；APAFIS#15464-2018060810566765v2)验证。
Sprague-Dawley大鼠由Janvier Labs(Le Genest-Saint-Isle，法国)提供并被安置在UPJV的PLATAN动物设施中。将大鼠在22±2℃的温度和50％的湿度下保持12小时昼夜循环。所有大鼠均具有获得水和食物颗粒的自由，并监控大鼠的重量变化。
研究的设计
为了经由加速骨重建现象来评估二糖的骨诱导能力并且为了确定最佳DP2分子的浓度以及在骨折固结手术的生理条件下最适合的支持物的性质(炎症反应，细胞活性)，在大鼠的颅骨中制作了2个骨缺损。
测试三种不同类型的支持物和两种不同浓度的DP2。为此，将102只8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠分成12个实验组，例如：
-支持物1：生物活性磷酸钙骨替代物(MBCP：Biomaltante，Vigneux-de-Bretagne，法国)
ο第1组(S1L1)：仅MBCP支持物
ο第2组(S1L2)：MBCP支持物+DP2[3mM]
ο第3组(S1L3)：MBCP支持物+DP2[9mM]
ο第4组(S1L4)：MBCP支持物+BMP-2
-支持物2：由牛来源的骨的矿物质部分组成的骨替代物(Bio-oss；Roissy-en-France；法国)
ο第5组(S2L5)：仅Bio-oss支持物
ο第6组(S2L6)：Bio-oss支持物+DP2[3mM]
ο第7组(S2L7)：Bio-oss支持物+DP2[9mM]
ο第8组(S2L8)：Bio-oss支持物+BMP-2
-支持物3：牛跟腱的I型胶原蛋白(Sigma)
ο第9组(S3L9)：仅胶原蛋白支持物
ο第10组(S3L10)：胶原蛋白支持物+DP2[3mM]
ο第11组(S3L11)：胶原蛋白支持物+DP2[9mM]
ο第12组(S3L12)：胶原蛋白支持物+BMP-2
为了减少所使用的大鼠的数量，每只大鼠制作两个骨缺损；将一个缺损留为空白并且用作每只大鼠的内部对照。因此，仅支持物的组被认为是实验的对照。将DP2和BMP-2在无菌盐水溶液中稀释，然后与支持物混合并放置在颅缺陷中。对于仅支持物的条件，将后者与无菌盐水溶液混合。
外科手术
在被分配到以上示出的12个组之一之后，在面罩中使用IsoVet(异氟烷)将大鼠麻醉(诱导剂量为5％以及维持剂量为2％至3％)。在5分钟之后，通过捏动物的爪子或尾巴来进行伤害测试以检查麻醉的有效性。在工作站上，然后在切口旁边进行剃毛和用贝塔定的消毒。
还用7mg/kg的稀释至5mg/ml的2％利多卡因(20mg/mL)进行局部麻醉。
在工作站上，进行用15刀刃冷手术刀沿中线切开皮肤，然后将皮下组织分离。然后，沿中线切开并进行骨膜的提升和侧向移位。利用毛刺，通过间隔尽可能地大并且在不接触上矢状窦的情况下，在矢状缝合线的每侧以5mm直径进行两处颅损伤。在铣削步骤期间使用盐水溶液。根据组，在左侧进行支持物的植入；使用没有支持物的右侧作为对照以评估在不存在支持物的情况下损伤的影响和自然修复过程。将骨膜放回原位并用7/0皮肤缝合线缝合。将皮肤也放回原位并用4/0皮肤缝合线闭合。
用作为镇痛剂的剂量为0.05mg/kg的丁丙诺啡对大鼠进行皮下注射。在苏醒之后，通过每个笼子放1只大鼠将大鼠放回其常规的饲养条件。每天对动物进行监督，并进行动物福利监测。
所有动物在研究的持续时间内均存活而没有并发症。在3个月之后，缺损部位不存在感染、血肿或坏死的临床体征。这表明DP2不具有任何体内毒性作用。此外，所有大鼠均在骨重建中表现出同质性，这通过计算已用作每只大鼠的内部对照的所有空孔中获得的值来评估。在D14与D63之间观察到骨修复的显著增加(峰值)；然后存在不太显著的增加，例如从D63开始的平稳期。对于3种支持物获得的结果总结在下表1中。
[表1]
(＝：无差异，N/A：不适用，*p≤0.05，**p≤0.01，***：p≤0.001)
表1中的结果表明由外科手术后D29，2个MBCP+DP2组相对于单独的MBCP增加了骨矿化。3个Bio-oss组相对于单独的Bio-oss不具有任何作用，这也在兔的颅缺损的模型中观察到(Leventis等，2018)。这可以通过由支持物释放的问题来说明。在D14之后，仅胶原蛋白+DP2[3mM]组增加了骨矿化。
有趣的是，注意到MBCP+BMP-2组随时间而形成异位骨，这似乎与如BMP-2的不利影响观察到的结果类似。此外，胶原蛋白+BMP-2组不在旧骨与新形成的骨之间形成连续的骨修复，这不是用化合物DP2的情况。

Claims (9)

1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：作为活性成分的至少一种式(I)的化合物和这些化合物的可药用盐：
其中R1选自H、SO3 -，R2选自H和COCH3，R3选自H、COCH3、苄基、SO3 -，除了其中R1＝SO3 -且R2＝COCH3且R3＝H的所述式(I)的化合物和该化合物的钠盐之外，以及除了其中R1＝R3＝H且R2＝COCH3的所述式(I)的化合物之外；以及至少一种可药用赋形剂。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含至少一种可药用盐，以及其特征在于，所述盐彼此独立地选自钠盐、钾盐和锂盐。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述赋形剂选自氯化钠的可注射溶液。
4.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含其中R1＝H，R2＝H且R3＝COCH3的所述式(I)的化合物和其中R1＝H，R2＝COCH3且R3＝H的所述式(I)的化合物的混合物作为活性成分。
5.一种试剂盒，包含：能够在对象的体内植入的生物相容性支持物；和至少一种具有下式(I)的化合物和这些化合物的可药用盐：
其中R1选自H、SO3 -，R2选自H和COCH3，R3选自H、COCH3、苄基、SO3 -。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述生物相容性支持物选自：多孔生物相容性支持物，特别是包含可生物降解聚合物，特别是PLA、聚乙醇酸、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、胶原蛋白、聚乙交酯、壳聚糖、聚己内酯或由可生物降解聚合物，特别是PLA、聚乙醇酸、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、胶原蛋白、聚乙交酯、壳聚糖、聚己内酯组成的支持物；包含陶瓷或由陶瓷组成的支持物；包含磷酸钙或由磷酸钙组成的支持物；包含骨的矿物质部分或由骨的矿物质部分组成的支持物。
7.一种具有下式(I)的化合物和这些化合物的可药用盐：
其中：
a)R1＝R3＝H目R2＝COCH3
b)R1＝SO3 -；R3＝H；R2＝COCH3
c)R1＝R2＝R3＝H
d)R1＝SO3 -；R2＝R3＝H
e)R1＝R2＝H且R3＝COCH3，
其单独或者以两种或更多种的组合用于在骨密度的至少局部降低作为症状而产生的病症，特别是骨质疏松症、骨质减少、骨软化症、成骨不全、糖尿病性骨痂形成、骨硬化病、骨佩吉特病、骨肿瘤、癌性骨肿瘤方面的治疗中的用途；或者其单独或者以两种或更多种的组合用于在治疗骨缺损或用于治疗骨折，特别是病理性骨折的外科手术方法中的用途，所述骨缺损被定义为在骨材料中具有缺陷的骨区域。
8.根据权利要求7所述的化合物，用于根据权利要求7中的其用途，其特征在于，以组合使用a)和e)中限定的化合物。
9.一种具有下式(I)的化合物：
其中R1＝R2＝H且R3＝COCH3。
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