CN116731325A - 一种靶向抗肿瘤细胞和肿瘤干细胞的纳米载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种靶向抗肿瘤细胞和肿瘤干细胞的纳米载体及其制备方法和应用。本发明提供了一种两亲性嵌段共聚物,通过酰胺键连接具有双硫键的聚姜黄素和透明质酸形成两亲性嵌段共聚物,该两亲性嵌段共聚物具有更高的姜黄素载量,姜黄素的含量能够达到25%;同时酰胺键的存在使其作为载体时在生理环境中更稳定,可减少靶头在未到达肿瘤靶点前的脱落。本发明的两亲性嵌段共聚物作为载体负载化疗药物,能够同时靶向乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞,负载药物后在细胞水平和动物体内均可靶向乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞,并发挥抗乳腺癌效果,可作为抗肿瘤的新的纳米载体,为抗肿瘤治疗提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种靶向抗肿瘤细胞和肿瘤干细胞的纳米载体及其制备方法和应用。
背景技术
手术治疗、放疗、化疗以及这三种方法相互结合的治疗是目前临床乳腺癌治疗的主要手段。临床上乳腺癌治疗方法的不断更新完善,给乳腺癌患者带来新的希望,同时也延长了患者的生存时间。但是,乳腺癌的复发和现存方法存在的缺陷(化疗药物的耐药性、全身毒副作用等)依然是临床急需解决的问题。近年来大量的研究表明,乳腺癌干细胞与乳腺癌的复发、耐药与转移存在着密切的关系。乳腺癌干细胞是乳腺癌中存在的一小部分细胞,通过不断自我更新和分化来维持乳腺肿瘤的生长和发展(Zhang,Y.,et al.,Theeradication of breast cancer and cancer stem cells using octreotide modifiedpaclitaxel active targeting micelles and salinomycin passive targetingmicelles.Biomaterials,2012.33(2):p.679-91.)。目前临床使用的大部分化疗药物对乳腺癌干细胞无效,在化疗之后存活下来的干细胞,经过一段时间的休眠后,通过自我更新和分化形成新的肿瘤,导致乳腺癌的复发和转移。因此,药物治疗乳腺癌时,同时杀死乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞显得至关重要。
利用纳米载体制备的纳米药物在肿瘤的靶向治疗中有许多优势,比如提高疏水药物的水溶性、提高药物的生物利用度、提高组织或者细胞靶向性等等,但是也存在着不能有效地控制药物从载体中释放、释药不够完全、靶向效果不理想、不能同时靶向肿瘤细胞和肿瘤干细胞等问题;载体材料也存在着在体内无法降解、载药量较低等问题;比如中国发明专利公开了一种聚姜黄素与透明质酸以酯键嵌合的两亲性嵌段共聚物作为纳米载体,该共聚物载体增加了姜黄素的水溶性,提高了载药量和稳定性,但是该共聚物载体姜黄素的载药量仍然有限,该共聚物载体采用DCC/DMAP为缩合剂,通过姜黄素的酚羟基与透明质酸上支链的羧基进行链接形成酯键,然而这种连接方法的接枝率一般不太高,姜黄素的含量只占到1.3%左右(Manju S,Sreenivasan K.Conjugation of curcumin onto hyaluronicacid enhances its aqueous solubility and stability[J].Journal of colloid andinterface science,2011,359(1):318-325.),姜黄素的载量较低。因此十分有必要研究出新的姜黄素高载量、同时实现肿瘤细胞和肿瘤干细胞的靶向治疗的载体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中肿瘤治疗的不足,提供一种靶向抗肿瘤细胞和肿瘤干细胞的纳米载体及其制备方法和应用。
本发明的目的在于提供一种两亲性嵌段共聚物,所述两亲性嵌段共聚物可作为一种靶向抗肿瘤细胞和肿瘤干细胞的纳米载体。
本发明的目的在于提供所述两亲性嵌段共聚物的制备方法。
本发明的目的在于提供所述两亲性嵌段共聚物在制备靶向抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的药物中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现:
本发明提供了一种两亲性嵌段共聚物,该两亲性嵌段共聚物以具有双硫键的聚姜黄素(PCDA)作为纳米载体的疏水端,以能够同时与肿瘤细胞和肿瘤干细胞表面过度表达的CD44受体特异性结合的透明质酸(HA)作为亲水端和靶头,通过酰胺键连接PCDA和HA形成两亲性嵌段共聚物(HA-b-PCDA),该两亲性嵌段共聚物作为纳米载体负载药物可以高效的靶向肿瘤细胞和肿瘤干细胞,实现药物在靶细胞内的智能快速释放,从而杀死肿瘤细胞和肿瘤干细胞。该两亲性嵌段共聚物可以高效接枝姜黄素,提高姜黄素载量;同时,该两亲性嵌段共聚物中酰胺键的存在使得其作为载体时在生理环境中更稳定,可减少靶头在未到达肿瘤靶点前的脱落。
一种两亲性嵌段共聚物(HA-b-PCDA),以具有双硫键的聚姜黄素(PCDA)作为疏水端,以透明质酸(HA)作为亲水端和靶头,具有双硫键的聚姜黄素通过酰胺键与透明质酸连接形成两亲性嵌段共聚物(HA-b-PCDA),所述具有双硫键的聚姜黄素(PCDA)的结构式如式(I)所示:
所示两亲性嵌段共聚物的结构式如式(II)所示:
一种两亲性嵌段共聚物的制备方法,包括以下步骤:
S1.具有双硫键的聚姜黄素(PCDA)的制备
将姜黄素、3,3’-二硫二丙酸、N-N-二环已基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)与无水二氯甲烷混合,室温下充分反应;过滤,滤液以无水乙醚结晶,晶体纯化、干燥后即得具有双硫键的聚姜黄素(PCDA);所述具有双硫键的聚姜黄素为橙黄色粉末;
优选地,步骤S1所述姜黄素:3,3’-二硫二丙酸质量比为1~1.2:0.5~0.6。
进一步优选地,步骤S1所述姜黄素:3,3’-二硫二丙酸质量比为1.008:0.572。
S2.氨基功能化透明质酸的制备
将透明质酸(HA)与pH5~6的缓冲液混合后再与1,4-丁二胺混合,50~55℃下充分反应;然后添加氰基硼氢化钠,50~55℃下充分反应,反应结束后,将反应物透析,干燥即得氨基功能化透明质酸;所述氨基功能化透明质酸为乳白色固体;
优选地,步骤S2所述缓冲液为pH5.6的2wt%乙酸缓冲液。
优选地,步骤S2所述充分反应为50~55℃下搅拌20~24h。
进一步优选地,步骤S2所述充分反应为50℃下磁力搅拌24h。
优选地,步骤S2所述添加氰基硼氢化钠并充分反应的步骤,分3次进行。
优选地,步骤S2所述透析是在去离子水中透析70~72h。
优选地,步骤S2所述透析是在去离子水中透析72h。
S3.聚姜黄素琥珀酰亚胺酯(PCDA-NHS)的制备
将步骤S1制备的具有双硫键的聚姜黄素(PCDA)的二氯甲烷溶液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)混合,室温下充分反应,然后用无水乙醚0~10℃下结晶反应产物,将结晶的固体干燥即得聚姜黄素琥珀酰亚胺酯(PCDA-NHS);所述PCDA-NHS为橙黄色胶状固体。
优选地,步骤S3所述二氯甲烷为无水二氯甲烷。
优选地,步骤S3所述充分反应是室温下搅拌20~22h。
进一步优选地,步骤S3所述充分反应是室温下搅拌20h。
优选地,步骤S3所述具有双硫键的聚姜黄素(PCDA):N-羟基琥珀酰亚胺(NHS):1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的质量比为0.5~0.6:0.1~0.2:0.2~0.3。
进一步优选地,步骤S3所述具有双硫键的聚姜黄素(PCDA):N-羟基琥珀酰亚胺(NHS):1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的质量比为0.506:0.134:0.234。
优选地,步骤S3所述结晶的温度为3~6℃。
进一步优选地,步骤S3所述结晶的温度为4℃。
优选地,步骤S3所述结晶的时间为10~12h。
进一步优选地,步骤S3所述结晶的时间为12h。
S4.两亲性嵌段纳米载体(HA-b-PCDA)的制备
将步骤S2制备的氨基功能化透明质酸和步骤S3制备的聚姜黄素琥珀酰亚胺酯(PCDA-NHS)与二甲亚砜(DMSO)混合,然后再与N,N-二异丙基乙胺混合,在45~55℃下充分反应。将反应溶液透析,干燥即得两亲性嵌段共聚物(HA-b-PCDA);所述HA-b-PCDA为橙色粉末。
优选地,步骤S4所述充分反应为45~55℃下搅拌46~48h。
优选地,步骤S4所述充分反应为50℃油浴下搅拌48h。
优选地,步骤S4所述氨基功能化透明质酸:聚姜黄素琥珀酰亚胺酯:N,N-二异丙基乙胺的质量体积比为0.2~0.8g:0.3~0.4g:15~20μL。
进一步优选地,步骤S4所述氨基功能化透明质酸:聚姜黄素琥珀酰亚胺酯:N,N-二异丙基乙胺的质量体积比为0.280g:0.352g:20μL。
优选地,所述透析以去离子水透析70~72h。
进一步优选地,所述透析以去离子水透析72h,每12h更换一次去离子水。
利用上述制备方法制备得到的两亲性嵌段共聚物也在本发明的保护范围之内。
所述两亲性嵌段共聚物在制备靶向抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地,所述两亲性嵌段共聚物作为纳米载体在制备抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的纳米药物中的应用。
优选地,所述肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞为表面表达CD44受体的肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞。
进一步优选地,所述肿瘤为乳腺癌、胰腺癌、唾液腺癌肿瘤、胃癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌或白血病中的一种或多种。
进一步优选地,所述肿瘤为乳腺癌。
一种靶向抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的药物,以所述两亲性嵌段共聚物制备得到。
一种靶向抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞药物的制备方法,将所述两亲性嵌段共聚物(HA-b-PCDA)的二甲亚砜(DMSO)溶液与水混合,或两亲性嵌段共聚物(HA-b-PCDA)和抗肿瘤药物的二甲亚砜(DMSO)溶液与水混合,混合液透析,即得药物。
优选地,所述药物以低毒的二甲亚砜作为有机溶剂,安全性更高,通过简单的混合及透析即可制备纳米药物,制备工艺简单。
优选地,所述水为超纯水。
优选地,所述两亲性嵌段共聚物:抗肿瘤药物质量比为1~2:0.1~0.2。
进一步优选地,所述两亲性嵌段共聚物:抗肿瘤药物质量比为1:0.1。
优选地,所述抗肿瘤药物为阿霉素或多西紫杉醇。
相比现有技术,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种两亲性嵌段共聚物,所述两亲性嵌段共聚物通过酰胺键将聚姜黄素和透明质酸连接,该两亲性嵌段共聚物可作为载体负载化疗药物,同时能够靶向乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞,负载药物后在细胞水平和动物体内均可靶向乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞,并发挥抗乳腺癌效果,可作为抗肿瘤药物新的载体;同时,该两亲性嵌段共聚物具有更高的姜黄素载量,姜黄素的含量能够达到25%;同时酰胺键的存在使两亲性嵌段共聚物作为载体时在生理环境中更稳定,可减少靶头在未到达肿瘤靶点前的脱落,为抗肿瘤的治疗提供了新的药物选择。
附图说明
图1为本发明实施例1HA-b-PCDA的合成路线图。
图2为本发明实施例1合成的HA-b-PCDA的核磁共振氢谱。
图3为本发明纳米粒靶向乳腺癌细胞的结果;其中A为荧光显微镜下4T1细胞对DOX/HA-b-PCDA NPs和游离DOX的摄取情况,标尺为100μm;B为荧光显微镜下293T细胞(B)对DOX/HA-b-PCDA NPs和游离DOX的摄取情况,标尺为100μm;C为共聚焦显微镜下DOX/HA-b-PCDA NPs在4T1细胞中的胞内分布,红色表示阿霉素荧光,蓝色为DAPI染细胞核,绿色为Lysosome(溶酶体)染绿色,Overlay为三个通道的叠加,表明细胞核、溶酶体和阿霉素共定位情况,标尺为20μm;D为与DOX溶液或DOX/HA-b-PCDA NPs溶液孵育后,4T1细胞和293T细胞中DOX的平均荧光强度,“*”组,与4T1组相比,p<0.01;E为与DOX溶液或DOX/HA-b-PCDA NPs溶液孵育后,在4T1细胞中DOX的平均荧光强度,“*”,p<0.01,与HA溶液预孵育组比较;DOX代表游离DOX处理;NPs代表DOX/HA-b-PCDA NPs处理;HA+NPs代表游离HA预孵育过的NPs处理;HA+DOX代表游离HA预孵育过的游离DOX处理;Overlay为DAPI(细胞核染成蓝色)和DOX(阿霉素红色)图片的叠加,表示DAPI和DOX的共定位情况。
图4为本发明纳米粒靶向乳腺癌干细胞的结果;其中,A为富含乳腺癌干细胞的4T1乳腺球细胞摄取DOX/HA-b-PCDA NPs和游离DOX荧光显微镜观察结果,标尺为100μm;B为DOX/HA-b-PCDA NPs在富含乳腺癌干细胞的4T1乳球细胞中的胞内分布的共聚焦显微镜观察结果,红色表示阿霉素荧光,蓝色为DAPI染细胞核,绿色为Lysosome(溶酶体)染绿色,Overlay为三个通道的叠加,表明细胞核、溶酶体和阿霉素共定位情况,标尺为20μm;DOX代表游离DOX处理、NPs代表DOX/HA-b-PCDA NPs处理、HA+NPs代表游离HA预孵育过的NPs处理、HA+DOX代表游离HA预孵育过的游离DOX处理、Overlay即DAPI(细胞核染成蓝色)和DOX(阿霉素红色)图片的叠加,表示DAPI和DOX的共定位情况。
图5为本发明纳米粒对细胞活力影响的结果;其中A为乳腺癌细胞株4T1细胞、B为正常细胞株293T细胞;C为4T1乳腺癌干细胞。
图6为本发明纳米粒对已有的富含乳腺癌干细胞的4T1乳腺球的破坏效果;a为空白对照组(未加任何药物处理),b为阿霉素处理组,c为DOX/HA-b-PCDA NPs处理组。
图7为本发明纳米粒对富含乳腺癌干细胞的4T1乳腺球再形成的影响结果;a为空白对照组(未加任何药物处理),b为阿霉素处理组,c为DOX/HA-b-PCDA NPs处理组。
图8为本发明纳米粒对富含乳腺癌干细胞的4T1乳腺球中ALDH1+细胞的影响结果,a为空白对照组(未加任何药物处理),b为阿霉素处理组,c为HA-b-PCDA NPs处理组,d为DOX/HA-b-PCDA NPs处理组;TEST表示测试样品,DEAB表示阴性对照样品。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
RPMI 1640培养基(货号:11835-030,批号:1951096,Life TechnologiesCorporation,500mL);
DMEM/F12+GlutaMAXTM培养基(货号:10565-018,批号:2277125,LifeTechnologies Corporation,500mL);
AldefluorTM fluorescent试剂(货号:01700,批号:18E91436,STEMCELLTechnologies);
PBS缓冲液:含135mM NaCl,4.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM NaH2PO4,pH值为7.3±0.1;
干细胞培养基:10mL B27(1:50,Invitrogen)+10μg EGF(20ng/mL)+5μgbFGF(10ng/mL)+2g 0.4%BSA(牛血清白蛋白)+2.5mg胰岛素(5μg/mL)+500mL DMEM/F12(1:1)。
本发明所述纳米粒即利用HA-b-PCDA制备的纳米形式的药物,或利用HA-b-PCDA和抗肿瘤药物制备的纳米形式的药物。
实施例1 HA-b-PCDA的制备和鉴定
1.具有双硫键的聚姜黄素(PCDA)的制备
称取姜黄素(Cur)1.008g(2.736mmol)、3,3’-二硫二丙酸0.572g(4.827mmol),N-N-二环已基碳二亚胺(DCC)1.008g(4.893mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.121g(0.9904mmol)溶于40mL无水二氯甲烷,在室温下搅拌反应24h,真空抽滤,得到橙黄色浊液,在滤液中加入600mL无水乙醚以析晶,真空抽滤后用少量无水乙醚洗涤沉淀,真空干燥,得到橙黄色粉末0.603g(0.0754mmol),即PCDA。
2.氨基功能化透明质酸的制备
透明质酸(HA)与1,4-二氨基丁烷以氰基硼氢化钠(NaCNBH3)为还原剂进行未端还原胺化反应。
将1g HA(5.6kDa,0.18mmol)溶于30mL乙酸缓冲液(pH=5.6,2wt%)中。然后在磁搅拌下向HA溶液中加入1mL 1,4二氨基丁烷(11.4mmol)。50℃搅拌24小时,HA与1,4-二氨基丁烷反应得到亚胺混合物。随后,在搅拌下,每天向混合物中加入0.2g氰基硼氢化钠(3.2mmol),连续三天。混合物通过透析袋(Spectra/Por,MWCO3500)以去离子水透析纯化72小时,以去除多余的1,4-二氨基丁烷和氰基硼氢化钠。收集最终产物并冻干,得到乳白色固体1.569g(0.0785mmo l)即氨基功能化透明质酸。
3.聚姜黄素琥珀酰亚胺酯(PCDA-NHS)
将1制备的PCDA称取0.506g(0.0633mmol)溶于40mL无水二氯甲烷,加入0.234g(1.22mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.134g(1.164mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),在室温下搅拌20h,得到橙红色溶液,在反应液中加入40mL的无水乙醚。于冰箱上层4℃中析晶12h,抽滤后将沉淀于真空中干燥至恒重,得到橙黄色胶状固体0.301g(0.01501mmol)即PCDA-NHS。
4.HA-b-PCDA的制备
称取2制备的氨基功能化透明质酸0.352g(0.0176mmol)和3制备的PCDA-NHS0.280g(0.0187mmol)溶解于20mL DMSO中,再加入20μl的N-N-二异丙基乙胺,在50℃油浴下搅拌48h,反应结束后将溶液装入以去离子水为透析液的透析袋(MWCO=8000-14000)中透析72h,每12h更换一次去离子水,收集透析袋中的溶液,进行冻干干燥后可得橙色粉末,即为HA-b-PCDA。
HA-b-PCDA的合成路线图如图1所示。
5.HA-b-PCDA的鉴定
对制备得到的HA-b-PCDA进行鉴定,HA-b-PCDA的核磁共振氢谱如图2所示。从图2可知,HA-b-PCDA的核磁结果解析如下:
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.85(d,J=10.6Hz,1H,-OHC=CH),8.06(s,1H,-NHCO-),8.00(s,1H,-NHCO-),7.59–7.51(m,2H,-CHCHC-),7.31(s,4H,-OCCHC-),7.16(s,H,-OCCHC-),6.83(s,H,-CCHCH-),6.78(s,3H,-C=CHCH-),6.16(d,J=7.0Hz,2H,2nH,-CH=CH-),6.10(s,2H,-CH=CH-),4.31–4.34(d,4H,-OCH2CH2-,OHCH2CH2-),3.83(t,6H,-OCH3),3.85–3.82(m,16H,HOCHCHHO,),3.19(s,2H,SSCH2CO),3.10-3.00(m,4H,-CH2CH2S-),2.89-2.91(d,2H,-CH2CH2S-),2.92(s,2H,-CH2CH2S-),2.64(s,2H,-CH2CH2S-),1.39-1.23(s,6H,–NOCCH3–),1.07(s,2H,OH),0.99(s,1H,OH).
HA-b-PCDA的结构式如式(II)所示:
实施例2 HA-b-PCDA中姜黄素含量的测定
取10mg实施例1制备的HA-b-PCDA溶于10mL超纯水中,待溶解完后,取1mL HA-b-PCDA的水溶液,用DMSO定容至10mL,作为样品溶液,此时样品浓度用C样品表示。取5mg姜黄素加DMSO溶解后,定容至10mL,作为对照溶液,此时对照溶液浓度用C对照表示。采用紫外分光光度计(U-2910,HITACHI,Japan),分别测定样品溶液和对照溶液在420nm的吸光度值A样品和A对照,根据如下公式求算样品溶液中姜黄素的浓度:
C样品=C对照×A对照/A样品
HA-b-PCDA中姜黄素含量(%)=C样品×100
采用本实施例的方法测得实施例1制备的HA-b-PCDA中姜黄素含量为25%。
对比例
参考专利CN105646861A的方法合成聚姜黄素和透明质酸(HA)通过酯键接枝的两亲性嵌段共聚物PCDA-HA。
0.9g聚姜黄素,9g透明质酸,400mg缩合剂DCC和36mg催化剂DMAP溶于40mL的无水DMSO中,室温下反应1天,过滤,加入适量的冷乙酸乙酯沉淀产物,反复沉淀3次,过滤,真空干燥,即得PCDA-HA。采用实施例2姜黄素含量测定的方法,测得PCDA-HA中姜黄素的含量为5%。
实施例3纳米粒的制备及纳米粒的表征
1.纳米粒的制备
1.1 HA-b-PCDA纳米粒(HA-b-PCDA NPs)
取2.5mg实施例1制备的HA-b-PCDA溶于0.5mL二甲亚砜(DMSO)中,边搅拌边滴加到5mL超纯水中,滴加完毕后,透析12h(截留分子量为3500),即得纳米粒溶液,冷冻干燥得纳米粒冻干粉。
1.2 DOX/HA-b-PCDA纳米粒(DOX/HA-b-PCDA NPs)
取2.5mg的HA-b-PCDA和0.25mg游离阿霉素(DOX)溶于0.5mL DMSO中,边搅拌边滴加到5mL超纯水中,滴加完毕后,透析12h(截留分子量为3500),即得纳米粒溶液,冷冻干燥得纳米粒冻干粉。
1.3 DTX/HA-b-PCDA纳米粒(DTX/HA-b-PCDA NPs)
取2.5mg的HA-b-PCDA和0.25mg多西紫杉醇(DTX)溶于0.5mL DMSO中,边搅拌边滴加到5mL超纯水中,滴加完毕后,透析12h(截留分子量为3500),即得纳米粒溶液,冷冻干燥得纳米粒冻干粉。
2.纳米粒的表征
采用动态激光光散射仪(DLS)分别测定各纳米粒的粒径大小、表面电荷。
实验结果表明:HA-b-PCDA NPs的粒径为170.8nm,电位为-43.5mv;DOX/HA-b-PCDANPs的粒径为175.1nm,电位为-36.1mv;DTX/HA-b-PCDA NPs的粒径为125.8nm,电位为-38.9mv;说明HA-b-PDCA载体可以负载多种临床使用化疗药物形成纳米药物。
实施例4纳米粒靶向乳腺癌细胞的效果评价
1.实验
以4T1乳腺癌细胞株和293T细胞株分别作为肿瘤细胞株和正常细胞株模型,采用显微镜观察和流式细胞仪测定,评价纳米粒靶向乳腺癌细胞的效果。
显微镜观察:细胞以5×105个/皿的密度接种于15mm的RPMI 1640为培养基的共聚焦培养皿,孵育过夜,然后将DOX/HA-b-PCDA NPs或游离DOX分别加入培养皿中与细胞孵育4h,孵育结束后,除去含药DOX的RPMI 1640培养基,PBS缓冲液洗涤三次,4%多聚甲醛固定,DAPI染核后,采用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。
流式细胞仪测定:细胞以5×104个/孔的密度接种于24孔板中,以RPMI 1640培养基孵育过夜,然后将DOX/HA-b-PCDA NPs或游离DOX分别加入培养皿中与细胞孵育4小时,孵育结束后,除去含药DOX的RPMI 1640培养基,PBS缓冲液洗涤三次,0.25%(wt/v%)胰酶消化后重悬于0.5mL的PBS缓冲液,然后采用流式细胞仪测定。
2.结果
显微镜观察和流式细胞仪测定的纳米粒靶向乳腺癌细胞的结果如图3所示。其中A为荧光显微镜观察4T1细胞对DOX/HA-b-PCDA NPs和游离DOX的摄取情况,标尺为100μm,;B为荧光显微镜观察293T细胞对DOX/HA-b-PCDA NPs和游离DOX的摄取情况,标尺为100μm;C为共聚焦显微镜观察DOX/HA-b-PCDA NPs在4T1细胞中的胞内分布,DAPI染色(蓝色)观察细胞核,溶酶体染色(绿色),红色表示阿霉素荧光,蓝色为DAPI染细胞核,绿色为Lysosome(溶酶体)染绿色,Overlay为三个通道的叠加,表明细胞核、溶酶体和阿霉素共定位情况,标尺为20μm;D为与DOX溶液或DOX/HA-b-PCDA NPs溶液孵育后,4T1细胞和293T细胞中DOX的平均荧光强度,“*”组,与4T1组相比,p<0.01;E为与DOX溶液或DOX/HA-b-PCDA NPs溶液孵育后,在4T1细胞中DOX的平均荧光强度,“*”,与HA溶液预孵育组比较,p<0.01;DOX代表游离DOX处理、NPs代表DOX/HA-b-PCDA NPs处理、HA+NPs代表游离HA预孵育过的NPs处理、HA+DOX代表游离HA预孵育过的游离DOX处理、Overlay即DAPI(细胞核染成蓝色)和DOX(阿霉素红色)图片的叠加,表示DAPI和DOX的共定位情况。
从图3中A,B可以看出DOX/HA-b-PCDA NPs处理4h后,4T1细胞(肿瘤细胞株)胞内红色荧光明显强于293T细胞(正常细胞),而游离DOX处理组,4T1细胞胞内红色荧光较293T细胞弱;D可以看出DOX/HA-b-PCDA NPs处理组,4T1细胞(肿瘤细胞株)平均荧光强度明显强于293T细胞(正常细胞),而游离DOX处理组,4T1细胞胞内平均荧光强度较293T细胞弱;这些结果表明:与游离DOX相比,DOX/HA-b-PCDA NPs在4T1癌细胞中比非癌性293T细胞具有更高的细胞摄取选择性,DOX/HA-b-PCDA NPs能够显著提高DOX靶向肿瘤细胞的效果。
从图3中C可以看出DOX/HA-b-PCDA NPs与细胞溶酶体特异性定位,说明DOX/HA-b-PCDA NPs通过内吞作用进入细胞。从图3A,3B,3E可以看出:对于游离DOX处理组,经过量游离HA处理或不经过量游离HA处理的细胞之间的荧光强度无显著差异;而DOX/HA-b-PCDANPs处理组中,经过过量游离HA预处理的4T1细胞的荧光强度较未经过过量游离HA预处理的细胞明显降低,结果表明:DOX/HA-b-PCDA NPs对CD44过表达的乳腺癌细胞具有高选择性,DOX/HA-b-PCDA NPs可以通过CD44受体介导的内吞实现进入细胞。
综上可知,DOX/HA-b-PCDA NPs可以通过CD44受体介导的内吞实现进入细胞,且能够显著提高DOX靶向肿瘤细胞的效果。
实施例5纳米粒靶向乳腺癌干细胞的效果评价
1.实验
采用悬浮培养法获的4T1乳腺癌干细胞作为乳腺癌干细胞模型,采用显微镜观察和流式细胞仪测定,评价纳米粒靶向乳乳腺癌干细胞效果。
显微镜观察:细胞以5×105个/皿的密度接种于15mm的含有干细胞培养基的共聚焦培养皿,孵育过夜,将DOX/HA-b-PCDA NPs或游离DOX分别加入培养皿中与细胞孵育4小时,孵育结束后,除去含药DOX干细胞培养基,PBS缓冲液洗涤三次,4%多聚甲醛固定,DAPI染核后,采用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。
流式细胞仪测定:细胞以5×104个/孔的密度接种于24孔板中,以干细胞培养基孵育过夜,将DOX/HA-b-PCDA NPs或游离DOX分别加入培养皿中与细胞孵育4小时,孵育结束后,除去含药DOX干细胞培养基,PBS缓冲液洗涤三次,0.25%(wt/v%)胰酶消化后重悬于0.5mL的PBS缓冲液,然后采用流式细胞仪测定。
2.结果
显微镜观察和流式细胞仪测定的纳米粒靶向乳腺癌干细胞的结果如图4所示。图4中A为富含乳腺癌干细胞的4T1乳腺球细胞摄取DOX/HA-b-PCDA NPs和游离DOX荧光显微镜观察结果,标尺为100μm;B为DOX/HA-b-PCDA NPs在富含乳腺癌干细胞的4T1乳球细胞中的胞内分布的共聚焦显微镜观察结果,红色表示阿霉素荧光,蓝色为DAPI染细胞核,绿色为Lysosome(溶酶体)染绿色,Overlay为三个通道的叠加,表明细胞核、溶酶体和阿霉素共定位情况,标尺为20μm;DOX代表游离DOX处理、NPs代表DOX/HA-b-PCDA NPs处理、HA+NPs代表游离HA预孵育过的NPs处理、HA+DOX代表游离HA预孵育过的游离DOX处理。
从图4中A、B可以看出,DOX/HA-b-PCDA NPs处理组,4T1乳腺癌癌干细胞具有非常强的红色荧光信号(A),部分红色荧光信号与溶酶体的绿色信号共定位(图4中B),说明DOX/HA-b-PCDA NPs通过内吞的方式进入4T1乳腺癌癌干细胞;而在游离DOX处理组中,4T1乳腺癌癌干细胞中有轻微的红色荧光信号,表明DOX/HA-b-PCDA NPs可以提高DOX靶向4T1乳腺癌癌干细胞的效果。在DOX/HA-b-PCDA NPs处理组,当细胞与游离HA预孵育阻断CD44受体时,红色荧光信号明显下降(HA+NPs与NPs相比),但在游离DOX处理组中,游离HA预孵育的细胞与未预孵育的细胞之间,红色荧光信号无显著差异(HA+DOX与DOX相比)。
综上可知,DOX/HA-b-PCDA NPs能够显著提高DOX靶向4T1乳腺癌干细胞的效果。
实施例6纳米粒抗乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞的效果评价
1.实验
1.1利用MTT法评价纳米粒抗乳腺癌细胞的效果
将4T1乳腺癌细胞、293T正常细胞,分别以5000个/孔的密度接种于96孔板,以RPMI1640培养基孵育过夜。然后将不同浓度的DOX/HA-b-PCDA NPs或游离DOX分别加入孔板中,然后孵育72h。孵育结束后,采用MTT法测定各组细胞活力。
1.2利用CCK-8法评价纳米粒抗乳腺癌干细胞的效果
将悬浮培养法获得的4T1乳腺癌干细胞,以5000个/孔的密度接种于96孔板,以干细胞培养基孵育过夜。然后将不同浓度的DOX/HA-b-PCDA NPs或游离DOX分别加入孔板中,然后孵育72h。孵育结束后,采用CCK-8法测定各组细胞活力。
1.3通过纳米粒对乳腺癌干细胞球的破坏实验评价纳米粒抗乳腺癌干细胞的效果
将4T1乳腺癌干细胞球在干细胞培养基中分别与5μg/mL DOX/HA-b-PCDA NPs和游离DOX孵育10天,使用倒置显微镜(IX81,Olympus,Japan)拍摄4T1乳腺癌干细胞球的形貌。
1.4通过纳米粒阻止4T1乳腺癌干细胞球再形成实验评价抗乳腺癌干细胞的效果
将4T1乳腺癌干细胞球分散形成单个细胞后,以每孔2×105个细胞的密度接种到超低附着的6孔板中,并在干细胞培养基中培养;然后将DOX/HA-b-PCDA NPs或游离DOX以DOX浓度为5μg/mL每孔加入孔板中,与4T1乳腺癌干细胞孵育5天。孵育结束后,利用显微镜对形成的乳腺球拍照观察。
1.5流式细胞仪测定ALDH1+细胞比例评价抗乳腺癌干细胞效果
将4T1乳腺癌干细胞在干细胞培养基中接种到超低附着24孔板中,孵育24h后,更换含DOX/HA-b-PCDA NPs或游离DOX的干细胞培养基,继续孵育48h。孵育结束后,采用AldefluorTM fluorescent试剂染细胞,再采用流式细胞仪分析每组细胞中ALDH1+细胞比例。
2.结果
纳米粒对乳腺癌细胞株4T1细胞、正常细胞株293T细胞和4T1乳腺癌干细胞的细胞活力影响分别如图5的A、B、C所示;纳米粒对已有的富含乳腺癌干细胞的4T1乳腺球的破坏如图6所示,其中a为空白对照组(未加任何药物处理),b为阿霉素处理组,c为DOX/HA-b-PCDA NPs处理组;纳米粒对富含乳腺癌干细胞的4T1乳腺球再形成的影响如图7所示,其中a为空白对照组(未加任何药物处理),b为阿霉素处理组,c为DOX/HA-b-PCDA NPs处理组;纳米粒对富含乳腺癌干细胞的4T1乳腺球中ALDH1+细胞的影响如图8所示,其中a为空白对照组(未加任何药物处理),b为阿霉素处理组,c为HA-b-PCDA NPs处理组,d为DOX/HA-b-PCDANPs处理组;TEST表示测试样品,DEAB表示阴性对照样品。
从图5中的A和B可以看出DOX/HA-b-PCDA NPs对4T1细胞(肿瘤细胞)的抑制作用大于对293T cells(正常细胞)的抑制作用,而游离DOX刚好相反,这些结果表明:DOX/HA-b-PCDA NPs能够显著增加DOX抗肿瘤细胞的效果,而降低DOX对正常细胞的毒性。
从图5中的C可以看出,游离DOX对4T1乳腺癌干细胞的IC50值显著大于对4T1乳腺癌细胞的IC50值,表明:4T1乳腺癌干细胞对DOX产生了明显的耐药;此外,DOX/HA-b-PCDA NPs抗4T1乳腺癌干细胞的效果显著强于游离DOX。
从图6可以看出治疗10天后,4T1乳腺癌干细胞球在PBS处理组和游离DOX处理组中未被明显破坏,但在DOX/HA-b-PCDA NPs组中被明显破坏;这些结果表明DOX/HA-b-PCDANPs具有清除乳腺癌干细胞球的能力。
从图7可以看出PBS或游离DOX处理组,乳腺癌干细胞球明显较大,而DOX/HA-b-PCDA NPs处理组,没有形成明显的乳腺癌干细胞球;这些结果表明DOX/HA-b-PCDA NPs可以显著抑制乳腺癌干细胞再成球。
从图8可以看出HA-b-PCDA和DOX/HA-b-PCDA NPs处理组ALDH1+细胞的比例分别从31.9%(阴性对照组)显著降低至9.98%和12.30%。相比之下,游离DOX处理组ALDH1+细胞的比例却明显增加;这些结果表明,HA-b-PCDA是一种具清除乳腺癌干细胞作用的载体。
综上可知,HA-b-PCDA能够显著增加DOX抗肿瘤细胞、抗4T1乳腺癌干细胞的效果;同时具有清除乳腺癌干细胞球、显著抑制乳腺癌干细胞再成球的能力;HA-b-PCDA是一种具清除乳腺癌干细胞作用的载体。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种两亲性嵌段共聚物,其特征在于,所述两亲性嵌段共聚物为具有双硫键的聚姜黄素通过酰胺键与透明质酸连接,所述具有双硫键的聚姜黄素的结构式如式(I)所示:
2.根据权利要求1所述两亲性嵌段共聚物,其特征在于,所述两亲性嵌段共聚物的结构式如式(II)所示:
3.一种两亲性嵌段共聚物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.具有双硫键的聚姜黄素的制备
将姜黄素、3,3’-二硫二丙酸、N-N-二环已基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶与无水二氯甲烷混合,室温下充分反应,过滤,滤液以无水乙醚结晶,晶体纯化、干燥后即得具有双硫键的聚姜黄素;
S2.氨基功能化透明质酸的制备
将透明质酸与pH5~6的缓冲液混合后再与1,4-丁二胺混合,50~55℃下充分反应;然后添加氰基硼氢化钠,50~55℃下充分反应;反应结束后,将反应物透析,干燥即得氨基功能化透明质酸;
S3.聚姜黄素琥珀酰亚胺酯的制备
将步骤S1制备的具有双硫键的聚姜黄素的二氯甲烷溶液、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐混合,室温下充分反应,然后用无水乙醚0~10℃下结晶反应产物,将结晶的固体干燥即得聚姜黄素琥珀酰亚胺酯;
S4.两亲性嵌段共聚物的制备
将步骤S2制备的氨基功能化透明质酸和步骤S3制备的聚姜黄素琥珀酰亚胺酯与二甲亚砜混合,然后再与N,N-二异丙基乙胺混合,在45~55℃下充分反应;将反应溶液透析,干燥即得两亲性嵌段共聚物。
4.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,所述步骤S2中缓冲液为pH5.6的2wt%乙酸缓冲液。
5.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,所述步骤S3中具有双硫键的聚姜黄素:N-羟基琥珀酰亚胺:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为0.5~0.6:0.1~0.2:0.2~0.3;步骤S4中氨基功能化透明质酸:聚姜黄素琥珀酰亚胺酯:N,N-二异丙基乙胺的质量体积比为0.2~0.8g:0.3~0.4g:15~20μL。
6.利用权利要求3~5任一所述制备方法制备得到的两亲性嵌段共聚物。
7.权利要求1或2或权利要求6所述两亲性嵌段共聚物在制备靶向抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述应用,其特征在于,所述肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞为表面表达CD44受体的肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞。
9.一种靶向抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的药物,其特征在于,以权利要求1或2或权利要求6所述两亲性嵌段共聚物制备得到。
10.一种靶向抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞药物的制备方法,其特征在于,将权利要求1或2或权利要求6所述两亲性嵌段共聚物的二甲亚砜溶液与水混合,或将权利要求1或2或权利要求6所述两亲性嵌段共聚物和抗肿瘤药物的二甲亚砜溶液与水混合,混合液透析,即得药物。
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