CN116731170A - 一种全人源抗人Ang2抗体及其用途 - Google Patents

一种全人源抗人Ang2抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种全人源抗人Ang2抗体及其用途，所述抗人Ang2抗体能够特异性地结合人Ang2蛋白，可以用于治疗与Ang2激活和/或过量表达相关的疾病。

Description

一种全人源抗人Ang2抗体及其用途
技术领域
本发明属于抗体药物领域，具体涉及一种全人源抗人Ang2抗体及其应用。
背景技术
血管生成是从现有的血管中形成新的血管的生物学过程。通常，血管生成是在促血管生成因子和抗血管生成因子的严格调控下，但在某些疾病情况下会发生异常的血管生成。这些疾病包括但不限于肿瘤、增殖性视网膜病变或年龄相关的黄斑性变性、类风湿性关节炎和慢性炎症等疾病。因此，涉及血管生成的因素已经成为开发用于肿瘤、增殖性视网膜病变等疾病治疗的重要靶标。
Ang-2(血管生成素-2)是Tie2受体的拮抗性配体(antagonistic ligand)，存在于血管内皮细胞中，通过与Ang-1(血管生成素-1)竞争结合Tie2来抑制Tie2信号通路的转导。Ang-1为Tie2的激动性配体，在维持血管稳定中，发挥着重要作用。在病理状态如炎症状态下，血管内皮细胞被激活，Ang2表达增加进而与Tie2结合增加，从而促进了新血管的形成，有效的抗Ang2治疗可能对众多的患者带来治疗益处。
因此，Ang-2己成为开发血管生成抑制剂的重要靶点，满足临床上的治疗需求的新型、特异性的抗Ang2抗体仍亟待开发。
发明内容
基于此，本申请的发明人进行了大量的实验，利用酵母展示文库筛选特异性结合人Ang2的全人源抗体，从而提供一种新型的治疗性抗人Ang2抗体。
因此，本发明提供了一种结合人Ang2的抗体或其抗原结合片段；提供了编码所述结合人Ang2的抗体或其抗原结合片段的核酸分子；提供了包含所述核酸分子的表达载体；提供了包含所述表达载体的细胞；提供所述结合人Ang2的抗体或其抗原结合片段的制备方法；提供了包含所述结合人Ang2的抗体或其抗原结合片段的药物组合物；提供了所述结合人Ang2的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途。
为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
本发明一方面提供一种与人Ang2结合的抗体或其抗原结合片段，包含：
重链可变区，其包含SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36所示的重链CDR1，SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42所示的重链CDR2，SEQ ID NO：47、SEQID NO：48、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50所示的重链CDR3；和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的轻链CDR1，SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的轻链CDR2，SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的轻链CDR3。
本发明中，术语“抗体”以最广泛意义使用且涵盖各种抗体结构，包括完整抗体及其任何抗原结合片段，其是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在被称为框架区(FR)的更加保守的区域中。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。VH和VL含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的成分。术语“可变区”(也称“可变结构域”)通常是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域，这些结构域通常是抗体中最可变的部分并且含有抗原结合位点。然而，可变性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中，它集中在VH和VL中的三个区段，所述三个区段被称为高变区(HVR)或被称为互补决定区(CDR)，分别为LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。可变结构域中更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区：H-FRI，H-FR2，H-FR3，H-FR4，L-FR1，L-FR2，L-FR3，L-FR4，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDR结构环区连接。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点。本发明的抗体是指与人Ang2特异性结合的抗Ang2抗体，包括与人Ang2特异性结合的完整抗体形式，及与人Ang2结合的抗原结合片段。在本发明中，“抗人Ang2抗体”、“特异性结合人Ang2蛋白的抗体”、“特异性结合人Ang2的抗体”、“抗人Ang2单克隆抗体”、“与人Ang2结合的抗体”可互换使用，其在靶向人Ang2方面可用作诊断剂和/或治疗剂。
本发明中，术语“特异性结合”通常是指可测量且可再现的相互作用。例如抗原和抗体之间的结合，抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。例如，特异性结合靶物(其可以是表位)的抗体是以比其结合其它靶物更高的亲和力、亲合力、更容易和/或以更长的持续时间结合此靶物的抗体。当抗体相比于其将结合随机的、不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该抗原。
本发明中，术语“表位”是指可与其特异性结合的蛋白决定簇。表位通常是由一组化学活性表面分子(例如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷性质。构象表位与非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在的情况下，与前者的结合丢失，而与后者的结合并没有丢失。
本发明中，术语“单克隆抗体”通常是指从一类基本均一的群体获得的抗体，即除少数可能存在的天然发生的突变外，该群体中包含的单个抗体是相同的。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。
本发明中，术语“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”)是指保留与人Ang2特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。本发明的抗原结合片段包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段。在本发明中，术语“Fab“通常是指由VH、VL、CL和CH1结构域组成的单价片段。术语Fab’通常是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab的片段。术语“F(ab’)2”通常是指Fab’的二聚体，包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段。术语“Fv”通常是指由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段。术语“scFv“通常是指VH和VL通过连接子(linker)连接配对形成的单价分子，此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-连接子-VH-COOH或NH2-VH-连接子-VL-COOH。这些抗体片段可用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。
在本领域中，可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则、基于结构环区域位置的Chothia定义规则和基于IMGT本体论(IMGT-ONTOLOGY)的概念。本发明中，所述抗人Ang2抗体的VL和VH的氨基酸序列按Chothia编码规则进行编码，所述抗人Ang2抗体的轻链CDR1-3和重链CDR1-3按Chothia定义。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO：34所示的重链CDR1、SEQ ID NO：40所示的重链CDR2和SEQ ID NO：47所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：8所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：14所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：20所示的轻链CDR3；
(b)重链可变区，其包含SEQ ID NO：35所示的重链CDR1、SEQ ID NO：41所示的重链CDR2和SEQ ID NO：48所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：9所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：15所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：21所示的轻链CDR3；
(c)重链可变区，其包含SEQ ID NO：36所示的重链CDR1、SEQ ID NO：42所示的重链CDR2和SEQ ID NO：49所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：10所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：16所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：22所示的轻链CDR3；或
(d)重链可变区，其包含SEQ ID NO：36所示的重链CDR1、SEQ ID NO：42所示的重链CDR2和SEQ ID NO：50所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：11所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：14所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：23所示的轻链CDR3。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含SEQ IDNO：34所示的重链CDR1、SEQ ID NO：40所示的重链CDR2和SEQ ID NO：47所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：8所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：14所示的轻链CDR2和SEQ IDNO：20所示的轻链CDR3。例如，该抗体或其抗原结合片段可包含与Ab1910AN1相同的重链CDR1-3和轻链CDR1-3序列。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含SEQ IDNO：35所示的重链CDR1、SEQ ID NO：41所示的重链CDR2和SEQ ID NO：48所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：9所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：15所示的轻链CDR2和SEQ IDNO：21所示的轻链CDR3。例如，该抗体或其抗原结合片段可包含与Ab1910AN2相同的重链CDR1-3和轻链CDR1-3序列。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含SEQ IDNO：36所示的重链CDR1、SEQ ID NO：42所示的重链CDR2和SEQ ID NO：49所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：10所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：16所示的轻链CDR2和SEQID NO：22所示的轻链CDR3。例如，该抗体或其抗原结合片段可包含与Ab1910AN7相同的重链CDR1-3和轻链CDR1-3序列。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含SEQ IDNO：36所示的重链CDR1、SEQ ID NO：42所示的重链CDR2和SEQ ID NO：50所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：11所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：14所示的轻链CDR2和SEQID NO：23所示的轻链CDR3。例如，该抗体或其抗原结合片段可包含与Ab1910AN10相同的重链CDR1-3和轻链CDR1-3序列。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30所示的重链可变区。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的轻链可变区。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30所示的重链可变区；和SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3或SEQ ID NO：4所示的轻链可变区。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO：27所示的重链可变区和SEQ ID NO：1所示的轻链可变区；
(b)SEQ ID NO：28所示的重链可变区和SEQ ID NO：2所示的轻链可变区；
(c)SEQ ID NO：29所示的重链可变区和SEQ ID NO：3所示的轻链可变区；或
(d)SEQ ID NO：30所示的重链可变区和SEQ ID NO：4所示的轻链可变区。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：27所示的重链可变区和SEQ ID NO：1所示的轻链可变区。例如，该抗体可包含与Ab1910AN1相同的重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：28所示的重链可变区和SEQ ID NO：2所示的轻链可变区。例如，该抗体可包含与Ab1910AN2相同的重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：29所示的重链可变区和SEQ ID NO：3所示的轻链可变区。例如，该抗体可包含与Ab1910AN7相同的重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：30所示的重链可变区和SEQ ID NO：4所示的轻链可变区。例如，该抗体可包含与Ab1910AN10相同的重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方式中，所述抗体还包含重链恒定区，所述重链恒定区包含源自IgG的恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体还包含重链恒定区，所述重链恒定区为IgG1亚型。
在某些实施方式中，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：53所示。
在某些实施方式中，所述抗体还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区为K亚型。
在某些实施方式中，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：54所示。
在某些实施方式中，所述抗体还包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为IgG1亚型，所述轻链恒定区为K亚型。
在某些实施方式中，所述抗体还包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：53所示，和所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：54所示。
在某些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61所示的重链HC。
在某些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62所示的轻链LC。
在某些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61所示的重链HC，和包含SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ IDNO：62所示的轻链LC。
在在某些实施方式中，所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO：55所示的重链HC和SEQ ID NO：56所示的轻链LC；
(b)SEQ ID NO：57所示的重链HC和SEQ ID NO：58所示的轻链LC；
(c)SEQ ID NO：59所示的重链HC和SEQ ID NO：60所示的轻链LC；或
(d)SEQ ID NO：61所示的重链HC和SEQ ID NO：62所示的轻链LC。
在某些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO：55所示的重链HC和SEQ ID NO：56所示的轻链LC。例如，该抗体可被称为Ab1910AN1。
在某些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO：57所示的重链HC和SEQ ID NO：58所示的轻链LC。例如，该抗体可被称为Ab1910AN2。
在某些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO：59所示的重链HC和SEQ ID NO：60所示的轻链LC。例如，该抗体可被称为Ab1910AN7。
在某些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO：61所示的重链HC和SEQ ID NO：62所示的轻链LC。例如，该抗体可被称为Ab1910AN10。
在某些实施方式中，所述抗体为全人源抗体。
在本发明中，术语“全人源抗体”或“人抗体”通常是指抗体所有部分(包括抗体的可变区和恒定区)均由人类来源的基因所编码。全人源抗体可以大大减少异源抗体部分对人体造成的免疫副反应。本领域获得全人源抗体的方法可以有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术等。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包含Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段或scFv片段。
本发明所述的与人Ang2结合的抗体或其抗原结合片段在能够特异性地识别人Ang2的范围内可以包含本发明所述的抗人Ang2抗体序列以及其生物学等同物。例如，可以对抗体的氨基酸序列进行修饰，以进一步提高抗体的结合亲和力和/或其它生物学功能。此类修饰包括但不限于对抗体序列残基的缺失、插入和/或取代。这些氨基酸变化是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性(例如疏水性、亲水性、电荷、大小等)产生的。对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析表明，精氨酸、赖氨酸和组氨酸带正电荷；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可以被认为是生物学功能等同物。
在本发明的抗体或其抗原结合片段包含与所述抗体或其抗原结合片段具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。这种同源性可由本领域已知的方法进行序列比较和/或比对来确定。例如，序列比对算法BLAST或手动比对可以测定序列同一性或同源性。
另一方面，本发明提供一种核酸分子，其编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明中，术语“核酸”具有全面的含义，包括DNA和RNA，以及核苷酸，所述核苷酸是核酸中的基本结构单元，其不仅包括天然核苷酸、还包括具有经修饰的碱基位点的核苷酸。编码本发明所述抗体的重链和/或轻链可变区的核酸序列可被修饰，此类修饰包括核苷酸的添加、缺失或非保守或保守取代。
另一方面，本发明提供一种表达载体，其包含本发明所述的核酸分子。
本发明中，术语“载体”通常是指能够转运与它连接的另一个核酸分子，并在合适的宿主中自我复制的核酸分子。载体包括任何遗传元件，例如质粒、转座子、人工染色体、病毒等，其在与适当的控制元件组合时能够进行自我复制并且将基因序列转移到宿主或宿主之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体还可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
另一方面，本发明提供一种细胞，其包含本发明所述的表达载体。
本发明所述的“细胞”为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使本发明所述的表达载体稳定低地自行复制，且所携带的本发明所述的核酸分子可被有效表达即可。其中所述的细胞可包括原核表达细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。例如，动物细胞可以包括：CHO-S、CHO-K1和/或HEK-293细胞。将本发明所述的表达载体转化至本发明所述的宿主细胞中，即可得到重组表达转化体。其中，所述转化方法为本领域常规转化方法，例如，化学转化法、热激法或电转法。
另一方面，本发明提供一种制备所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包含以下步骤：培养本发明所述的细胞；以及从培养的细胞中回收本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明所述的宿主细胞的培养方法、所述抗体的分离和纯化方法为本领域常规方法，例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间培养本发明所述的细胞，并回收细胞表达的抗体或其抗原结合片段。本发明中涉及的与人Ang2结合的抗体或其抗原结合片段的制备方法包括：在表达条件下，培养本发明所述的宿主细胞，从而表达本发明所述的结合人Ang2的抗体或其抗原结合片段；分离和纯化所述的结合人Ang2的抗体或其抗原结合片段。利用上述方法，可将得到的结合人Ang2的抗体或其抗原结合片段纯化为基本均一的物质。
本发明的发明人对所得的与人Ang2结合的抗体或其抗原结合片段进行了检测实验，实验结果表明所述与人Ang2结合的抗体或其抗原结合片段能够与人Ang2特异性结合，具有较好的结合特异性和亲和力。
本发明中，术语“亲和力”通常是指抗体分子的一条重链与一条轻链所构成的一个抗原结合部位与一个相应抗原表位之间的结合强度，抗原抗体的亲和力取决于二者空间构型互补的程度。亲和力的大小一般可用抗体与其抗原之间的平衡解离常数KD来表示。在本发明中“KD”、“KD”或“KD”可互换使用，本发明中使用的“KD”是解离速率常数(kdis，也称为“解离率(off-rate)(koff)”或“kd”)与结合速率常数(kon，也称为“结合率(kon)”或“ka”)的比值。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知的，包括但不限于生物膜干涉技术(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面等离子共振(SPR)、荧光共振能量迁移(FRET)、免疫共沉淀(Co-IP)以及蛋白质芯片技术。如果在不同的条件(例如盐浓度、pH下测量)，则所测得的某种特定蛋白-蛋白相互作用的亲和力可不同。
另一方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的佐剂。
本发明所述的“药学上可接受的佐剂”包括但不限于表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂或缓冲液中的一种或其组合。其中，表面活性剂包括但不限于非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或吐温80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基或十八烷基肌氨酸等，其加入量应使结合人Ang2的抗体或其抗原结合片段的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂包括但不限于糖类，例如还原性糖或非还原性糖；氨基酸类，例如谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如三元醇、丙二醇或聚乙二醇；溶液稳定剂的加入量应使最后形成的制剂在本领域技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定的状态。等渗调节剂包括但不限于氯化钠、甘露醇或其组合。缓冲液包括但不限于Tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或其组合。
本发明所述的药物组合物以符合医疗实践的方式配制、给药和施用。例如，所述的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。此外，本发明所述的药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。
本发明所述的结合人Ang2的抗体或其抗原结合片段，可以与药学上可接受的载体一起组成药物组合物制剂，从而更稳定地发挥疗效，这些药物组合物制剂的形式可以保证本发明所述的结合人Ang2的抗体或其抗原结合片段的构象完整性，同时还保护所述抗体或其抗原结合片段的多官能团能防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。所述药物组合物制剂可为本领域常用的混悬、水针、冻干制剂等。例如，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年；对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。
另一方面，本发明所述的抗体或其抗原结合片段、所述的核酸分子、所述的表达载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物在制备治疗与Ang2激活和/或过量表达相关的疾病的药物中的用途。
在某些实施方式中，所述与Ang2激活和/或过量表达相关的疾病为眼病，例如早产儿视网膜病、角膜血管生成、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新生血管疾病和年龄相关性黄斑变性。
在某些实施方式中，所述与Ang2激活和/或过量表达相关的疾病为表达Ang2的肿瘤或癌症，以及不表达Ang2的肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤及其他肿瘤性癌。进一步地，本发明所述的抗体或其抗原结合片段可用于难治性或复发性癌症的治疗。
本发明所用的试剂和原料均市售可得。
本发明的抗人Ang2抗体能够特异性地结合人Ang2，不结合人Ang1，具有较好的结合特异性、热稳定性、亲水性和电荷异构体比例，且细胞活性实验中证明其具有中和Ang2蛋白的功能，产生了有益的效果。
附图说明
为了更清楚地描述本申请发明所涉及的特点和优势，下面对附图作简要说明如下：
图1scFv酵母展示文库构建方法示意图；
图2Fab酵母展示文库构建方法示意图；
图3Tie2报告基因实验。
具体实施方式
本发明的其他特征和优点通过下面的实施例将是显而易见的，该实施例不应理解为是限制性的。如本领域技术人员将认识到的，本发明的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本发明的精神和范围。
实施例1酵母展示文库构建与筛选
选用自建的单链噬菌体文库，针对生物素标记的人ANG-2(Acro，货号：AN2-H82E7，简称hANG-2biotin)进行两轮淘选，获得阳性富集。
以噬菌体两轮淘选后质粒为模板，设计引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增单链抗体(scFv)VH，VK基因片段，PCR扩增的scFv基因片段回收后与酵母展示质粒共转入酿酒酵母菌株EBY100(购自ATCC)，通过酿酒酵母的同源重组使scFv插入至酵母展示质粒中，进而实现在酵母细胞壁表面展示单链抗体，如图1所示，构建后文库编号JYYDL166。PCR扩增的VH、VK基因片段回收后与酵母展示质粒pJYY132-Y、pJYY132-X共转入酿酒酵母菌株EBY100，如图2所示，构建展示Fab形式抗体的酵母展示文库，文库编号为JYYDL167。
文库JYYDL166、JYYDL167电转后分别在100mL的SD-Tm培养基(Clontech，货号：630308)、SD-Trp-Leu培养基(Clontech，货号：630316)，30℃、225转/分钟培养过夜；各取1.0×108菌量重悬于20mL YPGP诱导培养基(2％半乳糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物，0.54％Na2HPO4，0.86％NaH2PO4·H2O)，20℃、225转/分钟培养24小时，置于4℃冰箱待用。
文库诱导后菌液，测定菌液的OD600，按1 OD为1.0×107细胞数计算，JYYDL166取4.0×107细胞，JYYDL167取2.0×107细胞按如下步骤进行流式染色分选：(1)用2mL1×PBSA(1×PBS+I％BSA)洗涤一次，3000转/分钟离心3分钟(以下离心均为此条件)弃上清；(2)每管与1000μL含10nM HumanANG2-Bio(Acro货号：AN2-H82E7)的1×PBSA，室温孵育30分钟；(3)离心去上清后，各加入5mL 1×PBSA重悬细胞，加入20μL磁珠混匀(miltenyi，货号：130-090-485)混匀孵育10分钟，每两分钟混匀一次；(4)离心弃上清，各加入5mL的1×PBSA重悬细胞，加入磁力柱(Quadro MACS Starting Kit)，JYYDL166、JYYDL167分别用SD-Trp、SD-Trp-Leu培养基洗脱，并收集阳性细胞群。阳性细胞经过再次培养、诱导后进行第二轮筛选：(1)各取3.0×107细胞，每管与200μL 1×PBSA的含100nM Cyno ANG2-Fc，室温孵育30分钟；(2)加入1mL 1×PBSA重悬细胞后离心去上清；(3)加入200μL 1×PBSA含Mouse Anti V5-FITC(Invitrogen货号：R963-25，1∶1000体积比稀释)、Mouse Anti Human IgG Fc-APC(Biolegend货号：409306，1∶400体积比稀释)，避光孵育20分钟；(4)加入1mL 1×PBSA离心去上清；(5)加入1mL 1×PBSA重悬细胞，进行流式分选，收集FITC、APC信号均强的细胞群体；(6)分选后细胞分别涂布于相应营养缺陷型平板，30℃静置培养3天。
实施例2单克隆酵母菌落鉴定与候选抗体表达
JYYDL166、JYYDL167第二轮筛选产物的单克隆平板，各挑取92个单克隆进行测序。最终JYYDL166文库获得55个独一的抗体序列，JYYDL167文库获得62个独一的抗体序列。对相应的酵母单克隆菌落进行流式染色分析，各取1×106个细胞按表1方案进行染色：方案1与hANG-2 biotin结合的强弱由PE平均荧光信号强度(MFI)反映，PE荧光强度越强，表面与hANG-2结合力越强，同理方案2反映了克隆与Mouse ANG-2的结合强弱；方案3反映了克隆与无关抗原的结合强弱，证明了单克隆的结合特异性；方案4使用再生元公司的抗ANG-2单抗Nesvacumab(内部自制)作为对照，进行竞争性流式染色，分析各克隆与对照抗体结合抗原的表位是否相同，APC的信号越强表示克隆与对照抗体结合抗原的表位不同，反之结合表位相同；方案5反映了克隆与人ANG-1的结合强弱，同理方案6反映了克隆与Cyno ANG-2的结合强弱，APC的信号越强表示结合越强。
表1单克隆酵母菌落流式染色鉴定方案
酵母单克隆菌落流式染色分析结果如表2所示，根据各克隆的染色结果，挑选方案1、2、6中信号强的克隆，去除方案3、4、5中信号强的克隆。最终从JYYDL0166文库中获得Y86E5、Y87F1和Y87D1抗体序列；从JYYDL167文库中获得Y89A2抗体序列，总计4个候选抗体。
表2酵母单克隆菌落流式染色分析结果
对所得抗体的轻链、重链可变区氨基酸序列按照Chothia编码规则进行编码及划分CDR区，所得候选抗体的序列如表3所示。
表3候选抗体的序列
实施例3候选抗体的表达
将得到的4个候选抗体，选择野生型IgG1 Kappa亚型，进行质粒构建与抗体的表达、纯化，候选抗体表达相应信息见表4。
表4候选抗体表达、纯化数据
实施例4候选抗体亲和力测定
测定候选抗体Ab1910AN1、Ab1910AN2、Ab1910AN7和Ab1910AN10与人、猴和鼠ANG-2的结合。采用Octet RED96e(Fortébio)测定候选抗体分别与人ANG-2-his(Acro，货号：AN2-H5242)、猴ANG-2-his(SinoBiological，货号：90026-C07H)的亲和力，抗原及抗体均用1×PBST(1×PBS：生工，B548117-0500；0.02％吐温20：sigma，P1379)稀释，抗原使用浓度均为100nM，抗体使用浓度为33.3nM。将候选抗体样品按200μL/孔加入96孔板(Greiner bio-one，655209)，设置软件参数，温度30℃、收集标准动力学信号的频率为5.0Hz；用1×PBST预湿AHC传感器(Fortébio，货号：18-0015)10分钟，然后上机检测。每个循环包含以下步骤：(1)浸入缓冲液60s；(2)检测抗原是否与传感器有非特异性结合；(3)10mM pH1.7的甘氨酸溶液再生；(4)浸入缓冲液60s；(5)抗体固化在传感器上，时间为40s；(6)传感器浸入缓冲液180s；(7)抗原与抗体结合，时间180s；(8)抗原抗体的解离，时间10分钟；(9)传感器再生。采用Fortebio的Data Analysis 12.0软件，对抗原-抗体以1∶1的结合方式，测定结合速率(Kon)和解离速率(Koff)，以此计算抗体的平衡解离常数(KD)。结果如表5和表6所示，候选抗体Ab1910AN1、Ab1910AN2、Ab1910AN7和Ab1910AN10与人ANG-2、猴ANG-2具有较好的亲和力。
表5候选抗体与人ANG-2的亲和力测定
抗体编号 响应值 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
Ab1910AN1 0.18 2.02E-08 1.01E+05 2.04E-03
Ab1910AN2 0.20 9.60E-09 1.21E+05 1.16E-03
Ab1910AN7 0.27 1.04E-08 1.72E+05 1.79E-03
Ab1910AN10 0.36 1.15E-08 9.67E+05 1.12E-02
表6候选抗体与猴ANG-2的亲和力测定
继续测定候选抗体Ab1910AN1、Ab1910AN2、Ab1910AN7和Ab1910AN10与鼠ANG-2-biotin(Sino Biological，货号：50298-M07H)和人ANG-1-biotin(Sino Biological，货号：13667-H02H1)的亲合力。测定条件同抗体与人ANG-2的亲和力，用SA传感器(Fortébio，货号：18-0009)固化抗原，且测定与鼠ANG-2-biotin的结合时，抗原使用浓度为17.7nM，抗体使用浓度为1000nM；测定与人ANG-1-biotin的结合时，抗原使用浓度为12.2nM，抗体使用浓度为100nM。具体每个循环均包含以下步骤：(1)浸入缓冲液60s；(2)检测抗体是否与传感器有非特异性结合；(3)换新的传感器浸入缓冲液60s；(4)抗原固化在传感器上，鼠ANG-2-biotin时间为240s，人ANG-1-biotin时间为120s；(5)传感器浸入缓冲液180s；(6)抗原与抗体结合，时间180s；(7)抗原抗体的解离，时间10分钟。最后，采用Fortébio的Data Analysis12.0软件，对抗原-抗体以1∶1的结合方式，测定结合速率(Kon)和解离速率(Koff)，以此计算抗体的平衡解离常数(KD)。结果均显示四个候选抗体与鼠ANG-2弱结合，与人ANG-1不结合。
实施例5候选抗体中和ANG2蛋白的能力鉴定
通过报告基因实验测定Ab1910AN1、Ab1910AN2、Ab1910AN7和Ab1910AN10中和ANG2蛋白的能力。
首先，收集GS-H3/Tie2细胞(金斯瑞，货号：RD00771/IVP02FB010)，使用完全培养基(EMEM+10％FBS+200μg/mL Hygromycin B+10μg/mL Puromycin)重悬细胞，按照5000个/孔加入至384孔板(康宁，货号：3590)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。接着，配制4×浓度的8μg/mL ANG2蛋白(R&D，货号：623-AN/CF)和抗体样品，且抗体起始配制浓度为320μg/mL(即终浓度为80μg/mL)，3倍稀释，共8个稀释梯度点。然后，取出孵育过夜的384孔板，转移10μL的4×浓度的ANG2蛋白至384孔中，室温孵育0.5小时，再分别转移10μL的4×浓度的抗体样品至384孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育6小时。最后，把Bio-GloTM LuciferaseAssay Substrate(Promega，货号：G720A)和Bio-GloTM Luciferase Assay buffer(Promega，货号：G719A)进行1∶1混合后，取30μL加入384孔板室温孵育5分钟，使用PHERAstar(BMG，型号：PHERAstar FSX)进行检测，记录数据。
依据相对化学发光信号值和最终检测浓度的对应关系建立相应的量效曲线，结果如图3所示：可知Ab1910AN10、Ab1910AN7、Ab1910AN2、Nesvacumab、Ab1910AN1中和ANG2的作用呈量效关系，其量效曲线的IC50分为2.168μg/mL、2.122μg/mL、2.021μg/mL、1.665μg/mL、1.660μg/mL。
实施例6候选抗体理化性质评估
根据以上实施例的实验结果可知，候选抗体Ab1910AN1、Ab1910AN2、Ab1910AN7和Ab1910AN10亲和力及体外功能较为理想，继续对其进行理化成药性评估，具体如下：
6.1HIC-HPLC分析
(1)将样品浓度调整至1mg/ml，离心取上清待测。设置色谱条件如下：
色谱条件 参数
色谱柱 MAbPacTMHIC-10
检测波长 214nm
柱温 30℃
样品室温度 5℃
流速 0.8mL/分钟
(2)用流动相A(50mM磷酸盐缓冲液/1M硫酸铵，pH7.0)和流动相B(50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0)进行梯度洗脱，记录主峰保留时间，出峰时间短则抗体亲水性强。
6.2熔解温度(Tm)值分析
将样品浓度调整至1mg/mL，然后按照Protein Thermal ShiftTM Starter Kit说明书，取供试品溶液13μL加入至PCR管内，加入5μL Protein Thermal shift TM Buffer，加入2μL10×染色液，使反应体积为20μL，混匀后，12000rpm离心5分钟以去除气泡。将检测样品置于PCR仪内，进行样品分析，记录样品的Tm值，Tm值越高表示抗体的热稳定性越好。
6.3等电聚焦(iCIEF)分析
取样品溶液加入到已经充分混匀的以下体系中：1％的甲基纤维素(MC)70μL，尿素5M 80μL，两性电解质Pharmalyte pH 3-10 8μL，pI marker 5.5和9.5各2μL。补加适当体积超纯水至200μL，混匀。离心取上清进样分析。分析结束后，将结果文件导入ChromPerfect软件进行图谱积分处理并计算各峰的等电点以及各峰百分比，分析候选抗体的电荷异构体分布情况。
候选抗体Ab1910AN1、Ab1910AN2、Ab1910AN7、Ab1910AN10理化性质汇总如表7，由表7可知，候选抗体的热稳定性、亲水性、电荷异构体比例等理化指标均较为理想，且与人ANG-2、猴ANG-2均能特异性结合，与人ANG-1不结合，体外功能实验与对照抗体Nesvacumab相当，可作为候选分子继续开发。
表7候选抗体理化性质分析结果
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出更多变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

Claims (14)

1.一种与人Ang2结合的抗体或其抗原结合片段，包含：
重链可变区，其包含SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36所示的重链CDR1，SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42所示的重链CDR2，SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50所示的重链CDR3；和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的轻链CDR1，SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的轻链CDR2，SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO：34所示的重链CDR1、SEQ ID NO：40所示的重链CDR2和SEQ ID NO：47所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：8所示的轻链CDR1、SEQID NO：14所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：20所示的轻链CDR3；
(b)重链可变区，其包含SEQ ID NO：35所示的重链CDR1、SEQ ID NO：41所示的重链CDR2和SEQ ID NO：48所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：9所示的轻链CDR1、SEQID NO：15所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：21所示的轻链CDR3；
(c)重链可变区，其包含SEQ ID NO：36所示的重链CDR1、SEQ ID NO：42所示的重链CDR2和SEQ ID NO：49所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：10所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：16所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：22所示的轻链CDR3；或
(d)重链可变区，其包含SEQ ID NO：36所示的重链CDR1、SEQ ID NO：42所示的重链CDR2和SEQ ID NO：50所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：11所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：14所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：23所示的轻链CDR3。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30所示的重链可变区。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的轻链可变区。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30所示的重链可变区；和SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的轻链可变区。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO：27所示的重链可变区和SEQ ID NO：1所示的轻链可变区；
(b)SEQ ID NO：28所示的重链可变区和SEQ ID NO：2所示的轻链可变区；
(c)SEQ ID NO：29所示的重链可变区和SEQ ID NO：3所示的轻链可变区；或
(d)SEQ ID NO：30所示的重链可变区和SEQ ID NO：4所示的轻链可变区。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为全人源抗体。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段或scFv片段。
9.一种核酸分子，其编码权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
10.一种表达载体，其包含权利要求9所述的核酸分子。
11.一种细胞，其包含权利要求10所述的表达载体。
12.一种制备权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包含以下步骤：培养权利要求11所述的细胞；以及从培养的细胞中回收所述的抗体或其抗原结合片段。
13.一种组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的佐剂。
14.权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体、权利要求11所述的细胞和/或权利要求13所述的药物组合物在制备治疗与Ang2激活和/或过量表达相关的疾病的药物中的用途。
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