CN116693608A - 一种小分子化合物及其在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小分子化合物及其在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用，其中，所述小分子化合物为凝血酶受体激活肽，本发明首次发现凝血酶受体激活肽(TRAP‑6)能够结合并激活GPR15，并且通过功能性实验验证了凝血酶受体激活肽具有抑制混合淋巴细胞反应和治疗急性移植物抗宿主病的作用，为急性移植物抗宿主病的治疗提供了一种小分子药物。
Description
技术领域
本发明属于小分子药物技术领域，具体涉及一种小分子化合物及其在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用。
背景技术
急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)是异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)的主要并发症之一，也是导致移植后病人死亡的主要因素之一。T细胞是导致aGVHD发生的关键因素，激素可抑制T细胞功能，是目前治疗aGVHD的一线方案，但疗效尚不能令人满意且激素的作用缺乏靶向性，仍需开发新的治疗方案。
我们发现G蛋白偶联受体GPR15表达于活化T细胞表面，具有调节T细胞功能的作用，敲除T细胞的GPR15可加重小鼠aGVHD，然而，目前尚缺乏可以靶向作用于GPR15的小分子化合物。寻找到可以靶向结合并激活GPR15的小分子化合物，并考察其对体外混合淋巴细胞反应和急性移植物抗宿主病aGVHD发病的影响，是有待解决的技术问题。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。
作为本发明其中一个方面，本发明提供一种小分子化合物在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用，其种，所述小分子化合物为凝血酶受体激活肽，其多肽序列为：SFLLRN。
其中，所述凝血酶受体激活肽的剂量为2.5-10mg/kg。
其中，所述凝血酶受体激活肽能够结合并激活GPR15。
其中，所述凝血酶受体激活肽通过静脉给药。
其中，所述小分子化合物还包括凝血酶受体激活肽的可溶性盐。
其中，所述凝血酶受体激活肽为粉末或制剂。
其中，所述小分子化合物能够抑制混合淋巴细胞反应。
优选地，所述小分子化合物还包括凝血酶受体激活肽的突变体，所述凝血酶受体激活肽的突变体的多肽序列分别为：SALLRN、SFALRN、SFLARN、SFLLRA。
其中，所述凝血酶受体激活肽的突变体在具有治疗急性移植物抗宿主病的同时避免了诱发血小板聚集的副作用。
作为本发明的另一个方面，本发明还提供一种小分子化合物，其中，所述小分子化合物为凝血酶受体激活肽的突变体，所述凝血酶受体激活肽的突变体的多肽序列为SALLRN、SFALRN、SFLARN、SFLLRA中的一种或几种。
本发明的有益效果：本发明首次发现凝血酶受体激活肽(TRAP-6)能够结合并激活GPR15，并且通过功能性实验验证了凝血酶受体激活肽具有抑制混合淋巴细胞反应和治疗急性移植物抗宿主病的作用，为急性移植物抗宿主病的治疗提供了一种小分子药物及作用靶点。此外，我们通过构建TRAP-6的突变体避免了TRAP-6诱导血小板聚集的副作用、同时保留了抑制混合淋巴细胞反应和抗aGVHD的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为β半乳糖苷酶活性检测。
图2为TRAP-6与GPR15在体外的结合情况。
图3为体外培养淋巴细胞的活性检测。
图4为TRAP-6减轻小鼠aGVHD且依赖于GPR15的表达。
图5为TRAP-6降低小鼠外周血血小板计数。
图6为TRAP-6及其突变体在体外诱导血小板聚集的作用。
图7为TRAP-6及其突变体在体外对混合淋巴细胞反应的抑制作用。
图8为Mutant#2对aGVHD小鼠外周血血小板计数的影响。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实验材料：
①CHO-K1 GPR15/β-arrestin2报告基因细胞：购于美国Discover X公司，货号93-0682C2。该细胞的GPR15受体被激活时可通过β-arrestin2激活表达下游的报告基因(β半乳糖苷酶)，通过检测β半乳糖苷酶的活性，判断待测化合物是否可以激活GPR15。
②G蛋白偶联受体化合物库：购于美国MedChemExpress公司，货号HY-L006。该化合物库包括目前已知的可以激活G蛋白偶联受体的小分子化合物。
③β半乳糖苷酶检测试剂盒：购于美国Thermo Fisher Scientific公司，货号T1027。
④CCK-8检测试剂盒：购于日本DOJINDO公司，货号CK04。
⑤小鼠：野生型C57BL/6和BALB/c小鼠购于北京维通利华公司。GPR15基因敲除(Gpr15KO)鼠C57BL/6-Gpr15tm1cyagen购于苏州Cyagen公司。
⑥合成多肽：凝血酶受体激活肽(TRAP-6)是本技术方案发现的可以激活GPR15的分子。TRAP-6的氨基酸序列为SFLLRN，TRAP-6和6种突变体(表1)在南京金斯瑞公司合成，同时合成带有biotin或FITC标签的TRAP-6多肽。
表1.TRAP-6及其6种突变体的多肽序列
| 名称 | 多肽序列 |
| TRAP-6 | SFLLRN |
| Mutant#1 | AFLLRN |
| Mutant#2 | SALLRN |
| Mutant#3 | SFALRN |
| Mutant#4 | SFLARN |
| Mutant#5 | SFLLAN |
| Mutant#6 | SFLLRA |
实验方法：
①β半乳糖苷酶活性检测：取G蛋白偶联受体化合物库中的化合物，将梯度浓度的化合物(10-10-10-5mol/L)与CHO-K1 GPR15/β-arrestin2报告基因细胞混合培养90分钟，随后使用β半乳糖苷酶检测试剂盒中的底物加入细胞培养物中，置于30℃培养箱中温育2小时。酶标仪检测底物发光数值。
②混合淋巴细胞反应：分别取C57BL/6和BALB/c小鼠的脾细胞，辐照处理BALB/c小鼠脾细胞(3.0Gy)，将两种脾细胞按细胞浓度等比例混合或者单独使用C57BL/6脾细胞，计数3×105个细胞加入96孔板，同时加入筛选得到的可以激活GPR15的化合物，培养72小时后采用CCK-8试剂盒检测细胞活性。
③构建小鼠aGVHD模型：以BALB/c小鼠为移植受鼠，野生型C57BL/6或Gpr15KO小鼠为移植供鼠。给与受鼠铯137全身辐照处理，总计量7.5Gy，剂量率为1.1Gy/min。辐照24小时后，取供鼠骨髓细胞和脾细胞并将其经尾静脉输注至受鼠体内，每只受鼠输注5×106个骨髓细胞和5×106个脾细胞。移植后，每周给予受鼠输注化合物3次处理，共进行9次输注。连续观察受鼠的生存率和aGVHD评分。
④体外结合实验(pulldown法)：取CHO-K1报告基因细胞裂解获得的总蛋白0.5mg，将其与0.01mmol/L biotin标记的TRAP-6混合，置于4℃过夜后加入Streptavidin磁珠继续混匀4小时，随后使用磁力架吸附磁珠，使用PBST缓冲液洗涤磁珠3遍，将磁珠加入蛋白样本制备缓冲液中95℃加热10分钟，免疫印迹法检测GPR15蛋白和biotin标记的TRAP-6。
⑤体外结合实验(免疫荧光法)：将FITC标记的TRAP-6加入到培养的CHO-K1报告基因细胞中，终浓度为0.01mmol/L，37℃孵育2小时，去除细胞培养上清，甲醇固定细胞，加入GPR15抗体37℃孵育2小时，加入CoraLite594标记的二抗室温孵育1小时，DAPI复染细胞核，共聚焦显微镜检测细胞。
⑥血小板计数：取枸橼酸钠抗凝的外周血20微升，使用Mindray血细胞计数仪计数血小板。
⑦血小板聚集实验：取枸橼酸钠抗凝的外周血5毫升，180g离心30分钟，收取上层含有血小板的血浆，加入TRAP-6或各种突变体(终浓度为0.01mmol/L)处理1分钟，使用AggRAM Analyzer检测仪检测血小板聚集。
实验结果：
①筛选得到可以激活GPR15的小分子
经β半乳糖苷酶活性检测分析显示，G蛋白偶联受体化合物库中的凝血酶受体激活肽(TRAP-6)可以激活GPR15，TRAP-6的浓度在10-8-10-5mol/L之间时呈剂量依赖性增加β半乳糖苷酶活性，EC50值为3.81×10-7mol/L，见附图1。
图1为β半乳糖苷酶活性检测。将梯度浓度的TRAP-6(10-10-10-5mol/L)与CHO-K1GPR15/β-arrestin2报告基因细胞混合培养90分钟，随后使用β半乳糖苷酶检测试剂盒中的底物加入细胞培养物中，置于30℃培养箱中温育2小时。酶标仪检测底物发光数值(n＝6)。
②TRAP-6体外可与GPR15结合
使用biotin标记的TRAP-6进行pulldown法检测显示，TRAP-6可结合GPR15蛋白。免疫荧光法检测显示，FITC标记的TRAP-6在细胞上与GPR15存在共定位现象，见图2。图2为TRAP-6与GPR15在体外的结合情况。其中，(A)pulldown法，western blot检测。(B)免疫荧光法，箭头指示荧光共定位部位。
③TRAP-6可抑制混合淋巴细胞反应且依赖于GPR15的表达
在体外单独培养的野生型C57BL/6脾细胞中，加入梯度浓度(0.01，0.1，1.0和10μmol/L)的TRAP-6不改变细胞活性；而在混合培养的野生型C57BL/6和BALB/c小鼠脾细胞中，加入梯度浓度的TRAP-6可显著降低细胞活性。
在体外单独培养的Gpr15KO C57BL/6脾细胞中，加入梯度浓度(0.01，0.1，1.0和10μmol/L)的TRAP-6不改变细胞活性；在混合培养的Gpr15KOC57BL/6和BALB/c小鼠脾细胞中，加入梯度浓度的TRAP-6也不改变细胞活性。见图3。
图3为体外培养淋巴细胞的活性检测。取野生型(WT)(A)或Gpr15KO小鼠(B)淋巴细胞，将其单独培养或与辐照(irrad)处理过的BALB/c小鼠混合培养，同时加入梯度浓度的TRAP-6处理细胞，培养72小时后采用CCK-8试剂盒检测细胞活性(n＝6)。＊表示野生型细胞混合培养中，1μM和10μMTRAP-6处理组与0μM处理组(溶剂阴性对照)比较p＜0.05。
④TRAP-6可减轻小鼠aGVHD且依赖于GPR15的表达
在输注野生型C57BL/6供鼠细胞的BALB/c受鼠中(每组n＝20)，第30天给予对照试剂输注处理的受鼠的生存率为15％，中位生存时间15天，95％Cl(13.9-16.1)，2.5mg/kgTRAP-6处理的第30天生存率为30％，中位生存时间18天，95％Cl(13.6-22.4)，10mg/kgTRAP-6处理的第30天生存率为55％，未观察到中位生存时间。Log rank分析提示TRAP-6输注处理增加了受鼠的生存率。TRAP-6输注降低了aGVHD评分。
在输注Gpr15KO C57BL/6供鼠细胞的BALB/c受鼠中(每组n＝15)，第21天给予对照试剂输注处理的受鼠全部死亡，中位生存时间13天，95％Cl(7.7-18.3)，2.5mg/kg TRAP-6处理的受鼠第19天全部死亡，中位生存时间13天，95％Cl(10.5-15.5)，10mg/kg TRAP-6处理的受鼠第16天全部死亡，中位生存时间13天，95％Cl(9.2-16.8)。Log rank分析提示TRAP-6输注处理不改变受鼠的生存率。TRAP-6输注也不改变aGVHD评分。见图4。图4为TRAP-6减轻小鼠aGVHD且依赖于GPR15的表达。构建小鼠aGVHD模型，受鼠分别接受野生型(A)或者Gpr15KO小鼠(B)的T细胞输注。连续观察受鼠的生存率和aGVHD评分。
可见，TRAP-6能够经GPR15依赖性的抑制混合淋巴细胞反应和小鼠aGVHD，该作用具有显著的靶向性。
⑤TRAP-6突变体保留抗aGVHD作用但可以避免诱导血小板聚集的副作用：TRAP-6起初被发现的作用是激活血小板并诱导血小板聚集。在小鼠aGVHD模型中，我们发现输注TRAP-6可减少外周血血小板计数，见图5。图5为TRAP-6可降低小鼠外周血血小板计数。在小鼠aGVHD模型的第28天，取受鼠外周血进行血小板计数。
在造血干细胞移植中，血小板计数降低是病人恢复的不利因素。我们采用丙氨酸扫描的方式合成了6种TRAP-6多肽的突变体，见表1。本发明收集了6例健康成人的外周血血小板，分析了TRAP-6及其突变体在体外诱导血小板聚集的作用，结果显示：在6例样本的血小板聚集实验中，TRAP-6处理组阳性6例(即6例均出现血小板集聚)；Mutant#1处理组阳性5例，阴性1例；Mutant#2处理组阴性6例；Mutant#3处理组阳性4例，阴性2例；Mutant#4处理组阳性2例，阴性4例；Mutant#5处理组阳性1例，阴性5例；Mutant#6处理组阳性5例，阴性1例。提示TRAP-6多肽中的苯丙氨酸(F)是其诱导血小板聚集的关键位点，见图6。图6为TRAP-6及其突变体在体外诱导血小板聚集的作用。分别使用TRAP-6(序列为SFLLRN)和6种突变体处理收集到的健康成人外周血血小板，检测血小板集聚，结果显示的是发生聚集的血小板的百分比。HH#1-#6分别代表6例健康成人。
我们进一步分析了这些突变体在体外对混合淋巴细胞反应的抑制作用。Mutant#2、#3、#4和#6具有抑制混合淋巴细胞反应的作用，并且该作用依赖于GPR15的表达。Mutant#1和#5在体外不具有抑制混合淋巴细胞反应的作用。见图7。图7为TRAP-6及其突变体在体外对混合淋巴细胞反应的抑制作用。取野生型(WT)或Gpr15KO小鼠淋巴细胞，将其与辐照处理过的BALB/c小鼠淋巴细胞混合培养，同时加入梯度浓度的TRAP-6或突变体处理细胞，培养72小时后采用CCK-8试剂盒检测细胞活性(n＝6)。＊表示野生型细胞混合培养中，该浓度处理组与0μM处理组(溶剂阴性对照)比较p＜0.05。
结合血小板聚集实验和混合淋巴细胞反应实验的结果，我们认为Mutant#2既保留了抑制同种反应的作用又避免了诱发血小板聚集的副作用。在小鼠aGVHD模型中我们分别给与受鼠输注对照试剂、TRAP-6(10mg/kg)和Mutant#2(10mg/kg)处理(每组n＝15)。第30天，对照组生存率为6.67％(95％Cl，019.29)，TRAP-6组生存率为46.67％(95％Cl，21.42-71.91)，Mutant#2组生存率为60.00％(95％Cl，35.21-84.79)。TRAP-6组和Mutant#2组与对照组比较差异均有统计学意义。检测外周血血小板计数显示：TRAP-6组血小板计数低于对照组和Mutant#2组，而对照组与Mutant#2组的血小板计数无统计学差异。因此，Mutant#2避免了降低血小板计数的副作用、同时又保留了抗aGVHD作用，见图8。图8显示，Mutant#2不降低aGVHD小鼠外周血血小板计数。在小鼠aGVHD模型的第14天，取受鼠外周血进行血小板计数。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种小分子化合物在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用，其特征在于：所述小分子化合物为凝血酶受体激活肽，其多肽序列为：SFLLRN。
2.根据权利要求1所述的小分子化合物在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用，其特征在于：所述凝血酶受体激活肽应用剂量为2.5-10mg/kg。
3.根据权利要求1或2所述的小分子化合物在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用，其特征在于：所述凝血酶受体激活肽能够结合并激活GP R15。
4.根据权利要求1或2所述的小分子化合物在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用，其特征在于：所述凝血酶受体激活肽通过静脉给药。
5.根据权利要求1或2所述的小分子化合物在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用，其特征在于：所述小分子化合物还包括凝血酶受体激活肽的可溶性盐。
6.根据权利要求1或2所述的小分子化合物在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用，其特征在于：所述凝血酶受体激活肽为粉末或制剂。
7.根据权利要求1或2所述的小分子化合物在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用，其特征在于：所述小分子化合物能够抑制混合淋巴细胞反应。
8.根据权利要求1或2所述的小分子化合物在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用，其特征在于：所述小分子化合物还包括凝血酶受体激活肽的突变体，所述凝血酶受体激活肽的突变体的多肽序列分别为：SALLRN、SFALRN、SFLARN、SFLLRA。
9.根据权利要求8所述的小分子化合物在制备治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用，其特征在于：所述凝血酶受体激活肽的突变体在具有治疗急性移植物抗宿主病的同时避免了诱发血小板聚集的副作用。
10.一种小分子化合物，其特征在于：所述小分子化合物为凝血酶受体激活肽的突变体，所述凝血酶受体激活肽的突变体的多肽序列为SALLRN、SFALRN、SFLARN、SFLLRA中的一种或几种。
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