CN116670178A - 用于细胞治疗的水凝胶 - Google Patents
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Landscapes
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
带有羧酸类基团的交联右旋糖酐聚合物，其中属于两个不同聚合物链的右旋糖酐的至少两个糖单元通过至少一个至少二价的基团共价连接，该至少二价的基团是包含至少15个碳原子和任选地杂原子(例如氧、氮或硫)的直链、支链或环状烷基。
Description
本发明的领域是治疗，特别是细胞治疗。更具体地，本发明涉及包含水凝胶的植入物，该水凝胶可并入：
-活性成分，例如肽、激素或蛋白质，或者
-分泌细胞，其可以是分泌肽或激素的细胞。
目的是预防、治疗或治愈疾病。特别地，这可通过完全或部分替代患者体内缺乏的天然存在的细胞的功能来预防和/或治疗慢性疾病。本发明还涉及交联聚合物、其前体、用于获得交联聚合物的方法和用于获得水凝胶特别是包含细胞的水凝胶的方法。
细胞可是分离的或聚集的，并且可是一种类型或不同类型。
水凝胶可用于多种系统，如：
-作为受控药物(controlled drug)或活性药物成分释放系统的支架，或
-用作包含细胞的可植入装置的支架。
水凝胶包含在3D网络中交联的聚合物或由在3D网络中交联的聚合物组成。水凝胶可以是天然的或合成的均聚物或共聚物。其具有吸收和保留大量水分的能力。这称为水凝胶的溶胀(swelling)。
为了具有可以是能够长期递送活性成分的植入物的系统，必须获得许多特征。
在这些特征中可列举：
-低降解性，特别是低生物降解性或良好的体内稳定性，以使细胞不进入患者的机体，
-良好的选择透过性，通过使所并入的细胞全部或部分与宿主的免疫系统分离，同时允许活性成分(例如激素、肽或蛋白质)通过，从而允许低的免疫应答或甚至更好是无免疫应答，
-良好减轻的外来物应答，或良好的生物相容性，特别是低细胞毒性和良好的局部耐受性，
-使细胞具有高存活率，例如在细胞附近具有良好的血管形成，
-使细胞在水凝胶内具有良好的功能。
为了用作细胞的控释系统或支架，水凝胶必须具有特定特性，使得显示出所有或部分如上所述所期望的特性以及良好的机械和流变特性。
针对水凝胶的高度感兴趣的流变和机械特性中可列举：
-良好的均匀性，这可与良好的透明性或半透明性联系起来，
-对应力和应变力学具有适当的抵抗性和柔性，特别是在处理和植入时，
-限定的网尺寸以使氧气和营养物交换最大化，控制的运输特性，和选择透过性
-良好的体内稳定性，即对酶促降解或氧化降解具有抵抗性。
在可对所期望的流变和机械特性给出指示的参数中，可列举：
-tanδ(称为损耗角正切)，对机械特性给出指示，
-G’，其对网尺寸和弹性特性给出指示，
-断裂压缩和/或拉伸变形，其对水凝胶的弹性和抵抗性给出指示，
-膨胀性，其对机械特性给出指示。
以下是关于水凝胶的现有技术：
-Nestor Loper Mora et al，“evaluation of dextran(ethyleneglycol)hydrogel films for giant unilamellar lipid vesicle production and theirapplication for the encapsulation of polymersome，Soft Matters，January 2017，Vol.13，n°33，pp 5580-5585，
-Hanwei Zhang etal.，″In situ gelable interpenetrating double networkhydrogel formulated from binary components：thiolated chitosan and oxidizeddextran″，Biomacromolecules，2011，Vol.12，n°5，pp 1428-1437，
-Rongsheng Zhang et al.，″A novel pH and ionic strength sensitivecarboxymethyl dextran hydrogel，Biomaterials，2005，Vol.26，n°22，pp 4677-4683，，and
-Taichi Itoet al.，″Dextran-based in situ cross-linked injectablehydrogels to prevent peritoneal adhesions″，Biomaterials，2007，Vol.28，n°23，pp3418-3426，
所公开的水凝胶不能够像本发明的水凝胶那样解决技术问题。
比较实施例示出了根据本发明的水凝胶与上述列举的现有技术的水凝胶相比的优越性。
通过提供一种凝胶解决了潜在的问题，所述凝胶具有允许制造可植入装置的物理化学特性和允许细胞存活的生物相容性特性。
此外，与许多现有技术相比，考虑到使用的前体和进行交联的方式，本发明允许制备具有可调节特征的水凝胶。这可导致水凝胶使特定的物质从水凝胶受控地并入和特定的物质从水凝胶受控地释放。
水凝胶的适用性取决于其主体结构，因此用于表征根据本发明的水凝胶的网络结构的重要参数是溶胀状态下的聚合物体积分数、两个相邻交联点之间的聚合物链的分子量和相应的网尺寸。
通过提供一种新的带有羧酸类(carboxylate)基团的交联右旋糖酐聚合物解决了问题，其中属于两个不同聚合物链的右旋糖酐的至少两个糖单元通过至少一个二价的基团共价连接，该至少二价的基团是包含至少15个碳原子和任选地杂原子例如氧、氮或硫的直链、支链或环状烷基。
图1示出了与在C15-4(正方形)和C15-5(三角形)中包封的原代人胰岛相比，在裸原代人胰岛的灌注(perifusion)(圆形)中测量的对葡萄糖刺激的胰岛素分泌响应。G3是3mM葡萄糖Krebs缓冲液/G15是15mM葡萄糖Krebs缓冲液。N＝1个独立实验，n＝1个样品。x轴是时间(以分钟为单位)，并且y轴是信号(提高倍数)。
通过选择和调整交联反应条件、右旋糖酐和交联剂的取代度以及分子量，这类水凝胶的特性可针对应用进行调节和定制。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是带有羧酸类基团的右旋糖酐聚合物，其中所述至少二价的基团L(-)i与具有i-(R1)mG1-基团的右旋糖酐聚合物主链共价结合，其中，
-L(-)i是在其末端带有杂原子例如氧、氮或硫的直链或支链聚醚，
-i是L的化合价，并且是2至8的整数(2≤i≤8)，
-m是等于0或1的整数，
--R1-是包含1至6个碳原子和任选地杂原子例如氧、氮或硫的直链或支链烷基二价基团，
--G1-是包含1至6个碳原子的直链或支链或环状烷基二价基团，并且可包含杂原子例如氧、氮或硫。
在一个实施方案中，当m为1时，-R1-与右旋糖酐连接，并且-G1-与接头连接。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是在其末端带有至少两个杂原子例如氧、氮或硫的直链聚醚基团。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是在其末端带有至少两个杂原子例如氧、氮或硫的支链聚醚基团。
支链聚醚意指通过接头连接的数个聚醚臂(arm)。所述接头可以是包含2至20个碳原子以及任选地杂原子例如氧、氮或硫的烷基。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是在其末端带有至少两个杂原子例如氧、氮或硫的直链或支链聚醚，所述聚醚包含至多8个臂。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中在i＝2的情况下L(-)i是在其末端带有2个杂原子例如氧、氮或硫的支链或直链聚醚，所述聚醚包含2个臂。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中在i＝3的情况下L(-)i是在其末端带有3个杂原子例如氧、氮或硫的支链聚醚，所述聚醚包含3个臂。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中在i＝4的情况下L(-)i是在其末端带有4个杂原子例如氧、氮或硫的支链聚醚，所述聚醚包含4个臂。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中在i＝5的情况下L(-)i是在其末端带有5个杂原子例如氧、氮或硫的支链聚醚，所述聚醚包含5个臂。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中在i＝6的情况下L(-)i是在其末端带有6个杂原子例如氧、氮或硫的支链聚醚，所述聚醚包含6个臂。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中在i＝7的情况下L(-)i是在其末端带有7个杂原子例如氧、氮或硫的支链聚醚，所述聚醚包含7个臂。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中在i＝8的情况下L(-)i是在其末端带有8个杂原子例如氧、氮或硫的支链聚醚，所述聚醚包含8个臂。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中在i＝2的情况下L(-)i是在其末端带有2个硫原子的直链聚醚。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中在i＝4的情况下L(-)i是在其末端带有至多4个硫原子的支链聚醚。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是在其末端带有一个硫原子并包含至多8个臂的支链聚醚。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是在其末端带有2个硫原子并包含2个臂的支链聚醚。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中在i＝3的情况下L(-)i是在其末端带有3个硫原子并包含3个臂的支链聚醚。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中在i＝4的情况下L(-)i是在其末端带有4个硫原子并包含4个臂的支链聚醚。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中在i＝8的情况下L(-)i是在其末端带有8个硫原子并包含8个臂的支链聚醚。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是由包含至少2个硫原子和包含至多8个臂的直链或支链巯基聚乙二醇产生的基团，其中
-数均分子量(number-average molecular weight，Mn)为500至40 000g/mol(500≤Mn≤40 000g/mol)，或
-聚合度(polymerisation degree，DP)为8至1000(8≤DP≤1000)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是由包含至少2个硫原子和包含至多8个臂的直链或支链巯基聚乙二醇产生的基团，其中
-Mn为1000至25 000g/mol(1000≤Mn≤25 000g/mol)，或者
-聚合度(DP)为15至600(15≤DP≤600)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是由巯基聚乙二醇产生的根据式II的基团：
-S-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-S-
式II
其中p是8至1000的整数(8≤p≤1000)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是由巯基乙基聚氧乙烯产生的根据式III’的基团：
其中
-Q是碳原子或包含2至10个碳原子的烷基链，所述烷基链可包含选自氧、硫和氮的杂原子
-p是8至1000的整数(8≤p≤1000)
-q是2至8的整数(2≤q≤8)
-w是1或2，并且
-Z是-(CH2-CH2O)p-CH2-CH2-S-。
在一个实施方案中，w为1。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是由巯基乙基聚氧乙烯产生的根据式III的基团：
其中
-Q是碳原子或包含2至10个碳原子的烷基链，所述烷基链可包含选自氧、硫和氮的杂原子
-p是8至1000的整数(8≤p≤1000)
-q是2至8的整数(2≤q≤8)
-Z是-(CH2-CH2O)p-CH2-CH2-S-。
在一个实施方案中，Q是包含2至8个碳原子和1或2个氧原子的烷基链。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i对应于在q＝4并且Q是碳原子的情况下的式III’，并且是根据式VII的基团
其中
-Z是-(CH2-CH2O)p-CH2-CH2-S-
-p是8至1000(8≤p≤1000)
-w是1至2，(1≤w≤2)。
在一个实施方案中，w为1。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是根据式VII’的基团
其中：
-p是8至1000，(8≤p≤1000)并且
-Z是-(CH2-CH2O)p-CH2-CH2-S-。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是由下表中列举的硫醇聚乙二醇或巯基聚氧乙烯产生的根据式II、III、III’、VII或VII’的基团：
| 化学名称 | i | Mn(kg/mol) |
| 聚(乙二醇)二硫醇 | 2 | 10 |
| 聚(乙二醇)二硫醇 | 2 | 3.4 |
| 聚(乙二醇)二硫醇 | 2 | 1 |
| 季戊四醇匹(巯基乙基)聚氧乙烯 | 4 | 5.2 |
| 季戊四醇四(巯基乙基)聚氧乙烯 | 4 | 20 |
| 三季戊四醇八(巯基乙基)聚氧乙烯 | 8 | 20 |
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是在w＝1的情况下的根据式VII的基团，或特别地是由季戊四醇四(巯基乙基)聚氧乙烯(CAS#188492-68-4)产生的式VII’的基团。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中-R1-是包含1至6个碳原子和任选地杂原子例如氧、氮或硫的直链或支链烷基二价基团。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中-R1-是包含一个氮原子的直链或支链烷基二价基团。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中-R1-是包含1至6个碳原子和一个氮原子的直链烷基。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中-R1-是包含2至5个碳原子和一个氮原子的直链烷基。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中-R1-是包含3至4个碳原子和一个氮原子的直链烷基。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中-R1-是包含2个碳原子和一个氮原子的直链烷基。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中-R1-是包含2至5个碳原子和一个氮原子的根据式XIII的直链烷基：
-NHCH2CH2-式XIII
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中基团-R1-通过酰胺官能团共价结合，所述酰胺官能团由右旋糖酐所带有的羧酸类基团与一种带有胺官能团的-R1-前体或-(R1)mG1-前体反应产生。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中基团-R1-通过醚官能团共价结合，所述醚官能团由右旋糖酐所带有的羟基官能团与一种带有离去基团(即卤素原子)的-R1-前体或-(R1)mG1-前体反应产生。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中基团-G1-是根据式V的二价基团：
其中-*表示与右旋糖酐主链和接头连接的连接位点。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中基团-G1-是根据式V’的基团：
-S-CH2-SO2-CH2-CH2- 式V’。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中与右旋糖酐聚合物主链带有的羧酸类基团共价结合的-(R1)mG1-是根据式VI的二价基团：
其中-*表示与右旋糖酐主链和接头连接的连接位点。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中与右旋糖酐聚合物主链带有的羧酸类基团共价结合的-(R1)mG1-是根据式VIII的二价基团：
其中-*表示与右旋糖酐主链和接头连接的连接位点。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中与右旋糖酐聚合物主链带有的羟基官能团共价结合的-(R1)mG1-是根据式X的二价基团：
其中-*表示与右旋糖酐主链和接头连接的连接位点。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中与右旋糖酐聚合物主链带有的羟基官能团共价结合的-(R1)mG1-是根据式XI的二价基团：
其中-*表示与右旋糖酐主链和接头连接的连接位点。
在式VI和X的一个实施方案中，-(R1)mG1-通过上键即通过-R1-或N-乙基键与右旋糖酐连接，并通过下键即来自饱和环的键与接头连接。
在式VIII和XI的一个实施方案中，-(R1)mG1-通过左键即通过-R1-与右旋糖酐连接，并通过右键与接头连接。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中与糖单元结合的羧酸类基团通过醚键结合并选自带有至少一个羧酸类基团的直链或支链烷基。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中与糖单元结合的羧酸类基团通过醚键结合并选自根据式I的羧酸类基团
-(CH2)n-COX 式I
其中
-n是1至7的整数(1≤n≤7)
-X选自-OH、-ONa、-OK或-(R1)mG1-基团。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中根据式I-(CH2)n-COX的羧酸类基团通过醚官能团与右旋糖酐聚合物主链共价结合，所述醚官能团由右旋糖酐所带有的羟基官能团与一个带有离去基团即卤素原子的-(CH2)n-COX前体反应产生。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中不与-(R1)mG1-基团结合的-(CH2)n-COX为盐形式，并且X选自ONa或OK。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是根据式I的带有羧酸类基团的右旋糖酐聚合物，其中n为1至7。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是根据式I的带有羧酸类基团的右旋糖酐聚合物，其中n为1至6。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是根据式I的带有羧酸类基团的右旋糖酐聚合物，其中n为1至5。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是根据式I的带有羧酸类基团的右旋糖酐聚合物，其中n为1至4。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是根据式I的带有羧酸类基团的右旋糖酐聚合物，其中n为1至3。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是根据式I的带有羧酸类基团的右旋糖酐聚合物，其中n为1至2。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是根据式I的带有羧酸类基团的右旋糖酐聚合物，其中n为1。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是根据式XII的，
其中R选自
--H、-(CH2)n-COX或-(R1)mG1-；n、m、X、-R1-、-G1-和L(-)i如上所限定，并且L(-)i与另一个具有-(R1)mG1-基团的右旋糖酐聚合物主链共价结合，并且
-I是20至5000(20≤I≤5000)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(weight averagemolecular weight，Mw)为5至1000kDa的右旋糖酐。
换句话说，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是在重均分子量(Mw)为5至1000kDa的天然右旋糖酐聚合物取代和交联之后获得的。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为5至250kDa的右旋糖酐。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为5至100kDa的右旋糖酐。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为5至50kDa的右旋糖酐。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为5至25kDa的右旋糖酐。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为250至1000kDa的右旋糖酐。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为10至500kDa的右旋糖酐。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为20至500kDa的右旋糖酐。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为20至100kDa的右旋糖酐。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为20至50kDa的右旋糖酐。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为40至250kDa的右旋糖酐。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为40至100kDa的右旋糖酐。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中具有-(R1)mG1-基团的右旋糖酐主链的取代度(degree of substitution)(DS1)在0.001至0.4的范围内(0.001≤DS1≤0.4)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中具有-(R1)mG1-基团的右旋糖酐主链的取代度(DS1)在0.01至0.4的范围内(0.01≤DS1≤0.4)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中具有-(R1)mG1-基团的右旋糖酐主链的取代度(DS1)在0.1至0.4的范围内(0.1≤DS1≤0.4)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为5至250kDa的右旋糖酐，并且具有-(R1)mG1-基团的右旋糖酐主链的取代度(DS1)在0.1至0.4的范围内(0.1≤DS1≤0.4)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为20至100kDa的右旋糖酐，并且具有-(R1)mG1-基团的右旋糖酐主链的取代度(DS1)在0.2至0.4的范围内(0.2≤DS1≤0.4)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为20至100kDa的右旋糖酐，并且具有-(R1)mG1-基团的右旋糖酐主链的取代度(DS1)在0.2至0.3的范围内(0.2≤DS1≤0.3)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为250至1000kDa的右旋糖酐，并且具有-(R1)mG1-基团的右旋糖酐主链的取代度(DS1)在0.001至0.4的范围内(0.001≤DS1≤0.4)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为250至1000kDa的右旋糖酐，并且具有-(R1)mG1-基团的右旋糖酐主链的取代度(DS1)在0.01至0.4的范围内(0.01≤DS1≤0.4)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中右旋糖酐聚合物主链是在交联和取代之前重均分子量(Mw)为250至1000kDa的右旋糖酐，并且具有-(R1)mG1-基团的右旋糖酐主链的取代度(DS1)在0.1至0.4的范围内(0.1≤DS1≤0.4)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中具有根据式I的羧酸类基团的右旋糖酐主链的取代度(DS2)在0.5至3的范围内(0.5≤DS2≤3)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中具有根据式I的羧酸类基团的右旋糖酐主链的取代度(DS2)在1至2.75的范围内(1≤DS2≤2.75)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中具有根据式I的羧酸类基团的右旋糖酐主链的取代度(DS2)在1.5至2.5的范围内(1.5≤DS2≤2.5)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其中具有根据式I的羧酸类基团的右旋糖酐主链的取代度(DS2)在1.75至2.25的范围内(1.75≤DS2≤2.25)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其-(R1)mG1-基团的摩尔浓度与交联基(cross-linker)L(-)i的反应性官能团的摩尔浓度之间的摩尔比(DC)在0.5至1.5(0.5≤DC≤1.5)范围内。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其-(R1)mG1-基团的摩尔浓度与交联基L(-)i的反应性官能团的摩尔浓度之间的摩尔比在0.8至1.2的范围内(0.8≤DC≤1.2)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其-(R1)mG1-基团的摩尔浓度与交联基L(-)i的反应性官能团的摩尔浓度之间的摩尔比在0.9至1.1的范围内(0.9≤DC≤1.1)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其-(R1)mG1-基团的摩尔浓度与交联基L(-)i的反应性官能团的摩尔浓度之间的摩尔比在0.95至1.05的范围内(0.95≤DC≤1.05)。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是这样的交联右旋糖酐聚合物，其-(R1)mG1-基团的摩尔浓度与交联基L(-)i的反应性官能团的摩尔浓度之间的摩尔比为1(DC＝1)。
本发明还涉及包含根据本发明的交联右旋糖酐聚合物的水凝胶。
在一个实施方案中，所述水凝胶是透明的。
“透明的”意指在实施例C21中公开的在用于目视检查的条件下，与标准2(6NTU)相比，观察者认为样品是透明的，和/或如在实施例C21中测量的水凝胶的UV吸光度低于0.06(吸光度单位)。
在一个实施方案中，所述水凝胶在视觉上是透明的，并且UV吸光度为<0.06(吸光度单位)。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于Tan δ小于1。
在本说明书中，tan δ是储能模量(也称为弹性模量)G’与损耗模量G”(tan δ＝G'/G”)的比率。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于Tan δ小于或等于0.5。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于Tan δ小于或等于0.1。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于Tan δ小于或等于0.05。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于Tan δ小于或等于0.01。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于在水中溶胀之后交联右旋糖酐聚合物浓度为0.01至0.2g/g。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于在水中溶胀之后交联右旋糖酐聚合物浓度为0.03至0.1g/g。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于在水中溶胀之后交联右旋糖酐聚合物浓度为0.05至0.1g/g。
在一个实施方案中，所述水凝胶是半透明的。
在另一实施方案中，所述水凝胶是透明的。
在一个实施方案中，所述水凝胶的杨氏模量为1至200kPa。
在一个实施方案中，所述水凝胶的杨氏模量为5至200kPa。
在一个实施方案中，所述水凝胶的杨氏模量为20至200kPa。
在一个实施方案中，所述水凝胶的杨氏模量为30至200kPa。
在一个实施方案中，所述水凝胶的杨氏模量为50至200kPa。
在一个实施方案中，所述水凝胶的杨氏模量为30至180kPa。
在一个实施方案中，所述水凝胶的杨氏模量为50至150kPa。
在一个实施方案中，所述水凝胶的G’为0.5至70kPa。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂压缩变形大于或等于10％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂压缩变形大于或等于15％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂压缩变形大于或等于20％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂压缩变形大于或等于25％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂压缩变形大于或等于30％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂压缩变形大于或等于35％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂压缩变形大于或等于40％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂压缩变形大于或等于45％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂压缩变形大于或等于50％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂压缩变形大于或等于55％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂压缩变形大于或等于60％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂拉伸变形大于或等于10％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂拉伸变形大于或等于15％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂拉伸变形大于或等于20％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂拉伸变形大于或等于25％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂拉伸变形大于或等于30％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂拉伸变形大于或等于35％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的断裂拉伸变形大于或等于40％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的溶胀比大于1。
在一个实施方案中，所述水凝胶的溶胀比大于1.1。
在一个实施方案中，所述水凝胶的溶胀比大于或等于1.2。
在一个实施方案中，所述水凝胶的溶胀比大于或等于1.3。
在一个实施方案中，所述水凝胶的溶胀比大于或等于1.4。
在一个实施方案中，所述水凝胶的溶胀比大于或等于1.5。
在一个实施方案中，所述水凝胶的溶胀比大于或等于1.6。
在一个实施方案中，所述水凝胶的溶胀比小于或等于5。
在一个实施方案中，所述水凝胶的溶胀比小于或等于4。
在一个实施方案中，所述水凝胶的溶胀比小于或等于3。
在一个实施方案中，所述水凝胶的溶胀比小于或等于2.8。
在一个实施方案中，所述水凝胶的含水量为至少80wt％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的含水量为至少85wt％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的含水量为至少90wt％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的含水量为至少97wt％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的含水量为至少96wt％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的含水量为至少95wt％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的含水量为至少94wt％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的含水量为至少93wt％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的含水量为至多99wt％。
在一个实施方案中，所述水凝胶的含水量为至多98wt％。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于其还包含生物细胞(biological cell)。
在一个实施方案中，所述细胞是来自人或动物来源的细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是细胞系。
在一个实施方案中，所述细胞是干细胞来源的。
在一个实施方案中，所述干细胞选自胚胎干细胞、诱导多能干细胞或间充质干细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是原代细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是蛋白质分泌细胞、激素分泌细胞或肽分泌细胞。
在一个实施方案中，所述细胞选自：
-用于糖尿病治疗的胰岛素分泌细胞
-用于血友病治疗的因子VIII分泌细胞或因子IX分泌细胞，和
-用于戈谢病(Gaucher disease)的β-葡糖脑苷脂酶分泌细胞。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于胰岛素分泌细胞选自胰腺细胞的组。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于胰岛素分泌细胞是朗格汉斯岛(Langherans islet)。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于所述生物细胞是假胰岛。
本发明还涉及将根据本发明的交联右旋糖酐共聚物合成为水凝胶形式以制备细胞组合物的用途。
在一个实施方案中，所述细胞选自可分泌活性成分的一种或更多种类型的细胞，其是分离的或聚集的。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是带有羧酸类基团的右旋糖酐聚合物，其中至少二价的基团L(-)i与具有i-(R1)mG1-基团的右旋糖酐聚合物主链共价结合，其中i是2、4或8。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是带有羧酸类基团的右旋糖酐聚合物，其中至少二价的基团L(-)i与具有i-(R1)mG1-基团的右旋糖酐聚合物主链共价结合，其中i是2。
在一个实施方案中，根据本发明的交联右旋糖酐聚合物是带有羧酸类基团的右旋糖酐聚合物，其中至少二价的基团L(-)i与具有i-(R1)mG1-基团的右旋糖酐聚合物主链共价结合，其中i是4。
本发明还涉及所述交联右旋糖酐聚合物的前体，所述前体是带有与-(R1)mG2单价基团的羧酸类基团共价结合的右旋糖酐聚合物，其中-G2作为基团-G1-的前体是迈克尔接受体(Michael acceptor)。
在一个实施方案中，所述前体是如上所限定的交联右旋糖酐聚合物，其中-G2选自马来酰亚胺或者乙烯基砜或者包含马来酰亚胺或乙烯基砜的基团。
在一个实施方案中，所述前体是如上所限定的交联右旋糖酐聚合物，其中-G2是马来酰亚胺。
本发明还涉及合成带有羧酸类基团和至少一个-(R1)mG2取代基的右旋糖酐的方法
-其中-G2作为G1的前体是迈克尔接受体，-G2选自包含1至6个碳原子的直链或支链或环状烷基单价基团，并且可包含杂原子例如氧、氮或硫，
-R1如上所限定，
所述方法包括以下步骤：
a)制备带有羧酸类基团的右旋糖酐溶液，
b)用-(R1)mG2取代羧酸类基团的羟基。
在一个实施方案中，带有羧酸类基团和至少一个-(R1)mG2取代基的根据本发明的右旋糖酐是这样的右旋糖酐聚合物，其中-G2选自马来酰亚胺或者乙烯基砜或者包含马来酰亚胺或乙烯基砜的基团。
在一些特定的实施方案中，带有羧酸类基团和至少一个-(R1)mG2取代基的右旋糖酐与接头L(-)i的前体交联。
通过将包含带有羧酸类基团和至少一个-(R1)mG2取代基的右旋糖酐的溶液与接头L(-)i的前体的溶液混合来进行交联步骤。
在一个实施方案中，接头L(-)i的前体带有官能团即-SH基团，该-SH基团在迈克尔加成反应中与包含乙烯基砜或马来酰亚胺基团的-(R1)mG2基团反应，以产生本发明的交联右旋糖酐聚合物。
在一个实施方案中，用包含1至150mM，优选10至100mM的右旋糖酐羧酸类前体的反应性官能团-(R1)mG2的溶液进行交联步骤。
在一个实施方案中，用包含1至150mM，优选10至100mM的接头L(-)i前体的反应性官能团的溶液进行交联步骤。
在一个实施方案中，在交联步骤中，以等摩尔比(1∶1)使用带有反应性官能团-(R1)mG2的右旋糖酐聚合物前体的溶液和接头L(-)i前体的溶液。
在一个实施方案中，反应性官能团-(R1)mG2与L(-)i前体的反应性官能团之间的比率为0.8至1.2。
在一个实施方案中，反应性官能团-(R1)mG2与L(-)i前体的反应性官能团之间的比率为0.9至1.1。
在一个实施方案中，反应性官能团-(R1)mG2与L(-)i前体的反应性官能团之间的比率为1。
所述交联步骤是导致形成根据本发明的水凝胶的凝胶化步骤。
水凝胶形成动力学是温度的函数，并且可通过反应物的浓度、pH和温度来调节。
在一个实施方案中，获得根据本发明的水凝胶的时间为1分钟至6小时。
在一个实施方案中，所述交联步骤进行1小时。
在一个实施方案中，所述交联步骤的温度为4℃至室温(20至25℃)，并且可在混合步骤与凝胶化和成型步骤之间变化。
在一个实施方案中，混合在4℃下进行，并且凝胶化在室温(20至25℃)下进行1小时。
在一个实施方案中，混合在室温(20至25℃)下进行。
在一个实施方案中，混合在4℃或室温(20至25℃)下进行，并且凝胶化在室温(20至25℃)下进行1小时。
在一个实施方案中，凝胶化在37℃下进行。
在一个实施方案中，在交联或凝胶化之后，所述水凝胶在缓冲溶液中溶胀，所述缓冲溶液的pH为5至8，优选6至8，并且更优选6.8至7.5。
在一个实施方案中，所述缓冲溶液是pH 7.4的PBS溶液。
在一个实施方案中，所述缓冲溶液是pH 7.4的Tris溶液。
在一个实施方案中，所述缓冲溶液是pH 8的Tris溶液。
在一个实施方案中，与水凝胶的初始质量相比，溶胀使其质量提高了1、2、3或4倍。
本发明还涉及将根据本发明的交联右旋糖酐聚合物合成为水凝胶形式的方法，其包括以下步骤：
a)制备无菌溶液，所述无菌溶液溶液包含带有根据式I的羧酸甲酯基团和至少两个-(R1)mG2基团的右旋糖酐，
b)制备根据式II、III、III′、VII或VII′的巯基聚乙二醇或巯基乙基聚氧乙烯的无菌溶液
c)将从步骤b获得的无菌溶液添加至从步骤a获得的溶液，
d)添加直接在模具中进行或者在混合之后将所述溶液引入到模具中，
e)例如在室温(20至25℃)或37℃下，通过迈克尔反应进行交联和凝胶化，
f)进行脱模和溶胀以获得水凝胶。
在一个实施方案中，步骤c)和d)同时进行。
在一个实施方案中，在pH 7.4的PBS溶液中进行溶胀。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，将活性药物成分(activepharmaceutical ingredient，API)包载到水凝胶中。
本发明还涉及将根据本发明的水凝胶作为治疗植入物以向哺乳动物施用API的治疗用途。
本发明还涉及制备包含生物细胞的水凝胶的方法，其包括以下步骤：
a)制备包含带有根据式I的羧酸类基团和至少两个-(R1)mG2基团的右旋糖酐的无菌溶液，
b)制备根据式II、III、III’、VII或VII’的巯基聚乙二醇或巯基乙基聚氧乙烯的无菌溶液，
c)制备生物细胞的悬液，
d)将从步骤c获得的生物细胞悬液与从步骤b或a获得的溶液混合，
e)将步骤d中未使用的从步骤a或b获得的无菌溶液添加至从步骤d获得的溶液，
f)步骤e的添加直接在模具中进行或者在混合之后将所述溶液引入到模具中，
g)在室温(20至25℃)下通过迈克尔反应进行交联和凝胶化，
h)进行脱模和溶胀以获得包含生物细胞的水凝胶。
在一个实施方案中，在pH 7.4的PBS溶液中进行溶胀。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于其还包含生物细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是来自人或动物来源的细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是细胞系。
在一个实施方案中，所述细胞是干细胞来源的。
在一个实施方案中，所述干细胞选自胚胎干细胞、诱导多能干细胞或间充质干细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是原代细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是蛋白质分泌细胞、激素分泌细胞或肽分泌细胞。
在一个实施方案中，所述细胞选自：
-用于糖尿病治疗的胰岛素分泌细胞
-用于血友病治疗的因子VIII分泌细胞或因子IX分泌细胞，和
-用于戈谢病的β-葡糖脑苷脂酶分泌细胞。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于胰岛素分泌细胞选自胰腺细胞的组。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于胰岛素分泌细胞是朗格汉斯岛。
在一个实施方案中，根据本发明的水凝胶的特征在于所述生物细胞是假胰岛。
本发明还涉及根据本发明的水凝胶用于在哺乳动物中治疗病症或疾病的治疗用途，其中所述病症或疾病是由于胰腺器官的内分泌功能缺乏或功能障碍所致。
本发明还涉及水凝胶用作药物。
本发明还涉及水凝胶用于治疗疾病例如糖尿病。
本发明还涉及可植入装置，其包括至少一种根据本发明的水凝胶并且是根据本发明的方法获得的。
本发明还涉及由根据本发明的水凝胶组成的植入物。
本发明还涉及植入物，其包含根据本发明的水凝胶。
在一个实施方案中，至少50％的水凝胶表面与其中植入水凝胶的介质直接接触。
在一个实施方案中，至少75％的水凝胶表面与其中植入水凝胶的介质直接接触。
在一个实施方案中，至少90％的水凝胶表面与其中植入水凝胶的介质直接接触。
在一个实施方案中，至少95％的水凝胶表面与其中植入水凝胶的介质直接接触。
在一个实施方案中，99％的水凝胶表面与其中植入水凝胶的介质直接接触。
在一个实施方案中，至少50％的水凝胶表面与装置或植入物的外部直接接触。
“与外部直接接触”意指水凝胶与外部之间没有分隔，例如水凝胶与装置或植入物外部之间没有由非水凝胶材料制成的壁。
在一个实施方案中，至少75％的水凝胶表面与装置或植入物的外部直接接触。
在一个实施方案中，至少90％的水凝胶表面与装置或植入物的外部直接接触。
在一个实施方案中，至少95％的水凝胶表面与装置或植入物的外部直接接触。
在一个实施方案中，至少99％的水凝胶表面与装置或植入物的外部直接接触。
在一个实施方案中，100％的水凝胶表面与装置或植入物的外部直接接触。
细胞或APl被包埋在交联右旋糖酐水凝胶的迷宫(maze)中。
在本说明书中，词语“包埋”等同于“包封”或“封装”。
水凝胶基质允许小分子(例如营养物和API，API被包埋在水凝胶中或由包埋的细胞分泌)通过。
通常，API是选自PTH蛋白、胰岛素和凝血因子的激素和肽药物。
在一个实施方案中，基质的网孔尺寸是免疫隔离的并阻止T淋巴细胞以便保存细胞。
在一个实施方案中，该网孔尺寸小于1μm。
在另一个实施方案中，其小于100纳米，优选小于10纳米，并更优选约5纳米。
实施例
第A部分-化学
实施例A1：经取代的右旋糖酐羧酸甲酯-马来酰亚胺(DMCMal)和右旋糖酐羧酸甲酯-乙烯砜(DMCVS)的合成
表1：合成的多糖DMCMal和DMCVS的列表
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多糖DMCMal-1
多糖DMC-1：
在30℃下，将65g(0.4mol葡糖苷单元，1.2mol羟基官能团)重均摩尔质量为40kg/mol的右旋糖酐(Pharmacosmos，聚合度n＝205)溶解在水(285g/L)中，然后添加NaBH4(74mg，1.95mmol)，并将混合物在30℃下搅拌2小时。向该溶液中添加氯乙酸钠(140g，1.2mol)，并将混合物在65℃下加热1小时。然后在1.5小时内缓慢添加10N NaOH(200mL，2mol)，并将混合物在65℃下搅拌1小时。将混合物用水(120mL)稀释，冷却至室温，用乙酸中和，并随后在PES膜(MWCO 5kDa)上针对pH 7的磷酸盐缓冲液，然后针对水进行超滤来纯化。最终溶液的多糖DMC-1浓度由干提取物来确定，并随后进行酸/碱测定以确定经羧酸甲酯取代的程度。
根据干提取物：[多糖DMC-1]＝50.6mg/g
根据酸/碱测定，经羧酸甲酯取代的程度(DS2)＝1.2
多糖DMCMal-1：
向158g以上获得的多糖DMC-1的溶液(50.6mg/g，DS2＝1.2，10.0g多糖DMC-1，38.73mmol葡糖苷单元)中添加2-羟基吡啶1-氧化物(HOPO)(4.30g，38.73mmol)，并将混合物冷却至4℃。向该溶液中添加N-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐(Mal)(2.05g，11.62mmol)、Et3N(1.62mL，11.62mol)和N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(7.42g，38.73mmol)，并将反应混合物在4℃下搅拌4小时。每4小时处理两份另外添加的EDC(7.42g，38.73mmol)。将混合物用pH 7的磷酸盐缓冲液稀释，然后在PES膜(MWCO 5kDa)上针对pH 7的磷酸盐缓冲液、在水中的NaCl(9g/L)并随后针对水进行超滤来纯化。最终溶液的多糖DMCMal-1浓度由干提取物确定，并且经马来酰亚胺取代的程度由D2O中的1H NMR确定。最终溶液储存在-20℃下或冷冻干燥。
根据干提取物：[多糖DMCMal-1]＝18.0mg/g
根据1H NMR(D2O)，经马来酰亚胺取代的程度(DS1)＝0.24
多糖DMCMal-2
多糖DMC-2：
在65℃下，将90g(0.35mol葡糖苷单元)冻干的多糖DMC-1溶解在水(260g/L)中，然后添加氯乙酸钠(204g，1.75mol)，并将混合物在65℃下保持1小时。然后在1小时内缓慢添加10N NaOH(175mL，1.75mol)，并将混合物在65℃下再搅拌1小时。然后添加另一部分的氯乙酸钠(122g，1.05mol)，并将混合物在65℃下保持0.5小时。然后在1小时内缓慢添加10NNaOH(105mL，1.05mol)，并将混合物在65℃下再搅拌1小时。将混合物用水稀释，冷却至室温，用乙酸中和，并随后在PES膜(MWCO 5kDa)上针对pH 7的磷酸盐缓冲液，然后针对水进行超滤来纯化。最终溶液中多糖DMC-2浓度由干提取物确定，并随后进行酸/碱测定以确定经羧酸甲酯取代的程度。
根据干提取物：[多糖DMC-2]＝48.8mg/g
根据酸/碱测定，经羧酸甲酯取代的程度(DS2)＝2.25
多糖DMCMal-2：
使用类似于用于制备多糖DMCMal-1的方法，从多糖DMC-2(48.8mg/g，DS2＝2.25，10.0g，29.22mmol葡糖苷单元)以及N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐(1.55g，8.77mmol)开始，获得多糖DMCMal-2。
根据干提取物：[多糖DMCMal-2]＝17.9mg/g
根据XH NMR(D2O)，经马来酰亚胺取代的程度(DS1)＝0.24。
多糖DMCMal-3
多糖DMC-3：
使用类似于用于制备多糖DMC-1的方法，从重均摩尔质量为500kg/mol的右旋糖酐开始，获得多糖DMC-3。
根据干提取物：[多糖DMC-3]＝34.3mg/g
根据酸/碱测定，经羧酸甲酯取代的程度(DS2)＝1.0
多糖DMCMal-3：
使用类似于用于制备多糖DMCMal-1的方法，从多糖DMC-3(34.3mg/g，DS2＝1.0，10.0g，41.29mmol葡糖苷单元)以及N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐(2.19g，12.39mmol)开始，获得多糖DMCMal-3。
根据干提取物：[多糖DMCMal-3]＝12.0mg/g
根据1H NMR(D2O)，经马来酰亚胺取代的程度(DS1)＝0.25
多糖DMCMal-4
使用类似于用于制备多糖DMCMal-1的方法，从多糖DMC-3(34.3mg/g，DS2＝1.0，10.0g，41.29mmol葡糖苷单元)以及N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐(729mg，4.13mmol)开始，获得多糖DMCMal-4。
根据干提取物：[多糖DMCMal-4]＝18.0mg/g
根据1H NMR(D2O)，经马来酰亚胺取代的程度(DS1)＝0.09。
多糖DMCMal-5
多糖DMC-5：
使用类似于用于制备多糖DMC-2的方法，从重均摩尔质量为250kg/mol的右旋糖酐开始，获得多糖DMC-5。
根据干提取物：[多糖DMC-5]＝47.6mg/g
根据酸/碱测定，经羧酸甲酯取代的程度(DS2)＝2.0
多糖DMCMal-5：
使用类似于用于制备多糖DMCMal-1的方法，从多糖DMC-5(47.6mg/g，DS2＝2.0，10.3g，31.98mmol葡糖苷单元)以及N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐(1.69g，9.59mmol)开始，获得多糖DMCMal-5。
根据干提取物：[多糖DMCMal-5]＝18.3mg/g
根据1H NMR(D2O)，经马来酰亚胺取代的程度(DS1)＝0.25
多糖DMCVS-1
向205g多糖DMC-2(48.8mg/g，DS2＝2.25，10.0g多糖DMC-2，29.22mmol葡糖苷单元)的溶液中添加2-羟基吡啶1-氧化物(HOPO)(3.25g，29.22mmol)，并将混合物冷却至4℃。向该溶液中添加2-[[2-(乙烯基磺酰基)乙基]硫代]乙胺盐酸盐(VS)(2.03g，8.77mmol)、Et3N(1.83ml，13.15mmol)和N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(5.60g，29.22mmol)，将反应混合物在4℃下搅拌4小时。每4小时处理两次另外添加的EDC(5.60g，29.22mmol)。将混合物用pH 9至10的碳酸盐缓冲液稀释，搅拌3小时，然后在PES膜(MWCO 5kDa)上针对碳酸盐缓冲液pH 9至10、在水中的NaCl(9g/L)、磷酸盐缓冲液pH 7、在水中的NaCl(9g/L)、然后针对水进行超滤来纯化。最终溶液的多糖DMCVS-1浓度由干提取物确定，并且经乙烯砜取代的程度由D2O的1H NMR来确定。最终溶液储存在-20℃或冷冻干燥。
根据干提取物：[多糖DMCVS-1]＝20.7mg/g
根据1H NMR(D2O)，经乙烯基砜取代的程度(DS1)＝0.25
实施例A2：包含至少两个硫醇官能团的聚乙二醇衍生物(在本说明书中称为“PEG-SH”)
购买用硫醇(SH)基团官能化的商业聚乙二醇(PEG)衍生物。使用具有不同分子量的线性同型双官能PEG-SH和多臂同型官能PEG-SH，并在下表2中示出。
表2：使用的商业PEG-SH的列表
比较例A3多糖右旋糖酐马来酰亚胺(右旋糖酐Mal A3)
用马来酰亚胺(Mal)基团官能化的商业右旋糖酐衍生物购自Cellendes。该产品是包含170μL(在重构之后的体积)右旋糖酐-Mal(其中马来酰亚胺官能团的浓度为30mmol/L)和130mg/mL聚合物(在重构之后的浓度)的试剂盒。根据供应商，经马来酰亚胺取代的程度为0.046。
第B部分-生物学
实施例B1：假胰岛的制备
在37℃和5％CO2的培养箱中，使β-TC-tet细胞系(ATCC)或Min-6细胞系(CaltagMedsystems)在表3所示的介质中培养。使用0.05％胰蛋白酶/EDTA每周3次传代培养细胞以分离细胞，并在培养基中稀释5倍。
表3：培养基组分
使用β-TC-tet细胞系，使用由模板(Sigma-Aldrich)形成的琼脂糖300pm微孔模具通过每微孔接种200个细胞并将其在37℃和5％CO2下孵育3天，形成平均直径为150μm的假胰岛。然后收集假胰岛，通过离心浓缩，并最终混悬在0.9％NaCl中。
使用Min-6细胞系，使用400μm微孔Eplasia板(Coming)通过每微孔接种500个细胞并将其在37℃和5％CO2下孵育3天，形成平均直径为150μm的假胰岛。然后收集假胰岛，通过离心浓缩，并最终混悬在0.9％NaCl中。
实施例B2：原代人胰岛的分离
胰腺从脑死亡的人供体中获得。按照用于胰岛分离的胰腺获取技术(Pattou etal.，Anchir 2005)中描述的方法产生胰岛。简言之，从组织中分离出胰腺，并灌注于Wirsung管中用胶原酶I和II(Roche，France)的混合物进行消化，以便确保胰岛的释放。然后使用密度梯度离心(EuroFicoll，SigmaAldrich)纯化胰岛。纯化的胰岛最终在培养瓶中于37℃下、在5％CO2下在以下任一介质中培养：
·介质1：补充有0.1％BSA的CMRL介质(Gibco)。
·介质2：补充有0.625％BSA和1％青霉素/链霉素的CMRL介质培养基每2至3天更换一次。
实施例B3：原代大鼠胰岛分离
按照在啮齿动物胰岛分离和评估实用指南(Pratical Guide to Rodent IsletIsolation and Assessment)，Carter et al.Biological Procedures Online 2009中描述的类似方法，从雄性Wistar大鼠(大约重：300g)中分离胰岛。
简言之，将胰腺用经由总胆管注射的胶原酶灌注。在灌注之后，将胰腺切除，并在37℃下进行消化10分钟。然后通过密度梯度离心纯化胰岛。在37℃和5％CO2下，将纯化的胰岛在非贴壁培养瓶中在补充有10％胎牛血清、2g/L葡萄糖和1％青霉素/链霉素的RPMI介质(Gibco)中进行培养。培养基每2至3天更换一次。
实施例B4：胰岛当量计数
为了使每个实验中使用的胰岛数量归一化，对胰岛或假胰岛进行计数，以确定胰岛当量计数(IEQ)。一个IEQ对应于直径为150μm的完美球形胰岛的体积。在计数期间，根据每个胰岛的尺寸对其应用倍增因子。这种对胰岛不同直径的数学补偿允许胰岛制剂之间归一化(参见NIH CIT联合会化学制造控制监测委员会(NIH CIT Consortium ChemistryManufacturing Controls Monitoring Committee)；纯化的人胰岛：使用双硫腙(Dithizone，DTZ)对胰岛进行定性和定量评估：NIH临床胰岛移植联盟(NIH ClinicalIslet Transplantation Consortium)的标准操作程序。CellR4修复更换再生重新编程(Repair Replace Regen Reprogram))。
在具有50μm网格的载玻片上对来自每个胰岛或假胰岛批次的两个50μL样品进行计数。根据表4按尺寸对胰岛或假胰岛进行分类。
表4：用于胰岛当量确定的胰岛尺寸的倍增因子
| 胰岛尺寸 | 倍增因子 |
| 50-100μm | 1/6 |
| 100-150μm | 1/1.5 |
| 150-200μm | 1.7 |
| 200-250μm | 3.5 |
| 250-300μm | 6.3 |
胰岛当量计数通过对由两个独立样品的计数结果进行平均来确定。
第C部分-物理化学
实施例C1：浓缩的多糖DMCMal溶液的制备
浓缩的多糖溶液通过称取适当重量的根据第A1部分获得的无菌冻干多糖并添加适当重量的无菌去离子水来制备。将溶液放置于定轨振荡器上在70rpm下过夜以完全溶解。通过添加浓缩的HCl(4mol/L)将溶液的pH调节至pH 3、pH 4或pH 5。多糖DMCMal溶液的质量浓度(mg/g)通过干提取物来确定。多糖DMCMal溶液的体积浓度(mg/ml)通过称量三次100μL溶液的密度测量来确定。该溶液冷冻在-20℃下直至使用。
实施例C1A：浓缩的多糖DMCVS溶液的制备
浓缩的多糖溶液通过称取适当重量的根据第A1部分获得的无菌冻干多糖并添加适当重量的无菌去离子水来制备。将溶液放置于定轨振荡器上在70rpm下过夜以完全溶解。通过添加NaOH将溶液的pH调节至pH 7.4。多糖DMCVS溶液的质量浓度(mg/g)通过干提取物来确定。多糖DMCVS溶液的体积浓度(mg/ml)通过称量三次100μL溶液的密度测量来确定。该溶液冷冻在-20℃下直至使用。
实施例C2：浓缩的PEG-SH溶液的制备
浓缩的PEG-SH溶液(来自根据表2的列表)通过称量适当重量的PEG-SH粉末并添加适当重量的无菌去离子水来制备。在无菌过滤(0.22μm)之前，将该溶液放置在滚筒振荡器上在15rpm下2小时以完全溶解。PEG-SH溶液的质量浓度(mg/g)通过干提取物来确定。PEG-SH溶液的体积浓度(mg/ml)通过称量三次100μL溶液的密度测量来确定。该溶液冷冻在-20℃下直至使用。
实施例C3：水凝胶制备-1
水凝胶的制备在无菌环境中进行。
分别根据实施例C1和C2制备的多糖DMCMal和PEG-SH浓缩无菌溶液在室温(20至25℃)或4℃下平衡。
将225μL PEG-SH浓缩溶液添加至在2mL Eppendorf中的225μL多糖DMCMal浓缩溶液中。将溶液用移液管进行混合，并将200μL混合物引入矩形硅树脂模具(IBIDI 12×7.75mm)中。凝胶化在室温(20至25℃)下进行1小时。将水凝胶脱模并引入pH 7.4的10mLPBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液中在37℃下2小时。任选地，PBS溶液含有10mM半胱氨酸。将水凝胶用10mL不含半胱氨酸的PBS溶液冲洗，并进一步浸入20mL PBS溶液中在37℃下过夜。然后将水凝胶块储存在4℃下的10mL PBS溶液中直至使用。
实施例C3A：水凝胶制备-2
水凝胶的制备在无菌环境中进行。
分别根据实施例Cl或C1A和实施例C2制备的多糖DMCMal或DMCVS和PEG-SH浓缩无菌溶液用浓缩的NaCl溶液调节，以便获得等渗储备溶液(300mOsm/kg)，并在室温(20至25℃)或4℃下平衡。任选地，DMCVS浓缩溶液补充有pH 7.4或pH 8的tris缓冲液。
将20mL PEG-SH的浓缩溶液添加至在2mL Eppendorf中的20mL多糖DMCMal或DMCVS的浓缩溶液中。将溶液用移液管混合，并将受控体积的混合物(32μL)引入黏附至载玻片上的圆形硅树脂隔离器(9mm直径/0.5mm厚，来自Grace Biolab)中。
凝胶化在室温(20至25℃)或37℃下进行1小时。将水凝胶脱模并引入pH 8的Tris150mM/NaCl 30mM/半胱氨酸10mM溶液(2mL)中在37℃下1小时15分钟。将水凝胶用20mL不含半胱氨酸的PBS溶液冲洗，并进一步浸入10mL PBS溶液中在37℃下过夜。然后将水凝胶块储存在4℃下的10mL PBS溶液中直至使用。
实施例C4：水凝胶组合物-1
根据实施例C3中描述的方案制备不同的水凝胶组合物(表3)。反应基团(马来酰亚胺(Mal)和硫醇(SH))和聚合物(多糖DMCMal和PEG-SH)的浓度对应于在将聚合物溶液进行混合之后的最终浓度。
表5：由DMCMal多糖和PEG-SH制成的多种水凝胶的组合物
*未用包含半胱氨酸的PBS溶液洗涤的组合物。
获得固体矩形水凝胶块。12×7.75×2.1mm的水凝胶块容易脱模，并用镊子处理用于表征。
实施例C4A：水凝胶组合物-2
根据实施例C3A中所述的方案制备不同的水凝胶组合物(表3)。反应基团(马来酰亚胺(Mal)或乙烯砜(VS)和硫醇(SH))和聚合物(多糖DMCMal或DMCVS和PEG-SH)的浓度对应于在将聚合物溶液进行混合之后的最终浓度.
表6由DMCMal或DMCVS多糖和PEG-SH聚合物制成的水凝胶的组合物
获得固体盘状水凝胶块。水凝胶块(9mm直径/0.5mm厚)容易脱模，并用镊子处理用于表征。
实施例C4’：水凝胶流变学表征
振荡剪切测试用配备有锥板几何的旋转流变仪(AR2000，TA仪器)进行。凝胶化是在“原位”完成的，这意味着在开始振荡测量之前，将多糖和PEG浓缩溶液滴引入锥状物和平板之间，并通过几何的旋转来混合。振荡时间扫描测试在25℃或37℃下进行，其中恒定应变为0.1％，并且恒定振荡频率为1Hz。储能模量G’(即弹性模量)和Tan δ(比率G'/G”)值在1600秒时在测量(G’，G”)的平台区域中作为时间的函数报道。
表4：水凝胶流变学表征的结果。
水凝胶呈现低Tan δ值，这意味着G’比G”高的多，这是表现为固体弹性材料的化学交联水凝胶的典型特性(参见Polysaccharide Hydrogels：Characterization andBiomedical Applications，2016 Pan Stanford Publishing Pte.Ltd.；第3章，第97页)。Mal:SH中浓度的提高导致弹性模量G’值的提高。
提高温度和pH是加速由DMCVS和PEG-SH制备的水凝胶的凝胶化的两种方式。例如，从中性pH进行至pH 8和/或将温度从25℃提高至37℃会导致更快的凝胶化。
这可允许凝胶化速度的微调，这可能是方便的，因为快速凝胶化可有利于避免细胞沉降，而慢速凝胶化可有利于凝胶化之前的聚合物混合浇铸。
实施例C5：水凝胶溶胀和水含量
将水凝胶块在脱模之后(w0)和在PBS溶液中过夜溶胀之后立即称重(w过夜)。溶胀比定义为质量比w过夜/w0。水凝胶的水含量从溶胀状态中水凝胶质量的测量和聚合物的控制中扣除。
表7：水凝胶溶胀和水含量。
水凝胶含有高的水含量。水含量根据聚合物前体的结构和浓度变化。
实施例C6：水凝胶在37℃下的生理介质中的稳定性
将水凝胶块储存在pH 7.4的PBS中或37℃下的血清(FBS胎牛血清)中，并在不同时间段称重。
在实施例C6-1和C6-2中，使用12×8×2.1mm的矩形水凝胶块。在实施例C6-3中，测试了直径为9mm和厚度为1.6mm的盘状水凝胶。
表8：水凝胶在生理介质中的稳定性
将水凝胶完整地回收，并且在37℃下储存在生理介质中之后，其质量没有显著变化。例如，在水解副反应的情况下，在网络结构改变的情况下预期水凝胶膨胀(质量增大)或溶解(质量减小)。这表明水凝胶在生理条件下是稳定的。
实施例C7：水凝胶中大分子探针的包封
将市售荧光右旋糖酐-FITC 3kDa和右旋糖酐-FITC 70kDa各自溶解在水中以获得浓缩的储备溶液。
将分别根据实施例C1和C2制备的多糖DMCMal和PEG-SH浓缩无菌溶液在4℃下平衡。对于基于DMCVS的水凝胶，将分别根据实施例C1A和C2制备的多糖DMCMal和PEG-SH浓缩溶液在20至25℃下平衡。
将多糖DMCMal或DMCVS的溶液与荧光右旋糖酐混合。将100μL PEG-SH的浓缩溶液添加至100μL多糖DMCMal或DMCVS和荧光右旋糖酐的浓缩溶液中。将溶液用移液管混合，并将200μL的后一种混合物引入矩形硅树脂模具(IBIDI 12×7.75mm)中。对于基于DMCMal的水凝胶，凝胶化在室温(20至25℃)下进行1小时，或者对于基于DMCVS的水凝胶，凝胶化在37℃下进行1小时。
将水凝胶块脱模，引入孔(12孔多板)中，并用1.3mL pH 8的Tris(200mM)/NaCl(50mM)的缓冲溶液浸泡，该缓冲溶液含有相同浓度的包封的荧光右旋糖酐。在37℃下进行水凝胶溶胀过夜，并称重上清液以估计溶胀度和水凝胶体积中的量(mg)。
在释放实验之前，将水凝胶用1mL pH 8的Tris的缓冲溶液(200mM)/NaCl(50mM)快速冲洗两次(在实施例C8中示出)。
表9：具有包封的荧光大分子探针的水凝胶的组合物
实施例C8：水凝胶内大分子探针的释放
将根据实施例C7中产生的具有包封的荧光探针的水凝胶各自引入孔(12孔多板)中，并用2mL pH 8的Tris(200mM)/NaCl(50mM)的缓冲溶液浸泡。将板用膜覆盖，并放入37℃下的烘箱中。在不同的时间点取样200μL缓冲液，并替换为新鲜缓冲液。使用校准曲线通过荧光(荧光板阅读器SAFAS)测定样品中的荧光探针浓度。在每个时间点释放的荧光探针的累积分数对应于在溶胀水凝胶中释放的荧光探针的累积量与荧光探针的初始量之比。
表10：在不同时间点从水凝胶中释放的大分子探针的累积级分。
nm*：未测量的
提高大分子探针的尺寸导致释放的动力较慢。这显示了水凝胶网络结构的选择性渗透特性。
实施例C9：在水凝胶中β-TC-tet假胰岛的包封
假胰岛包封在无菌环境中进行。
将分别根据实施例C1和C2制备的多糖DMCMal和PEG-SH浓缩无菌溶液用浓缩的NaCl溶液调节，以便获得等渗储备溶液(300mOsm/kg)。将溶液在室温(20至25℃)或4℃下平衡
通过将等体积的等渗PEG-SH溶液和假胰岛混悬液(根据实施例B1制备的)进行混合来制备PEG-SH和假胰岛的浓缩混合物。然后使用移液管将含有PEG-SH和假胰岛的混合物与等体积的多糖DMCMal的等渗浓缩溶液轻轻混合。
将含有多糖DMCMal、PEG-SH和假胰岛的混合物引入模具中，例如矩形硅树脂模具(IBIDI 12×7.75mm)或多孔板中。
凝胶化在室温(20至25℃)下进行30分钟。将矩形水凝胶块脱模并引入多孔板中。在多孔板中形成的凝胶保持在室温下。
为了中和，在室温(20至25℃)下，将pH 8的2mL Tris(200mM)/NaCl(50mM)的缓冲溶液添加至含有凝胶的孔中持续15分钟。
用2mL含有1μg/mL四环素的培养取代Tris缓冲溶液以停止细胞增殖。水凝胶在进一步使用之前在37℃和5％CO2下孵育。
根据该方法制备不同的水凝胶组合物。
反应基团(马来酰亚胺和硫醇)和聚合物(多糖DMCMal和PEG-SH)的浓度对应于在假胰岛存在下将聚合物溶液混合之后的最终浓度。
表11：含有包封的假胰岛的水凝胶的组合物
实施例C10：薄水凝胶盘的模制
根据实施例C3所述的方案，将浓缩的聚合物溶液在4℃下平衡。将溶液用移液管混合，并将受控体积的混合物引入黏附至载玻片上的圆形硅树脂隔离器(9mm直径/0.5mm厚，来自Grace Biolab)中。
在20至25℃下凝胶化15分钟之后，将水凝胶盘脱模，并在脱模之后立即称重(w0)和在37。C下在PBS中过夜溶胀之后称重(w过夜)。溶胀比定义为质量比w过夜/w0。用测径器测量溶胀水凝胶的直径。厚度是从盘的测量直径和重量推断出来的。
表12：含有包封的假胰岛的水凝胶组合物的厚度
该方法允许通过调节模具的直径和水凝胶的体积来获得受控直径和厚度的水凝胶盘。
实施例C11：水凝胶机械抗性的确定。
为了压缩，将如实施例C3中所述的溶胀的矩形水凝胶块引入平板玻璃结晶器中，并浸入PBS中。单轴压缩在20至25℃下的PBS中通过使用配备有平压缩板的AR2000流变仪的轴向力传感器以0.6mm/分钟的速度进行。当力开始提高时，从板与水凝胶的接触中来确定样品的初始厚度。变形由压缩位移(mm)和初始厚度(mm)的比来定义。断裂时的变形由力/位移曲线来确定。当观察到力相对于位移减小时，即定义为断裂。
对于牵引，狗骨形水凝胶块通过在狗骨形硅树脂模具中模制水凝胶来制备。在20至25℃下，在空气中用配备有螺旋夹具的通用机械测试仪器(Instron或Zwickroell)以3mm/分钟的速度进行单轴牵引。用直尺在夹具之间测量样品的初始长度。变形由牵引位移(mm)和初始长度(mm)之比来定义。断裂时的变形由力/位移曲线来确定。当观察到力相对于位移下降时，即定义为断裂。杨氏模量(Young modulus)由真实应变/变形曲线的斜率来确定。真实应变(kPa)对应于压力(N)与样品在压缩下的瞬时表面积(mm2)之比。
表13：水凝胶的机械抗性
根据本发明的水凝胶表现出非常好的结合了适合于外科植入的可变形性和刚度的机械抗性特征。
实施例C15：水凝胶中产生胰岛素的细胞胰岛的包封
细胞胰岛包封在无菌环境中进行。
将分别根据实施例C1或C1A和C2制备的多糖DMCMal或DMCVS和PEG-SH浓缩无菌溶液用浓缩的NaCl溶液调节，以便获得等渗储备溶液(300mOsm/kg)。对于基于DMCVS的水凝胶，将溶液在室温(20至25℃)下平衡，对于DMCMal水凝胶，将溶液在4℃下平衡。
通过将等体积的等渗PEG-SH溶液胰岛混悬液(根据实施例B1、B2、B3和/或B4制备)进行混合来制备PEG-SH和胰岛的浓缩混合物。然后，将含有PEG-SH和胰岛的混合物与多糖DMCMal或DMCVS的等渗浓缩溶液以70∶30体积∶胰岛混悬液/PEG-SH体积比例∶多糖轻轻混合。
将溶液用移液管轻轻混合，并将受控体积的混合物引入黏附至载玻片上的来自Grace Biolab的圆形硅树脂隔离器中。根据体积和硅树脂模具直径制备不同的水凝胶尺寸。
表14：模制的水凝胶体积和尺寸
凝胶化在室温(20至25℃)或37℃下进行1小时。将并入胰岛的水凝胶脱模，并在室温下引入pH 8的Tris 150mM/NaCl 30mM/半胱氨酸10mM溶液中持续15分钟。然后将水凝胶浸入含有10mM半胱氨酸的培养基中在37℃下持续1小时。在1小时之后，除去含有半胱氨酸的培养基，并替换为培养基。在进一步的体外测试或体内植入之前，将含有细胞的无菌水凝胶储存在37℃和5％CO2下。
根据该方法，用假胰岛或原代胰岛制备不同的水凝胶组合物。反应基团(马来酰亚胺或乙烯砜和硫醇)和聚合物(多糖DMCMal和PEG-SH)的浓度对应于在胰岛存在下将聚合物溶液混合之后的最终浓度。
表15：模制的水凝胶体积和尺寸
比较例CE16：用EDC交联的羧甲基右旋糖酐基水凝胶的制备
浓缩的多糖溶液通过称取适当重量的根据A1部分获得的无菌冻干多糖DMC-3并添加适当重量的去离子水来制备。
EDC/NHS偶联剂的浓缩溶液通过将EDC和NHS粉末溶解在去离子水中来制备。
将EDC/NHS浓缩溶液添加至3mL玻璃小瓶中的多糖浓缩溶液中，以获得所期望的组合物(表15)。获得透明且非黏性的溶液。将小瓶放置在滚筒振荡器上在室温(20至25℃)下30分钟。获得黏性溶液。将受控体积的混合物(100μL)引入黏附至载玻片上的圆形硅树脂隔离器(9mm直径/2mm厚，来自Grace Biolab)。凝胶化在37℃下进行45分钟。
将水凝胶脱模并引入pH 8的Tris 150mM/NaCl 30mM(2ml)中在37℃下持续1小时。用PBS替换Tris/NaCl，并且在机械测试之前将水凝胶在37℃下储存过夜。
表16：用EDC/NHS交联的羧甲基右旋糖酐基水凝胶
实施例C17：用DTT(二硫苏糖醇)(比较例)或PEG-SH交联的DMC-Mal基水凝胶的制备
将分别根据实施例C1和实施例C2制备的多糖DMCMal和PEG-SH浓缩溶液用浓NaCI溶液调节，以获得等渗储备溶液(300mOsm/kg)并在4℃下平衡。
通过将DTT粉末溶解在水和浓缩的NaCl溶液中来制备浓缩的DTT溶液，以便获得等渗储备溶液(300mOsm/kg)并在4℃下平衡。
将112μL DTT或PEG-SH的浓缩溶液添加至在2mL Eppendorf中的112μL多糖DMCMal的浓缩溶液中。将溶液用移液管混合，将受控体积的混合物(100μL)引入黏附至载玻片上的圆形硅树脂隔离器(9mm直径/2mm厚，来自Grace Biolab)中。凝胶化在室温(20至25℃)下进行1小时。将水凝胶脱模并引入pH 8的Tris 150mM/NaCl 30mM(2ml)中在37℃下持续1小时。用PBS替换Tris/NaCl，并将水凝胶在机械测试之前在37℃下储存过夜。
表17：用DTT或PEG-SH交联的DMC-Mal基水凝胶
实施例C18：用EDC/NHS或DTT(比较例)或PEG-SH交联的水凝胶的杨氏模量
将如实施例CE16和C17中所述的圆形水凝胶块引入平板玻璃结晶器中，并浸入PBS中。在20至25℃下，在PBS中通过使用配备有平压缩板的通用机械测试装置(Zwickroell)的轴向力传感器以0.2mm/分钟的速度来进行单轴压缩。当力开始提高时，从板与水凝胶的接触来确定样品的初始厚度。变形由压缩位移(mm)和初始厚度(mm)之比来定义。杨氏模量由真实应变/变形曲线的斜率来确定。真实应变(kPa)对应于压力(N)与样品在压缩下的瞬时表面积(mm2)之比。
表18：水凝胶的压缩杨氏模量
与基于用PEG-SH交联的基于羧甲基右旋糖酐马来酰亚胺的水凝胶相比，用EDC/NHS交联的基于羧甲基右旋糖酐马来酰亚胺的水凝胶或用DTT交联的基于羧甲基右旋糖酐马来酰亚胺水凝胶显示出更小的杨氏模量值。由于杨氏模量代表材料的硬度，这意味着PEG接头导致更适合于外科植入的更硬的水凝胶。
实施例C19：浓缩的多糖右旋糖酐Mal A3溶液的制备
浓缩的多糖溶液通过向比较例A3中所述的无菌冻干多糖中添加适当体积的500mMpH 4的磷酸盐缓冲液来制备。
将溶液放置于轨道振荡器上1小时以完全溶解，并在20至25℃下储存直至当天用于凝胶制备。
比较例CE20：由右旋糖酐A3制备水凝胶
水凝胶的制备在无菌环境中进行。
将分别根据实施例C19和C2制备的多糖右旋糖酐Mal A3和PEG-SH浓缩无菌溶液在室温(20至25℃)下平衡。
将45mL PEG-SH的浓缩溶液添加至在2mL Eppendorf中的133mL多糖右旋糖酐Mal的浓缩溶液和21mL pH 4的500mM磷酸盐缓冲液中。将溶液用移液管混合，并将200mL混合物引入矩形硅树脂模具(IBIDI 12×7.75mm)中。凝胶化在室温(20至25℃)下进行1小时。将水凝胶脱模并引入pH 7.4的10mL PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液中持续一夜。然后更换PBS缓冲液，并随后将水凝胶块储存在4℃下直至使用。
表19：基于右旋糖酐Mal A3的水凝胶
实施例C21：水凝胶透明度的确定
实施例C4和C4A中描述的水凝胶组合物和实施例C中公开的另一些水凝胶在视觉上是透明的，类似于水或PBS介质。
为了量化水凝胶的透明度特性，UV吸光度测量(UV分光光度计V530)通过将水凝胶浇铸在10mm光程的UV比色皿/>中，并测量与欧洲药典标准(Europeanpharmacopeia standard)(StabICal Formazine参考混悬液，由/>提供)比较的500nm处的吸光度来进行。在500nm处的吸光度测量用于量化样品的浊度水平。下表中的样品也在标准条件下，在光线水平为2,000至3,750Lux的黑色面板(/>Apollo II液体检测装置)前进行目视检查。
类似于实施例C3A制备组合物C4A-1的水凝胶。将分别根据实施例C1和实施例C2制备的多糖DMCMal和PEG-SH浓缩无菌溶液用浓缩的NaCl溶液调节，以获得等渗储备溶液(300mOsm/kg)，并在4℃下平衡。
将250μL PEG-SH的浓缩溶液添加至在2mL Eppendorf中的250μL多糖DMCMal或DMCVS的浓缩溶液中。将溶液用移液管混合，将受控体积的混合物(400μL)引入UV比色皿。
凝胶化在室温(20至25℃)下进行1小时。在一小时之后，在其中进行目视检查和紫外吸光度测量，并将1.2mL PBS添加至UV比色皿中。在37℃下溶胀1小时之后，在其中重复进行UV测量和目视检查。
表20：水凝胶透明度的确定(NTU：比浊法浊度单位)
这些结果表明根据本发明的水凝胶是透明的。
第D部分-水凝胶的生物学评价
实施例D1：通过提取物测试评估水凝胶细胞毒性谱
按照ISO 10993-5：医疗装置的生物评估建议，使用提取方法来评价水凝胶的细胞毒性谱。
将水凝胶放置于24孔板中3cm2/ml的培养基(补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的MEM)中。它们在37℃和5％CO2下在定轨搅拌(70rpm)下孵育24小时，以获得水凝胶提取介质。平行地，将HDFa细胞以7500个细胞/孔置于96孔板的培养基中，并在37℃和5％CO2下孵育过夜。第二天，去除细胞的培养基，用水凝胶孵育介质替换。在HDFa细胞与提取培养基在37℃和5％CO2下孵育24小时之后，按照制造商的说明，通过用ATPLite试剂盒(Perkin Elmer)定量细胞内ATP浓度来测量生存力。
使用以下公式计算生存力百分比：
通过该提取物测试来评价水凝胶组合物C4-2、C4-4、C4-9、C4-10、C4A-1和C4A-2的细胞毒性。结果在下表20中示出。将生存力百分比与未经处理的对照进行比较。计算一式三份孔的平均生存力的标准偏差(S.D.)(n＝2个水凝胶，每个提取物存放在一式三份细胞孔中)。
表20：通过提取测试(ISO 10993-5)的水凝胶的生存力。
与未经处理的对照相比，没有一种提取介质显示出任何细胞毒性(参见表20)。DMCMal聚合物长度的变化、反应基团即马来酰亚胺或乙烯砜的性质、PEG-SH聚合物长度的变化、硫醇和马来酰亚胺或乙烯砜反应基团的浓度以及交联化学的类型不影响水凝胶的体外生物相容性。总之，根据该方案，水凝胶没有表现出任何体外细胞毒性。
实施例D2：包封的假胰岛的体外生存力和基础分泌
a)包封的假胰岛的生存力
通过向培养基补充1mM钙黄绿素-AM和8mM溴化乙锭30分钟，用活/死染色(ThermoFisher)对根据实施例C9-1制备的包封的假胰岛进行染色。在洗涤步骤之后，用5×放大的落射荧光显微术(epifluorescence microscopy)对假胰岛进行成像。
使用以下公式计算生存力评分：
表21中显示了从D+1至D+10获得的包封的假胰岛的生存力的结果。
表21：使用活/死染色评估实施例C9-1水凝胶中包封的假胰岛的生存力。
在包封10天之后，超过90％的假胰岛仍然是存活的(表21)。
b)基础胰岛素分泌定量
在不同时间点在培养基中测量基础胰岛素分泌，并使用两种单克隆抗体通过夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)对胰岛素定量进行量化。结果通过包封之前裸露的胰岛的基础胰岛素分泌来归一化。
表22示出了从D+3至D+10中获得的包封的假胰岛的基础胰岛素分泌的结果。
表22：实施例C9-1水凝胶中包封的假胰岛的基础胰岛素分泌
这些结果显示细胞的基础胰岛素分泌得以维持(表22)。
总的来说，这些结果证明包封的假胰岛在包封之后至少10天内存活，其基础生理学没有重大改变。
实施例D3：包封的假胰岛的体外功能
a)假胰岛包封
如实施例C9-2、C9-3和C9-4中所述的包封假胰岛。
b)葡萄糖刺激的胰岛素分泌
在包封之后3天，洗涤包封和未包封的假胰岛，并在含有0.1％BSA和1mM葡萄糖的Krebs缓冲液中孵育60分钟(低糖Krebs，平衡步骤)。在3个洗涤步骤后，假胰岛在低糖Krebs中再孵育60分钟。然后，收集上清液用于胰岛素含量定量。然后将包封和未包封的假胰岛在含有0.1％BSA和16.6mM葡萄糖的Krebs缓冲液中孵育60分钟。最后，收集上清液用于胰岛素含量定量。使用实施例D2b中描述的ELISA测定进行胰岛素定量。通过将在高葡萄糖Krebs和低葡萄糖Krebs条件下测量的胰岛素浓度相除来计算分泌指数。获得的结果在表23中示出。
S.D代表标准偏差(n＝2个水凝胶)。
表23：未包封和包封的假胰岛的分泌指数。
| 组 | 分泌指数±S.D. |
| 未包封的假胰岛 | 3.0±0.3 |
| 实例C9-2 | 2.6±0.3 |
| 实例C9-3 | 2.4±0.5 |
| 实例C9-4 | 2.1±0.6 |
对于所有测试的水凝胶组合物(表23)，包封和未包封的假胰岛的胰岛素分泌反应相似(Kruskal-Wallis检验，p＝0.27)，因此证明假胰岛功能在包封之后在水凝胶中维持至少3天。
实施例D4：包封不影响体外假胰岛的生存力和功能
a)假胰岛和原代胰岛包封
如实施例C15-1和C15-2所述的包封Min-6假胰岛，并在37℃/5％CO2培养箱中的培养基(参见实施例B1)中维持。在包封之后3或4天评价它们的生存力和功能，并与来自同一批次的裸露的假胰岛进行比较。
如实施例C15-4、C15-5、C15-7和C15-9中所述的包封原代人胰岛，并在37℃/5％CO2培养箱中的培养基(来自实施例B2的培养基1)中维持。在包封之后1、2、6或7天评价它们的生存力和功能，并与来自同一批次的裸露的胰岛进行比较。
b)生存力评价
在包封的或裸露的胰岛或假胰岛上使用活/死染色(ThermoFisher)，以确定它们的生存力。该方案与实施例D2a相比略有更新，以提高该方法的稳健性。磷酸盐缓冲盐水(PBS)用于洗涤样品。然后将它们在补充有2mM钙黄绿素-AM和8mM溴化乙锭的PBS中孵育60分钟。它们最终在PBS中洗涤，并使用落射荧光显微术。
通过分割图像进行生存力的量化。计算绿色通道中的积分强度(面积像素强度之和)V(活细胞)和红色通道中的积分强度D(死细胞)。
通过计算获得生存力比率。
c)功能评价方法
为了评价胰岛或假胰岛(裸露的或包裹的)的功能，进行了灌注实验。在包封之后1、2、6或7天，将来自用于包封的批次(原代胰岛或假胰岛)的400个IEQ(参见实施例B4)以及包封的样品灌注室。然后按照表24中描述的一个方案同时灌注腔室。
表24：灌注条件
收集流通缓冲液，并使用用于胰岛素定量的ELISA对胰岛素进行定量。
通过对在每个时间点测量的胰岛素浓度归一化为在第一基础分泌步骤期间测量的平均胰岛素浓度来计算信号提高倍数。
每个样品的分泌指数计算为刺激步骤期间测量的平均胰岛素浓度相对于第一基础分泌步骤期间测量的平均胰岛素浓度之比。
d)在培养7天至后，裸露的和包封的原代人胰岛的体外功能的比较
在包封之后7天，在灌注中评价裸露的和包封的原代人胰岛(参见图1)：裸露的胰岛由圆圈表示，包封的原代人胰岛C15-4由正方形表示，并且C15-5由三角形表示。
图1所示的结果显示，在裸露的胰岛以及包封的样品中，在葡萄糖刺激开始之后10分钟内胰岛素分泌提高。葡萄糖降至基础水平后，胰岛素分泌恢复至基础水平。这些结果有力地表明，在包封之后长至7天，包封的胰岛显示出与裸露的胰岛相似的体外功能。
e)在培养7天之后，裸露的和包封的原代人胰岛的体外生存力和功能的比较
使用实施例D4c(装置：定制装置)中描述的方法，在灌注中评价裸露的原代人胰岛或Min-6假胰岛，并与包封的样品C15-1、C15-2、C15-4、C15-5、C15-7和C15-9进行比较。对于这些组合物，也如实施例D4b中所述评估生存力。
参见表25.S.D.代表标准差。n代表实验的次数，并且n代表每次实验的独立样本数。N.D.意指未确定的。
表25：与包封的样品相比，裸露的假胰岛或胰岛的生存力和功能结果。
结果显示，与裸露的假胰岛相比，Min-6包封的假胰岛生存力降低11％至22％，并且分泌指数无显著差异，表明在包封之后3至4天的功能相似(Welch′s t检验，p＝0.17)。
在包封至后多至7天，未观察到包封的原代人胰岛与裸露的胰岛相比在生存力和功能方面的差异。与裸露的胰岛相比，在包封之后7天的C15-9样品显示出略低的功能，这可能仅仅是由于样品的可变性。
这些结果强烈表明，包封不会显著影响水凝胶中包封的原代人胰岛的生存力(跨原代人胰岛包封条件的ANOVA，p＝0.34)和功能。
实施例D5：包封的原代胰岛的长期体外生存力和功能
a)原代胰岛包封
如实施例C15-3所述，在分离之后2天，将原代大鼠胰岛包封，并在37℃/5％CO2培养箱中的培养基(补充有10％胎牛血清、2g/L葡萄糖终浓度和1％青霉素/链霉素的RPMI培养基)中维持。如实施例C15-8所述的包封原代人胰岛，并维持在37℃/5％CO2培养箱中的培养基(来自实施例B2的培养基2)中。
在包封之后1、5、8、15和22天评价原代大鼠胰岛功能。在包封之后3、7、10、14和21天评价初级人胰岛功能。使用实施例D4c(装置：Peri4，Biorep)中描述的方法，用n＝2个水凝胶评价每个时间点。参见表26。N.D.意指未确定的。S.D.意指标准偏差
表26：包裹的原代胰岛的长期体外生存力和功能。N＝1个独立实验，n＝2个样品
结果显示，包封的原代大鼠胰岛的生存力在体外维持直至包封之后至少15天(ANOVA，p＝0.65)。类似地，原代人胰岛的生存力在包封之后至少21天在体外维持生存力(ANOVA，p＝0.19)。
结果显示包封的原代大鼠胰岛的灌注分泌指数稳定并维持在2以上直至包封之后至少22天(ANOVA，p＝0.35)，表明包封的原代大鼠胰岛是功能性的。在原代人胰岛上观察到类似的结果直至包封之后至少21天(ANOVA，p＝0.44)。
总之，这些结果表明，包封的原代大鼠胰岛(C15-3)的体外生存力和功能在包封之后时间内分别维持至少15天和22天。此外，包封的原代人胰岛(C15-8)的生存力和功能在体外维持至少21天。
实施例D6：大鼠网膜中异种移植的包封胰岛的体内存活和功能。
a)原代人胰岛包封
如实施例C15-6中所述的包封原代人胰岛，并在大鼠网膜中植入3天和6天。
在体内植入
使用称重在250g与400g之间的Wistar大鼠。
使异氟烷进行麻醉。
将每只动物以仰卧位放置于暖垫上。用手术刀片从手术区域剃去皮毛。手术部位用聚维酮碘溶液消毒。
在腹部进行2至3cm长的中线切口。将肠子移至左侧并用盐水浸泡的纱布覆盖以防止脱水。将胃部完全暴露，并将网膜铺在潮湿的纱布上。将两个植入物放在网膜上并用它覆盖(包裹技术)。在网膜上进行不可再吸收的缝线(Prolene 6/0)以将植入物维持在适当的位置，并避免它们滑移和/或重叠。在缝合腹部之前，将2mL生理盐水溶液分配到腹腔中以防止脱水。用连续的不可再吸收的缝线(Prolene 4/0)缝合具有肌肉层的腹膜，然后用间断的单针缝合皮肤(Prolene 4/0)，并用聚维酮碘溶液清洁切口。
在手术之后，将每只动物移至恢复区，并监测其从麻醉中的恢复情况，直至实现胸骨平卧。在康复之后，将动物分组圈养，并观察总体健康状况。
在指定的时间点将动物处死。收集植入部位，并从每只动物上解剖一个不含组织的外植体，用于植入后融合和生存力测定。通过在主动脉分叉水平处放血来采集血液。
b)外植体评价
在体内植入之后3天和6天，如实施例D4b和D4c(装置：Peri4，Biorep)中所述的评价外植体的生存力和功能。参见表27。S.D.代表标准差。
表27：在大鼠网膜中体内植入之后，包封的原代人胰岛外植体的功能。N＝1个独立实验，n＝1个样品。
结果显示，在大网膜中体内植入之后至少6天，包封的胰岛具有75％以上的生存力，且响应于葡萄糖的胰岛素提高。
实施例D7：水凝胶的体内短期局部耐受性：DMC-PEG相对于右旋糖酐-PEG。
水凝胶的局部耐受性是基于指南ISO 10993第6部分(2016)：在植入之后对局部效应测试进行评价的。
将C4-2、C4-3(均为DMC-PEG)和CE20-1(右旋糖酐-PEG)水凝胶植入兔子的背部皮下组织中1周。按照ISO 10993第6部分的建议，肉眼地和通过组织病理学分析(每篇文章和每段时间n＝5个位点)对局部组织效果以及水凝胶的外观进行评价，如下所示：在处死动物和移植水凝胶之后，通过对植入物的多种组分进行0至4级的评分来评价由植入物产生的组织反应性。评价的组分是多形核细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、巨细胞，一部分坏死，另一部分新生血管化、纤维化和脂肪浸润。多种炎症细胞类型或形态学特征仅在存在时才被报道。每件测试品获得的平均评分减去由阴性对照品HDPE(高密度聚乙烯；根据ISO 10993第6部分的建议)获得的平均评分，得出组织反应性评分。
肉眼可见地，C4-2和C4-3水凝胶在形状、尺寸、颜色和稠度方面保存良好。相反，CE20-1水凝胶比植入材料更大。另外，与C4-2和C4-3相比，CE20-1诱导了更强的组织反应(弥漫性发红)。
在组织病理学检查之后，并根据ISO10993指南第6部分对组织反应性的评分量表，发现C4-2和C4-3诱导了“最小至无反应”，而CE20-1被分级为诱导了“中度反应”。
表28：在皮下植入兔中1周之后，C4-2、C4-3和CE20-1相对于阴性对照(NC)HDPE的评分和组织反应性。
n/a：不适用。
这些结果表明，使用DMC形成的水凝胶比使用右旋糖酐形成的水凝胶呈现出更好的耐受性。
实施例D8：水凝胶的体内长期局部耐受性
水凝胶的局部耐受性基于指南ISO10993第6部分(2016)：在植入之后对局部效应的测试进行评价。
将C4A-1和C4A-2水凝胶以及与盘状水凝胶尺寸相同的盘状HDPE植入大鼠的背部皮下组织中13周。如实施例D7中所述，肉眼地和通过组织病理学分析(每个制品和每段时间n＝5个位点)对局部组织效果以及水凝胶的特征进行评价。
肉眼可见地，C4A-1和C4A-2水凝胶在形状、尺寸、颜色和稠度方面保存良好。另外，很少观察到组织反应(发红)。
在组织病理学检查之后，并根据指南ISO10993第6部分对组织反应性的评分量表，发现C4A-1和C4A-2引起“最小至无反应”，并且平均评分反应评分低于阴性对照HDPE。
表29：在皮下植入大鼠中13周之后，C4A-1和C4A-2水凝胶相对于阴性对照(NC)HDPE的评分和组织反应性。n/a：不适用。
因此，在植入大鼠皮下组织13周之后，两种水凝胶均显示出优异的局部耐受性。
实施例D9：水凝胶的体内免疫隔离特性
在涉及将异种(人在小鼠中)或同种(大鼠在大鼠中)包封的朗格汉斯胰岛植入网膜或背侧皮下组织的研究过程期间，评估了水凝胶的免疫分离特性。小鼠和大鼠具有免疫活性。
a)异种移植
使用称重为25至35g的Swiss小鼠。
使每只动物植入一个圆盘状C15-10植入物，该植入物含有约1000个胰岛当量(IEq)，密度为33 000IEq/mL。
在植入之前，带面罩将每只小鼠放置于吸入麻醉剂(异氟烷)下。
为了植入皮下组织(SC)，将局部麻醉软膏(赛洛卡因(xylocaine))施加于手术区域。将每只动物放置于俯卧位。对于网膜植入，将动物置于仰卧位。将动物放置在发热垫上。将中性眼用软膏施加于双眼以保护角膜免于干燥，并根据需要再次施加。用手术刀片从手术区域剃去毛发。手术部位用聚维酮碘溶液消毒。在稍低于肩胛间水平并垂直于脊柱的皮肤上进行足够大的切口以容纳植入物。通过钝性切开皮下组织形成口袋，并将植入物引入该隔间。用不可吸收的线(Prolene 5/0)和手术胶(3M Vetbond)缝合皮肤，并用聚维酮碘溶液清洁切口。
对于网膜植入，在腹部进行2至3cm长的中线切口。将肠移至左侧并用盐水浸泡的纱布覆盖以防止脱水。在棉签的帮助下，充分暴露胃，并使用一对镊子定位并小心地展开网膜。翻转胃以暴露胃后腔。一个植入物被放置在这个腔中并用网膜覆盖。然后胃被推回到其原来的位置。
在手术之后，将每只动物移至恢复区域，并监测其从麻醉中的恢复情况，直至实现胸骨平卧。笼中有饮食凝胶(diet gel)(Diet Gel recovery)。在康复之后，将动物分组圈养，并观察总体健康状况。
在植入之后26天处死动物，并肉眼观察植入部位，然后收集植入物进行组织病理学分析。在植入物周围没有注意到肉眼可见的炎症反应。
无论植入部位如何，对包封的人胰岛的组织病理学检查未发现炎性宿主细胞渗入水凝胶，且未注意到植入物周围组织中的炎性宿主响应迹象。这支持了C15-10水凝胶的良好耐受性及其针对宿主免疫反应免疫隔离异种胰岛的能力。
b)同种异体移植
在糖尿病雄性Wistar大鼠中进行同种异体移植。通过腹膜内施用45mg/kg的链脲佐菌素来诱导糖尿病。在诱导之后10周植入动物。在手术时，动物称重为250至350g。
使每只动物植入两个盘状C15-13植入物，每个植入物含有约200IEq，密度为33000IEq/mL。
将动物用异氟烷麻醉，称重，然后注射了抗炎治疗剂(美洛昔康，1mg/kg SC)和广谱抗生素(Shotapen 0.1mL/kg SC)。另外，将麻醉软膏(利多卡因)施加于手术区域。将每只大鼠仰卧放置加热垫上并准备手术。
在腹部进行中线切口。用棉签将肠移至腔的左侧，以便暴露胃。将网膜定位并小心地铺在湿纱布上。使用镊子将网膜片分开以便创建口袋。将两个植入物放置于产生的空间中，避免重叠，并用网膜组织覆盖。需要时，用生物胶(Tisseel，Baxter)密封口袋边缘。将植入物用不可吸收缝线(MersilkTM 4-0)进行定位。在腹腔中替换了胃和肠。
在缝合切口之前，用NaCl 0.9溶液对腹腔进行再水合(10％的血容量)。用可吸收缝线(VicrylTM 4-0)缝合腹部。
在手术之后立即将膳食凝胶(dietary gel)(Diet gel)放入单独的笼子中，并观察动物直到其胸骨平卧。动物被单独圈养直至康复(至少4天)，然后分组圈养。
在手术之后，动物连续三天每天一次接受抗炎治疗(美洛昔康，1mg/kg SC)，并在手术后三和六天接受两次Shotapen(0.1mL/kg SC)注射。
在第21天采集血液用于血液生化分析。结果没有揭示任何与植入物相关的炎症反应的证据。
在手术之后35天处死动物，并肉眼观察植入部位，然后收集植入物用于组织病理学。没有注意到肉眼可见的炎症迹象。
对包封的大鼠胰岛的组织病理学检查未发现炎性宿主细胞渗入水凝胶，除非当水凝胶因破损而停止使用时。无论植入部位如何，在植入物周围的组织中没有注意到炎症宿主反应的迹象。这支持了C15-13水凝胶的良好耐受性及其针对宿主免疫反应免疫隔离同种异体胰岛的能力。
实施例D10：包封胰岛的功能的体内证明
在用两个含有人胰岛的盘状C15-12植入物植入网膜的大鼠中评价包封的人胰岛的体内功能。每只动物以38000IEq/mL的密度植入5000IEq。
如实施例D9所述进行网膜植入。
通过测量植入之后多至6天的血清中人C肽来评价胰岛的功能。在施用葡萄糖以刺激胰岛素分泌之后15至20分钟，每2至3天采集一次血液。通过腹膜内途径施用2g/kg葡萄糖进行葡萄糖刺激。制备血浆并使用特异性ELISA免疫测定测量C肽(Mercodia，Ref.10.1141.01)。
在植入后3天和6天时，所有动物的C肽血浆水平均可检测到，这表明包封的胰岛具有功能，并且水凝胶允许胰岛素扩散到血流中。
实施例D11：包封胰岛的效力的体内证明
在糖尿病大鼠中评价包封的人胰岛的体内效力。如实施例D7所述诱导糖尿病。通过监测血糖来测量胰岛调节高血糖症的能力来评估效力。
如实施例D9b中所述，使每只动物植入两个盘状C15-13植入物。如实施例D9b中所述进行包封的胰岛的网膜植入。作为对照，将裸露的胰岛植入另一组动物中，如下所述：将几滴生物胶(Tisseel，Baxter)涂在网膜上并使其聚合。一旦胶聚合，将所需数量的胰岛注射到胶中。
在血糖测量之前四小时，除去动物的食物以最小化血糖的可变性。在植入之前的第14天测量血糖(基础值，例如，在第0天)。从切下的尾尖收集一滴血，并使用One血糖仪(来自Lifescan)测量血糖。
在植入之前，所有糖尿病大鼠中的血糖水平均高于600mg/dL的检测限。对照组大鼠的血糖在第14天保持在600mg/dL以上，而植入C15-13植入物的所有大鼠的血糖均下降，在植入之后14天达到平均值340mg/dL(个体血糖值在252与422mg/dL之间)。
表30：在用裸露的胰岛或C15-13植入物植入网膜的糖尿病大鼠中测量的第1天和第14天的个体和平均血糖水平(以mg/dL计)。
裸露的胰岛不能控制高血糖症，这强烈表明及其没有功能，可能是由于宿主反应。相反，包封的胰岛(C15-13)在植入之后14天导致血糖非常强烈的降低，表明包封的胰岛是存活的和有功能的，这要归功于水凝胶在保持其效力的同时提供免疫隔离的能力。
Claims (17)
1.带有羧酸类基团的交联右旋糖酐聚合物，其中属于两个不同聚合物链的右旋糖酐的至少两个糖单元通过至少一个至少二价的基团L(-)i共价连接，该至少二价的基团是包含至少15个碳原子和任选地杂原子例如氧、氮或硫的直链、支链或环状烷基。
2.根据权利要求1所述的交联右旋糖酐聚合物，其中所述至少二价的基团L(-)i与具有i-(R1)mG1-基团的右旋糖酐聚合物主链共价结合，其中，
-L(-)i是在其末端带有杂原子例如氧、氮或硫的直链或支链聚醚，
-i是L的化合价，并且是2至8的整数(2≤i≤8)
-m是等于0或1的整数，
--R1-是包含1至6个碳原子和任选地杂原子例如氧、氮或硫的直链或支链烷基二价基团，
--G1-是包含1至6个碳原子的直链或支链或环状烷基二价基团，并且可包含杂原子例如氧、氮或硫。
3.根据权利要求1或2所述的交联右旋糖酐聚合物，其中与所述糖单元结合的所述羧酸类基团通过醚键结合并且选自根据式I的羧酸类基团
-(CH2)n-COX
式I
其中
-n是1至7的整数(1≤n≤7)
-X选自-OH、-ONa、-OK或-(R1)mG1-基团。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的交联右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是在其末端带有至少两个杂原子例如氧、氮或硫的直链聚醚基团。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的交联右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是在其末端带有杂原子例如氧、氮或硫的支链聚醚，所述支链聚醚包含至多8个臂。
6.根据权利要求4所述的交联右旋糖酐聚合物，其中i＝2并且L(-)i是由巯基聚乙二醇产生的根据式II的基团：
-S-(CH2-CH2O)p-CH2-CH2-S-
式II
其中p是8至1000的整数(8≤p≤1000)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的交联右旋糖酐聚合物，其中L(-)i是由巯基乙基聚氧乙烯产生的根据式III的基团：
-其中Q是碳原子或包含1至10个碳原子的烷基链，所述烷基链可包含选自氧、硫和氮的杂原子
-p是8至1000的整数(8≤p≤1000)
-q是2至8的整数(2≤q≤8)
-Z是-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-S-。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的交联聚合物，其中-R1-是包含1至6个碳原子和任选地杂原子例如氧、氮或硫的直链或支链烷基二价基团。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的交联右旋糖酐聚合物，其中所述-R1-基团通过酰胺官能团共价结合，所述酰胺官能团由右旋糖酐所带有的羧酸类基团与一种带有胺官能团的-R1-前体或-(R1)m-G1-前体反应产生。
10.根据权利要求2至8中任一项所述的交联右旋糖酐聚合物，其中-R1-基团通过醚官能团共价结合，所述醚官能团由右旋糖酐所带有的羟基官能团与一种带有离去基团即卤素原子的-R1-前体或-(R1)m-G1-前体反应产生。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的交联右旋糖酐聚合物，其中-G2作为-G1-基团的前体选自马来酰亚胺或者乙烯基砜或者包含马来酰亚胺或乙烯基砜的基团。
12.根据前述权利要求中任一项所述的交联右旋糖酐聚合物，其中所述右旋糖酐聚合物主链是根据式XII的，
其中R选自-H、-(CH2)n-COX或-(R1)mG1-；n、m、X、-R1-、-G1-和L(-)i如权利要求2和3中所限定，并且L(-)i与另一个具有-(R1)mG1-基团的右旋糖酐聚合物主链共价结合，并且
-I是20至5000(20≤I≤5000)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的交联右旋糖酐聚合物，其中
-具有-(R1)mG1-基团的右旋糖酐主链的取代度(DS1)在0.001至0.4的范围内(0.001≤DS1≤0.4)和/或
-具有根据式I所述的羧酸类基团的右旋糖酐主链的取代度(DS2)在0.5至3的范围内(0.5≤DS2≤3)和/或
-所述右旋糖酐聚合物的所述-(R1)mG1-基团的摩尔浓度与交联基L(-)i的反应性官能团的摩尔浓度之间的摩尔比(DC)在0.5至1.5的范围内(0.5≤DC≤1.5)。
14.水凝胶，其包含根据前述权利要求中任一项所述的交联右旋糖酐聚合物。
15.根据权利要求14所述的水凝胶，其特征在于其还包含生物细胞。
16.根据权利要求14至15中任一项所述的水凝胶的治疗用途，其用于在哺乳动物中治疗病症或疾病，其中所述病症或疾病是由于胰腺器官的内分泌功能缺乏或功能障碍所致。
17.植入物，其包含根据权利要求14至15中任一项所述的水凝胶。
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