CN116640765A - 一种工程改造的sgRNA设计及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向DNA的RNA及其在基因编辑中的应用，其包含单向导RNA(sgRNA)和富含腺嘌呤核糖核苷酸的核糖核苷酸序列；以及提供了提高sgRNA介导的基因编辑的效率的方法，包括在sgRNA的3’端添加富含腺嘌呤核糖核苷酸的核糖核苷酸序列。

Description

一种工程改造的sgRNA设计及制备方法
技术领域
本发明涉及基因编辑领域，特别涉及一种工程改造的单向导RNA(sgRNA)。
背景技术
成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)技术是一种双组分基因编辑系统，其中效应蛋白在基因靶向单向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)的帮助下诱导基因编辑(Wiedenheft,B.et al.(2012)RNA-guided genetic silencing systems in bacteriaand archaea.Nature 482,331-338)。sgRNA结构包括CRISPR RNA(crRNA)、反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)和tetraloop，长度在97-103个核苷酸(Basila,M.etal.(2017)Minimal 20-O-methyl phosphorothioatelinkage modification pattern ofsynthetic guide RNAs forincreased stability and efficient CRISPR-Cas9 geneediting avoiding cellular toxicity.PLoS One12,e0188593)。
sgRNA可以通过化学合成(Wang,W.et al.(2018)BacteriophageT7transcription system:an enabling tool in syntheticbiology.Biotechnol.Adv.36,2129–2137)或体外转录产生。化学合成sgRNA可以快速提供足够数量和保证纯度的预期sgRNA，但是从技术上讲，化学合成冗长的RNA是不可行的，化学合成sgRNA(102nt)的长度已接近化学合成工艺所能达到的序列保真度的上限(Zetsche,B.et al.(2015)Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cassystem.Cell 163,759–77125)。
体外转录可以制备较长sgRNA，并且扩大生产容易，序列保真度高，但是由于体外转录的过程无法进行碱基和结构的修饰，sgRNA稳定性较差，易被核酸酶降解，导致体外转录制备的同样序列的sgRNA引导核酸酶的基因编辑效率低(Hu Z.et al.Customized one-step preparation of sgRNA transcription templates via overlapping PCR Usingshort primers and its application in vitro and in vivo gene editing[J].Cell,Bioscience,2019,9)。
sgRNA可以通过多种方式进行工程改造，包括化学修饰、间隔序列长度的改变、间隔序列或支架序列的修饰、DNA序列的修饰以及对部分RNA序列使用DNA替换。化学修饰只能使用在化学合成制备sgRNA的过程中，且化学合成的制备长度限制在了110个核苷酸的极限。间隔序列长度的改变可以提高sgRNA引导基因编辑的特异性，但是不能提高sgRNA的稳定性和基因编辑的效率。间隔序列或支架序列的修饰能提高sgRNA与cas9蛋白酶的结合能力，但是不能提高sgRNA的稳定性。DNA序列的修饰及替换在技术上操作复杂，sgRNA制备成本高昂。
因此，需要能够通过体外转录大量制备出引导基因编辑效率高的sgRNA。
发明内容
针对RNA稳定性研究，我们首先尝试了使用加帽酶和加尾酶来对sgRNA的5’端和3’端进行修饰，结果显示，相比于未修饰的sgRNA，加帽酶和加尾酶修饰后的sgRNA能明显提高基因编辑效率(图4A，泳道2和泳道3结果对比；图4B，泳道2和泳道3结果对比)。但是，由于加尾酶和加帽酶成本较高，且poly(A)尾的序列数不确定，导致在生产sgRNA的过程中成本高，工艺复杂，且sgRNA序列单一性较低。
第一方面，本发明提供了一种靶向DNA的RNA，其包含sgRNA和位于3’端的富含腺嘌呤核糖核苷酸(A)的长度大于20个核糖核苷酸的序列。优选地，所述富含腺嘌呤核糖核苷酸(A)的核糖核苷酸序列的长度为至少20个核糖核苷酸，其中所述A在所述核糖核苷酸序列中的含量为至少60％，更优选地，选自SEQ ID NO：13、20和21。
在一个实施方案中，所述sgRNA从5’至3’方向包含：特异性靶向DNA序列的核糖核苷酸序列和CRISPR效应蛋白结合部分。特别地，所述靶向DNA序列的核糖核苷酸序列的长度为18-25个核糖核苷酸，优选与所述DNA中的靶序列100％互补，和/或，所述蛋白质结合部分包含杂交形成双链RNA(dsRNA)双链体的两个至少部分互补的核糖核苷酸片段。
第二方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码第一方面的靶向DNA的RNA。
第三方面，本发明提供了一种构建体，其包含第二方面的核酸。
第四方面，本发明提供了一种生产第一方面的靶向DNA的RNA的方法，包括：(a)提供编码所述靶向DNA的RNA的核酸，例如第二方面的核酸；和(b)体外转录所述核酸，以产生RNA，以及(c)任选地，分离和/或纯化所产生的RNA。特别地，所述核酸通过PCR扩增获得。
第五方面，本发明提供了一种提高sgRNA介导的基因编辑的效率的方法，包括在sgRNA的3’端添加富含腺嘌呤核糖核苷酸(A)的核糖核苷酸序列，所述核糖核苷酸序列的长度为至少20个核糖核苷酸，其中所述A在所述核糖核苷酸序列中的含量为至少60％。特别地，所述富含腺嘌呤核糖核苷酸(A)的核糖核苷酸序列选自：SEQ ID NO：13、20和21。
第六方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含：
-模板引物核酸，其包含编码CRISPR效应蛋白结合部分的核酸序列；和
-第一引物，其从5’至3’方向包含与SEQ ID NO：13、20或21所示序列互补的序列以及与模板引物核酸3’端的部分序列互补的序列，
-任选包含第二引物，其从5’至3’方向编码启动子、相应于特异性靶向DNA序列的核糖核苷酸序列的序列和相应于CRISPR效应蛋白结合部分的5’端一部分的序列。
第七方面，本发明提供了一种基因编辑方法，包括使用第一方面的靶向DNA的RNA第二方面的核酸或第三方面的构建体。
第八方面，本发明提供了第一方面的靶向DNA的RNA、第二方面的核酸或第三方面的构建体用于基因编辑的用途。
附图说明
图1：sgRNA通过PCR方法的制备流程图。
图2：不同类型的sgRNA引导cas9蛋白进行体外切割DNA片段。DNA片段大小为926bp左右，酶切后片段大小分别约为516bp和410bp。泳道1和7为DNA Marker；泳道2为目的DNA片段；泳道3为化学合成的sgRNA引导cas9蛋白进行体外切割目的DNA片段，其中sgRNA的两端分别进行了2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯修饰(SEQ ID NO：3)；泳道4为体外转录制备的sgRNA引导cas9蛋白进行体外切割目的DNA片段，其中sgRNA的3’端进行了poly(A)尾修饰；泳道5和泳道6为体外转录制备的sgRNA引导cas9蛋白进行体外切割目的DNA片段，其中sgRNA没有进行任何修饰。
图3：不同类型的sgRNA引导cas9蛋白进行体外切割DNA片段。DNA片段大小为900bp左右，酶切后片段大小分别约为500+bp和400bp。泳道1和6为DNA Marker；泳道2为目的DNA片段；泳道3为化学合成的sgRNA引导cas9蛋白进行体外切割目的DNA片段，其中sgRNA的两端分别进行了2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯修饰(SEQ ID NO：3)；泳道4为体外转录制备的sgRNA引导cas9蛋白进行体外切割目的DNA片段，其中sgRNA的3’端加了固定序列，(固定序列如SEQ ID NO：13所示)；泳道5为体外转录制备的sgRNA引导cas9蛋白进行体外切割目的DNA片段，其中sgRNA的3’端加了固定序列(固定序列如SEQ ID NO：13所示)，sgRNA的5’端进行了加帽修饰。
图4：不同类型的sgRNA引导cas9蛋白进行细胞内基因编辑后，目的序列同源重组的检测。此实验过程为首先使用不同类型的sgRNA引导cas9蛋白进行细胞内基因编辑并同时加入插入基因组的目的DNA序列，通过同源重组修复达到将目的DNA序列插入到基因组中的目的，然后培养细胞72h，提取细胞基因组，最后通过能否扩增出整合到基因组中的序列来判定是否细胞内发生了同源重组。扩增引物分别在左侧同源臂和右侧同源臂的两端。其中验证左侧同源臂同源重组的正向引物序列(SEQ ID NO：9)位于同源臂左侧的基因组中，验证左侧同源臂同源重组的反向引物序列(SEQ ID NO：11)位于插入的基因序列中；验证右侧同源臂同源重组的正向引物序列(SEQ ID NO：12)位于同源臂右侧的基因组中，验证右侧同源臂同源重组的反向引物序列(SEQ ID NO：10)位于插入的基因序列中。图4A示出在左侧同源臂附近的同源重组后的序列扩增，其中扩增序列片段大小为1304bp；图4B示出在右侧同源臂附近的同源重组后的序列扩增，其中扩增序列片段大小为1321bp；泳道1为DNAMarker；泳道2为体外转录制备的sgRNA(无修饰)和cas9蛋白引导的同源重组后扩增的DNA片段；泳道3为体外转录制备的sgRNA(5’端加帽和3’端加尾修饰)和cas9蛋白引导的同源重组后扩增的DNA片段；泳道4为体外转录制备的sgRNA(3’端固定序列修饰)和cas9蛋白引导的同源重组后扩增的DNA片段；泳道5为体外转录制备的sgRNA(5’端加帽和3’端固定序列修饰)和cas9蛋白引导的同源重组后扩增的DNA片段；泳道6为化学合成的sgRNA(5’端和3’端2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯修饰)和cas9蛋白引导的同源重组后扩增的DNA片段；泳道7为仅有化学合成的sgRNA(5’端和3’端2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯修饰)引导的同源重组后扩增的DNA片段，此实验组为阴性对照组；泳道8为未基因编辑的细胞扩增的DNA片段，此实验组为阴性对照组。
图5：优化sgRNA的3’端增加序列长度。由于基因编辑成功后，原可以表达NeonGreen-teLuciferase的稳定株细胞293T-GL中的NeonGreen-teLuciferase表达元件被编辑置换，不再表达荧光素酶，之前表达的荧光素酶蛋白也在1周内逐步下降到本底水平。因而通过检测基因编辑1周后残留的荧光素酶活性便可比较不同sgRNA(SEQ ID NO：14～19)介导的基因编辑的相对效率。图5的结果显示，3’端增加的序列为在20个核糖核苷酸残基以上时效果更佳，其中NG20-sgRNA的效果最佳。(**,p<0.01)
具体实施方式
除非另有说明或者上下文明显，本文所用的缩写具有其在化学和生物学领域内的常规含义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。本发明中未作具体说明的实验方法，均根据《分子克隆实验指南》(第四版)J.萨姆布鲁克一书中具体方法进行，或者按照相关产品说明书进行。本发明中所用生物试剂，无特殊说明，均可以从商业途径获得。本领域技术人员在不偏离本发明精神的范围内可以进行多种变化、改变和替代。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，并且定义为由通过肽键连接的氨基酸残基组成的生物分子。
如本文所用，术语“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸”和“核酸序列”可互换使用，是指多个核苷酸通过3’-5’-磷酸二酯键连接而成的大分子，其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。除非特别指出或者根据上下文可以确定，本文的核酸包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体等。
除非另有说明，本文中提及核酸(包括DNA和RNA)序列时从左至右为5′至3′方向；提及氨基酸序列时从左(上游)至右(下游)为氨基(N)至羧基(C)方向。
如本文所用，术语“脱氧核糖核酸序列”、“脱氧核糖核苷酸序列”、“聚脱氧核糖核苷酸”和“DNA”可互换使用，是指脱氧核糖核酸，主链由脱氧核糖核苷酸(脱氧腺嘌呤核苷酸(A)、脱氧鸟嘌呤核苷酸(G)、脱氧胞嘧啶核苷酸(C)和/或脱氧胸腺嘧啶核苷酸(T))通过3’,5’-磷酸二酯键连接形成的线形或环形多聚体，包含单链或双链，线性或圆形。DNA可以包含本领域已知的合适修饰，例如甲基化、硫代等。
如本文所用，术语“核糖核酸序列”、“核糖核苷酸序列”、“聚核糖核苷酸”和“RNA”可互换使用，是指核糖核酸，主链由核糖核苷酸(腺嘌呤核苷酸(A)、鸟嘌呤核苷酸(G)、胞嘧啶核苷酸(C)和/或尿嘧啶核苷酸(U))通过磷酸二酯键聚合而成的线性大分子。除非另有说明或根据上下文可以推断，提及RNA是指单链RNA分子。所述单链RNA分子可具有部分双链结构(例如茎环结构)，而该RNA分子在变性后，为一条单链核苷酸链。
如本文所用，“互补”是指与给定序列能够以相反方向(即5’-3’/3’-5’)以Watson-Crick碱基配对即A-T/A-U或G-C形式互补，从而形成双链的序列，例如5’-ATGC-3’和5’-GCAT-3’彼此是互补序列。本文中所用的互补序列的长度可以为任何合适长度，优选为10-30个核苷酸，更优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
如本文所用，术语“编码”RNA的DNA序列为转录成该RNA的DNA核酸序列。DNA核酸可编码mRNA、tRNA、rRNA或本文所述的靶向DNA的RNA。
如本文所用，“gRNA”和“向导RNA”可互换使用，指的是能够与CRISPR效应蛋白形成复合物并由于与靶序列具有一定互补性而能够将所述复合物靶向靶序列的RNA分子。例如，在基于Cas9的基因编辑系统中，gRNA通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成，其中crRNA包含与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性地结合的序列。本领域已知可以设计单向导RNA(sgRNA)，其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。
如本文所用，术语“单向导RNA”或“sgRNA”是指能够与CRISPR效应蛋白形成复合物并由于与靶序列(例如待编辑的DNA序列中的特定序列)具有一定互补性的核苷酸序列(如本文所述的spacer序列)而能够将所述复合物靶向靶序列的单一RNA分子。例如，sgRNA可以包括特异性靶向DNA序列的核糖核苷酸序列和CRISPR效应蛋白结合部分，该部分包括两段序列互补的能够形成RNA双链体的序列。基于所使用的CRISPR核酸酶和待编辑的靶序列设计合适的sgRNA属于本领域技术人员的能力范围内，例如可参见：Wang,Y.etal.Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheatconfers heritable resistance to powdery mildew.Nat.Biotechnol.32,947-951(2014)；Shan,Q.et al.Targeted genome modification of crop plants using aCRISPR-Cas system.Nat.Biotechnol.31,686-688(2013)；Liang,Z.et al.Targetedmutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system.J GenetGenomics.41,63–68(2014)。
如本文所用，术语“CRISPR效应蛋白”通常指在天然存在的CRISPR系统中存在的核酸酶，以及其修饰形式、其变体、其催化活性片段等。该术语涵盖基于CRISPR系统的能够在细胞内实现基因基因编辑的任何效应蛋白或其功能性变体。CRISPR效应蛋白可以通过与sgRNA一起相互作用来识别、结合和/或切割靶核酸结构。在一些实施方案中，所述CRISPR效应蛋白和其功能性变体具有双链切割活性，即在靶序列中形成双链断裂(DSB)的能力。
所述基因编辑一般导致靶序列中的一或多个核苷酸缺失，优选多个连续核苷酸的缺失。缺失的类型和长度取决于CRISPR核酸酶造成的双链断裂(DSB)位置和靶序列或其互补序列中存在的胞嘧啶(C)碱基的数量和位置。在一些实施方案中，所述缺失的长度不超过所述靶序列的长度。例如，所述缺失可以是大约1-25个核苷酸，例如10-25个核苷酸，例如10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸的缺失。
“CRISPR效应蛋白”的实例例如是Cas9核酸酶或其活性变体(例如包含Cas9的活性DNA切割结构域和Cas9的gRNA结合结构域的蛋白)。“Cas9核酸酶”和“Cas9”在本文中可互换使用，是CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统)基因组编辑系统的组分，能在向导RNA的指导下靶向并切割DNA靶序列形成DNA双链断裂(DSB)。所述Cas9核酸酶可以是来自不同物种的Cas9核酸酶，例如来自化脓链球菌(S.pyogenes)的spCas9或衍生自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的SaCas9。
“CRISPR效应蛋白”的实例还可以包括Cpf1核酸酶或其变体，所述Cpf1核酸酶可以来自不同物种，例如来自Francisella novicida U112、Acidaminococcussp.BV3L6和Lachnospiraceae bacterium ND2006的Cpf1核酸酶。
如本文所用，“靶序列”是与sgRNA中包含的大约20个核糖核苷酸的引导(spacer，即所述特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列)序列互补或相同(取决于CRISPR核酸酶)的序列。sgRNA通过与靶序列或其互补链之间的碱基配对而靶向所述靶序列。
第一方面，本发明提供了一种靶向DNA的RNA，其从5’至3’方向，包含：(i)单向导RNA(sgRNA)和(ii)富含腺嘌呤核糖核苷酸(A)的核糖核苷酸序列，所述富含腺嘌呤的核糖核苷酸序列长度为至少20个核糖核苷酸，其中A在所述富含腺嘌呤核糖核苷酸的核糖核苷酸序列中的含量为至少60％。
在一个实施方案中，所述富含腺嘌呤核糖核苷酸的核糖核苷酸序列的长度为20-30例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核糖核苷酸。优选地，所述富含腺嘌呤核糖核苷酸的核糖核苷酸序列的长度为20-25、20-24、20-23例如20、21、22、23、24个核糖核苷酸。在一个特别优选的实施方案中，所述富含腺嘌呤核糖核苷酸的核糖核苷酸序列的长度为20个核糖核苷酸。
在一个实施方案中，A在所述富含腺嘌呤核糖核苷酸的核糖核苷酸序列中的含量为至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或更高。所述含量是指核糖核苷酸序列中腺嘌呤核糖核苷酸数占总核糖核苷酸数的百分比。
在一个实施方案中，所述富含腺嘌呤核糖核苷酸的核糖核苷酸序列选自SEQ IDNO：13、20和21。在一个特别优选的实施方案中，所述富含腺嘌呤核糖核苷酸的核糖核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
在一个实施方案中，所述富含腺嘌呤核糖核苷酸的核糖核苷酸序列的5’端可以与所述CRISPR效应蛋白结合部分的3’端直接连接或者通过本领域已知的任何合适方式例如核苷酸接头间接连接，只要连接后不显著影响CRISPR效应蛋白结合部分与CRISPR效应蛋白的相互作用即可。
在一个实施方案中，所述核苷酸接头的长度可为约3-30个核苷酸，例如约3-25、3-20、3-15、3-10、3-5、5-25、5-20、5-15、5-10、10-25、10-25、10-20、10-15、15-25、15-20、20-25个核苷酸，如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个核苷酸。
本文中，所述RNA靶向的DNA可以是任何希望被编辑的DNA，例如存在于单细胞真核生物内、植物细胞内、无脊椎动物的细胞内或脊椎动物的细胞内的DNA分子。
如本文所用，术语“sgRNA”是指本领域已知的和可获得的任何sgRNA。在一个实施方案中，sgRNA从5’至3’方向包含特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列和CRISPR效应蛋白结合部分。在一个实施方案中，sgRNA包含从5’至3’方向包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。
在一个实施方案中，本文sgRNA的长度可为约80-120个核糖核苷酸，例如约80-115、80-110、80-105、80-100、80-95、80-90、85-115、85-110、85-105、85-100、85-95、85-90、90-115、90-110、90-105、90-100、95-115、95-110、95-100个核糖核苷酸，如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105个核糖核苷酸。
如本文所用，所述特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列是指包含与靶DNA序列互补的核糖核苷酸序列的核糖核苷酸序列。sgRNA因此能够通过杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶DNA相互作用。根据靶DNA序列，本领域技术人员可以设计所需的特异性靶向序列，从而实现与靶DNA的特异性相互作用。
在一个实施方案中，所述特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列的长度可以为约8-50个核苷酸。例如约8-45、8-40、8-35、8-30、8-25、8-20、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、8-10、9-45、9-40、9-35、9-30、9-25、9-20、9-15、9-14、9-13、9-12、9-11、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、10-14、10-13、10-12个核苷酸，例如约为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸。在一个实施方案中，所述特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列的长度可以为约20-23例如20、21、22或23个核苷酸。
在一个实施方案中，所述特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列是与靶DNA序列至少部分互补、优选完全互补的核糖核苷酸序列，从而能够特异性靶向靶DNA序列。在一个实施方案中，所述特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列的长度为18-25个核糖核苷酸，例如18、19、20、21、22、23、24或25个核糖核苷酸。
本文中，所述CRISPR效应蛋白结合部分是能够与CRISPR效应蛋白形成复合物的核糖核苷酸结构，由此，所述CRISPR效应蛋白通过特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸的靶向作用可以定位于靶DNA序列，从而可以允许进行后续的基因组编辑(例如CRISPR技术所示)。
在一个实施方案中，所述CRISPR效应蛋白结合部分包含能够形成双链RNA双链体的两个至少部分互补的核糖核苷酸片段。在一个实施方案中，所述CRISPR效应蛋白结合部分至少包含crRNA的一部分(即除特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列之外的部分)和tracrRNA，任选包含tetraloop区。
在一个实施方案中，所述crRNA和tracrRNA可通过核苷酸接头连接并且部分序列杂交形成双链RNA双链体，从而形成茎环结构，从而能够与CRISPR效应蛋白(例如Cas9)相互作用。在一个实施方案中，所述双链RNA双链体的长度可为约6-50bp，例如约6-40、6-30、6-25、6-20、6-15、8-40、8-30、8-25、8-20或8-15bp，如约8-10、10-15、15-18、18-20、20-25、25-30、30-35、35-40或40-50bp。
如本文所用，crRNA包含形成dsRNA双链体的一半的核糖核苷酸，以及tracrRNA包含形成dsRNA双链体的另一半的核糖核苷酸。由此，crRNA与tracrRNA互补并杂交，形成CRISPR效应蛋白结合部分的dsRNA双链体。
本领域已知或可获得各种crRNA和tracrRNA。例如，各种crRNA和tracrRNA以对应的互补对形式可见于例如CN107603976B的图8。本文所述的sgRNA可包含任何对应的crRNA和tracrRNA对。
在一个实施方案中，所述蛋白质结合部分的长度可为约8-100个核糖核苷酸。例如，蛋白质结合部分的长度可为约10-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、15-100、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-100、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、20-25、25-100、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40、25-30例如10、15、20、25、30、35、40个核糖核苷酸。
在一些实施方案中，所述CRISPR效应蛋白可以是选自Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Cas9、Csn2、Cas4、Cpf1、C2c1、C2c3和C2c2的核酸酶，或这些核酸酶的功能性变体。
本发明人发现：在所述CRISPR效应蛋白结合部分的3’端连接包含如SEQ ID NO：13、20或21所示的核糖核酸序列后，可以提高基因组编辑效率和靶特异性，能够实现高效安全的基因编辑。所述SEQ ID NO：13、20或21所示的核糖核酸序列的5’端可以与所述CRISPR效应蛋白结合部分的3’端直接连接或者通过本领域已知的任何合适方式例如核苷酸接头间接连接，只要连接后不显著影响蛋白质结合部分与定点修饰多肽的相互作用即可。
第二方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码第一方面的RNA。
特别地，所述核酸为DNA分子，其能够转录产生所述RNA。在一个实施方案中，所述核酸包含编码上文所述的启动子、sgRNA以及所述富含腺嘌呤核糖核苷酸的核糖核苷酸序列的多核苷酸。
第三方面，本发明提供了一种构建体，其包含第二方面的核酸。
另外，所述构建体包括载体例如表达载体，其中所述构建体包括用于转录和/或翻译的所需元件，例如启动子、增强子、转录终止子等，由此可以通过转录获得RNA。本领域已知并可获得多种适合的表达载体。
本文中，启动子可以是任何适合的启动子、特别是真核启动子，例如包括但不限于T7启动子、CMV立即早期启动子、SV40启动子。在一个实施方案中，所述T7启动子包含SEQ IDNO：4的第1-21位核苷酸所示的序列。
第四方面，本发明提供了一种生产第一方面的RNA的方法，包括：(a)提供编码所述RNA的核酸；和(b)体外转录所述核酸，以产生RNA，以及任选地(c)分离和/或纯化所产生的RNA。
可以通过任何合适的方法提供编码RNA的核酸，例如化学合成或生物表达或扩增例如PCR。所述核酸可以是RNA或DNA，优选DNA。
如本文所用，体外转录是指在非活细胞或者细胞外环境中，使用转录试剂例如RNA聚合酶和其它所需离子或化合物，自靶DNA合成RNA的过程。
RNA的分离和纯化是本领域技术人员熟知的，可以采用任何合适的方法进行。
在一个实施方案中，本发明提供了一种生产第一方面的RNA的方法，包括：
(i)提供包含相应于本文所述CRISPR效应蛋白结合部分的模板引物核酸，
(ii)提供上游引物和下游引物，其中下游引物自5’至3’方向包含与SEQ ID NO：13、20或21所示序列互补的序列和与模板引物核酸3’端的部分序列互补的序列，上游引物包含相应于特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列的核苷酸序列和模板引物核酸5’端的部分序列，
(iii)进行PCR扩增，获得模板核酸，优选模板DNA，
(iv)从所述模板核酸进行体外转录，获得RNA，以及
(v)任选地，分离纯化所获得的RNA。
在一个实施方案中，上游引物包含启动子序列、相应于特异性靶向靶DNA序列的核苷酸序列的核苷酸序列和模板引物核酸5’端的部分序列。
如本文所用，“相应于模板引物核酸5’端的部分序列”和“相应于特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列的核苷酸序列”是指所述核苷酸序列与模板引物核酸5’端的部分序列或特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列一致，除了在DNA中使用T代替RNA中的U。
在一个实施方案中，所述模板引物核酸包含SEQ ID NO：6所示的DNA序列。
如本文所用，所述启动子可以使用本领域已知的任何合适的启动子，例如那些可以用于体外转录的启动子，如T7 RNA聚合酶启动子、T3 RNA聚合酶启动子。在一个实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO：4的第1-21位核苷酸所示的序列。
如本文所用，模板引物核酸5’端的部分序列是指位于模板引物核酸5’端的一段序列。由此该引物能够与模板引物核酸的反义链互补，在模板引物核酸退火后与反义链杂交，从而能够通过合适方法例如PCR扩增模板引物核酸。
如本文所用，与模板引物核酸3’端的部分序列互补的序列是指与位于模板引物核酸3’端的序列互补的序列片段。由此该引物能够与模板引物核酸的有义链互补，在模板引物核酸退火后与有义链杂交，从而能够通过合适方法例如PCR扩增模板引物核酸。
所述模板引物核酸5’端或3’端的部分序列或其互补序列可以为适于用作引物的任何长度，例如约8-50个核苷酸，例如约8-45、8-40、8-35、8-30、8-25、8-20、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、8-10、9-45、9-40、9-35、9-30、9-25、9-20、9-15、9-14、9-13、9-12、9-11、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、10-14、10-13、10-12个核苷酸，例如约为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸。
PCR扩增是本领域熟知方法。本领域技术人员根据要扩增的序列以及引物序列可以确定合适的扩增步骤和条件。
体外转录是本领域熟知方法。本领域技术人员根据要转录的序列可以确定合适的转录步骤和条件。
第五方面，本发明提供了一种提高sgRNA介导的基因编辑的效率的方法，包括在sgRNA的3’端添加富含腺嘌呤核糖核苷酸(A)的核糖核苷酸序列，其中所述sgRNA和富含腺嘌呤核糖核苷酸(A)的核糖核苷酸序列如上文所述。
本领域已知在sgRNA的3’端添加核糖核苷酸序列的各种方法，包括化学合成、重组方法等。在一个实施方案中，通过PCR扩增实现在sgRNA的3’端添加所需的核糖核苷酸序列。
第六方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含：
-模板引物核酸，其包含编码CRISPR效应蛋白结合部分的核酸序列；和
-第一引物和第二引物，其中第一引物从5’至3’方向包含与SEQ ID NO：13、20或21所示序列互补的序列以及与模板引物核酸3’端的部分序列互补的序列，并且第二引物从5’至3’方向包含相应于特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列的核苷酸序列和模板引物核酸5’端的部分序列。
在一个实施方案中，所述模板引物核酸包含SEQ ID NO：6所示序列的多核苷酸。
在一个实施方案中，所述第一引物包含SEQ ID NO：5所示序列的多核苷酸。
在一个实施方案中，所述试剂盒还可以包括从5’至3’方向包含启动子序列、编码特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列的序列和编码相应于模板引物核酸5’端的部分序列的第二引物。所述启动子可以为本领域已知的任何合适的启动子，例如那些可以用于体外转录的启动子，如T7启动子。在一个实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO：4的第1-21位核苷酸所示的序列。
在一个实施方案中，所述试剂盒还可以包括用于体外转录DNA的合适试剂，例如RNA聚合酶，和/或分离纯化RNA的试剂。
在一个实施方案中，所述试剂盒还可以包括本文所述的CRISPR效应蛋白。
在一个实施方案中，所述试剂盒可以用于制备本发明第一方面的RNA或者第二方面的核酸中，或者用于基因编辑。
第七方面，本发明提供了一种基因编辑方法，包括使用第一方面的RNA或第二方面的核酸或第三方面的构建体，例如将其引入靶细胞中。将核酸引入靶细胞中的方法为本领域所熟知，包括例如但不限于电转化等。
第八方面，本发明提供了第一方面的RNA或第二方面的核酸或第三方面的构建体用于基因编辑的用途。
本发明第一方面的RNA或编码其的核酸可以用于基因编辑中。例如，将本发明的RNA和CRISPR效应蛋白例如Cas9蛋白形成复合物，再与靶细胞接触，从而在靶DNA位点处修饰靶DNA，导致例如DNA裂解、DNA甲基化、DNA损坏、DNA修复等。
本文中，所述靶细胞可以是任何合适的需要进行基因编辑的对象的细胞，例如包括但不限于细菌、古细菌、植物、藻类、真菌(例如酵母)、动物例如非人哺乳动物如啮齿动物和人的细胞。
如本发明所述的经工程改造的sgRNA可以提高基因组编辑效率和靶特异性、调节生物毒性和编辑灵活性，能够实现更具体、高效、安全的基因编辑，最终提高基因治疗的临床效益。
除非上下文另有指示，本文中词语“或”旨在包括“和”。
如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如，任选包括的步骤是指该步骤存在或不存在。
如本文所用，术语“约”是指包括具体数值的数值范围，本领域技术人员可以合理认为其类似于具体数值。在一些实施方案中，术语“约”是指在使用本领域通常接受的测量的标准误差内。在一些实施方案中，约是指到具体数值的±10％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％或甚至±0.5％。
如本文所用，当说明书中针对一个特征列出具体数值或比例时，也涵盖了任意其两个数值或比例组成的范围。例如列出数值1、2、3、4时，也涵盖了1-2、1-3、1-4、2-3、2-4和3-4等。
虽然在此示出并描述了本发明的各个实施方案和各方面，但是本领域技术人员显然了解这些实施方案和各个方面只是举例说明本发明。本领域技术人员在不偏离本发明精神的范围内可以进行多种变化、改变和替代。应理解本文所述的本发明的实施方案的各种替代选择可用于本发明的实施中。
实施例
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。常规质粒构建所涉及的PCR、酶切、连接等实验，以及蛋白质表达所涉及的转化、细菌培养等实验为本领域研究人员所熟悉，所以具体相关实验细节没有详细注明，具体可参照分子克隆实验指南[J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南(第三版)[M]，科学出版社，2002]所述常规实验条件。
除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1：sgRNA的制备
制备方法：先通过重叠延伸聚合酶链反应(PCR)快速制备DNA模板并使用DNA纯化试剂盒纯化DNA模板，然后通过体外转录大量制备sgRNA，最后通过纯化获得大量具有高纯度和完整性的sgRNA(参见图1)。
1.PCR组装用于体外转录的DNA模板
1.1引物
引物名称 原液浓度(μM) 稀释浓度(μM)
T7G-sgRNA 100 90μl无菌水+10μl引物原液＝10μM
crRNA/tracrRNA 100 90μl无菌水+10μl引物原液＝10μM
tracrRNA 100 90μl无菌水+10μl引物原液＝10μM
1.2 PCR反应体系：按照下表加入各反应物，反应体系为50μl。
1.3 PCR反应程序
2.PCR产物纯化(普通DNA产物纯化试剂盒，品牌：TIANGEN，货号：DP204)
此步骤按照纯化试剂盒中的说明书进行操作，纯化收集DNA溶液并检测DNA浓度，此DNA溶液作为后续体外转录的模板DNA。
3.sgRNA体外转录(品牌：武汉瀚海新酶生物科技有限公司)
sgRNA体外转录:PCR反应体系配置：按照下表加入各反应物，反应体系为20μl
37℃反应4h，加入2U DNaseI(无RNase)(品牌：武汉瀚海新酶生物科技有限公司，货号：HBP000907)在37℃、30min去除DNA模板。
4.sgRNA纯化
4.1加入体外转录(IVT)产物同等体积的5M LiCl溶液(品牌：武汉瀚海新酶生物科技有限公司，批号：HH20221020)，混合均匀，置于-20℃至少30min。
4.2在4℃环境下，以12500g离心15min。
4.3吸弃上清，加入样品10倍体积预冷的70％乙醇洗涤RNA沉淀，4℃离心8min。
4.4吸弃上清，再次加入样品10倍体积预冷的70％乙醇洗涤RNA沉淀，4℃离心8min。
4.5用适量体积的RNase-free H2O溶解RNA沉淀。
4.6检测浓度。
实施例2：sgRNA的细胞外功能验证
1.细胞培养
1.1提前半小时打开生物安全柜紫外灯进行消毒，将DMEM完全培养基放置于37℃水浴锅中预热，DPBS(品牌：BBI，货号：E607009-0500)和Tryple(品牌：gibco，货号：A12859-01)放置于常温。
1.2消毒结束后，从5％ CO2培养箱中取出细胞培养皿，吸弃细胞培养皿中的上清，加入1ml DPBS，轻轻摇晃洗涤，去除残留培养基。
1.3吸弃DPBS，加入1ml的Tryple到细胞培养皿中，静置1min，加入2ml DMEM完全培养基，轻轻将细胞培养皿底部的293T细胞吹下，吸取所有细胞移至50ml离心管中，标记为293T，轻轻吹打混匀。
1.4吸取细胞悬液，加入到1.5ml EP管中用于DNA提取。若不能及时进行细胞基因组提取，以转速300g，时间3min离心，吸去上清后将细胞团块置于-20℃暂存。
2.细胞基因组提取(AxyPrep基因组DNA小量试剂盒，品牌：AXYGEN，货号：AP-MN-MS-GDNA-4AP-MN-MS-GDNA-50)
此步骤按照纯化试剂盒中的说明书进行操作，纯化收集DNA，保存于-20℃用于后续PCR鉴定。
3.目的基因扩增
3.1利用引物Primer 1F/1R及细胞基因组进行PCR验证。
3.2 PCR反应试剂盒为：诺唯赞2×Taq Plus Master Mix II(Dye Plus)。
3.3 PCR反应体系配制：
3.4 PCR反应程序为：
3.5琼脂糖凝胶制作：称量0.3g琼脂糖(品牌：生工，货号：9012-36-6)，加入到30mlTAE(1×)(品牌：生工，货号：B548101-0500)中，微波加热溶化，加入3μl GelRed(品牌：Biotium，货号：41003)，混匀，倒入制胶板中，等待冷却凝固。
3.6 PCR反应结束后，取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带大小是否符合目的条带的大小，条带大小符合预期，则将PCR产物进行纯化。
4.目的基因纯化(普通DNA产物纯化试剂盒，品牌：TIANGEN，货号：DP204)
此步骤按照纯化试剂盒中的说明书进行操作，纯化收集的DNA溶液并检测DNA浓度。
5.体外酶切功能验证
5.1sgRNA及cas9蛋白形成复合体：取一干净200μl PCR管，加入超纯水(按酶切体积30μl补足)、10μmol cas9蛋白和10μmol gRNA，混匀。加入3μl10×buffer。室温放置10min，形成RNP。
5.2加入1μmol DNA，于37℃孵育25min。孵育完成后，加入0.5μl Rnase A，混匀后加入3μl Protein K，于56℃孵育10min，消化cas9蛋白。
5.3琼脂糖凝胶制作：称量0.6g琼脂糖，加入到60ml TAE(1×)中，微波加热溶化，加入6μl GelRed，混匀，倒入制胶板中，等待冷却凝固。
5.4取出酶切产物，与阴性对照一起进行琼脂糖凝胶电泳，吸取15μl进行电泳。
6.结果
如图2和图3所示，体外果显示，未工程改造的sgRNA(SEQ ID NO：1，101nt)、工程改造的sgRNA(SEQ ID NO：2，126nt)和化学合成的经过碱基修饰的sgRNA(SEQ ID NO：3，101nt)均能有效引导cas9蛋白对目的DNA的切割。
实施例3：sgRNA的iPSC细胞内功能验证
1.细胞培养
1.1提前半小时打开生物安全柜紫外灯进行消毒，将Y27632(品牌：MCE,货号：HY-10583)+ncTarget完全培养基(品牌：中盛溯源生物科技有限公司，货号：RP01020)、DPBS和EDTA传代工作液(品牌：中盛溯源生物科技有限公司，货号：RP01007)放置于常温预热。
1.2消毒结束后，从5％ CO2培养箱中取出细胞培养皿，吸弃细胞培养皿中的上清，加入1ml DPBS，轻轻摇晃洗涤，去除残留培养基。
1.3吸弃DPBS，加入1ml的EDTA传代工作液到细胞培养皿中，静置5-8min后吸弃，加入2ml Y27632+ncTarget完全培养基，轻轻将细胞培养皿底部的iPSCs细胞吹下，吸取所有细胞移至50ml离心管中，标记为iPSCs，轻轻吹打混匀，以转速300g，时间3min离心，吸去上清后将细胞备用。
2.细胞电转
2.1将iPSCs制成细胞悬液，可稍微吹打尽量成单细胞，并用计数仪计数。(可换成TrypLE消化细胞，要注意消化时间，1-2min即可)
2.2提前将电转液buffer A(Celetrix)和buffer B(Celetrix)按1：1混合均匀，将其标记为buffer C备用。
2.3将1-1.5μg Cas9蛋白、1-1.5μg sgRNA、2μg供体DNA和10μL buffer C加入1.5mL规格的EP离心管中，在室温下孵育10-15min。
2.4收获1-1.5×106个活细胞，200g离心3min收集细胞。
2.5用10μL buffer C重悬步骤2.4中的细胞沉淀。
2.6将步骤2.3和2.5中的溶液轻柔的混合，并在室温下孵育10min。
2.7根据Celetrix电转仪的说明书，对细胞进行电穿孔操作，iPSC细胞可使用540V。
2.8电转后将细胞轻轻转移到含预温的Y27632+ncTarget完全培养基的培养板中。
2.9水平十字摇匀，置于37℃，5％CO2的培养箱中,再次水平十字摇匀，培养过夜。18-24小时后更换新ncTarget完全培养基，此后每天换液。
3.细胞基因组提取(AxyPrep基因组DNA小量试剂盒，品牌：AXYGEN，货号：AP-MN-MS-GDNA-4AP-MN-MS-GDNA-50)
此步骤按照纯化试剂盒中的说明书进行操作，纯化收集DNA，保存于-20℃用于后续同源重组效率鉴定。
4.目的基因扩增鉴定是否成功发生同源重组
4.1利用同源重组后同源臂两侧引物及细胞基因组进行PCR验证。
4.2 PCR反应试剂盒为：诺唯赞2×Taq Plus Master Mix II(Dye Plus)。
4.3左侧同源臂PCR反应体系配制：
4.4右侧同源臂PCR反应体系配制：
4.5 PCR反应程序为：
4.6琼脂糖凝胶制作：称量0.3g琼脂糖，加入到30ml TAE(1×)中，微波加热溶化，加入3μl GelRed，混匀，倒入制胶板中，等待冷却凝固。
4.7PCR反应结束后，取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带大小是否符合目的条带的大小，条带大小符合预期，则将PCR产物进行纯化。
5.结果
体外基因编辑结果显示，未工程改造的sgRNA(SEQ ID NO：1)、工程改造的sgRNA(SEQ ID NO：2)和化学合成的经过碱基修饰的sgRNA(SEQ ID NO：3)均能有效引导cas9蛋白对目的DNA的切割(图2,图3)；
体内同源重组结果显示，相比于未工程改造的的sgRNA，工程改造的sgRNA(加帽酶和加尾酶共修饰，固定序列修饰，加帽酶和固定序列共修饰，化学合成的经过碱基修饰)均能高效率引导DNA模板进行同源重组(图4A，泳道3，4，5，6和泳道2结果对比；图4B，泳道3，4，5，6和泳道2结果对比)；其中相比于其他工程改造的sgRNA(加帽酶和加尾酶共修饰，加帽酶和固定序列共修饰，化学合成的经过碱基修饰)，3’端增加序列的sgRNA显示出同等效果效率引导DNA模板进行同源重组(图4A，泳道3，5，6和泳道4结果对比；图4B，泳道3，5，6和泳道4结果对比)。
因此，相比其他方法工程改造的sgRNA，3’端单独固定序列修饰的sgRNA具有成本低，工艺简单，易规模化扩大生产等明显优势，为新型的基因编辑疗法提供充分的保障与支持。
实施例4：3端增加序列的长短对sgRNA细胞内功能的影响
1.细胞培养
1.1贴壁培养已经稳转了NeonGreen-teLuciferase表达元件(Zhang Y,Hu J,YuM,Wang Z,Qing H,Fu H,Yuan L,Li F,Zhao S*.A novel BRET based genetic codedbiosensor for apoptosis detection at deep tissue level in liveanimal.Apoptosis.2021Dec；26(11-12):628-638.doi:10.1007/s10495-021-01693-x.Epub 2021Nov 8.)的293T细胞株(293T-GL)，可表达绿色荧光蛋白和teLuciferase。
1.3吸弃DPBS，加入1ml的Tryple到细胞培养皿中，静置1min，加入2ml DMEM完全培养基，轻轻将细胞培养皿底部的293T细胞吹下，吸取所有细胞移至50ml离心管中，标记为293T，轻轻吹打混匀，以转速300g，时间3min离心，吸去上清后将细胞备用。
2.细胞电转
2.1将293T-GL制成细胞悬液，可稍微吹打尽量成单细胞，并用计数仪计数。(可换成TrypLE消化细胞，要注意消化时间，1-2min即可)
2.2提前将电转液buffer A(Celetrix)和buffer B(Celetrix)按1：1混合均匀，将其标记为buffer C备用。
2.3将1-1.5μg的Cas9蛋白、1-1.5μg带长短不同3’端增加序列的靶向NeonGreen编码区的sgRNA：NG0-sgRNA，SEQ ID NO：14；NG5-sgRNA，SEQ ID NO：15；NG10-sgRNA，SEQ IDNO：16；NG15-sgRNA，SEQ ID NO：17；NG20-sgRNA，SEQ ID NO：18；或NG25-sgRNA，SEQ ID NO：19(这些sgRNA的3端增加的序列长度分别为0，5，10，15，20，25个核苷酸残基)、2μg的供体DNA和10μL buffer C加入1.5mL规格的EP离心管中，在室温下孵育10-15min。
2.4收获1-1.5×106个活细胞，200g离心3min收集细胞。
2.5用10μL buffer C重悬步骤2.4中的细胞沉淀。
2.6将步骤2.3和2.5中的溶液轻柔的混合，并在室温下孵育10min。
2.7根据Celetrix电转仪的说明书，对细胞进行540V电穿孔操作。
2.8电转后将细胞轻轻转移到含预温的DMEM完全培养基的培养板中。
2.9水平十字摇匀，置于37℃，5％ CO2的培养箱中,再次水平十字摇匀，培养过夜。18-24小时后更换新DMEM完全培养基，此后每天换液。
3.荧光素酶活力测试
电转一周后，消化细胞，每个样品取3个重复(5x104细胞)放入96孔板，每孔加入10μl 10％的tritonX100室温裂解5min后，置于荧光酶标仪下加入荧光素酶底物：Diphenylterazine(DTZ，终浓度30μM)进行荧光素酶活性定量测定。震荡5秒混匀后检测发光强度。
4.结果
由于基因编辑成功后，原可以表达NeonGreen-teLuciferase的稳定株细胞293T-GL中的NeonGreen-teLuciferase表达元件被编辑置换，不再表达荧光素酶，之前表达的荧光素酶蛋白也在1周内逐步下降到本底水平。因而通过检测基因编辑1周后残留的荧光素酶活性便可比较不同sgRNA介导的基因编辑的相对效率。图5的结果显示，3’端增加的序列为在20/25个核苷酸残基时效果明显好于更短的序列，其中NG20-sgRNA的效果最佳。
序列表
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Claims (13)

1.一种靶向DNA的RNA，其从5’至3’方向包含：
(i)单向导RNA(sgRNA)；和
(ii)富含腺嘌呤核糖核苷酸(A)的核糖核苷酸序列，所述核糖核苷酸序列的长度为至少20个核糖核苷酸、优选20-30、更优选20-25个核糖核苷酸，其中所述A在所述核糖核苷酸序列中的含量为至少60％、优选为至少70％、至少75％或更高，特别地，所述核糖核苷酸序列选自：SEQ ID NO：13、20和21所示的核苷酸序列，
优选地，所述DNA存在于单细胞真核生物内、植物细胞内、无脊椎动物的细胞内或脊椎动物的细胞内。
2.权利要求1所述的靶向DNA的RNA，其中所述sgRNA从5’至3’方向包含：
-特异性靶向DNA序列的核糖核苷酸序列，优选地，所述核糖核苷酸序列的长度为18-25个核糖核苷酸，优选与所述DNA中的靶序列100％互补，和
-CRISPR效应蛋白结合部分，
优选地，所述CRISPR效应蛋白选自Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Cas9、Csn2、Cas4、Cpf1、C2c1、C2c3或C2c2蛋白，或这些核酸酶的功能性变体。
3.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1或2的靶向DNA的RNA的核苷酸序列，任选地，所述核酸还包含与所述核苷酸序列可操作地连接的启动子。
4.权利要求3所述的核酸，其包含编码启动子、sgRNA以及所述富含腺嘌呤核糖核苷酸的核糖核苷酸序列的多核苷酸，优选地，所述启动子为T7启动子，例如包含SEQ ID NO：4的第1-21位核苷酸所示的序列。
5.一种构建体，例如表达载体，其包含权利要求3或4所述的核酸。
6.一种制备权利要求1或2所述的靶向DNA的RNA的方法，包括：(a)提供编码所述靶向DNA的RNA的核酸，例如权利要求3或4所述的核酸，和(b)体外转录所述核酸，以产生RNA，以及(c)任选地，分离纯化所产生的RNA。
7.权利要求6所述的方法，其中所述核酸通过PCR扩增获得，优选地，所述(a)包括：
(i)提供包含编码CRISPR效应蛋白结合部分的模板引物核酸，优选所述模板引物核酸包含SEQ ID NO：6所示的DNA序列，
(ii)提供上游引物和下游引物，其中下游引物自5’至3’方向包含与SEQ ID NO：13、20或21所示核酸核苷酸序列互补的序列和与模板引物核酸3’端的部分序列互补的序列，上游引物从5’至3’方向包含相应于特异性靶向靶DNA序列的核糖核苷酸序列的核苷酸序列和模板引物核酸5’端的部分序列，
优选地，所述下游引物包含SEQ ID NO：5所示的DNA序列，和
(iii)进行PCR扩增，获得模板核酸，优选模板DNA。
8.一种提高sgRNA介导的基因编辑的效率的方法，包括在sgRNA的3’端添加富含腺嘌呤核糖核苷酸(A)的核糖核苷酸序列，所述核糖核苷酸序列的长度为至少20个核糖核苷酸、优选20-30、更优选20-25个核糖核苷酸，其中所述A在所述核糖核苷酸序列中的含量为至少60％、优选为70％、至少75％、至少80％、至少90％或更高，特别地，所述核糖核苷酸序列选自：SEQ ID NO：13、20和21。
9.权利要求8所述的方法，其中所述sgRNA从5’至3’方向包含：
-特异性靶向DNA序列的核糖核苷酸序列，和
-CRISPR效应蛋白结合部分。
10.一种试剂盒，其包含：
-模板引物核酸，其包含编码CRISPR效应蛋白结合部分的核酸序列，其中所述CRISPR效应蛋白结合部分从5’至3’方向包含crRNA和tracrRNA，任选包含tetraloop区；和
-第一引物，其从5’至3’方向包含与SEQ ID NO：13、20或21所示序列互补的序列以及与模板引物核酸3’端的部分序列互补的序列的。
11.权利要求10所述的试剂盒，其中：
(a)所述第一引物包含SEQ ID NO：5所示序列的多核苷酸；和/或
(b)所述模板引物核酸包含SEQ ID NO：6所示序列的多核苷酸；和/或
(c)所述试剂盒还包括从5’至3’方向包含启动子序列、相应于特异性靶向DNA序列的核糖核苷酸序列的序列和相应于模板引物核酸的5’端的部分序列的序列的第二引物，优选地，所述启动子为T7启动子，例如包含SEQ ID NO：4的第1-21位核苷酸所示的序列。
12.一种基因编辑方法，包括将权利要求1或2所述的靶向DNA的RNA、权利要求3或4所述的核酸或权利要求5所述的构建体、任选将CRISPR效应蛋白引入靶细胞的步骤。
13.权利要求1或2所述的靶向DNA的RNA、权利要求3或4所述的核酸或权利要求5所述的构建体在基因编辑中的应用。
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