CN116590337A - 水稻转录因子OsbZIP13及其编码序列的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种水稻碱性亮氨酸拉链转录因子OsbZIP13及其编码基因在调控植物抗旱胁迫中的应用，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其cDNA全长序列如SEQ ID NO.2所示，本发明OsbZIP13基因属于碱性亮氨酸拉链转录因家族，受到干旱胁迫抑制表达，表明了OsbZIP13基因在水稻具有响应干旱胁迫的作用。通过转基因的方法对OsbZIP13基因分别进行过表达和基因敲除，伴随着OsbZIP13的功能缺失，水稻耐旱能力减弱。因此可将水稻OsbZIP13基因和相应蛋白应用于农作物的基因工程遗传育种，培育耐旱的作物品种，降低全球气候变化导致的异常干旱对粮食作物带来的安全危害，并对其它作物的干旱耐受性相关研究具有重要参考意义。

Description

水稻转录因子OsbZIP13及其编码序列的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及水稻转录因子OsbZIP13及其编码在调控植物抗旱胁迫中的应用。
背景技术
水稻是世界上重要的粮食作物之一，目前全世界超过50％的人口以大米为主食。由于全球气候变暖及环境破坏加剧导致的干旱胁迫已成为影响农作物生长和产量的重要因素。在过去10年内，由于干旱导致作物减产所造成的经济损失远高于其它病害等造成的经济损失的总和。因此，对于耐旱分子作用机制研究及新品种的分子选育一直是热点研究领域。水稻由于拥有较小的基因组、具有完整的基因组测序以及有效的遗传转化技术和巨量的遗传信息，是一种典型的模式植物，并为单子叶植物的研究提供了良好研究基础。
植物对外界干旱胁迫的响应是一个复杂且高效的信号转导过程。以往大量的研究热点集中于各种转录因子(DREB、NAC、bZIP、锌指蛋白基因、MYB、WRKY、TIFY等)和一些功能性蛋白(LEA等)在干旱胁迫中的生物学功能，并分离鉴定了很多与耐旱相关的基因。这些基因能有效的改善植物的耐旱性，从而增加农作物在干旱条件下的产量。bZIP转录因子普遍存在于真核生物细胞内，广泛参与了植物生长发育及各种生物、非生物逆境胁迫过程。
碱性亮氨酸拉链(bZIP)是在植物应激反应和激素信号转导中具有重要作用的一个转录因子家族。已经证实bZIP蛋白存在于所有真核生物中，包括酵母、脊椎动物和植物。人类有56个bZIP蛋白。拟南芥中大约有100个bZIP序列在其基因组中被预测并被分为10个亚家族。而在水稻中总共有89个bZIP基因，被分为11组。bZIP蛋白由保守的bZIP结构域定义，bZIP结构域的长度为60至80个氨基酸。bZIP蛋白结构呈L型，具有2个结构域，包括高度保守的DNA结合碱性区和更多样化的亮氨酸拉链二聚化区，通常以二聚体或者四聚体的形式发挥作用，碱性区具有个氨基酸残基。最引人注目的基本区域是存在不变的N-x7-R/K基序。亮氨酸拉链由Leu的七肽重复组成，由重复的基序组成几种氨基酸或其他疏水性氨基酸的模式。由于其独特的氨基酸组成，Leu拉链倾向于在每个七肽中形成具有2个螺旋匝的两亲性螺旋。大多数bZIP蛋白显示对ACGT基序的高结合亲和力，其包括CACGTG(G盒)，GACGTC(C盒)，TACGTA(A盒)，AACGTT(T盒)和GCN4基序，即TGA(G/C)TCA。少量的bZIP因子如OsOBF1也可以识别回文序列。然而，其他，包括LIP19，OsZIP-2a和OsZIP-2b，不结合DNA序列。相反，这些bZIP蛋白与其他bZIPs形成异二聚体来调节转录活性。很多bZIP蛋白，如OsbZIP52/RISBZ5，OsAREB1/OsABF2，OsABI5/OREB1，OSBZ8能与ABA反应元件ABRE结合调控ABA依赖性基因的表达参与植株对非生物胁迫的应激过程。
bZIP蛋白形成转录的超家族是介导植物胁迫反应的因子。目前bZIP蛋白在多种生物非生物逆境胁迫过程中起作用，包括病原体防御、多种非生物胁迫的应答、种子的萌发和发育、衰老和对水杨酸、茉莉酸和脱落酸信号响应过程等。这些转录因子可能通过水杨酸途径参与了水稻的生物胁迫或者通过ABA途径在多种生物、非生物胁迫过程中起着重要作用，且不同的bZIP蛋白的生物学功能不同。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供水稻转录因子OsbZIP13及其编码基因在调控植物抗旱胁迫中的应用。
本发明的第一个方面，是提供水稻转录因子OsbZIP13的编码基因在调控植物抗旱胁迫中的应用，所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示，或所述编码基因的序列为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明的第二个方面，是提供水稻转录因子OsbZIP13调控植物抗旱胁迫中的应用，所述水稻转录因子OsbZIP13的序列如氨基酸SEQ ID NO.1所示。
本发明的第三个方面，是提供水稻转录因子OsbZIP13的编码基因在改良植物对干旱耐受性的遗传育种中的应用，所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示，或所述编码基因的序列为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
将所述转录因子OsbZIP13基因应用于植物基因工程中，可得到OsbZIP13的超表达和水稻CRISPR/Cas9基因敲除的水稻转基因植株，用于改变水稻对干旱的耐受性。
发明的第四个方面，是提供插入有水稻转录因子OsbZIP13的编码基因的过表达载体及其应用。
插入有水稻转录因子OsbZIP13的编码基因的过表达载体所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示，或所述编码基因的序列为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了转化有上述的过表达载体的农杆菌。
上述插入有水稻转录因子OsbZIP13的编码基因的过表达载体、所述农杆菌在提高植物干旱耐受性中的应用。
上述插入有水稻转录因子OsbZIP13的编码基因的过表达载体、所述农杆菌在改良植物对干旱耐受性的遗传育种中的应用。
在其中一些实施例中，所述重组表达载体为pCAMBIA1301-FLAG。
在其中一些实施例中，所述农杆菌为农杆菌EHA105。
一种提高植物干旱耐受性的生物制剂，所述生物制剂的活性成分含有上述插入有水稻转录因子OsbZIP13的编码基因的过表达载体。
本发明的第五个方面，是提供了一种调控植物抵抗旱胁迫的方法，该方法包括调控植物中水稻转录因子OsbZIP13的基因在植物中的表达，所述编码基因的序列如SEQ IDNO.2所示，或所述编码基因的序列为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
在其中一些实施例中，所述植物脱水干旱时间为8h，随后复水7d。
在其中一些实施例中，所述植物为水稻。
我们在研究中发现水稻转录因子OsbZIP13的干旱胁迫抑制表达，表明了该基因参与干旱胁迫的应答，论证了该基因为水稻应答干旱胁迫的重要基因，进一步延伸了该基因作为影响植物体内参与调控ABA合成关键基因OsNCED3的积累和响应干旱胁迫的候选功能基因。同时改变该基因的表达和蛋白功能均能影响植株对干旱胁迫的抗性。
本发明发现一个OsbZIP13基因和相应蛋白，该基因表达植物的碱性亮氨酸拉链转录因子OsbZIP13参与干旱胁迫应答，这对于全面理解植物中碱性亮氨酸拉链转录因子OsbZIP13的生物学功能具有重要的意义。同时，通过转基因的方法对OsbZIP13基因分别进行过表达和基因敲除，伴随着OsbZIP13的功能缺失，水稻耐旱能力减弱。因此可将水稻OsbZIP13基因和相应蛋白应用于农作物的基因工程遗传育种，培育耐旱的作物品种，降低全球气候变化导致的异常干旱对粮食作物带来的安全危害，并对其它作物的干旱耐受性相关研究具有重要参考意义。
附图说明
图1为实施例1中OsbZIP13基因的cDNA阅读框序列的PCR扩增电泳分析。
图2为实施例2中OsbZIP13蛋白在水稻原生质体中的亚细胞定位。
图3为实施例4中载体Ubi:pXu1301质粒图谱。
图4为实施例4中OsbZIP13-ox构建，其中，A/B为克隆OsbZIP13的CDS序列以同源重组的方式连接到载体Ubi:pXu1301，C为重组质粒Ubi:pXu1301阳性单克隆电泳结果，D为农杆菌EHA105的菌液PCR筛选获得的阳性单克隆的电泳结果，1～4泳道为不同阳性单克隆的检测结果。
图5为潮霉素检测的电泳结果。其中A为OsbZIP13-ox的T0代单株潮霉素检测的电泳结果，B为过表达OsbZIP13的转基因水稻株系OsbZIP13-ox-2的T1代单株潮霉素检测的电泳结果。
图6为实施例4中5个过表达OsbZIP13的转基因水稻株系。
图7为OsbZIP13的基因敲除转基因水稻的构建。
图8为实施例3中水稻在脱水干旱处理下，OsbZIP13基因在不同时间点的表达水平。
图9为实施例4中野生型水稻和OsbZIP13转基因水稻对ABA敏感性的比较，其中ZH11为ZhongHua 11，OsbZIP13-OE-2为：OsbZIP13-Overexpress line2，CRI13-1-18为CRISPER/Cas9-OsbZIP13 line 1-18。
图10为实施例4中野生型水稻和OsbZIP13过表达转基因水稻的耐旱能力比较，其中ZH11为ZhongHua 11，OsbZIP13-ox为：OsbZIP13-Overexpress line。
图11为实施例4中野生型水稻和OsbZIP13基因敲除转基因水稻的耐旱能力比较，其中ZH11为ZhongHua 11，osbzip13-1为CRISPER/Cas9-OsbZIP13 line1。
图12为实施例4中在干旱条件下，OsNCED3在野生型水稻和OsbZIP13过表达转基因水稻的表达量变化，其中ZH11为ZhongHua 11，OsbZIP13-OE-2为：OsbZIP13-Overexpressline 2，CRI13-1-18为CRISPER/Cas9-OsbZIP13 line 1-18。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一种水稻基因OsbZIP13的表达蛋白，所述水稻基因OsbZIP13的表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。
本发明以水稻幼苗为材料，提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，设计以下引物分别扩增OsbZIP13基因的cDNA全长序列。正反向扩增引物如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。以上PCR采用高保真DNA聚合酶HS DNA Polymerase进行扩增，并将得到的目的DNA片段进行回收，添加酶切位点SpeI和KpnI后连接于亚细胞定位表达载体pUC18-eGEP。
构建OsbZIP13的超表达(OsbZIP13-ox)和基因敲除载体(osbzip13)，并通过农杆菌EHA105介导法的遗传转化方法，将超表达和基因敲除载体转化至正常粳稻品种ZH11，最后获得OsbZIP13超表达和敲除表达的转基因水稻纯合体。经过多次重复逆境处理实验，OsbZIP13-ox表现在种子萌发过程中对ABA更敏感，并通过诱导ABA合成基因OsNECD3的表达，进而响应干旱胁迫中的功能研究。OsbZIP13则表现相反。
在本发明中，我们获得的一个水稻转录因子OsbZIP13并进行应用性探索，阐述了该基因以下应用方式：
(1)本发明涉及转录因子OsbZIP13受干旱诱导表达的特征，表明该基因具有干旱胁迫应答的基本功能，可将该基因应用于水稻针对干旱的遗传育种，改良水稻对干旱的耐受性。
(2)转录因子OsbZIP13将增强水稻干旱胁迫的耐受性，在转基因水稻中通过诱导ABA合成基因OsNECD3的表达响应干旱胁迫中的功能研究。因此，对此基因的研究为进一步丰富bZIP家族在ABA合成信号途径中的作用研究提供依据，为水稻耐旱分子育种提供更为丰富的基因遗传资源。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
主要试剂
其它常规试剂为进口或国产分析纯试剂。
水稻转录因子OsbZIP13氨基酸序列
>Os02t0128200-01Similar to Transcription factor HBP-1a(Histone-specific transcription factor HBP1).
MGTNDPGTPSKATKASEPEQSPATTSGTTAPVYPEWPGFQAYSAIPPHGFF
PPPVAASPQAHPYMWGAQPMVPPYGTPPPYMMYPPGTVYAHPSTPGVHPFN
HYPMLANGNVETAGTAPGASEINGKNELGRTSGPSANGITSHSESGSESESEG
SDANSQNDSHSKENDVKEDGSSQNGISHTALNQNMSMAPTQTGVVIGGVAP
TTNLNIGMDYWGAAGSSPVPAMHGKASSGSVRGEQWDERELKKQKRKQSN
RESARRSRLRKQAECEELSVRADNLRAENSSLRAELERIKKEYEALLSHNASLKEKLEGNSDSIPYMNEQNDTNGTHQKQQDSDAQPNDAP*(SEQ ID NO.1)水稻转录因子OsbZIP13 cDNA阅读框核苷酸序列
>Os02t0128200-01Similar to Transcription factor HBP-1a(Histone-specific transcription factor HBP1).
ATGGGTACTAATGATCCTGGCACGCCGTCCAAGGCAACAAAGGCATCA
GAACCGGAGCAGTCTCCAGCCACTACATCTGGCACTACAGCTCCAGTTTA
CCCTGAATGGCCTGGTTTTCAGGCCTACTCGGCAATTCCACCGCATGGGTT
CTTTCCACCTCCTGTTGCTGCAAGTCCCCAGGCTCATCCCTACATGTGGGG
AGCTCAGCCCATGGTGCCACCTTACGGGACACCACCACCTTATATGATGT
ATCCTCCAGGAACTGTATATGCACATCCCTCTACTCCTGGTGTGCATCCAT
TTAATCACTACCCTATGCTGGCAAATGGAAATGTTGAAACTGCTGGAACT
GCACCAGGTGCTTCAGAAATTAACGGGAAAAATGAGCTTGGCAGAACAT
CTGGTCCATCTGCCAACGGGATTACCTCCCACAGTGAGAGTGGAAGTGAG
AGTGAAAGTGAAGGAAGTGATGCCAACTCTCAAAATGATTCACATTCAA
AGGAAAATGATGTAAAGGAAGATGGTAGTTCTCAGAATGGCATATCACA
TACAGCATTAAATCAGAACATGTCGATGGCTCCAACTCAAACGGGTGTAG
TAATCGGGGGAGTTGCTCCCACAACAAACTTGAACATAGGAATGGACTAC
TGGGGTGCTGCTGGTTCTTCGCCTGTTCCTGCAATGCATGGCAAAGCATC
GTCTGGTTCAGTTCGAGGAGAGCAATGGGATGAAAGAGAGCTCAAGAAG
CAGAAAAGGAAGCAGTCTAATCGGGAATCAGCACGTAGATCCCGGCTGC
GCAAGCAGGCTGAGTGTGAAGAGCTTTCTGTACGCGCTGACAATTTAAGG
GCAGAAAACTCCTCTCTTAGGGCTGAGCTTGAACGGATCAAAAAGGAGT
ACGAGGCACTTCTTTCACACAATGCTTCACTCAAGGAAAAACTAGAGGGG
AACAGTGATTCAATACCTTATATGAATGAACAGAACGACACCAATGGCAC
CCACCAGAAGCAACAGGATTCTGATGCTCAGCCTAATGATGCGCCTTGA(SEQ ID NO.2)。
RT-PCR扩增转录因子Os02t0128200带酶切位点SpeI和KpnI阅读框序列的引物核苷酸序列：
Os02t0128200F:5’-CCCAAGCTTATGGGTACTAATGATCCTGGC-3’SEQ ID NO.3
Os02t0128200R:5’-CGCGGATCCTCAAGGCGCATCATTAGGC-3’SEQ ID NO.4
Real time RT-PCR检测水稻中OsbZIP13的表达的引物核苷酸序列：
OsbZIP13-qRT/F:5’-TGGTTCTTCGCCTGTT-3’SEQ ID NO.5
OsbZIP13-qRT/R:5’-TCCCGATTAGACTGCTTCCT-3’SEQ ID NO.6
Real time RT-PCR检测水稻内参基因eEF-1a的表达的引物核苷酸序列：
eEF-1a-qRT/F:5’-GCACGCTCTTCTTGCTTTC-3’SEQ ID NO.7
eEF-1a-qRT/R:5’-AGGGAATCTTGTCAGGGTTG-3’SEQ ID NO.8
Real time RT-PCR检测水稻中ABA合成途径基因OsNCED3的表达的引物核苷酸序列：
OsNCED3-qRT/F:5’-CCCCTCCCAAACCATCCAAACCGA-3’SEQ ID NO.9
OsNCED3-qRT/R:5’-TGTGAGCATATCCTGGCGTCGTGA-3’SEQ ID NO.10
RT-PCR扩增转录因子Os02t0128200带酶切位点BamHI和HindIII阅读框序列的引物核苷酸序列：
OsbZIP13-CDS-F:5’-GGACTAGTATGGGTACTAATGATCCTGGC-3’SEQ ID NO.11
和OsbZIP13-CDS-R:5’-CGGGGTACCTCAAGGCGCATCATTAGGC-3’SEQ ID NO.12。
实施例1：水稻转录因子OsbZIP13基因cDNA序列的RT-PCR扩增
正常粳稻品种ZH11为材料，Trizol裂解法提取总RNA。对提取的叶片总RNA进行B-500BIOPHOTOMETER核酸蛋白检测仪浓度检测。采用两步法以总RNA为模板进行逆转录反应获取cDNA第一链。cDNA单链的合成依照TaKaRa Clontech公司MMLV ReverseTranscriptase Protocol说明书进行。
以水稻叶片的cDNA单链为模板，采用高保真DNA聚合酶HS DNAPolymerase扩增水稻转录因子OsbZIP13基因。所采用的引物为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4(F和R)所示。
PCR反应体积为50μL。PCR扩增反应体系为：5×Buffer 10μL，10mMdNTP Mixture 4μL，10μM Os02t0128200F 1μL，10μM Os02t0128200R 1μl，/>HS DNA Polymerase 0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O 31.5μL。各种成分混匀后置于PCR仪上进行反应。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性10s、56℃退火5s、72℃延伸15s，30个循环；最后72℃延伸10min。
PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，可获得单一的DNA条带(1173bp)，即为PCR扩增得到的OsbZIP13基因片段(见图1所示)。OsbZIP13片段依照Magen公司HiPure GelPure DNAKits说明书进行琼脂糖凝胶电泳回收。
实施例2：水稻转录因子OsbZIP13亚细胞定位
通过网站http://rapdb.dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse_details/irgsp1？name＝Os12g0233800预测OsbZIP13属于碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)转录因子，定位于细胞核。目前的研究表明，植物bZIP转录因子在细胞中的位置主要定位于细胞核中，因为在其紧靠亮氨酸拉链结构域的N末端，通过一个固定的N-x7-R/K结构与特异DNA序列相结合，起核定位信号作用。
添加了KpnI和BamHI酶切位点的引物进行PCR扩增OsbZIP13的CDS，与经过改造的pUC18载体连接，构建融合表达载体。以经过改造的pUC18空载体作为对照和将OsbZIP13::SGFP融合表达载体分别与核定位信号mCherry共转入水稻原生质体，获得高效的瞬时表达。结果表明，对照GFP蛋白在细胞内均有分布，且与mCherry的定位完全一致。OsbZIP13则与mCherry共定位于细胞核中(见图2)，与网站预测结果一致。
实施例3：水稻转录因子OsbZIP13在干旱胁迫下被抑制表达
本发明中所用的水稻材料为本实验室萌发的水稻小苗，取水稻野生型材料ZH11大约50粒左右的饱满种子，采用70％乙醇浸泡1min，清水冲洗2次，3％的次氯酸钠浸泡40min，之后用自来水清洗5遍，将种子置于清水中萌发约5天，后移至国际水稻所常规水稻营养液继续培养约2周(22℃，每天16小时光照/8小时黑暗)。将ZH11幼苗倒掉水培液进行缺水胁迫，收集胁迫处理0小时、1小时、2小时、4小时、6小时后的水稻幼叶各0.5g，用于提取总RNA。Trizol裂解法提取总RNA。对提取的叶片总RNA进行B-500BIOPHOTOMETER核酸蛋白检测仪检测浓度。采用两步法以总RNA为模板进行逆转录反应获取cDNA第一链。cDNA单链的合成依照TaKaRa Clontech公司MMLV Reverse Transcriptase Protocol说明书进行。
通过Primer Premier 5设计OsbZIP13基因的real-time RT-PCR引物。用于检测OsbZIP13基因表达模式。用于检测OsbZIP13基因表达模式的引物为SEQ ID NO.5和6(OsbZIP13-qRT/F:5’-TGGTTCTTCGCCTGTT-3’和OsbZIP13-qRT/R:5’-TCCCGATTAGACTGCTTCCT-3’)。内参基因为水稻组成型表达基因eEF-1a，引物为SEQ ID NO.7和8(eEF-1a-qRT/F:5’-GCACGCTCTTCTTGCTTTC-3’和eEF-1a-qRT/R:5’-AGGGAATCTTGTCAGGGTTG-3’)。
参考TaKaRa Clontech公司Premix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)的说明书配制real time RT-PCR反应体系(冰上操作)。采用两步法PCR反应，扩增标准程序如下：
所有检测均采用两个生物学样本重复，每个生物学样本进行三次重复检测反应。
分别选取经过干旱及复水处理的野生型水稻ZH11幼苗的地上部分提取总RNA，通过qRT-PCR分析水稻转录因子基因OsbZIP13在非生物胁迫下的相对表达量(见图8)。结果表明，OsbZIP13的表达显著的受到干旱抑制，表明该基因具有干旱胁迫应答的基本功能，可将该基因应用于改良植物对干旱的耐受性。
实施例4：水稻转录因子OsbZIP13抗逆性实验中的功能探究
1、OsbZIP13-ox转基因水稻植株创制
通过SEQ ID NO.11和12(OsbZIP13-CDS-F:5’-GGACTAGTATGGGTACTAATGATCCTGGC-3’和OsbZIP13-CDS-R:5’-CGGGGTACCTCAAGGCGCATCATTAGGC-3’)克隆OsbZIP13带酶切位点BamHI和HindIII的cDNA阅读框序列，并以同源重组的方式连接到载体Ubi:pXu1301(见图3和图4A-B)。将菌液PCR筛选获得的阳性单克隆送至测序公司进行一代测序(见图4C)，并将测序正确的重组质粒转化至农杆菌EHA105，菌液PCR筛选获得的阳性单克隆保菌(见图4D)并用于后续水稻愈伤组织的转染。利用PCR技术检测27株T0代单株，一共得到20株阳性单株(见图5A)。
分别选取不同株系的地上部分提取总RNA，通过qRT-PCR检测OsbZIP13在阳性T1代转基因单株中的表达量，最终获得以Ubiquitin为启动子的OsbZIP13-ox-2、3、4、7和15共5个过表达OsbZIP13的转基因水稻株系(见图6)。其中，T1代OsbZIP13-ox-2的PCR检测结果为阳性单株：阴性单株＝20:7，符合孟德尔分离定律的3:1分离比(见图5B)。因此，选取OsbZIP13-ox-2阳性株系作为后续实验材料，其余几个转基因株系均留种备用。
2、Osbzip13-1转基因水稻植株创制
我们根据CRISPR-P v2.0(hzau.edu.cn/CRISPR2/)的预测结果选取3个编辑靶点分别命名为Tagert I、Targrt II和Target III，三个靶标分别位于OsbZIP13的第1、第12和第13个外显子上(见图7A)。随后通过农杆菌EHA105将同时编辑Tagert I和Targrt II以及同时编辑Tagert I和Target III的双敲除载体分别转染至ZH11，利用PCR检测T0代单株，最终获得22株T0代阳性单株，并将两种编辑类型的OsbZIP13双敲除转基因水稻分别命名为osbzip13-1(为CRISPER/Cas9-OsbZIP13 line 1)和osbzip13-2(为CRISPER/Cas9-OsbZIP13 line2)。
通过PCR技术扩增T0代阳性单株的靶点序列并进行一代测序，最终获得7株OsbZIP13的基因敲除转基因水稻(见图7B)，其余15株为未被编辑的阳性单株。
将OsbZIP13基因敲除水稻的T1代株系进行潮霉素基因检测后，通过PCR技术扩增T1代阳性单株的靶点序列并进行一代测序，筛选纯合突变的潮霉素阴性单株用于后续实验及繁种。
3、OsbZIP13-ox、osbzip13-1转基因水稻植株对ABA敏感性实验
将OsbZIP13-ox、osbzip13-1和ZH11水稻种子各30粒无菌播种于ABA浓度0、2.5μM的1/2MS中，28℃，15/24h光周期条件下萌发，于处理10天进行观察表型分析及拍照，统计萌根长以及芽长(见图9)，图9结果表明，OsbZIP13基因过表达的转基因水稻种子萌发过程中对ABA不敏感性。
2、OsbZIP13-ox、Osbzip13-1转基因水稻植株抗旱性实验探究
将在国际水稻所常规水稻营养液中进行水培约15天的OsbZIP13-ox、Osbzip13-1(为CRISPER/Cas9-OsbZIP13 line 1)和ZH11幼苗倒掉水培液8小时进行缺水胁迫。然后再进行复水实验，复水7天后拍照并统计成活率(见图10和图11)，图10结果表明，OsbZIP13基因过表达的转基因水稻植株抗旱性更强，图11结果表明osbzip13-1转基因水稻抗旱性更弱。
3、干旱胁迫下OsbZIP13-ox、Osbzip13-1转基因水稻中OsNCED3基因表达差异
本发明中所用的水稻材料为本实验室萌发的水稻小苗，取水稻转基因材料OsbZIP13-ox、Osbzip13-1和ZH11各50粒左右的饱满种子，采用70％乙醇浸泡1min，清水冲洗2次，3％的次氯酸钠浸泡40min，之后用自来水清洗5遍，将种子置于清水中萌发约5天，后移至国际水稻所常规水稻营养液继续培养约2周(22℃，每天16小时光照/8小时黑暗)。OsbZIP13-ox、Osbzip13-1和ZH11幼苗倒掉水培液进行缺水胁迫。收集胁迫处理0h、1小时、2小时、3小时后的水稻幼叶各0.5g，用于提取总RNA。Trizol裂解法提取总RNA。对提取的叶片总RNA进行B-500BIOPHOTOMETER核酸蛋白检测仪检测浓度。采用两步法以总RNA为模板进行逆转录反应获取cDNA第一链。cDNA单链的合成依照TaKaRa Clontech公司MMLVReverse Transcriptase Protocol说明书进行。
通过文献获得的OsNCED3基因的real-time RT-PCR引物。用于检测OsNCED3基因表达模式。用于检测OsNCED3基因表达模式的引物为SEQ ID NO.9和10(OsNCED3-qRT/F:5’-CCCCTCCCAAACCATCCAAACCGA-3’和OsNCED3-qRT/R:5’-TGTGAGCATATCCTGGCGTCGTGA-3’)。内参基因为水稻组成型表达基因eEF-1a，引物为SEQ ID NO.7和8。
real time RT-PCR体系及程序参考实施例3。
如图12所示，在干旱胁迫处理下，Osbzip13-1中ABA合成途径基因OsNCED3基因的表达受到干旱诱导，但与ZH11相比，OsNCED3基因的表达量极显著降低。
以上实验表明了OsbZIP13基因是一个通过调控ABA合成途径基因OsNCED3在干旱胁迫下表达，从而增强水稻抗旱性。该基因具备应用于针对水稻耐旱分子育种工程改良的潜力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.水稻转录因子OsbZIP13的编码基因在调控植物抗旱胁迫中的应用，所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示，或所述编码基因的序列为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.水稻转录因子OsbZIP13调控植物抗旱胁迫中的应用，所述水稻转录因子OsbZIP13的序列如氨基酸SEQ ID NO.1所示。
3.水稻转录因子OsbZIP13和/或其编码基因在改良植物对干旱耐受性的遗传育种中的应用；所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示，或所述编码基因的序列为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.提供插入有水稻转录因子OsbZIP13的编码基因的过表达载体，所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示，或所述编码基因的序列为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
5.转化有权利要求4所述的过表达载体的农杆菌。
6.权利要求4所述的过表达载体、转化有权利要求4所述的过表达载体的农杆菌在提高植物干旱耐受性中的应用。
7.权利要求4所述的过表达载体、转化有权利要求4所述的过表达载体的农杆菌在改良植物对干旱耐受性的遗传育种中的应用。
8.一种提高植物干旱耐受性的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂的活性成分含有插入有水稻转录因子OsbZIP13的编码基因的过表达载体，所述编码基因的序列如SEQ IDNO.2所示，或所述编码基因的序列为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
9.一种调控植物抵抗旱胁迫的方法，其特征在于，所述方法包括调控植物中水稻转录因子OsbZIP13的基因在植物中的表达，所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示，或所述编码基因的序列为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的调控植物抵抗旱胁迫的方法，其特征在于，所述植物为水稻。
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