CN116585256A - 用于抗细菌生物膜感染的微针阵列及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于抗细菌生物膜感染的微针阵列，由基底和在基底一侧上阵列分布的微针组成，微针呈棱锥状，微针阵列的基体材料为生物相容的水溶性生物可降解高分子材料，微针的基体材料中负载有抗生素和载金属纳米粒子的微球，所述载金属纳米粒子的微球主要负载于微针的尖端部；所述载金属纳米粒子的微球由丝素蛋白微球和均匀分布在丝素蛋白微球中的金属纳米粒子组成，所述丝素蛋白微球由丝素蛋白和电中性/带负电的多糖在全水相环境中制备得到；该微针阵列在按压施用至皮肤的细菌生物膜感染部位后，微针尖端首先作用于细菌生物膜对细胞外聚合物进行物理破坏，随后微针溶解而将抗生素和载金属纳米粒子的微球释放至细菌生物膜中并杀灭细菌。

Description

用于抗细菌生物膜感染的微针阵列及其制备方法

技术领域

本发明属于抗细菌生物膜感染微针材料领域，涉及用于抗细菌生物膜感染的微针阵列及其制备方法。

背景技术

创伤或手术治疗后发生细菌生物膜感染进而延迟愈合过程，是全球主要的医疗保健问题之一。细菌牢固包埋于一个由多糖、蛋白质、核酸和脂类组成的保护性细胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances,EPS)中形成了生物膜。EPS的致密结构是细菌抵御外部侵害的强大屏障，这将导致比浮游细菌高约1000倍的抗生素抵抗和耐药性诱导。目前，机械或尖锐清创是临床上去除生物膜的标准护理方法，然而清创治疗过程中伴有剧烈疼痛且生物膜通常会在初次清创后的两天内再生，致使患者依从性差、死亡率增高。因此，迫切需要更有效、患者依从性更好的方法来消除伤口细菌生物膜。

丝素蛋白(Silk Fibroin,SF)是一种具有重复模块化疏水结构域和小亲水性基团的天然生物大分子，因其优异的机械性能和良好的生物相容性被广泛用于组织再生领域。丝素蛋白良好的润湿性使得细菌易于附着在其表面，利用金属元素、天然抗菌剂、人工合成抗菌聚合物等与丝素蛋白复合形成生物抗菌材料，并加工成微球、水凝胶、膜、纤维、支架等多种不同形态，可通过两步作用机制先将细菌黏附在其表面，再将细菌杀灭。但这些形式的抗菌材料基本是通过喷撒或定植在患处，依靠抗菌剂对细菌生物膜的穿透能力杀灭膜内细菌，但因生物膜的屏障作用，这些给药方式导致材料中的抗菌剂对生物膜的穿透能力十分有限。虽然纳米材料相对于大凝胶材料有更强的穿透生物膜的能力，但仍然较为有限，同时，在细菌感染部位有很多巨噬细胞，纳米尺度的颗粒容易被巨噬细胞摄取，因此总体而言，纳米材料抗细菌生物膜的效果也有待改善。

载金属纳米粒子的丝素蛋白微球，利用酪氨酸残基的强供电子性能将金属离子还原为纳米单质，并通过配位作用稳定负载，可有效阻止金属纳米粒子的团聚和氧化，增强其抗菌、抗生物膜性和细胞相容性。已有研究报道过用于获得从几十纳米到几百微米不等的丝素蛋白微球的方法，包括自组装法、乳化法、盐析法、喷雾干燥法、微流控法以及高压静电喷射法等。但是，丝素蛋白微球结晶度低、毒性交联剂残留、制备过程繁琐以及成本高、难以实现规模化生产等诸多问题始终限制着丝素蛋白微球在临床上的进一步推广和使用。目前迫切需要开发出安全性好、粒径可控、结晶度高的抗菌丝素蛋白微球的制备方法。除此之外，面对细菌生物膜结构复杂、耐药菌数量不断增加的现状，最大限度地破坏EPS，实现抗菌剂或抗菌微球在生物膜内的高效递送也至关重要。

发明内容

针对现有生物膜治疗方法存在的抗生素渗透性差、耐药性诱导等问题，本发明提供了一种用于抗细菌生物膜感染的微针阵列及其制备方法，以实现抗生素和金属纳米粒子的协同抗菌作用并获得更广泛的抗菌谱。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于抗细菌生物膜感染的微针阵列，该微针阵列由基底和在基底一侧上阵列分布的微针组成，微针呈棱锥状，所述微针阵列的基体材料为水溶性生物可降解高分子材料，微针的基体材料中负载有抗生素和载金属纳米粒子的微球，所述载金属纳米粒子的微球主要负载于微针的尖端部；所述载金属纳米粒子的微球由丝素蛋白微球和均匀分布在丝素蛋白微球中的金属纳米粒子组成，所述丝素蛋白微球由丝素蛋白和电中性/带负电的多糖在全水相环境中制备得到，所述金属纳米粒子为对细菌具有杀灭作用的金属纳米粒子；

该微针阵列在按压施用至皮肤的细菌生物膜感染部位后，微针尖端首先作用于细菌生物膜对细胞外聚合物(EPS)进行物理破坏，随后微针溶解而将抗生素和载金属纳米粒子的微球释放至细菌生物膜中，释放出的抗生素直接杀灭细菌，释放出的载金属纳米粒子的微球诱导细菌在载金属纳米粒子的微球表面黏附并将细菌杀灭。

上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的技术方案中，所述电中性/带负电的多糖包括透明质酸、葡聚糖以及海藻酸钠中的至少一种。

上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的技术方案中，利用电中性/带负电的多糖，例如透明质酸(Hyaluronicacid,HA)与丝素蛋白巨大的溶解性差异以及电荷特性促进丝素蛋白微球的成型，实现了丝素蛋白微球在全水相环境中的可控制备，全水相制备有效提高了丝素蛋白微球的安全性，由此解决了现有技术制备丝素蛋白微球时存在的毒性交联剂残留、制备过程繁琐、成本高难以实现规模化生产等问题，有利于丝素蛋白微球在临床上的推广和应用。

上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的技术方案中，所述载金属纳米粒子的微球的制备方法如下：

(1)将丝素蛋白溶水溶液和透明质酸水溶液混合均匀得到混合液，该混合液中丝素蛋白的浓度为1wt.％～4wt.％；

(2)将混合液在温度为60～120℃、相对湿度为70％～80％的恒温恒湿环境中干燥成膜，将膜用水溶解，然后离心、弃上清，将所得产物洗涤并冷冻干燥，得到丝素蛋白微球；

(3)将步骤(2)制备的丝素蛋白微球充分分散在金属离子水溶液中，将所得分散液在紫外光下充分辐照，丝素蛋白将金属离子还原为金属纳米离子并通过配位作用将金属纳米离子稳定固定在丝素蛋白微球中，然后离心、弃上清，将所得产物洗涤并冷冻干燥，得到载金属纳米粒子的微球。

在步骤(2)制备丝素蛋白微球时，丝素蛋白微球的粒径、丝素蛋白微球中丝素蛋白的二级结构，会受到干燥成膜时的温度、混合液的黏度，以及电中性/带负电的多糖与丝素蛋白的质量比的影响；在步骤(3)制备载金属纳米粒子的微球时，丝素蛋白微球中电中性/带负电的多糖与丝素蛋白的比例关系、在紫外光下的辐照时间、丝素蛋白微球与金属离子的比例关系，会共同影响对金属离子的还原能力。因此，可以根据实际应用时对载金属纳米粒子的微球的粒径和金属纳米粒子负载量等的需求，灵活调整步骤(1)所述混合液中电中性/带负电的多糖与丝素蛋白的质量比以及二者的浓度，步骤(2)中干燥成膜时的温度，步骤(3)中在紫外光下的辐照时间以及丝素蛋白微球与金属离子的比例关系。

上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的技术方案中，在制备载金属纳米粒子的微球时，最好是控制步骤(1)所述混合液中电中性/带负电的多糖与丝素蛋白的质量比为(1～4):1，通常可控制步骤(3)所述分散液中丝素蛋白微球与金属离子供体的质量比为1:(5～10)，所述金属离子水溶液是将金属离子供体溶解在水中形成的，金属离子溶液中的金属离子供体的浓度通常为5～60mg/mL，步骤(3)在紫外光下辐照时，通常控制辐照时间为15～90min。

上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的技术方案中，该微针阵列中抗生素的含量和载金属纳米粒子的微球的含量可以根据实际应用时给药剂量的要求进行确定，以在达到预期抗菌效果的同时减少蓄积毒性。例如，对于一片分布有100个微针的微针阵列而言，微针阵列中，抗生素的含量可以为1μg/片～100μg/片，载金属纳米粒子的微球的含量可以为0.2mg/片～3mg/片。

上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的技术方案中，所述金属纳米粒子优选为银纳米粒子或金纳米粒子。在制备载金属纳米粒子的微球时通常采用硝酸银、氯金酸或氯金酸盐作为金属离子供体。

上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的技术方案中，载金属纳米粒子的微球的粒径分布在1～200μm之间，载金属纳米粒子的微球的平均粒径通常不超过10μm。载金属纳米粒子的微球中的金属纳米粒子的粒径通常不超过100nm。

上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的技术方案中，之所以采用生物相容的水溶性生物可降解高分子材料作为微针阵列的基体材料，是为了在微针阵列在刺入皮肤的细菌生物膜感染部位后，利用皮肤的水性环境将微针快速溶解以释放负载的抗生素和载金属纳米粒子的微球，利用抗生素在短时间内实现大量细菌的杀灭。在满足生物相容、水溶性和生物可降解的基础上，对生物相容的水溶性生物可降解高分子材料没有特别要求，例如可以是透明质酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮或羧甲基纤维素钠等。生物相容的水溶性生物可降解高分子材料的水溶性越好，抗生素起效的速度越快，可根据实际应用需求进行选择，具体可根据实际应用时对微针力学性能和溶解速度的需求选择生物相容的水溶性生物可降解高分子材料的种类和分子量。例如，选用分子量为10～100kDa的透明质酸作为生物相容的水溶性生物可降解高分子材料时，在确保微针力学性能的同时即有利于微针的快速溶解。

上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的技术方案中，所述抗生素为用于治疗皮肤感染的抗生素，具体的抗生素种类可以根据实际应用需求进行选择，例如，常见的用于治疗皮肤感染的抗生素包括莫匹罗星、瑞他帕林、夫西地酸、氧氟沙星、罗红霉素、克林霉素、甲硝唑等。

上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的技术方案中，微针的形状、阵列分布的微针的尖端部之间的间距、微针的高度等参数根据实际应用需求。为保证良好的机械强度，微针的形状优选正四棱锥状，微针的底面边长与微针高度之比优选为1:(2～3)。微针的高度应确保微针能刺破皮肤角质层而不触及神经，考虑到皮肤具有弹性，微针高度优选为400～800μm。

本发明还提供了一种上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的制备方法，包括以下步骤：

(1)将水溶性生物可降解高分子材料溶解于水中，脱除气泡，得到基底溶液，基底溶液中，水溶性生物可降解高分子材料的浓度为100～200mg/mL；将抗生素和载金属纳米粒子的微球与基底溶液充分混合，脱除气泡，得到浇筑液；

(2)将浇筑液加入到微针模具中，在1～4℃充分离心，使浇铸液填满微针模具，在恒温恒湿条件下干燥成型，脱模，得到用于抗细菌生物膜感染的微针阵列。

上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的制备方法的技术方案中，步骤(2)优选在温度为20～30℃、相对湿度为70％～85％的恒温恒湿条件下进行干燥成型，步骤(2)进一步优选在温度为20～25℃、相对湿度为70％～80％的恒温恒湿条件下进行干燥成型。

上述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的制备方法的技术方案中，步骤(1)所述浇筑液中抗生素和载金属纳米粒子的微球的浓度可以根据实际应用时给药剂量的要求进行确定，例如，浇铸液中抗生素的浓度可以为5～500μg/mL，载金属纳米粒子的微球的浓度可以为1～20mg/mL。

本发明所述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列发挥抗细菌生物膜的原理如下：本发明提供的微针阵列的使用方式是经皮肤给药，将微针阵列在刺入皮肤的细菌生物膜感染部位，微针尖端首先基于穿刺效应作用于细菌生物膜对细胞外聚合物(EPS)进行物理破坏，EPS的完整性被物理破坏后，微针阵列中所负载的抗菌物则更容易穿过EPS的屏障与细菌接触；随后，利用皮肤的水性环境将微针溶解而释放负载的抗生素和载金属纳米粒子的微球，释放出的抗生素可以在短时间内杀灭大量细菌，同时细菌会在载金属纳米粒子的微球上黏附，载金属纳米粒子利用其中负载的金属纳米粒子可以将黏附在所述微球上的细菌杀灭。

一方面，本发明提供的微针阵列可以对EPS进行物理破坏，打破EPS屏障，将微针内负载的抗菌物质直接递送至生物膜内，因此可以克服微米级颗粒不容易穿透生物膜的缺点，在生物膜内的高效传递，同时，利于微球负载金属纳米颗粒并依靠微针直接递送至生物膜内，还可以减少巨噬细胞对金属纳米颗粒的摄取；另一方面，本发明提供的微针中同时负载了抗生素和载金属纳米粒子的微球，抗生素与载金属纳米粒子的微球协同作用起到杀灭细菌的效果，可以在控制抗生素耐药的同时获得更广泛的抗菌谱；再一方面，本发明利用电中性/带负电的多糖辐照丝素蛋白微球成型，实现了实现了丝素蛋白微球在全水相环境中的可控制备，全水相制备有效提高了丝素蛋白微球的安全性，可以解决现有技术制备丝素蛋白微球时存在的毒性交联剂残留、制备过程繁琐、成本高难以实现规模化生产等问题。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果：

1.本发明提供了一种用于抗细菌生物膜感染的微针阵列，该微针阵列由基底和在基底一侧上阵列分布的微针组成，微针呈棱锥状，该微针阵列的基体材料为生物相容的水溶性生物可降解高分子材料，微针的基体材料中负载有抗生素和载金属纳米粒子的微球，该微针阵列在按压施用至皮肤的细菌生物膜感染部位后，微针尖端首先作用于细菌生物膜对细胞外聚合物进行物理破坏，随后微针溶解而释放出抗生素和载金属纳米粒子的微球，释放出的抗生素直接杀灭细菌，同时细菌会黏附在载金属纳米粒子的微球表面，进而被微球上负载的金属纳米离子杀灭。本发明提供的微针阵列可以对EPS进行物理破坏，打破EPS屏障，可实现微针内负载的抗菌物质在生物膜内的高效传递，微针阵列中同时负载了抗生素和载金属纳米粒子的微球，二者基于微针的溶解释放，可以起到协同抗菌作用，可以在控制抗生素耐药的同时获得更广泛的抗菌谱，因而可以解决现有生物膜治疗方法存在的抗生素渗透性差和耐药性诱导的问题。

2.本发明利用电中性/带负电的多糖辅助丝素蛋白微球成型，实现了丝素蛋白微球在全水相环境中的可控制备，全水相制备有效提高了丝素蛋白微球的安全性，相对于现有的需要使用毒性交联剂、有机溶剂或依托大型设备制备丝素蛋白微球的方法，在提高产品安全性和降低生产成本上具有明显优势，有利于丝素蛋白微球在临床上的推广应用。

3.本发明通过实验证实，本发明所提供的微针阵列具有良好的机械韧性，有利于在实际应用中顺利穿刺皮肤，进而实现自主给药。

4.本发明通过抗菌实验证实，本发明所提供的微针阵列具有优异的抗细菌生物膜能力，可有效解决目前生物膜治疗方法存在的抗生素渗透性差、耐药性诱导等问题，实现了抗生素和金属纳米粒子的协同抗菌作用并获得更广泛的抗菌谱。

附图说明

图1是实施例1～8制备的SF微球的扫描电镜图。

图2的a、b图是实施例1～8制备的SF微球的粒径分布图，图2的c、d图是实施例1～8制备的SF微球的平均粒径。

图3是实施例1～8制备的SF微球的X射线衍射图谱。

图4的a～d图是实施例11制备的载银纳米离子的SF微球的透射电镜图，图4的e～j图是实施例11制备的载银纳米离子的SF微球的元素分析结果，图4的k图是实施例11制备的载银纳米离子的SF微球中的银纳米离子粒径分布图。

图5是本发明所述微针阵列的制备过程示意图。

图6是实施例12制备的微针阵列在不同视角下的扫描电镜图。

图7是对比例5制备的微针阵列在不同视角下的荧光共聚焦显微镜图。

图8是实施例12、对比例1～4制备的微针阵列的机械性能测试结果。

图9是实施例12、对比例2～4制备的微针阵列的体外抗细菌生物膜能力测试结果。

图10是实施例12、对比例2～4制备的微针阵列影响体外生物膜结构的扫描电镜图像。

图11的a,b图是实施例12制备的微针阵列在体内细菌生物膜中插入的光学图像，图11的c图是实施例12制备的微针阵列在体内细菌生物膜中溶解不同时间高度的变化情况，图11的d图是实施例12制备的微针阵列在体内细菌生物膜中溶解不同时间微针高度变化的光学图像。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明提供的用于抗细菌生物膜感染的微针阵列及其制备方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明的保护范围。

下述各实施例和对比例中：

采用的微针模具包括阵列分布的针尖空腔和与针尖空腔的开口端连通的基底空腔，针尖空腔呈正四棱锥状，基底空腔是底面呈正方形的长方体空腔，基底空腔的底面尺寸为0.5cm×0.5cm，该微针模具中阵列分布(10×10矩阵)有100个针尖空腔，微针模具的材质为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)。

离心操作采用的设备为平板离心机，干燥操作采用的设备为恒温恒湿箱和冷冻干燥机。

采用的透明质酸(Hyaluronic acid,HA)的分子量为10～100kDa。

实施例1

本实施例中，制备丝素蛋白(silk fibroin,SF)微球，步骤如下：

(1)配制溶液

将SF溶于去离子水中得到SF溶液，将透明质酸(Hyaluronic acid,HA)溶于去离子水中得到HA溶液。将两种溶液在室温下均匀混合，所得混合液中SF的浓度为2wt.％，HA与SF的质量比为1:1。

(2)制备SF微球

将步骤(1)所得混合液倒入玻璃培养皿中并在恒温恒湿箱里干燥12h，恒温恒湿箱的温度和相对湿度分别设定为60℃、75％。取出干燥后形成的膜，用去离子水溶解后离心，弃去上清，加入去离子水洗涤所得产物沉淀，再次离心后弃去上清，重复3次，控制离心转速为8000～10000rpm，离心温度为4℃，每次离心时间为10min。将所得产物过100μm的金属滤网，取滤液冷冻干燥得到SF微球。

实施例2

本实施例中，制备SF微球，操作与实施例1基本相同，不同之处仅在于，在干燥步骤(1)所得混合液时，控制恒温恒湿箱的温度为90℃。

实施例3

本实施例中，制备SF微球，操作与实施例1基本相同，不同之处仅在于，在干燥步骤(1)所得混合液时，控制恒温恒湿箱的温度为120℃。

实施例4

本实施例中，制备SF微球，操作与实施例1基本相同，不同之处仅在于，步骤(1)所得混合液中SF的浓度为1wt.％。

实施例5

本实施例中，制备SF微球，操作与实施例1基本相同，不同之处仅在于，步骤(1)所得合液中SF的浓度为4wt.％。

实施例6

本实施例中，制备SF微球，操作与实施例1基本相同，不同之处仅在于，步骤(1)所得混合液中SF的浓度为6wt.％。

实施例7

本实施例中，制备SF微球，操作与实施例1基本相同，不同之处仅在于，步骤(1)所得混合液中HA与SF的质量比为1:4。

实施例8

本实施例中，制备SF微球，操作与实施例1基本相同，不同之处仅在于，步骤(1)所得混合液中HA与SF的质量比为4:1。

实施例9

本实施例中，考察实施例1～8制备的SF微球的形貌、粒径分布和结晶度。

将实施例1～8制备的SF微球固定在样品台上，在喷金前后进行氮气吹扫，使用扫描电镜观察其形貌，结果如图1所示，图中的a～h图分别为实施例1～8制备的SF微球的扫描电镜图。由图1可知，SF微球的粒径在微米级的，表面光滑，呈球形或类球形；成膜时的干燥温度、混合液的浓度和混合液中HA与SF的质量比都会影响SF微球的粒径大小和分布。实施例1、2、8制备的SF微球的尺寸相对更小并且更加均一。

使用粒度分析仪对实施例1～8制备的SF微球的粒径尺寸分布范围进行测量，结果如图2所示，其中的a～b图展示的是粒径尺寸分布范围，其中的c～d图展示的是其平均粒径。当混合液中SF浓度较大时，所制备的SF微球更容易互相粘连，例如实施例6。当混合液中SF的浓度为2wt％时，增大HA与SF的质量比将得到粒径更小、尺寸更均一的SF微球。

使用X射线衍射对实施例1～8制备的SF微球的结晶度进行分析，结果如图3所示，图中的XRD曲线，从下至上依次代表实施例1、2、3、7、8、4、5、6制备的SF微球。由图3可知，SF微球结晶度的增加与微球粒径的减小相对应，也取决于干燥温度，这是由于微球粒径的减小和热驱动的分子链运动加速会不可避免地导致SF疏水链靠在一起并进一步折叠。实施例8制备的SF微球具有丝素蛋白I和丝素蛋白II两种晶型的复合结构，而实施例6制备的SF微球中的则只含有丝素蛋白I这一种晶型。总体而言，本发明所述方法制备的SF微球中的SF都具有较高的结晶度，并且通过调控SF微球的制备条件还可以对结晶度进行灵活调控。

由于SF结晶度会显著影响其溶蚀溶胀和降解性能，进而影响微球中所负载的抗菌剂(金属纳米颗粒)从微针中释放速度，对于实际应用而言，SF微球中SF结晶度的高低可灵活调控意味着可以更好地满足抗菌剂递送的时效要求。而现有制备SF微球的方法，如自组装制备法，制备的SF微球的结晶度通常比较低，若希望利用其实现抗菌剂的长效和缓慢释放，还必须进行后处理提高结晶度。相对于现有制备SF微球的方法，本发明的方法具有SF微球结晶度易于调控的优势，通过调整SF微球的制备条件即可调整SF微球的结晶度。

实施例10

本实施例中，制备载银纳米粒子的SF微球，步骤如下：

取实施例8制备的SF微球，按照每1gSF微球采用0.2L硝酸银溶液的比例，将SF微球均匀分散于浓度为40mg/mL的硝酸银溶液中，在紫外灯下辐照75min。随后离心去除上清，加入去离子水重悬后再次离心去除上清，重复3次，控制离心转速为8000～10000rpm，离心温度为4℃，每次离心时间为10min。将离心所得沉淀冷冻干燥得到载银纳米粒子的SF微球。

实施例11

本实施例中，考察实施例10制备的载银纳米粒子的SF微球的形貌和粒径分布。

使用带有能量色散X射线光谱仪的透射电镜对载银纳米粒子的SF微球进行形貌表征和元素分析，结果如图4的a～j图所示，由图可知银纳米粒子被成功负载于SF微球上并在SF微球中均匀分布，主要暴露{111}晶面，银纳米粒子的粒径分布于15～30nm之间，如图4的k图所示。

实施例12

本实施例中，制备同时负载抗生素和载银纳米粒子的SF微球的可溶性微针阵列，该可溶性微针阵列即为用于抗细菌生物膜感染的微针阵列，其制备过程示意图如图5所示，步骤如下：

(1)配置溶液

将分子量为10～100kDa的HA溶于去离子水中，静置脱除气泡，得到基底溶液；基底溶液中，HA的浓度为100mg/mL。

将莫匹罗星与基底溶液混匀，然后加入实施例10制备的载银纳米粒子的SF微球并充分混匀，脱除气泡，得到浇筑液；浇筑液中莫匹罗星的浓度为200μg/mL，载银纳米粒子的SF微球的浓度为10mg/mL。

(2)制备微针阵列

将浇筑液加入到微针模具中，在4℃以4000rpm的转速离心20min使浇筑液填满微针模具，然后在25℃、相对湿度75％的条件下干燥成型，脱模并保存在干燥柜中，得到同时负载负载抗生素和载银纳米粒子的SF微球的可溶性微针阵列。

使用扫描电镜对本实施例制备的微针阵列的形貌进行表征，结果如图6所示，由图6可知：100根微针在基底上以10×10矩阵阵列排列，各微针均是结构均一、完整的正四棱柱状，针形尖锐，针尖可见微球聚集，即载银纳米粒子的SF微球主要分布于微针的针尖部位；微针高度约为450μm，底部呈正方形，边长约230μm，相邻微针的针尖之间距离约为465μm。

对比例1

本对比例中，制备HA微针阵列，操作与实施例12基本相同，不同之处仅在于，直接以基底溶液作为浇筑液。

对比例2

本对比例中，制备负载SF微球的微针阵列，操作与实施例12基本相同，不同之处仅在于：浇筑液中不含莫匹罗星，并将载银纳米粒子的SF微球替换为实施例8制备的SF微球。

对比例3

本对比例中，制备负载莫匹罗星的微针阵列，操作与实施例12基本相同，不同之处仅在于，浇筑液中含有莫匹罗星但不含载银纳米粒子的SF微球。

对比例4

本对比例中，制备负载了载银纳米粒子的SF微球的微针阵列，操作与实施例12基本相同，不同之处仅在于，浇筑液中含有载银纳米粒子的SF微球但不含莫匹罗星。

对比例5

本对比例中，制备同时负载4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)和载罗丹明B(RhodamineB,RhB)的SF微球的微针阵列。

(1)取实施例8制备的SF微球，按照每1gSF微球采用0.2LRhB溶液的比例，将SF微球均匀分散于浓度为40mg/mL的RhB溶液中。随后离心去除上清，加入去离子水重悬后再次离心去除上清，重复3次，控制离心转速为8000～10000rpm，离心温度为4℃，每次离心时间为10min。将离心所得沉淀冷冻干燥得到载RhB的SF微球。

(2)该步骤的操作与实施例12基本相同，不同之处仅在于，采用的浇筑液中分别用DAPI和载RhB的SF微球替代莫匹罗星和载银纳米粒子的SF微球。

使用荧光共聚焦显微镜观察本对比例制备的微针阵列中的DAPI和载RhB的SF微球的分布情况，结果如图7所示。由图7可知，DAPI在微针上均匀分布，载RhB的SF微球主要分布在微针的针尖和微针针体外部，当然在的其他部位也有分布，这主要是由SF微球的自身重力造成的。由本对比例的结果类推，可以知晓实施例12制备的微针阵列中，载银纳米粒子的SF微球在微针阵列中的分布情况也与此类似，即载银纳米粒子的SF微球主要分布于微针的针尖部位，同时在微针针体外部的分布也较为集中，在微针阵列的其他部位的分布相对更小。

实施例13

本实施中，考察实施例12和对比例1～4制备的微针阵列的机械性能。

通过万能拉力试验机测定实施例12和对比例1～4制备的微针阵列的机械强度。将微针阵列置于不锈钢平台上，微针针尖垂直朝上。以10μm/s的恒定速度垂直下压直至达到设定的最大压力40N。记录压缩过程中微针针尖的压缩位移和微针所承受压力的变化，其位移-压力测试结果如图8的a图所示。所有类型的微针阵列所受压缩力均随着微针针尖形变量的增加而增加，并且机械强度相差不大。

使用扫描电镜观察实施例12和对比例1～4制备的微针针尖在压缩过程中的形变情况，图9b～d图分别反映了在10、20和40N的压力下，实施例12制备的微针阵列的微针针尖弯曲变形，但并未出现断裂现象，说明抗生素和含载银纳米粒子的SF微球的负载不会造成微针阵列力学性能的明显降低，所制备微针阵列均有良好的机械韧性。

实施例14

本实施例中，考察实施例12和对比例2～4制备的微针阵列的体外抗细菌生物膜能力。

通过将实施例12和对比例2～4制备的微针阵列分别与革兰氏阴性大肠杆菌(E.C.)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S.A.)共培养来考察各微针阵列在体外的抗细菌生物膜活性，以未加入任何微针阵列的情况作为控制组。

图9展示了与不同的微针阵列共培养24h后细菌生物膜的残留量。由图9可知，除对比例2以外，其余微针阵列都具有一定的抗细菌生物膜能力，对比例3制备的微针阵列中的莫匹罗星对金黄色葡萄球菌更敏感，而对比例4制备的微针阵列对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有极强的杀灭作用，实施例12制备的微针阵列将抗生素与银纳米粒子联用，抗生物膜效果最优。

使用扫描电镜观察实施例12和对比例2～4制备的微针阵列与细菌生物膜共培养24h后的生物膜形态，结果如图10所示。由图10可知，细菌会在SF微球上黏附生长，除对比例2以外，其余微针阵列都对细菌生物膜表现出了一定的破坏作用，对比例3制备的微针阵列中的莫匹罗星对金黄色葡萄球菌形成的细菌生物膜更敏感，而对比例4制备的微针阵列对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌形成的细菌生物膜均具有破坏作用，实施例12制备的微针阵列将抗生素与银纳米粒子联用，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌形成的细菌生物膜均表现出最优异的破坏效果。

实施例15

本实施例中，考察实施例12制备的微针阵列在体内金黄色葡萄球菌(S.A.)生物膜上的溶解和穿刺能力。

将实施例12制备的微针阵列用拇指垂直按压插入小鼠生物膜感染的伤口中，如图11的a1～a2图所示，随后，将伤口周围的皮肤及其下的肌肉组织从小鼠体内取出，如图11的a3图所示，可以观察到，微针阵列没有从伤口上脱落，这表明微针阵列已经成功插入并粘附在感染部位。

对取出的部分进行组织切片，结果显示，细菌在伤口部位形成了生物膜，如图11的b1图所示，而微针阵列可以穿透细菌生物膜并植入载银纳米粒子的SF微球和药物，如图11的b2～b3图所示，同时由图可知，微针的穿透深度约为150μm，这对于消除从感染伤口迁移到真皮甚至皮下组织的细菌至关重要。亲水性的HA被选为微针基体材料，可以在短时间内将抗菌剂高效送入细菌生物膜。

将微针阵列插入有生物膜感染的伤口部位不同时间后取出，观察微针阵列中微针的形貌并统计微针高度百分比(微针高度占微针初始高度的百分比)随插入时间的变化情况，结果如图11的c～d所示，由于脓液的渗出，在微针阵列插入伤口后，微针的针尖会立即溶解，溶解程度随着插入时间的增加而增加。在微针阵列插入有生物膜感染的伤口部位20s后，微针的剩余高度只有21.15±2.29％，表明大部分的载银纳米粒子的SF微球和抗生素已经被递送到感染部位。

本实施例的实验结果表明，实施例12制备的微针阵列有足够的强度插入细菌生物膜，并可有效地输送抗菌剂，同时在皮肤中具有良好的溶解性，可以缩短临床上的给药时间。

Claims (10)

1.用于抗细菌生物膜感染的微针阵列，该微针阵列由基底和在基底一侧上阵列分布的微针组成，微针呈棱锥状，其特征在于，所述微针阵列的基体材料为生物相容的水溶性生物可降解高分子材料，微针的基体材料中负载有抗生素和载金属纳米粒子的微球，所述载金属纳米粒子的微球主要负载于微针的尖端部；所述载金属纳米粒子的微球由丝素蛋白微球和均匀分布在丝素蛋白微球中的金属纳米粒子组成，所述丝素蛋白微球由丝素蛋白和电中性/带负电的多糖在全水相环境中制备得到，所述金属纳米粒子为对细菌具有杀灭作用的金属纳米粒子；

该微针阵列在按压施用至皮肤的细菌生物膜感染部位后，微针尖端首先作用于细菌生物膜对细胞外聚合物进行物理破坏，随后微针溶解而将抗生素和载金属纳米粒子的微球释放至细菌生物膜中，释放出的抗生素直接杀灭细菌，释放出的载金属纳米粒子的微球诱导细菌在载金属纳米粒子的微球表面黏附并将细菌杀灭。

2.根据权利要求1所述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列，其特征在于，所述电中性/带负电的多糖包括透明质酸、葡聚糖以及海藻酸钠中的至少一种。

3.根据权利要求1所述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列，其特征在于，所述载金属纳米粒子的微球的制备方法如下：

(1)将丝素蛋白溶水溶液和电中性/带负电的多糖的水溶液混合均匀得到混合液，该混合液中丝素蛋白的浓度为1wt.％～4wt.％；

(2)将混合液在温度为60～120℃、相对湿度为70％～80％的恒温恒湿环境中干燥成膜，将膜用水溶解，然后离心、弃上清，将所得产物洗涤并冷冻干燥，得到丝素蛋白微球；

(3)将丝素蛋白微球充分分散在金属离子水溶液中，将所得分散液在紫外光下充分辐照，丝素蛋白将金属离子还原为金属纳米离子并通过配位作用将金属纳米离子稳定固定在丝素蛋白微球中，然后离心、弃上清，将所得产物洗涤并冷冻干燥，得到载金属纳米粒子的微球。

4.根据权利要求3所述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列，其特征在于，步骤(1)所述混合液中，电中性/带负电的多糖与丝素蛋白的质量比为(1～4):1。

5.根据权利要求3所述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列，其特征在于，步骤(3)所述分散液中，丝素蛋白微球与金属离子供体的质量比为1:(5～10)。

6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列，其特征在于，所述生物相容的水溶性生物可降解高分子材料为透明质酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮或羧甲基纤维素钠。

7.根据权利要求1至5中任一权利要求所述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列，其特征在于，所述抗生素为用于治疗皮肤感染的抗生素。

8.根据权利要求1至5中任一权利要求所述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列，其特征在于，所述微针的高度为400～800μm。

9.权利要求1至8中任一权利要求所述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将水溶性生物可降解高分子材料溶解于水中，脱除气泡，得到基底溶液，基底溶液中，水溶性生物可降解高分子材料的浓度为100～200mg/mL；将抗生素和载金属纳米粒子的微球与基底溶液充分混合，脱除气泡，得到浇筑液；

(2)将浇筑液加入到微针模具中，在1～4℃充分离心，使浇铸液填满微针模具，在恒温恒湿条件下干燥成型，脱模，得到用于抗细菌生物膜感染的微针阵列。

10.根据权利要求9所述用于抗细菌生物膜感染的微针阵列的制备方法，其特征在于，步骤(2)在温度为20～30℃、相对湿度为70％～85％的恒温恒湿条件下进行干燥成型。