CN116539704A - 一种对组织中ros分布进行可视化分析的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析检测技术领域，公开了一种对组织中ROS分布进行可视化分析的方法及其应用。具体涉及一种对生物组织内活性氧自由基(ROS)分布及含量进行可视化分析的方法及应用。所述方法其特征在于，所述方法包括：1)ROS探针试剂施加及在组织中原位转化步骤；2)质谱成像对探针产物进行原位采样步骤；3)成像数据处理及可视化步骤。本发明还涉及所述方法的应用。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体地说，是用于对生物组织中ROS进行可视化分析的方法及其应用。本发明针对生物组织中ROS的分布难以检测的问题，提供了一种将组织中ROS转化为有质谱信号响应的探针产物，并采用质谱成像技术对探针产物进行检测，从而实现对组织中ROS的分布及含量进行可视化分析的方法。本发明还提供了所述方法在体内和体外分析中的具体应用。
背景技术
活性氧(ROS)是需氧生物由于部分缺氧生成的不完全氧化代谢产物，包括过氧化物、超氧化物、羟基自由基、单线态氧和α-氧等来源的自由基和非自由基。 ROS的产生与生命体的多种生理(如细胞生长、分化、老化、凋亡等)和病理(如衰老，缺血，癌症等)过程密切相关，因此，对组织内的ROS进行分析有助于更好地理解氧化应激在生命体中的作用机制。
对ROS进行检测往往采用电子顺磁共振、色谱方法、荧光染色法、化学发光法、分光光度法、电化学生物传感器等。其中，电子顺磁共振、色谱方法和电化学方法能够测定组织和细胞的ROS；荧光染色法和化学发光法适合对培养细胞内的氧化还原状态进行测量。然而，这些方法往往适用于组织块、细胞样品或组织匀浆，未能对ROS在组织及组织微区中的空间分布进行表征。
质谱成像技术通过对样品按空间位置逐点进行扫描，获得样品表面化合物离子强度与位置关系的多维数据阵，然后通过对不同质荷比的离子按照其强度和空间位置进行重构和可视化，最终实现多种化合物分子的高通量成像分析。质谱成像技术作为一种新型的化学成像技术，具有高通量、高特异性等优点，在新药研发、疾病诊断、生命科学研究等领域具有巨大的应用前景。但由于ROS本身不稳定，难以用质谱直接进行检测，尚未有将质谱成像用于组织中ROS可视化分析的报道。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种对组织中ROS分布进行可视化分析的方法及应用。
为解决针对组织中ROS难以检测的难题，本发明提供了如下技术方案：
一种对组织中ROS分布进行可视化分析的方法，包括下列步骤：1)施加ROS 探针试剂，使其在组织原位转化为探针产物；2)采用质谱成像技术对转化后的样品进行原位采样；3)对所采集的成像数据进行数据处理及可视化分析。
本发明的方法适用于离体或在体的生物组织；生物组织的来源是动植物、微生物或人体之中的至少一种，动植物包括各品种大鼠、小鼠、兔、狗、斑马鱼、果蝇、植株；样品形式包括组织涂片、组织切片、模拟组织薄片、以及添加有标准物质的组织涂片、组织切片、模拟组织薄片等；所检测的ROS包括过氧化物、超氧化物、羟基自由基、单线态氧和α-氧等自由基和非自由基；所采用的ROS探针试剂是能够在生物组织内与ROS反应并转化为探针产物的试剂；ROS探针试剂和探针产物均具有质谱信号响应，还可含有荧光吸收基团；以体内给予或体外施加的方式将ROS探针试剂导入组织，其中，体内给予是指以体内血管内注射、灌流、灌胃、喂食等其中一种或多种方式将ROS探针试剂导入到生物组织，体外施加是指以喷涂、滴加、凝结、沉积等其中一种或多种方式将ROS探针试剂导入到组织原位。在本发明方法中，质谱成像是采用离子化方法对样品表面进行解吸附和电离，再经质量分析器获得样品表面各像素点离子的质荷比和离子强度信息的分析技术；离子化方法包括解吸电喷雾电离、激光解吸电离、二次离子电离、介质阻挡放电电离、基质辅助激光解吸电离、等离子体电离、空气动力辅助电离、等离子体辅助激光解吸电离等其中的一种或多种组合；质量分析器包括静电轨道阱质量分析器、飞行时间质量分析器、四极杆质量分析器、离子阱质量分析器等其中的一种或多种组合；数据处理是借助质谱工作站、质谱成像软件或其它软件对质谱数据进行导出、过滤、去卷积、峰识别、峰定量、峰特征提取与导出、数据库搜索、化合物结构鉴定操作；可视化分析是借助质谱成像软件在样品表面各像素点的质谱数据中搜寻指定质荷比离子的质谱峰，结合其信号强度及其在样本表面的定位信息，绘制出对应分子或离子在样本表面分布的三维图，包括对质谱成像数据按像素点进行点对点重建得到所述探针产物与所述探针试剂的离子丰度比值成像图，以表征组织中ROS的含量及分布；数据处理及可视化分析还包括同时对组织中的ROS和其它感兴趣化合物进行定性、定量和共定位研究。
本发明还提供了上述方法在组织中ROS分布可视化分析的应用，包括以下步骤：1)施加与反应步骤：向组织中施加ROS试剂，使其与组织内ROS发生反应； 2)成像采样步骤：采用质谱成像技术对所得到的样品进行原位采样；3)数据处理和可视化分析步骤：对质谱成像采集的数据进行处理和可视化分析。
本发明应用适用于各种生物组织、器官、器官微区、各类疾病模型、临床病理组织以及其他生物样品；能够实现不同生物样品间ROS的相对含量表征、组织微区内ROS相对含量表征、疾病微区ROS变化表征；通过质谱成像-标准物质添加法实现对组织中ROS的绝对定量；通过选用具有电荷基团的试剂作为ROS探针，能够提高质谱成像可视化分析ROS的灵敏度，ROS探针包括MitoB、DHE、DHR、 DCF、DCFH-DA、Mito-Tracker Red CMXRos；采用上述方法与光学成像分析方法联合使用可对同一样品进行多模态成像分析；对组织中的ROS和其它感兴趣化合物进行共定位和定性、定量分析；对ROS生成、转化、体内作用以及各方面相关联的代谢物进行同时检测，可探索ROS对机体和疾病的作用机制；利用上述方法测得的ROS相对含量可对未知类型组织样品进行识别，测得的ROS绝对含量可对未知类型组织样品进行疾病程度的量化比较，其中未知类型组织样品包括组织损伤，肿瘤组织。
本发明技术方案的优势
本发明的方法能够实现对生物组织中ROS的含量和分布进行可视化分析。方法采用质谱成像技术作为检测手段，对ROS探针产物的含量和分布进行检测，解决了直接检测原始组织内ROS的难题；通过采用灵活的探针试剂施加方式，扩展了对各类型器官、组织等生物样品的适用性；进一步采用探针产物/探针试剂离子的丰度比率作图反映组织内ROS的含量与分布，有效地消除了组织基质效应和检测误差的干扰。本发明的方法还能够对生物组织中与ROS相关化合物的含量和分布进行同步表征。
使用本发明的方法及其应用的具体优点包括：
(a)选用组织薄片作为待测样品，高保真地保留了ROS及其它内源性化学物质在原始组织中的定位信息。
(b)采用质谱成像技术作为检测手段，能够高通量、高特异性地同时获取待测样品中ROS探针试剂离子、探针产物离子及其它化合物离子在组织切片上的定性、定量和定位信息。
(c)采用质谱成像数据处理方法和相关软件，能够从采集到的成像数据中提取出并以二维图像的形式量化显示ROS探针试剂离子、探针产物离子及其它感兴趣化合物离子在组织切片上的空间分布信息。
(d)采用像素点对像素点的ROS探针产物离子/探针试剂离子丰度比值成像对组织切片中ROS进行高灵敏的表征，能够有效地消除组织基质效应和检测误差的干扰。
(e)通过选用或构建具有带电荷基团的试剂作为ROS探针，能够显著提高质谱成像可视化分析ROS的灵敏度。
(f)结合质谱成像分析和ROS与其探针试剂在组织原位的转化反应，能够开展对ROS在组织器官间、组织结构微区、病理微区等空间分布进行可视化的生物应用。
(g)采用质谱成像技术对组织中ROS进行检测时，还能同时获取样品中药物及其代谢产物、体内抗氧化代谢物、脂质过氧化产物及过氧化酶所催化内源性反应产物和底物等感兴趣化学特征的分布和相对含量，通过研究与ROS 分布和表达具有一致性的生物分子，有助于探索ROS产生及在体内的作用机制。
(h)通过采用体内或体外施加ROS探针试剂，扩展了对各类型器官、组织及组织切片等样品的适用性。
根据以下详细说明，本发明的其它特征和优点是显而易见的。但是应当理解，以下示例仅给出了本发明实施方式在特定实施例的详细说明。根据以下详细说明，在本发明的实质和范围内进行的各种改变和修改对于本领域的技术人员是显而易见的。
附图说明
根据本文中给出的详细说明和附图，将能更加充分地理解本发明特征、目的和优点，该详细说明和附图仅以示例的方式给出，不限制本发明的预期范围。
图1基于质谱成像对组织中ROS分布进行可视化分析的方法示意图。
图2分别用作ROS探针试剂和产物试剂的MitoB和MitoP结构式与转化反应，及其一级、二级质谱图。
图3(A)探针试剂MitoB与ROS反应生成MitoP随孵育时间变化曲线；(B) 分别孵育10min、2h、3h后组织中MitoB及MitoP的质谱图；(C)采用质谱成像标准添加法对肝组织中ROS进行分析的定量曲线。
图4带有荧光基团的ROS探针试剂DHE和产物试剂的(A)结构式和转化反应、(B)ROS在组织中分布的荧光图像、(C和D)在组织中分布的质谱成像图、以及(E)ROS在组织中分布的质谱成像图。
图5以MitoB作为探针试剂表征ROS在大鼠主要组织器官的分布。
图6以MitoB作为探针试剂表征ROS在肾组织微区中的分布。
图7以MitoB作为探针试剂表征ROS在心肌缺血再灌注模型的分布以及氧化应激引起的代谢改变。
图8心肌缺血再灌注模型中变化的代谢通路。
具体实施方式
申请人发现ROS探针试剂与ROS在生物组织中发生化学反应具有局域性的特点，这意味着对转化反应后组织上的ROS探针产物进行检测能够替代对原始组织内ROS的检测。申请人进一步采用质谱成像技术作为检测手段，能够高通量、高特异性地同时获取待测样品中ROS探针试剂离子、探针产物离子及其它化合物离子在组织切片上的定性、定量和定位信息。因此，本发明通过将质谱成像分析和 ROS与其探针试剂在组织原位的转化反应相结合而提供了用于对生物组织中ROS 分布进行可视化分析的方法和应用。
图1为本发明的方法示意图。
本发明在实施方式上，分成三个步骤：第一步是施加ROS探针试剂，使其在组织原位转化为探针产物。探针试剂的施加方式可分为体内给予和体外切片孵育两种。第二步是采用质谱成像技术对经转化得到的样品进行原位扫描采样。第三步是对所采集的成像数据进行数据处理及可视化分析。通过提取ROS产物离子与探针试剂离子的峰信号，并按像素点对点比值的方法重构质谱成像图来反映 ROS在组织中的分布和含量。
本发明方法的应用对象包括但不限于各实施例，同样适合于小鼠、果蝇、斑马鱼、各类植株及人体等各种生命体及各类型组织切片，具有广泛应用价值。
本发明的具体应用将在下面进行描述。
实施例1：体外孵育肝组织切片ROS分布可视化及绝对定量分析
本实施例的目的是证明采用体外孵育方式在离体组织的切片上施加探针试剂，以及对大鼠肝组织切片和模拟组织薄片上ROS分布进行可视化分析的可行性。具体地说，是考察在体外进行ROS转化反应的孵育时间，同时对样品中反应底物 ROS探针试剂MitoB和ROS产物MitoP进行原位质谱鉴定。此外，通过模拟组织标准添加法对肝组织中ROS含量进行绝对定量分析。
在本实施例中，优选地采用易于透过脂质膜并易于质谱检测的带有磷阳离子的MitoB作为ROS探针试剂。制备大鼠新鲜肝组织连续冰冻切片，切片制备完成后，在组织区滴加20μL 5ng/ml MitoB生理盐水溶液，切片置于暗盒内，避光37℃下孵育，孵育时间分别为：5min，10min，20min，45min，1h，2h，3h，4h， 8h。孵育后取出切片，PBS清洗3次后，于真空下干燥1h。优选地，使用敞开式离子源对所述样品切片进行解吸、电离并传输到质谱仪进样口直接分析，本实施例中，优选的离子源参数为：AFADESI离子源，喷雾溶液：乙腈水(8:2V/V),喷雾溶液流速：5μl/min,喷雾气压力：0.7MPa，线性扫描速率0.2mm/s，扫描间距：0.2mm。质谱仪以全扫描(扫描范围：m/z 70-1000)及平行反应监测模式(m/z 369.1400，m/z397.1520)采集数据。优选地，采用Q-Orbitrap质谱仪进行分析，仪器参数：自动增益时间：200ms，自动增益控制目标：3.0E6，RF电压：55V。经过质谱数据工作站处理正离子模式下采集的数据，如图2所示，得到MitoB及孵育后产生MitoP的一级、二级质谱信息和裂解规律。以孵育时间为横坐标，MitoP 与MitoB比值为纵坐标，绘制了ROS与MitoB反应随孵育时间变化曲线，如图3 所示。可见孵育5min后出现产物MitoP，5min-4h内反应随时间增加而继续进行，孵育4h后反应达到稳态。因此，优选出体外MitoB孵育组织切片ROS检测方法的最佳孵育时间为4h。
进一步地，使用标准加入法制备了含H2O2的肝模拟组织薄片用于大鼠肝组织中ROS的绝对定量分析。本实施例具体包括如下步骤：
赋形模板的准备：以5cm×1cm大小、厚度为100μm的聚氯乙烯膜作为模拟组织薄片赋形型材。使用高精度刻字机在聚氯乙烯膜上刻制4个矩形槽(矩形槽大小为5mm×2mm)。将刻制好矩形槽的聚氯乙烯膜去除背面保护膜，贴覆于玻璃载玻片上，与载玻片共同构成用于塑形的赋形模板，常温备用。
肝组织匀浆的制备：取SD大鼠新鲜肝组织100mg，加入温度为4℃纯净水 500μl于匀浆管中，以转速4000r/s匀浆30s，重复四次，每次间隔30s。
梯度H2O2溶液的制备：取3％的H2O2储备液，用纯净水进行逐倍稀释 10,50,100,500倍，现用现配。
肝模拟组织薄片制备：取80μL肝组织匀浆，10μL梯度稀释的H2O2溶液，10μL 10μg/ml mitoB溶液，充分混匀。每组取5μL混合溶液依次滴加于赋形模板上各矩形槽中心，填满整个矩形槽区域后，放置于保干器中真空常温干燥30min备用。
模拟组织薄片的质谱成像分析：干燥后撕去载玻片上赋形聚氯乙烯膜，将组织薄片进行质谱成像分析。优选地，采用空气动力辅助离子化质谱成像分析，离子源和质谱仪的参数设置同上。具体地说，将组织薄片按x，y轴方向逐行扫描， x轴步进为速度0.2mm/s，Y轴步进距离：0.2mm，质谱仪以全扫描模式在正离子模式下采集数据，质谱仪器参数如上所述。对采集到的质谱原始数据进行数据处理和可视化分析。优选地，采用质谱成像数据处理软件MassImager。经重构质谱成像图后，计算各模拟组织区MitoP平均响应强度，以MitoP响应强度为纵坐标，加入H2O2浓度为横坐标绘制回归曲线如图3C，回归方程为方程 Y＝1088342X+5710699，回归系数R2＝0.9715，根据该方程计算Y＝0时X值即为肝模拟组织中ROS含量，经计算为5.25pmol/mm2，根据匀浆稀释倍数推定组织中 ROS含量为32.8pmol/mm2。
实施例2：新鲜组织中ROS分布的原位多模态表征
本实施例的目的是证明采用含荧光基团的ROS探针试剂以体外孵育方式用于临床采集肿瘤组织样品的ROS可视化分析和进行多模态分析的可行性。具体地说，是在检测步骤中，先后使用多种检测方法对探针及探针产物进行可视化表征。
在本实施例中，优选地采用二氢乙啶(DHE)作为ROS探针试剂。将其施加于组织上，可在细胞内的超氧化物阴离子作用下脱氢，产生乙啡啶(图4A)，乙啡啶可以与细胞中DNA或RNA结合产生红色荧光。组织原位细胞中ROS越多，产生的乙啡啶越多，其红色荧光强度越强。在荧光成像分析之后，采用质谱成像技术检测探针试剂DHE和产物乙啡啶的离子信号，也可以特异性地反映组织中 ROS的分布和相对强度。
本实施例中优选荧光显微镜和质谱仪作为检测仪器，以探针及探针产物作为检测对象对ROS的分布进行多模态可视化表征。
本实施例优选地采用临床新鲜取样的胶质瘤组织切片为样品，以DHE为ROS 探针试剂，配制为5μM与组织进行孵育，37℃下孵育30min后，用PBS清洗3 次，随后通过荧光显微镜进行检测。检测结果如图4B所示，在临床鉴别为低级别胶质瘤样品中，其荧光强度明显高于正常组织样品，表明在胶质瘤发生发展进程中ROS发生了显著变化，低级别胶质瘤组织受到了氧化应激损伤。随后对其进行质谱成像分析，优选地，采用空气动力辅助离子化质谱进行成像分析，离子源和质谱仪的参数设置如实施例1。探针试剂及探针产物的离子成像图如图4C和D所示，进一步将两者离子信号作点对点比率成像图(图4E)，可视化地反映ROS的分布。
实施例3：大鼠各组织器官中ROS含量及分布表征
本实施例的目的是采用体内给予ROS探针试剂以及在体转化的方式，结合质谱成像对ROS探针产物进行检测，证明本方法对体内ROS相对含量和分布进行可视化分析的可行性以及对各组织器官的普遍适用性。
在本实施例中，采用实施例1中的MitoB作为ROS探针试剂。将MitoB生理盐水溶液按3μM/kg剂量经尾静脉注射至雄性SD大鼠体内，注射后令大鼠自由活动、饮食和饮水，4h后经高浓度乙醚致死，迅速取心、肝、脾、肺、肾等组织器官置于-80℃保存。将组织器官按最大切面切割制备冰冻切片，冰冻切片用于质谱成像扫描。优选地，采用空气动力辅助离子化质谱进行成像分析，离子源和质谱仪的参数设置如实施例1。具体地说，将冰冻切片按x，y轴方向逐行扫描，x轴步进为速度0.2mm/s，Y轴步进距离：0.2mm，质谱仪以全扫描模式在正离子模式下采集数据。经过质谱数据工作站及质谱成像软件处理得到各质荷比离子在组织区域分布及含量重构图，对切片各像素点ROS产物试剂MitoP离子(m/z 369.1398) 与ROS探针试剂MitoB离子(m/z 397.1520)的强度进行比值分析和图像重构，得到各器官中ROS分布如图5所示，在大鼠体内，肝、脾中产生的ROS最多，其次为心、肺，肾中产生的ROS含量相对较少。
实施例4：肾组织各结构微区中ROS的分布和相对含量表征
本实施例的目的是采用高分辨质谱成像方法对肾组织各解剖微区中ROS进行分析，证明本方法能够对组织微区内ROS以及相关代谢物的分布进行精细地可视化分析。
将MitoB生理盐水溶液按3μM/kg剂量经尾静脉注射至雄性SD大鼠体内，注射后令大鼠自由活动、饮食和饮水，4h后经高浓度乙醚致死，迅速取肾组织置于 -80℃保存。将肾组织按冠状面切割制备冰冻切片，用于质谱成像分析。优选地，使用空气动力辅助离子化质谱成像分析，离子源和质谱仪的参数设置同实施例1。具体地说，将冰冻切片按x，y轴方向逐行扫描，x轴步进为速度0.2mm/s，Y轴步进距离：0.2mm，质谱仪以全扫描模式在正离子模式下采集数据。经过质谱数据工作站及质谱成像软件处理得到各质荷比离子在组织区域分布及含量重构图，对切片各像素点ROS产物试剂MitoP离子(m/z 369.1398)与ROS探针试剂MitoB 离子(m/z 397.1520)的强度进行比值分析和图像重构，得到各器官中ROS分布如图6所示，肾各微区中ROS量为肾盂>内皮质>外皮质>肾髓质，肾皮质由于代谢活跃，产生的ROS更多。此外，本方法还能同时提供各个微区特异性代谢物，如图6，m/z 830.5444在外皮质呈特异性分布，m/z 854.5439在内皮质高表达，其分布与ROS高表达区高度一致，m/z257.1459在肾髓质呈特异分布，而m/z 537.1945 在肾盂高表达。
实施例5：心肌缺血再灌注模型的ROS分布及代谢组学分析
本实施例的目的是证明本方法能够从ROS及相关代谢物的分布特征角度对疾病机制开展研究。通过对ROS在心肌缺血再灌注大鼠模型疾病组织微区的特异性分布进行表征，从而对心肌缺血再灌注过程中氧化应激对机体代谢组学的影响进行探索。
本实施例包括如下步骤：
大鼠心肌缺血再灌注模型的制备：将MitoB生理盐水溶液按3μM/kg剂量经尾静脉注射至雄性SD大鼠体内，注射1h后将动物麻醉，仰卧固定手术板上。胸骨左侧剃毛，纵向剪开皮肤4cm,钝性分离皮下肌肉,在分离三和四肋间暴露出胸膜，用镊子撕开胸膜进入胸腔,用止血钳撑开肋骨,暴露出心脏。用镊子撕破心膜，把心脏夹出，于左心耳下方约3mm处进针，插入鱼线，活结结扎后用缝合线结扎放回胸腔，逐层缝合皮肤,缝合结束后擦拭碘伏消毒，制备大鼠心肌缺血模型。缺血30min后，轻抽鱼线再灌注，再灌注1.5h后经高浓度乙醚致死，迅速取心脏置于-80℃保存。
切片制备和质谱成像检测：将心脏按冠状面切割制备冰冻切片，用于质谱成像分析。优选地，使用空气动力辅助离子化质谱成像分析，离子源和质谱仪的参数设置及具体步骤同实施例1。此外，为了更全面地表征心肌缺血后代谢组学变化，本实施例中还进行了相邻组织切片负离子模式下质谱成像分析。经过质谱数据工作站及质谱成像软件处理得到各质荷比离子在组织区域分布及含量重构图，对切片各像素点MitoP(m/z 369.1398)与MitoB(m/z 397.1520)的强度进行比值分析和图像重构。
本实施例结果如图7所示，在心肌缺血核心区，由于组织坏死，细胞死亡， MitoB不能进入细胞，因此该区域未测到MitoP(m/z 369.1398)及MitoB(m/z 397.1520)离子信号。在缺血核心区周围，MitoP与MitoB比值呈高表达，这表明缺血周围区产生了大量ROS，进一步造成了组织氧化应激损伤。具体表现为：体内抗氧化代谢物谷胱甘肽(m/z 306.0770)、抗坏血酸(m/z 175.0249)在缺血区及缺血周围含量降低，脂质过氧化中间产物溶血磷脂酰胆碱(m/z 496.3398)及终产物4-羟基壬烯醛(m/z 179.1043)含量增高。
本实施例进一步展示了本发明提出方法可以在检测ROS同时检测出组织中多种代谢物及其分布。对心肌缺血再灌注后，缺血区与正常供血区代谢组学分析，经多变量与单变量统计分析，结合在人类代谢组学数据库(Human Metabolome Database,HMDB https://hmdb.ca/)对有统计学差异的离子进行数据库检索，推测质谱峰归属代谢物，共鉴定出309个差异代谢物。更进一步地，对差异代谢物进行了代谢通路归属和代谢通路分析。如图8展示了缺血后发生显著改变的代谢通路，包括糖代谢、三羧酸循环、氨基酸代谢、嘌呤和嘧啶代谢等。图8中，圆圈表示检测到有显著差异的代谢物，无圆圈标记的代谢物为未检测到或无统计学差异，但在代谢通路中作为连接差异代谢物关键的节点的代谢物。
本实施例说明，本发明提供的方法心肌缺血再灌注通过对组织中ROS及相关代谢物的分布进行共定位分析能够对氧化应激损伤的机制进行探讨。
以上应用了较佳的具体实施方式对本发明的构思、原理和流程进行了阐述。上述实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。凡依本发明专利申请范围所述的构思、原理及流程所做的变化或修饰，均包括在本发明权利要求的保护范围内。
附表 中英文对照
Claims (33)
1.一种对组织中ROS分布进行可视化分析的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
1)施加ROS探针试剂，使其在组织原位转化为探针产物；
2)采用质谱成像技术对经1)转化后的样品进行原位采样；
3)对2)中所采集的成像数据进行数据处理及可视化分析。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述组织是离体或在体的生物组织。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述生物组织的来源包括动植物、微生物或人体之中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的动植物包括各品种大鼠、小鼠、兔、狗、斑马鱼、果蝇、植株。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述ROS包括过氧化物、超氧化物、羟基自由基、单线态氧和α-氧等自由基和非自由基。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述ROS探针试剂是能够在生物组织内与ROS反应并转化为探针产物的试剂。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述ROS探针试剂和所述探针产物均具有质谱信号响应。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述ROS探针试剂和所述探针产物可含有荧光吸收基团。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述施加是指以体内给予或体外施加的方式将ROS探针试剂导入组织。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述体内给予是指以体内血管内注射、灌流、灌胃、喂食等其中一种或多种方式，将ROS探针试剂导入到生物组织。
11.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述体外施加是指以喷涂、滴加、凝结、沉积等其中一种或多种方式，将ROS探针试剂导入到组织原位。
12.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述样品为组织薄片形式。
13.根据权利要求12所述方法，其特征在于，所述组织薄片形式包括组织涂片、组织切片、模拟组织薄片、以及添加有标准物质的组织涂片、组织切片、模拟组织薄片。
14.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述质谱成像是采用离子化方法对样品表面进行解吸附和电离，再经质量分析器获得样品表面各像素点离子的质荷比和离子强度信息的分析技术。
15.根据权利要求14所述方法，其特征在于，所述离子化方法包括解吸电喷雾电离、激光解吸电离、二次离子电离、介质阻挡放电电离、基质辅助激光解吸电离、等离子体电离、空气动力辅助电离、等离子体辅助激光解吸电离等其中的一种或多种组合。
16.根据权利要求14所述方法，其特征在于，所述质量分析器包括静电轨道阱质量分析器、飞行时间质量分析器、四极杆质量分析器、离子阱质量分析器等其中的一种或多种组合。
17.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述数据处理是借助质谱工作站、质谱成像软件或其它软件对质谱数据进行导出、过滤、去卷积、峰识别、峰定量、峰特征提取与导出、数据库搜索、化合物结构鉴定等操作。
18.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述可视化分析是借助质谱成像软件在样品表面各像素点的质谱数据中搜寻指定质荷比离子的质谱峰，结合其信号强度及其在样本表面的定位信息，绘制出对应分子或离子在样本表面分布的三维图。
19.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述可视化分析还包括对质谱成像数据按像素点进行点对点重建得到所述探针产物与所述探针试剂的离子丰度比值成像图，以表征组织中ROS的含量及分布。
20.根据权利要求19所述方法，其特征在于，所述离子丰度比值成像图能够反映组织中ROS的含量及分布。
21.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述数据处理及可视化分析还包括同时对组织中的ROS和其它感兴趣化合物进行定性、定量和共定位研究。
22.权利要求1-21任一项所述的方法在组织中ROS分布可视化分析的应用，其特征在于，所述应用包括下列步骤：
施加与反应步骤：向组织中施加ROS试剂，使其与组织内ROS发生反应；
成像采样步骤：采用质谱成像技术对所得到的样品进行原位采样；
数据处理和可视化分析步骤：对质谱成像采集的数据进行处理和可视化分析。
23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述方法适用于各种生物组织、器官、器官微区、各类疾病模型、临床病理组织以及其他生物样品。
24.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述方法能够实现不同生物样品间ROS的相对含量表征、组织微区内ROS相对含量表征、疾病微区ROS变化。
25.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述方法通过质谱成像-标准物质添加法实现对组织中ROS的绝对定量。
26.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述方法通过选用具有电荷基团的试剂作为ROS探针，能够提高质谱成像可视化分析ROS的灵敏度。
27.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述ROS探针包括MitoB、DHE、DHR、DCF、DCFH-DA、Mito-Tracker Red CMXRos等试剂。
28.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，利用所述方法与光学成像分析方法联合使用对同一样品进行多模态成像分析。
29.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，利用所述方法对组织中的ROS和其它感兴趣化合物进行共定位和定性、定量分析。
30.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，利用所述方法对ROS生成、转化、体内作用以及各方面相关联的代谢物进行同时检测，探索ROS对机体和疾病的作用机制。
31.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，利用所述方法测得的ROS相对含量对未知类型组织样品进行识别。
32.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，利用所述方法测得的ROS绝对含量对未知类型组织样品进行疾病程度的量化比较。
33.根据权利要求31-32所述的应用，其特征在于，所述的未知类型组织样品包括组织损伤，肿瘤组织。
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| CN117007825B (zh) * | 2023-10-07 | 2023-12-22 | 北京众驰伟业科技发展有限公司 | 一种全自动凝血测试仪的试剂自动识别与定位系统及方法 |
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