CN116528902A - 用于高药物/基因负载的缀合有聚合物的微泡 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了精胺修饰的微泡及其制备方法，以及使用精胺修饰的微泡进行药物递送的方法。

Description

用于高药物/基因负载的缀合有聚合物的微泡
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月13日提交的美国临时申请第63/091,204号的优先权，其全部内容据此通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及用于通过微泡实现药物递送的微泡组合物，以及制备和使用(特别是与声致穿孔(sonoporation)结合使用)微泡组合物的方法。
背景技术
药物递送通常涉及使用载体将药物或治疗剂(例如，基因或治疗性蛋白质)递送至细胞，并任选地诱导细胞对治疗剂的摄取(例如，穿过细胞质膜的转移)。药物递送载体可以另外用于靶向特定细胞类型，并可提高治疗剂对体内全身性递送的药物的特定组织的生物利用度。药物递送在实现高药物/载体装载效率、稳定装载、保护治疗剂免于生物降解、靶向特定组织和细胞类型以及促进细胞对药物的高效摄取方面面临许多挑战。特别是基因疗法有希望为疾病提供单一治疗的治疗益处。大多数临床基因疗法利用病毒载体，其受到潜在诱变、免疫原性和非特异性递送的限制。微泡是临床上使用的超声造影剂，其被认为是靶向药物递送的有前景的媒介物。然而，利用阳离子微泡的药物递送的报道仅显示了对有效载荷诸如DNA的微弱且不稳定的结合，并且还确定了对不可接受的毒性的担忧。
发明内容
本文公开了微泡组合物，其用于将大量有效载荷，诸如核酸或其它药物可递送物(deliverables)，有效地装载到微泡上以用于药物递送(例如，基因疗法应用)。本文还公开了包含微泡组合物的药盒、制备微泡组合物的方法以及使用微泡组合物进行药物递送的方法。微泡组合物的外表面可用精胺分子修饰，以与有效载荷有效结合。大量精胺分子可通过交联聚合物诸如葡聚糖与微泡缔合，所述交联聚合物可以将一个或多个精胺分子与微泡连接。使用声致穿孔技术，可以以空间和时间靶向的方式将有效载荷有效地递送穿过细胞膜。
在本公开的一个方面，用于将有效载荷递送至一个或多个细胞的微泡组合物包含多个精胺修饰的微泡。每个微泡包含被表面活性剂壳包封的气体核心，并且多个精胺分子与每个微泡的表面活性剂壳的外表面缔合。
多个精胺分子可以非共价地偶联至每个微泡的外表面。多个精胺分子可以共价地偶联至每个微泡的外表面。多个精胺分子可以直接偶联至每个微泡的外表面。多个精胺分子可通过互连聚合物间接偶联至每个微泡的外表面。互连聚合物可通过一个或多个精胺分子与每个微泡的外表面共价交联。
互连聚合物可以是支架聚合物，该支架聚合物具有与每个支架聚合物共价偶联的多个精胺分子中的多个精胺分子。支架聚合物可以是线性的。支架聚合物可以是支化的。支架聚合物可以是葡聚糖。葡聚糖可以具有至少5kDa、至少10kDa、介于约20kDa与50kDa之间、或者介于约35kDa与45kDa之间的平均分子量。平均分子量可以是约40kDa。
气体核心可包含全氟化碳。全氟化碳可以是十氟丁烷。表面活性剂壳可包含脂质。脂质可以是磷脂。磷脂可包括1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)脂质中的一者或两者。表面活性剂壳包含聚乙二醇化的分子。表面活性剂壳可包含暴露在表面活性剂壳外表面上的多个反应性基团。反应性基团可以是马来酰亚胺。反应性基团可通过PEG接头与表面活性剂分子连接。互连聚合物可通过可生物降解的接头偶联至微泡，所述接头任选地可以是在溶酶体内部的pH下可裂解的。
每个微泡上的多个精胺分子可与多个有效载荷分子缔合。有效载荷分子可包括蛋白质。有效载荷分子可包括核酸。核酸可以包括DNA，其可以任选地是质粒。每个微泡可装载至少约30,000个核酸或至少约0.025μg/μm2的核酸。
微泡还可在表面活性剂壳的外表面上包含靶向分子，其被配置成结合一个或多个细胞。靶向分子可以是抗体。
微泡组合物的平均微泡尺寸介于约1μm与10μm之间，介于约1μm与约5μm之间，或为约3μm。
多个精胺分子可包括多精胺。
精胺修饰的微泡的一个或多个精胺可通过可生物降解的接头与另一精胺或互连聚合物连接。生物可降解聚合物可以是在溶酶体内部的pH值下可裂解的。可生物降解的接头可包括胱胺双丙烯酰胺或双丙烯酰胺缩酮。
组合物中至少约5％、10％、15％、20％、25％或50％的微泡可通过精胺与另一微泡交联。或者，组合物中不超过约5％、10％、15％、20％、25％或50％的微泡可通过精胺与另一微泡交联。
在本公开的另一方面，制备用于将有效载荷递送至一个或多个细胞的微泡组合物的方法包括将包含精胺分子的溶液与微泡溶液混合。每个微泡包含被表面活性剂壳包封的气体核心。该方法可以是制备上述任何一种微泡组合物的方法。
包含精胺分子的溶液可包含与聚合物缀合的精胺。聚合物可以是支架聚合物，其具有多个与支架聚合物共价偶联的精胺分子。支架聚合物可以是线性的或支化的。支架聚合物可以是葡聚糖。包含精胺分子的溶液可用平均分子量为至少5kDa、至少10kDa、约20kDa至50kDa、或约35kDa至45kDa的葡聚糖制成。包含精胺分子的溶液可包含多精胺。多精胺中的多个精胺可通过可生物降解的接头连接。
可将微泡溶液逐渐加入到包含精胺分子的溶液中，以使微泡被精胺分子饱和，任选地在混合过程中进行。可将包含精胺分子的溶液逐渐加入到微泡溶液中，以促进微泡通过精胺分子交联。
包含精胺分子的溶液可包含多个第一反应性基团，微泡溶液可包含暴露在微泡的表面活性剂壳外表面上的多个第二反应性基团。第一和第二反应性基团可被配置成将精胺分子共价偶联至微泡上。第一反应性基团可以是硫醇，第二反应性基团可以是马来酰亚胺。包含精胺分子的溶液与微泡溶液的混合物可包含至少2∶1、至少5∶1、至少10∶1或至少20∶1的第一反应性基团与第二反应性基团的摩尔比。微泡溶液可包含约1∶20的第二反应性基团分子与表面活性剂分子的摩尔比。微泡溶液可包含1x108至1x1010个微泡/mL。微泡溶液可包含大约1.10x 109个微泡/mL。
该方法还可包括在包含有效载荷分子的溶液中混合。可前将有效载荷溶液与包含精胺分子的溶液混合，然后与微泡溶液混合。可将包含精胺分子的溶液与微泡溶液混合，然后与与有效载荷溶液混合。可将包含微泡的溶液逐渐加入到有效载荷溶液中，以允许微泡被有效载荷分子饱和，任选地同时混合。有效载荷分子可包括蛋白质。有效载荷分子包括核酸。核酸可以包括DNA，其可以任选地是质粒。包含微泡的溶液与有效载荷溶液的混合物可包含至少1x 10-8μ/微泡、任选至少2x 10-8μg/微泡的有效载荷质量与微泡数量的比率，和/或其中混合物包含约1:1、1:2、1:5或1:10的精胺胺:有效载荷磷酸盐(N:P)比率。制备微泡的方法可产生具有平均至少5,000个、至少10,000个、至少20,000个或至少30,000个有效载荷分子/微泡的微泡组合物。该方法可生产每微泡具有至少1.0x 10-14g精胺-葡聚糖的精胺-葡聚糖修饰的微泡组合物。
该方法还可包括将包含靶向分子的溶液与包含微泡的溶液混合。包含靶向分子的溶液可以是与包含精胺分子的溶液相同的溶液。包含靶向分子的溶液可以是与有效载荷溶液相同的溶液。可将包含靶向分子的溶液在包含精胺分子的溶液之后或在包含精胺分子的溶液之前加入到微泡溶液中。靶向分子可以是抗体。
在本公开的另一个方面，公开了通过任何前述制备微泡的方法产生的微泡组合物。
在本公开的另一方面，使用声致穿孔将有效载荷递送至一个或多个细胞的方法包括将所述一个或多个细胞暴露于多个精胺修饰的微泡，然后将所述一个或多个细胞暴露于超声刺激，所述超声刺激被配置成对所述一个或多个细胞进行声致穿孔。可以以约1-2W/cm2的功率递送超声，任选地具有50％的占空比(duty cycle)。超声波可以被递送约30至60秒。在递送超声刺激之前，可将细胞暴露于微泡至少约10分钟。该方法还可包括在递送被配置成声致穿孔一个或多个细胞的超声刺激之前，使用超声来显现微泡。用于显现微泡的超声强度可小于超声刺激的强度。
该方法可以是体内方法，其中将所述一个或多个细胞暴露于多个微泡包括向受试者施用包含多个微泡的组合物。
该方法可以是体外方法。所述多个微泡可以以至少约5个、10个、15个、20个、25个或30个微泡/细胞的浓度与一个或多个细胞一起孵育。所述多个微泡可以以约15至约20个微泡/细胞的浓度与所述一个或多个细胞一起孵育。可将所述多个微泡与所述一个或多个细胞混合在一起。所述多个微泡可由上述任何微泡组合物提供。
本发明的另一方面是药盒，其包含任何上述微泡组合物，以及任选的用于与微泡组合物混合的有效载荷分子的组合物。
附图说明
图1描绘了精胺的化学结构，包括该分子的氨基的pKa。
图2描绘了聚乙烯亚胺(PEI)的化学结构。
图3描绘了支链葡聚糖的化学结构。
图4描绘了葡聚糖的化学氧化和由精胺和氧化的葡聚糖化学合成精胺-葡聚糖。
图5描绘了从氧化的葡聚糖(40kDa)(上)和精胺-葡聚糖(下)的合成中获得的NMR光谱。
图6描绘了N:P比为1:1(左上)、1:2(右上)、1:5(左下)和1:10(右下)的精胺-葡聚糖/pDNA多聚复合物的粒径测量。
图7描绘了对以1:1、1:2、1:5和1:10的N:P比率加载的精胺-葡聚糖/pDNA多聚复合物进行的琼脂糖凝胶电泳实验，对照为未加载的精胺-葡聚糖以及单独的pDNA。
图8描绘了相较于本领域已知的DSTAP微泡，根据本公开制备的精胺-葡聚糖微泡的测定的pDNA负载能力，以每微泡的DNA分子数表示。
图9描绘了对照Jeko细胞(上)和声致穿孔的JeKo细胞(下)的流式细胞术结果，所述细胞与载有pDNA的精胺-葡聚糖-ROR1微泡一起孵育。
图10描绘了声致穿孔的Jeko细胞的琼脂糖凝胶电泳实验，所述声致穿孔的Jeko细胞已用载有pDNA的精胺-葡聚糖-ROR1微泡转染，并与JeKo细胞以约5个微泡/细胞(左)和15个微泡/细胞(右)一起孵育，并以2W/cm2声致穿孔5秒，以2W/cm2声致穿孔30秒，1W/cm2声致穿孔60秒，或2W/cm2声致穿孔60秒，或根本不进行声致穿孔(阴性对照)。
图11描绘了TFA2-精胺的化学合成。
图12描绘了BOC2-精胺的化学合成。
图13描绘了聚二氨基乙烷(polyDAE)的化学合成。
图14描绘了多精蛋白的化学合成。
图15描绘了双丙烯酰胺缩酮的化学合成。
图16描绘了邻苯二甲酰亚胺-精胺的化学合成。
图17描绘了多精胺CBA的化学合成。
具体实施方式
微泡组合物
微泡
如本文中所用，“微泡”可以指由包封气体核心(gas core)的表面活性剂壳形成的气泡。表面活性剂壳可包含一种或多种类型的分子，其降低气体核心与外部水性环境诸如生理环境之间的界面张力。所述壳可包含例如脂质(例如，磷脂)、蛋白质(例如，白蛋白)、糖和/或聚合物。在一些实施方案中，气泡的直径可以不大于约10μm。除非另有说明，否则如本文中所用，微泡可包括小于1μm的气泡(即，纳米气泡)，诸如介于例如约100nm与1μm、约200nm与1μm或约300nm与1μm之间的气泡。在一些实施方案中，微泡组合物中的平均微泡尺寸至少约为1μm、2μm、3μm、4μm或5μm。在一些实施方案中，平均微泡尺寸约为1μm、2μm、3μm、4μm或5μm。在一些实施方案中，平均微泡尺寸介于约1μm与10μm、1μm与5μm、1μm与4μm、1μm与3μm、1μm与2μm、2μm与5μm、2μm与4μm、2μm与3μm、3μm与5μm或3μm与4μm之间。
气体核心可包含一种或多种气体。在一些实施方案中，气体核心包含一种或多种全氟化碳。所述一种或多种全氟化碳可包括八氟丙烷(OFP)/全氟丙烷(PFP)、十氟丁烷(DFB)/全氟丁烷(PFB)、十二氟戊烷(DDFP)/全氟戊烷(perfluoropentane)/全氟戊烷(perflenapent)、十四氟己烷/全氟己烷或十六氟庚烷/全氟庚烷、十八氟辛烷/全氟萘烷或全氟(2-甲基-3-戊酮)(PFMP)。在一些实施方案中，气体核心可包含一种或多种下列氟碳化合物：1,2-双(F-烷基)乙烯；1,2-双(F-丁基)乙烯；1-F-异丙基,2-F-己基乙烯；1,2-双(F-己基)乙烯；全氟甲基萘烷；全氟二甲基萘烷；全氟甲基-和二甲基-金刚烷；全氟甲基-、二甲基-和三甲基-双环(3,3,1)壬烷及其同系物；全氟全氢菲；下式的醚：(CF3)2CFO(CF2 CF2)2OCF(CF3)2、(CF3)2CFO(CF2 CF2)3OCF(CF3)2、(CF3)2CFO(CF2 CF2)2F、(CF3)2CFO(CF2 CF2)3F、F[CF(CF3)CF2O]2CHFCF3、[CF3CF2CF2(CF2)u]2O(其中u＝1、3或5)，以及胺N(C3F7)3、N(C4F9)3和N(C5F11)3；全氟-N-甲基全氢喹啉和全氟-N-甲基全氢异喹啉；和全氟烷基氢化物，诸如C6F13H、C8F17H、C8F16H2和卤化衍生物C6F13Br、(全氟溴)、C6F13CBr2CH2Br、1-溴4-全氟异丙基环己烷、C8F16Br2和CF3O(CF2CF2O)uCF2CH2OH(其中u＝2或3)。在一些实施方案中，所述气体核心包含空气。在一些实施方案中，所述气体核心包含六氟化硫。在一些实施方案中，气体核心包含氮气。与较低分子量气体相比，较高分子量气体通常可形成更稳定的微泡。
在一些实施方案中，表面活性剂壳可包含脂质，诸如磷脂，其在某些条件下自动调整形成亲水性外表面和亲脂性或疏水性内表面。磷脂可包括本领域中用于形成微泡、纳米微滴、胶束、脂质体等的任何标准磷脂。在一些实施方案中，磷脂可包含二酰基甘油酯结构，诸如磷脂酸(磷脂酸)(PA)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)(PE)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(例如磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸(PIP)、磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)。在一些实施方案中，磷脂可包括鞘磷脂，诸如神经酰胺磷酸胆碱(鞘磷脂)(SPH)、神经酰胺磷酸乙醇胺(鞘磷脂)(Cer-PE)和神经酰胺磷酰基脂质。在一些实施方案中，磷脂包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)或其衍生物。在一些实施方案中，磷脂包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)或其衍生物。在一些实施方案中，表面活性剂分子可以偶联至聚合物链，诸如聚(乙二醇)(即表面活性剂壳/微泡可以是聚乙二醇化的)。例如，表面活性剂分子可包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2k)。微泡的聚乙二醇化可以改善微泡的抗絮凝性/胶体稳定性、抗免疫原性、亲水性、生物相容性和/或体内循环时间/生物利用度。微泡外表面的聚乙二醇化可以为进行使微泡表面功能化的缀合提供有利的条件(例如，立体化学的)。在一些实施方案中，表面活性剂壳可包含两种类型的表面活性剂分子。在一些实施方案中，表面活性剂壳可包含三种类型的表面活性剂分子。在一些实施方案中，表面活性剂壳可包括多于三种类型的表面活性剂分子。在一些实施方案中，大约0-25％、0-20％、0-15％、0-10％、0-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、0-10％、10-20％、0-15％或15-25％的表面活性剂分子被聚乙二醇化。例如，大约10％的表面活性剂分子可被聚乙二醇化。在一些实施方案中，约0-25％、0-20％、0-15％、0-10％、0-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、0-10％、10-20％、0-15％或15-25％的表面活性剂分子包含被配置成暴露在表面活性剂壳的外表面上的官能团(例如，用于连接至精胺分子或靶向分子)。例如，在一些实施方案中，大约5％的表面活性剂分子被官能化。在一些实施方案中，大约一半的聚乙二醇化的表面活性剂分子可包含官能团。
在一些实施方案中，表面活性剂分子可包含在缀合反应中具有活性的官能团，所述缀合反应被配置成将额外的分子共价偶联至微泡壳。官能团可选自本领域中通常用于进行生物缀合的任何标准反应性基团。例如，官能团可包括胺、异硫氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、酮、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳化剂、亚胺酸酯、碳二亚胺、酸酐、氟苯基酯、羟甲基膦衍生物、胍基、硫醇、卤代乙酰基或烷基卤化物衍生物、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、吡啶基二硫化物、TNB硫醇、二硫化物还原剂、乙烯砜衍生物、重氮烷或重氮乙酰基化合物、羰基二咪唑、羟基、异氰酸酯、醛、酮、肼衍生物、席夫碱、重氮衍生物、二苯甲酮、蒽醌、双吖丙啶衍生物、补骨脂素化合物、硼酸衍生物或与前述任何一种反应的官能团。在一些实施方案中，官能团可以是参与点击反应的官能团，所述点击反应是诸如铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(copper(I)-catalyzed azide-alkynecycloaddition，CuAAC)、应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC)、应变促进的炔烃-硝酮环加成(strain-promoted alkyne-nitrone cycloaddition，SPANC)、应变烯烃和叠氮化物[3+2]环加成、应变烯烃和四嗪逆需求Diels-Alder反应(strained alkene and tetrazine inverse-demand Diels-Alderreaction)、应变烯烃和四唑光点击反应等。在一些实施方案中，官能团可以被配置成参与非共价反应。例如，官能团可包括链霉抗生物素蛋白或生物素、抗体或抗原、或受体或配体。官能团可存在于表面活性剂壳的外表面上。官能团可以直接与表面活性剂分子缀合，或者可通过接头诸如PEG接头隔开。例如，表面活性剂壳可包含1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000]。
本文描述的微泡组合物的微泡通常可以根据本领域已知的任何方法形成。在一些实施方案中，通过超声处理产生微泡。在一些实施方案中，通过摇动产生微泡。在一些实施方案中，微泡由高压乳化产生。在一些实施方案中，通过激活液芯纳米液微滴的相变来产生微泡。例如，可通过属于Reiss等人的美国专利第6,113,919号(200年9月5日发布的)或属于Unger的美国专利申请公布第US 2002/0150539号(2002年10月17日)；属于Dayton等人的US2013/0336891(2013年12月19日公布的)；属于de Gracia Lux等人的US 2018/0272012(2018年9月27日公布的)中公开的任何方法产生微泡，所述文献中的每一篇均据此通过引用以其整体并入本文。
精胺装饰
精胺(1,12-二氨基-4,9-二氮杂十二烷，也称为N,N’-双(3-氨基丙基)丁烷-1,4-二胺)是一种多胺，具体是一种有机二烷基胺，参与所有真核细胞中发现的细胞代谢。合成精胺的前体是氨基酸鸟氨酸。在某些细菌中，其为必需的生长因子。发现其在生理pH下是聚阳离子。精胺与核酸缔合，被认为会稳定螺旋结构，特别是在病毒中。精胺分子的氨基基团的pKa大约为10.9、8.4、7.9和10.1，如图1所示。精胺通常在生理pH(即pH 7.4)的水性环境中完全质子化。作为比较，图2所示的支化聚乙烯亚胺(PEI)据报道具有7.9至9.6的pKa值，并且通常预计至少50％的胺基在生理pH下被质子化。
如本文中所用，精胺可指如图1所示的精胺分子，或其衍生物或类似物(例如热精胺)，包括由精胺和亚精胺(精胺合成的前体)合成的分子，所有这些都包括在术语“精胺分子”中。由精胺合成的分子可包括多精胺，其可包含两个或更多个共价连接(可能利用中间交联剂)在一起的精胺。在本公开的实施方案中，实质上类似于精胺或由精胺模拟的精胺样分子(例如，polyDAE)可以替代精胺分子，如果其达到与本文别处所述实质上相同的效果的话。
在一些实施方案中，多精胺可通过将精胺聚合(可能利用中间交联剂)在一起来生产。在一些实施方案中，多个精胺可以通过图1所示的仲胺连接在一起，使得图1所示的一个或两个伯胺在反应后是游离的。在一些实施方案中，这些伯胺中的一个或多个可以随后用于将精胺分子连接至微泡或交联聚合物，如本文别处所述的。在一些实施方案中，精胺分子的伯胺可以与诸如9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、叔丁基氧基羰基(Boc)、三氟乙酸乙酯或邻苯二甲酰亚胺等保护基团反应。当合成更大的分子诸如多精胺或包含精胺的聚合物时，保护基团可用于保护精胺分子的伯胺。可使用本领域已知的标准剂除去保护基团，以允许伯氨基参与额外的反应(例如，与互连聚合物和/或微泡的缀合)或与有效载荷分子静电结合，如本文别处所述的。
在一些实施方案中，多精胺可用两个或更多个精胺基团之间的可生物降解/可裂解的接头形成(例如聚合)。可生物降解的接头是本领域公知的，包括例如属于Alferiev等人的美国专利US 8,580,545(2013年11月12日发布的)中描述的接头，所述专利据此通过引用以其整体并入。可生物降解的接头可被配置成在特定的生理环境(例如，低pH)中和/或在生理环境中进行可预测量的时间后被切割(例如，水解)。例如，精胺分子可包含多精胺CBA(参见例如实施例23)，其包含由可降解的胱胺双丙烯酰胺互连的精胺，其在低于7.4的生理pH的pH下易于被还原/裂解。作为另一个实例，精胺分子可包括由可生物降解的双丙烯酰胺缩酮互连的精胺(参见例如实施例21)。
本文所述的微泡可用精胺分子修饰。精胺修饰的微泡的组合物通常包含微泡，在所述微泡中多个精胺分子与组合物中每个或基本上每个微泡的表面活性剂壳的外表面缔合。在一些实施方案中，每个微泡可用大约100,000个、200,000个、300,000个、400,000个、500,000个、600,000个、700,000个、800,000个、900,000个、1,000,000个、2,000,000个、3,000,000个、4,000,000个、5,000,000个、6,000,000个、7,000,000个、8,000,000个、9,000,000或10,000,000个精胺分子修饰。在一些实施方案中，精胺分子可与微泡表面非共价缔合。例如，精胺分子可通过静电相互作用(诸如精胺上的一个或多个氨基的正电荷与微泡表面上的负电荷(例如，磷脂头上带负电荷的磷酸基团)之间的静电相互作用)与微泡表面缔合。在一些实施方案中，官能化的精胺分子可通过非共价结合相互作用(诸如受体-配体结合、抗体-抗原结合、链霉抗生物素蛋白-生物素结合等)与微泡表面上的官能团非共价缔合。在一些实施方案中，精胺分子可通过本领域已知的缀合化学(包括本文另处描述的那些)共价缀合于微泡表面。
在一些实施方案中，精胺分子中的一个或多个伯胺可用于将精胺分子共价偶联至微泡的表面活性剂壳中的表面活性剂分子(通过反应性官能团)或偶联至被配置成将精胺分子连接至微泡的互连聚合物。在一些实施方案中，伯胺可与异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、酮、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳化剂、亚胺酯、碳二亚胺、酸酐、氟苯基酯、羟甲基膦衍生物或存在于微泡表面或互连聚合物上的胍基共价偶联。例如，在一些实施方案中，可将伯胺缀合于酮、醛或乙二醛以形成席夫碱，其可通过还原(例如，用硼氢化物或氰基硼氢化物)而化学稳定。例如，精胺分子的一个或多个伯胺可与氧化的葡聚糖中的醛(如本文别处所述的)反应，或者与其它氧化r多糖反应。
互联聚合物
在一些实施方案中，至少一些或所有精胺分子通过互连聚合物与微泡缔合。在一些实施方案中，可将精胺分子缀合于互连聚合物，然后可将互连聚合物与微泡连接(例如共价偶联)。在一些实施方案中，微泡可以首先用互连聚合物修饰(例如共价偶联)，然后可将精胺分子缀合于互连聚合物。在一些实施方案中，可将互连聚合物以基本上同时的方式连接至精胺分子和微泡，诸如通过一次将包含精胺分子、微泡组合物和互连聚合物的溶液混合在一起。
在一些实施方案中，可将互连聚合物缀合于至少两个精胺分子，并且至少一个精胺分子可以用于将互连聚合物连接至微泡。例如，可将精胺上的一个伯胺共价连接至互连聚合物，可将另一个伯胺连接至微泡。可将两个连接伯胺通过相同类型的缀合或通过不同的(例如双正交)缀合偶联至互连聚合物和微泡。可将精胺分子通过本文另处描述的任何缀合化学或非共价相互作用缀合于微泡的互连聚合物。在一些实施方案中，可将精胺分子上的一部分游离伯胺硫醇化(例如，通过2-亚氨基四氢噻吩(iminothiolane))以与微泡表面缀合。可将精胺分子上的硫醇缀合于暴露在微泡表面的硫醇反应性基团诸如马来酰亚胺结合。在一些实施方案中，精胺分子中每5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或50个游离伯氨基中的大约1个和/或大约5％、10％、15％、20％或25％的游离伯氨基可被官能化以结合到微泡上。
当精胺分子用于将互连聚合物连接至微泡时，其被设计成间接将一种或多种也连接至互连聚合物的附加精胺连接至微泡。在一些实施方案中，多个精胺分子通过互连聚合物间接连接至微泡。应当理解，提到多个精胺分子间接连接至微泡包括一些精胺分子直接偶联至微泡的实施方案，例如，其中一个或多个精胺分子用作交联剂将互连聚合物连接至微泡的实施方案。在一些实施方案中，每个互连聚合物，例如葡聚糖(例如40kDa葡聚糖)，连接至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个精胺。在一些实施方案中，每个互连聚合物，例如葡聚糖(例如，40kDa葡聚糖)，连接1-10个、10-50个、50-100个、10-20个、20-30个、30-40个、40-50个、50-60个、60-70个、70-80个、80-90个或90-100个精胺。在一些实施方案中，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个连接的精胺分子和/或至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的连接的精胺分子是“游离”精胺。如本文中所用，游离精胺是其至少一个伯胺不与任何其它部分共价反应、而是“自由”与带负电荷的有效载荷相互作用的精胺，如本文另处所述的。游离精胺可通过其的其它伯氨基或例如通过仲胺与微泡的互联聚合物缀合。包含每个精胺上的至少一个游离伯氨基的多精胺被认为包含游离精胺。将交联聚合物交联到微泡上或者将两种交联聚合物交联在一起的精胺分子不是游离的。
在一些实施方案中，一种或多种精胺可通过可生物降解的接头(诸如本文别处所述的那些)连接至互连聚合物。在一些实施方案中，一种或多种互连聚合物可通过可生物降解的接头(诸如本文别处所述的那些)连接至微泡。
互连聚合物可以是其中多个游离精胺分子与每个互连聚合物缔合的支架聚合物。支架聚合物可用于增加精胺修饰的微泡组合物中精胺的负载能力，这是通过允许与每个微泡缔合的游离精胺的数量大于微泡与互连聚合物之间的连接(例如，共价键)的数量来实现的。在一些实施方案中，对于与微泡的每个共价键，存在至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个游离精胺分子。
在一些实施方案中，互连聚合物包括线性(非支化的)聚合物。可将一个或多个精胺缀合于每个互连聚合物。取决于所用的互连聚合物和缀合化学，可将精胺分子缀合于聚合物链的末端和/或链骨架中的反应性基团。在一些实施方案中，互连聚合物包括其中一个或多个支链从线性聚合物链骨架延伸的支化的聚合物。分支可以是线性的，或者本身可以是支化的。在一些实施方案中，精胺分子与线性聚合物链骨架缔合。在一些实施方案中，精胺分子与一个或多个聚合物支链缔合。在一些实施方案中，精胺分子与支化的互连聚合物的多个支链缔合。在本文所述方法的一些实施方式中，支化的支架聚合物的使用可导致精胺修饰的聚合物分子，其具有比具有类似分子量的精胺修饰的线性聚合物更小的流体动力学半径。相对于类似分子量的线性聚合物，支化的聚合物可以增加微泡的精胺运载能力。在本文所述方法的一些实施方式中，支化的支架聚合物的使用可导致精胺修饰的聚合物分子，其具有比具有类似流体动力学半径的精胺修饰的线性聚合物更高的精胺/有效载荷密度。减小精胺修饰的聚合物的流体动力学半径和/或增加具有给定半径的精胺修饰的聚合物的精胺/有效载荷密度可以增加声致穿孔的细胞中有效载荷的细胞摄取，在所述声致穿孔的细胞中建立的瞬时孔具有有限的尺寸。
互连聚合物可以是本领域中用于形成药物递送媒介物的任何聚合物(例如，多聚复合物或纳米颗粒)。互连聚合物可以是生物聚合物，诸如多糖(例如葡聚糖)或细胞外基质聚合物或其组分(例如，透明质酸、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或诸如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角蛋白等蛋白聚糖)。在一些实施方案中，互连聚合物可包括葡聚糖(dextran)。在一些实施方案中，互连聚合物可包括线性PEG。在一些实施方案中，互连聚合物可包括支化的PEG(例如，4臂或8臂星形PEG)。在一些实施方案中，互连可包括聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚己内酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、聚(原酸酯)、聚磷腈或其共聚物中的一种或多种。可根据其精胺负载能力来选择互连聚合物。可根据其生物相容性(例如，低毒性)来选择互连聚合物。在一些实施方案中，微泡组合物包括多种类型的互连聚合物。在一些实施方案中，互连聚合物包括线性和支化的聚合物。
互连聚合物可以是葡聚糖。如本文中所用，葡聚糖是指含有大量(1→6)连接的-α-D-吡喃葡萄糖基残基的D-葡聚糖。绝大多数葡聚糖是由以蔗糖为底物生长的细菌产生的。天然存在的葡聚糖是由葡萄糖的缩合衍生的复杂的支化的葡聚糖。葡聚糖链具有不同的长度(从3至2000kDa)。聚合物主链由葡萄糖单体之间的α-1,6糖苷键联组成，具有来自α-1,3键联的支链，如图3所示。支链可具有小至2或3个葡萄糖单位至大于50个葡萄糖单位的长度，较低分子量的葡聚糖比较高分子量的葡聚糖显示出较少的支化和较窄的分子量分布。分子量大于10,000个葡萄糖单位的葡聚糖表现得如同它们是高度支化的。已经发现天然葡聚糖具有在900万至5亿个葡萄糖单位的范围内的分子量(MW)。随着分子量的增加，葡聚糖分子获得更大的对称性。分子量为2,000至10,000个葡萄糖单位的葡聚糖往往表现出可膨胀卷曲的性质。当分子量低于2,000个葡萄糖单位时，葡聚糖往往更像杆状。可以化学合成线性形式的葡聚糖(无任何支化)。用葡聚糖修饰微泡可以改善微泡的抗絮凝性/胶体稳定性、抗免疫原性、亲水性、生物相容性和/或体内循环时间/生物利用度。葡聚糖是适用于体内应用的相对无毒的聚合物，尤其是与PEI相比。
在一些实施方案中，葡聚糖可包含大约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、150kDa、200kDa、500kDa、1MDa、1.5MDa或2MDa的平均分子量(整个微泡组合物)。在一些实施方案中，葡聚糖可包含至少大约5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、150kDa、200kDa、500kDa、1MDa的平均分子量。在一些实施方案中，葡聚糖可包含不大于大约50kDa、100kDa、150kDa、200kDa、500kDa、1MDa、1.5MDa或2MDa的平均分子量。在一些实施方案中，葡聚糖可包含大约5-100kDa、10-80kDa、15-70kDa、20-65kDa、25-60kDa、30-55kDa、35-50kDa、40-45kDa、or 35-45kDa、35-40kDa或20-50kDa的平均分子量。在各种实施方案中，可以以一个或多个分子量截断值透析互连聚合物，以从组合物中除去较低分子量的种类。可在偶联至精胺分子之前、偶联至精胺分子之后或者在偶联至精胺分子之前和之后透析聚合物。
用精胺修饰葡聚糖可使聚合物的有效分子量增加大约1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、10-20％、10-30％、20-30％、10-50％或更多。在一些实施方案中，葡聚糖分子中每2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、10-20个、20-30个、30-40个、40-50个、10-25个、25-50个或10-50个葡萄糖单体中大约有1个用精胺修饰。然而，由精胺缀合产生的氨解可使聚合物的分子量降低1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、10-20％、10-30％、20-30％、10-50％、50-75％、50-60％、70％-80％、50-75％或更多。例如，在一些实施方案中，在与精胺缀合后，40kDa的葡聚糖可以减小至大约10kDa。
在一些实施方案中，微泡组合物中的每个微泡最终用每个微泡约1x10-15-1x10- 13g、1x10-15-1x10-14g或1x10-14-1x10-13g互连聚合物(诸如精胺修饰的葡聚糖)修饰。例如，在一些实施方案中，每个微泡用至少约1.0x10-14g、1.1x10-14g、1.2x10-14g、1.3x10-14g、1.4x10-14g、1.5x10-14g、1.6x10-14g、1.7x10-14g、1.8x10-14g、1.9x10-14g、2.0x10-14g、3.0x10-14g、4.0x10-14g、5.0x10-14g、6.0x10-14g、7.0x10-14g、8.0x10-14g或9.0x10-14g/微泡修饰。在一些实施方案中，微泡组合物中的每个微泡最终用至少约25,000个、50,000个、75,000个、100,000个、150,000个、200,000个、300,000个、400,000个、500,000个、600,000个、700,000个、800,000个、900,000个或1,000,000个互连聚合物诸如精胺修饰的葡聚糖修饰。
微泡靶向
微泡可另外用靶向分子修饰，所述靶向分子结合特定的细胞类型或其它生物结构。在一些实施方案中，靶向分子可以是蛋白质或其它生物分子(例如，细胞表面受体的配体)。在一些实施方案中，靶向分子可以是生物聚合物或其成分，诸如细胞外基质聚合物(例如，透明质酸、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或诸如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角蛋白等蛋白聚糖)。在一些实施方案中，靶向分子是单克隆或多克隆抗体，包括源自/模仿具有抗原结合特性的抗体的抗体片段或肽。例如，抗体可以是Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fv片段、scFv、di-scFv、sdAb、重组IgG、包含一个或多个互补决定区(CDR)的肽、或本领域公知的具有抗原结合特性的任何其它抗体片段或生物分子。抗体可对在靶细胞类型的细胞表面上表达的抗原(例如，细胞表面受体)具有特异性。在一些实施方案中，微泡可被配置成靶向癌细胞/肿瘤细胞。在一些实施方案中，微泡可被配置成靶向免疫细胞(例如，T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、天然杀伤细胞等)。靶向分子可以共价偶联至微泡的表面活性剂壳的外表面。
靶向分子可以以与精胺分子相同的方式与微泡的外表面缔合。例如，靶向分子可以以与精胺分子相同的方式共价连接至表面活性剂壳的外表面上的官能团(例如，微泡可以连接至靶向分子或互连聚合物)。靶向分子可以连接至微泡上与精胺分子相同的官能团(例如，使用同一对反应性基团或如同官能化的精胺分子那样与相同反应性基团反应的第三反应性基团)，或者可以连接至不同的官能团。在一些实施方案中，可使用双正交反应将靶向分子和精胺分子连接至微泡，在所述双正交反应中在靶向分子与精胺分子之间，在靶向分子与微泡表面上被配置成结合精胺分子的官能团之间，或者在精胺分子与微泡表面上被配置成结合靶向分子的官能团之间没有交叉反应。通过将靶向分子与微泡组合物一起孵育(例如，将包含靶向分子的溶液与包含微泡组合物的溶液混合)，可以将靶向分子偶联至微泡。可在将精胺分子偶联至微泡之前、偶联至微泡的同时或偶联至微泡之后，将靶向分子偶联至微泡。在一些实施方案中，靶向分子和精胺分子可以偶联至相同的互连聚合物，使得互连聚合物将精胺分子和靶向分子都连接至微泡。在一些实施方案中，微泡组合物中的每个微泡用至少约5,000个、10,000个、15,000个、20,000 25,000个、50,000个、75,000个、100,000个、200,000个、300,000个、400,000个、500,000个、600,000个、700,000个、800,000个、900,000个或1,000,000个靶向分子修饰。
微泡有效载荷
本文所述的微泡可用于结合有效载荷用于药物递送，诸如通过本文别处所述的声致穿孔。在各种实施方案中，精胺修饰的微泡的精胺分子通过与有效载荷结合而充当有效载荷的药物递送媒介物(例如，转染剂)。在一些实施方案中，有效载荷包含蛋白质，诸如蛋白质治疗剂。蛋白质治疗剂可包括例如基于抗体的药物、抗凝血剂、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化蛋白支架、酶、Fc融合蛋白、生长因子、激素、干扰素、白细胞介素、溶栓剂等。在一些实施方案中，有效载荷包含核酸。核酸可以是例如质粒、siRNA或Dicer底物siRNA(DsiRNA)。在一些实施方案中，核酸可以是DNA，其可被例如作为基因疗法的一部分递送。基因疗法可以靶向体细胞或种系细胞，并可用于治疗诸如免疫缺陷、血友病、地中海贫血和囊性纤维化等疾患。在一些应用中，可对造血干细胞离体进行基因疗法。可被递送的基因的实例包括因子IX、人成纤维细胞生长因子-4、ND4蛋白、INFα-2b、肾上腺脑白质营养不良蛋白(ABCD1基因)、N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、连接蛋白43、REP1、芳基硫酸酯酶A、5T4癌胚抗原、胸苷激酶、AC6、胞嘧啶脱氨酶、因子VIII、肝细胞生长因子(例如，HGF728、HGF723)、SMN蛋白、β-珠蛋白等的基因。在一些实施方案中，核酸可以是RNA。在各种实施方案中，核酸可被修饰。例如，核酸可包含非天然存在的核苷酸，包括包含脱氧核糖核苷酸和脱氧核苷酸的分子。
有效载荷可通过微泡表面上的正电荷(例如，精胺分子的带正电荷的伯和/或仲氨基)与暴露在有效载荷分子上的负电荷(诸如，核酸的糖磷酸骨架上的带负电荷的磷酸基团)之间的静电相互作用结合至微泡。本文所述的微泡组合物可以根据修饰微泡组合物的微泡的带正电荷的胺基团的数量(N)与有效载荷组合物内带负电荷的核酸磷酸基团的数量(P)的比率来装载核酸。在一些实施方案中，可以以大约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20的N:P比率装载微泡组合物。在一些实施方案中，可以以至少约1:5、1:10、1:15或1:20的N:P比率装载微泡组合物。在一些实施方案中，可以以每个微泡大约1x10-7–1x10-10μg、1x10-7–1x10-9μg、1x10-7–1x10-8μg、1x10-8–1x10-10μg或1x10-8–1x10-9μg有效载荷(例如，pDNA)的浓度制备微泡组合物。可以例如以至少约1x10-8μg/微泡、2x10-8μg/微泡、3x10-8μg/微泡、4x10-8μg/微泡、5x10-8μg/微泡、6x10-8μg/微泡、7x10-8μg/微泡、8x10-8μg/微泡、9x10-8μg/微泡的浓度制备微泡组合物。
微泡组合物最终能够携带的核酸的量部分取决于可用正电荷的量(例如，微泡表面上氨基的表面密度)以及带正电荷的聚合物稳定结合核酸的能力。微泡组合物的结合稳定性通常在较高的负载能力下会降低。本公开的微泡组合物通常表现出比本领域已知的微泡组合物更稳定的装载，并且可以有效地实现比具有更高正电荷数量和/或密度的微泡组合物更高的负载能力。例如，PEI提供了每mg聚合物大约8.2mol的伯胺密度。如图4所示，其中每隔一个葡萄糖单元连接到精胺上的精胺-葡聚糖将提供每mg聚合物大约2.0mol的密度。然而，本文公开的结果表明，本文所述的精胺修饰的微泡相较于缀合有PEI的微泡能够装载明显更多的DNA，即使当葡聚糖的每2个葡萄糖单位中远少于1个有效地缀合于精胺。在一些实施方案中，本文公开的微泡组合物可表现出每个微泡至少约5,000个、10,000个、15,000个、20,000个、25,000个、30,000个或35,000个核酸分子的负载能力。在一些实施方案中，相对于微泡组合物的计算的表面积，本文公开的微泡组合物可表现出至少约0.010pg/μm2、0.015pg/μm2、0.020pg/μm2、0.025pg/μm2、0.030pg/μm2、0.035pg/μm2、0.040pg/μm2、0.045pg/μm2、0.050pg/μm2或0.100pg/μm2的核酸的负载能力。在一些实施方案中，本文公开的微泡组合物可表现出每10个、25个、50个、75个、100个、125个、150个、275个、200个、250个或500个精胺至少约一个核酸的负载能力。
制备微泡组合物的方法
包含精胺修饰的微泡的微泡组合物通常可以通过组合包含前述组分的溶液来制备，所述组分包括微泡、精胺分子、任选的互连聚合物(诸如葡聚糖)、任选的有效载荷分子(诸如核酸)和任选的靶向分子(诸如抗体)。每种溶液可以如本文别处所述制备。可根据本文另处所述的方法组合不同的溶液。与通过有效载荷的逐层沉积装载的微泡相比，本文所述的简单制备提供了方便和快速的有利方面。
在各种实施方案中，组合两种溶液的顺序和/或溶液组合的速度可影响所得的组合物。例如，如果希望第一组分在第二组分超过第一组分的条件下与第二组分反应，可以将包含第一组分的溶液缓慢或逐渐加入到包含第二组分的溶液中。在第一组分的一个分子能够与第二组分的多个分子反应的情况下，将第一组分缓慢或逐渐(例如，逐滴或在定时注射泵下)添加到第二组分中可以促进第一组分被第二组分饱和。缓慢地或逐渐地可以理解为处于促进基本饱和的速度或速率，并且可以取决于特定反应的动力学。所得混合物的最终摩尔比也会影响饱和度。具有第二溶液中反应性基团的数量明显超过第一溶液中相应反应性基团的数量的最终摩尔比的混合物可以促进第一组分被第二组分饱和。在一些实施方案中，相对于第一溶液中反应性基团的数量，第二溶液中反应性基团的数量可以以至少约2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1,10:1,15:1,20:1,25:1,50:1,75:1或100:1的最终摩尔比存在，以促进第一组分被第二组分饱和。
在一些实施方案中，将包含互连聚合物诸如葡聚糖(例如，氧化的葡聚糖)的溶液缓慢或逐渐加入到包含精胺分子的溶液中，使得每个互连聚合物基本上被精胺分子饱和。缓慢地或逐渐地将聚合物溶液加入到精胺溶液中，使精胺引起的聚合物之间的交联量最小化。在一些实施方案中，在该阶段基本上没有聚合物交联。例如，少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％的聚合物与另一种聚合物交联。在其中精胺的伯胺共价偶联至互连聚合物的实施方案中，促进饱和和减少聚合物分子之间的精胺交联剂的数量增加了可用于参与后续反应或与有效载荷结合的游离精胺和游离伯氨基的数量。在一些实施方案中，可在随后的制备步骤之前对精胺修饰的聚合物的溶液进行透析以除去未反应的精胺。
在其它实施方案中，将包含精胺分子的溶液缓慢或逐渐加入到包含互连聚合物诸如葡聚糖的溶液中。将包含精胺分子的溶液缓慢或逐渐加入到聚合物溶液中可以促进聚合物之间的交联增加。例如，至少超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％的聚合物分子可与至少一个另外的聚合物分子交联。交联聚合物可以增加精胺-聚合物复合物的有效分子量。交联聚合物可以有效地增加修饰微泡表面的聚合物中支化的相对量。
在一些实施方案中，将精胺分子在与互连聚合物诸如葡聚糖连接后官能化以与微泡缔合(例如，共价偶联)。可以在防止伯氨基被用于与微泡表面反应的官能团饱和的条件(诸如摩尔比)下对精胺修饰的聚合物进行官能化。在一些实施方案中，精胺分子中每5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或50个游离氨基中的大约1个和/或大约5％、10％、15％、20％或25％的游离伯氨基可用诸如硫醇基官能化，以与微泡结合。
在一些实施方案中，将包含微泡的溶液缓慢或逐渐加入到包含精胺分子或精胺修饰的聚合物诸如精胺修饰的葡聚糖的溶液中，使得每个微泡基本上被精胺分子/精胺修饰的聚合物饱和。缓慢地或逐渐地将微泡溶液加入到含精胺的溶液中可以使由精胺或精胺修饰的聚合物引起的微泡之间的交联量减少至最少。在一些实施方案中，在该阶段基本上没有微泡交联。例如，少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％的微泡与另一个微泡交联。促进微泡的饱和和减少微泡之间的交联数目可以增加可用于参与后续反应或与有效载荷结合的游离精胺和游离伯氨基的数目。在一些实施方案中，在随后的制备步骤之前，可对精胺修饰的微泡的溶液进行透析或洗涤以除去未结合的精胺和/或聚合物。
在其它实施方案中，将包含精胺分子或精胺修饰的聚合物的溶液缓慢或逐渐加入到包含微泡的溶液中。将包含精胺的溶液缓慢或逐渐加入到微泡溶液中可以促进微泡之间的交联增加。例如，至少超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％的微泡可与至少一个另外的微泡交联。在一些实施方案中，平均微泡可以与1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个另外的微泡交联。交联微泡可以增加单个颗粒的有效尺寸和表面积，所述颗粒可包含一个微泡或多个交联在一起的微泡，从而提高每个颗粒的有效载荷负载能力。在本文所述方法的一些实施方式中，增加每个颗粒的有效载荷负载能力可以诸如在本文别处所述的一些声致穿孔应用中，增加有效载荷递送至细胞的效率。在一些实施方案中，微泡颗粒的有效直径可为大约1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm或大于10μm。
在一些实施方案中，将包含精胺修饰的微泡的溶液缓慢或逐渐加入到包含有效载荷诸如核酸(例如质粒DNA或pDNA)的溶液中，使得每个精胺修饰的微泡基本上被有效载荷分子饱和。缓慢或逐渐地将精胺修饰的微泡溶液加入到有效载荷溶液中，使有效载荷分子导致的微泡之间的交联量减少至最少。在一些实施方案中，在该阶段基本上没有微泡或包含精胺交联的或聚合物交联的微泡的颗粒被交联(或进一步交联)。例如，少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％的微泡与另一个微泡交联。促进微泡或微泡颗粒被有效载荷饱和可以诸如在本文别处所述的一些声致穿孔应用中，增加有效载荷递送至细胞的效率。
在其它实施方案中，将有效载荷溶液缓慢或逐渐加入到包含精胺修饰的微泡的溶液中。缓慢或逐渐地将有效载荷溶液加入精胺修饰的微泡溶液中可以促进微泡之间的交联增加。例如，至少超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％的微泡可与至少一个另外的微泡交联。在一些实施方案中，平均微泡可以与1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个另外的微泡交联。交联微泡可以增加单个颗粒的有效尺寸和表面积，所述颗粒可包含一个微泡或多个交联在一起的微泡，从而提高每个颗粒的有效载荷负载能力。在本文所述方法的一些实施方式中，增加每个颗粒的有效载荷负载能力可以诸如在本文别处所述的一些声致穿孔应用中，增加有效载荷递送至细胞的效率。在一些实施方案中，微泡颗粒的有效直径可为大约1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm或大于10μm。
在各种实施方案中，包含精胺、聚合物、精胺修饰的聚合物、微泡、精胺修饰的微泡和/或有效载荷的溶液可通过本领域已知的标准方法组合在一起。在一些实施方案中，可如本文别处所述，例如使用注射泵或滴定瓶将溶液缓慢或逐渐组合。可将溶液在大约5min,10min,15min,30min，45min,1h,2h,3h,4h,5h,6h,7h,8h,9h,10h,12h,18h或24h的时间内混合，或者根据需要组合，以使反应进行到基本完成。可通过本领域已知的标准方法(包括旋转、搅拌、摇动等)在溶液组合期间和/或之后混合溶液。组合后，可在大约15min、30min，45min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、12h、18h或24h的时间内混合溶液。在一些实施方案中，第一组分呈干燥形式(例如，冻干的)并且通过将第一组分溶解在第二组分中而与溶液中的第二组分混合。在一些实施方案中，干组分可以是缓慢或逐渐添加到溶液中的组分。在不同的步骤中，可使用离心来洗涤或以其它方式将微泡与反应溶液中的其它组分分离。可将微泡收集在漂浮的上清液中。
使用微泡组合物进行药物递送的方法
声致穿孔(sonoporation)
在本公开的一个方面，提供了使用本文所述的微泡和声致穿孔技术将有效载荷递送至一个或多个细胞的方法。声致穿孔通常以超声波频率使用声音来增加细胞质膜的渗透性，以促进有效载荷穿过膜并进入细胞。声致穿孔可以特别有利于将有效载荷递送穿过血脑屏障或血肿瘤屏障。对于体内应用，声致穿孔可以是有利的药物递送手段，因为超声可以以非侵入方式深入穿透受试者的组织，并提供空间和时间靶向递送，而对非靶向组织的副作用最小或无副作用。在超声介导的药物递送中，微泡可用作声空化的核，由于微泡的高压缩性，可以有效地散射超声波。声致穿孔被认为是通过在细胞质膜中形成瞬时孔来诱导细胞渗透性的瞬时增加。不受理论的束缚，将微泡崩解可以产生能够透化附近的细胞膜的局部冲击波、水射流和剪切力。声致穿孔可以允许将治疗剂诸如核酸直接递送(即在内体转运途径之外)至细胞的胞质溶胶中。
超声波的强度和微泡壳的组成会影响声致穿孔的效果。微泡壳应该足够坚硬以承受小的压力扰动，但是足够有弹性以响应超声波而振荡。微泡尺寸的较低程度的多分散性可能是理想的，以便较大比例的微泡组合物对相同振幅的超声波敏感。不受理论的限制，经受低强度超声的微泡可以在共振直径附近稳定振荡，称为稳定空化。稳定空化产生局部剪切力和声微流。在更高的压力振幅下，微泡倾向于经历大的尺寸变化，这导致它们在称为惯性空化的事件中内爆，这种崩解导致喷水、冲击波和其它惯性现象。稳定的和瞬时的微泡空化都可诱导细胞膜透化。声致穿孔被认为提供了不依赖于内吞作用的细胞内药物递送途径。在一些实施方案中，可以在约0.1Mh与约10MHz之间、约0.5MHz与约5MHz之间、或约1MHz与约3MHz之间的频率下执行利用微泡的声致穿孔的超声触发。在一些实施方案中，超声触发可以以介于约100mW/cm2与约1kW/cm2之间、介于约100mW/cm2与约1W/cm2之间、介于约300mW/cm2与约1W/cm2之间、介于约500mW/cm2与约1W/cm2之间、介于约700mW/cm2与约1W/cm2之间、介于约1W/cm2与约500W/cm2之间、介于约1W/cm2与约100W/cm2之间、介于约1W/cm2与约100W/cm2之间、介于约1W/cm2与约50W/cm2之间、介于约1W/cm2与约20W/cm2之间、介于约1W/cm2与约10W/cm2之间、介于约1W/cm2与约5W/cm2之间或介于约1W/cm2与2W/cm2之间的强度进行。在一些实施方案中，超声触发可以以管理机构(例如，FDA)允许的最大强度(例如，大约720mW/cm2(用于诊断超声))进行。在一些实施方案中，超声触发可以以介于约10％至100％之间、介于约20％至约90％之间、介于约30％至约80％之间、介于约40％至约70％之间或介于约50％与约60％之间的占空比进行。在一些实施方案中，占空比约为50％。在一些实施方案中，超声的机械指数(MI)可介于约0.05至约5之间，介于约0.1至约5之间，介于约0.5至约5之间，介于约1至约5之间，介于约2至约5之间，介于约3至约5之间，介于约4至约5之间。在一些实施方案中，超声触发可以以管理机构(例如，FDA)允许的最大机械指数(例如，大约1.9(对于诊断超声))进行。在一些实施方案中，可将超声触发递送约0s–3min、10s-2min、10s-1min、10s–50s、10s–40s、10s–30s、30s–3min、30s-2min、30s-1min、30s–50s、30s–40s、1min–3min或1min-2min,2min–3min。
通过内吞作用进行的药物递送
在一些实施方案中，有效载荷的递送可以在没有声致穿孔的情况下发生和/或被诱导，例如，通过内吞作用(例如，吞噬作用、胞饮作用、受体介导的内吞作用)发生和/或被诱导。在一些实施方案中，靶向分子和/或修饰精胺修饰的微泡的另一种分子可以与诱导受体介导的内吞作用的受体相互作用。在各种实施方案中，精胺修饰的微泡可被掺入溶酶体，其中pH约为4.5-5.0。在各种实施方案中，溶酶体中降低的pH可以促进pH敏感性可生物降解的接头(诸如本文别处描述的胱胺双丙烯酰胺接头)的裂解(例如，通过二硫键的还原)。精胺分子之间、精胺分子与互连聚合物之间和/或互连聚合物与微泡之间的可生物降解的接头的降解可以有效地释放与精胺相关的有效载荷并允许更有效的递送。例如，在一些实施方案中，有效载荷与微泡的解离可以促进核定位。可以如本文别处所述制备精胺修饰的微泡和有效载荷和/或将其与细胞组合。
体外应用
在一些实施方案中，可在体外进行药物递送(以及可应用的声致穿孔)。精胺修饰的微泡组合物可以与贴壁细胞或溶液中的细胞组合。当将微泡加入到溶液中的细胞中时，可以对溶液中的细胞进行声致穿孔，或者随后可在声致穿孔之前使细胞粘附(可被铺板)。微泡可以以约1:1-100:1、5:1-50:1、5:1-25:1、10:1-50:1、10:1-30:1、10:1-25:1、10:1-20:1、10:1-15:1、15:1-20:1或15:1-25:1的微泡/细胞的比率与细胞组合。例如，在一些实施方案中，微泡和细胞以约10:1、15:1或20:1的微泡/细胞的比率组合。可将精胺修饰的微泡组合物孵育一段时间，例如5min、10min、15min、20min、25min、30min、45min、1h等，以允许精胺修饰的微泡与细胞充分混合并可能靶向细胞(例如，其中掺入了靶向分子)。在一些实施方案中，可以主动地将微泡与细胞混合(例如，通过旋转)，特别是当微泡与溶液中的细胞结合时。在其中微泡与贴壁细胞组合的实施方案中，可以在部分或整个组合时间内倒置细胞培养表面，以使漂浮的微泡更好地与贴壁细胞相互作用。可在混合后洗涤细胞/微泡组合物一次或多次。在一些实施方案中，在将微泡与细胞结合之前，用有效载荷(例如，pDNA)预先装载精胺修饰的微泡。在一些实施方案中，有效载荷和微泡基本上同时与细胞组合。例如，可在即将与细胞组合时或者基本上与细胞同时，将有效载荷组合到微泡溶液中。在一些实施方案中，有效载荷可在孵育期间与细胞组合，从而允许微泡与细胞混合和/或靶向细胞。在一些实施方案中，在微泡已被允许与细胞混合和/或靶向细胞之后，有效载荷可以与细胞组合。例如，在微泡与细胞组合之后的洗涤步骤之后，有效载荷可以与细胞组合。在微泡没有预先装载效载荷的一些实施方案中，可将有效载荷与细胞一起孵育一段时间，例如5min、10min、15min、20min、25min、30min、45min、1h等，然后进行声致超声以使有效载荷与精胺修饰的微泡上的精胺相互作用。在细胞与微泡和有效载荷充分组合后，可如本文别处所述进行声致穿孔。
体内应用
在一些实施方案中，可在受试者体内进行药物递送(和适用时声致穿孔)。受试者可包括能够体验到递送有效载荷的有益效果的任何生物体。受试者的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。
本文所述的微泡和/或有效载荷组合物(治疗性组合物)可通过向个体受试者施用(通常通过全身性施用(例如，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部施用)来进行体内递送。在一些实施方案中，治疗性组合物可包含预先装载了有效载荷的微泡组合物。在一些实施方案中，治疗性组合物可包含被依次或基本上同时施用的分开的微泡组合物和有效载荷组合物。当依次施用时，可在施用微泡组合物之前或之后向受试者施用有效载荷组合物。
在一些实施方案中，可将组合物离体递送至细胞，诸如从个体受试者移植的细胞(例如，淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检物)或通用供体造血干细胞，随后将细胞重新植入受试者体内，通常是在选择了已结合有效载荷的细胞之后。用于诊断、研究或分子疗法的离体细胞转染(例如，通过将转染的细胞重新输注到宿主生物体中)是本领域技术人员公知的。适用于离体转染的各种细胞类型为本领域技术人员所公知。在一个实施方案中，干细胞用于细胞转染和分子疗法的离体程序。可使用已知的方法分离干细胞以用于转导和分化。
还可向生物体直接施用治疗性组合物以用于体内细胞的转导。施用是通过通常用于将分子引入与血液或组织细胞最终接触的任何途径，包括但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。施用此类治疗性组合物的合适方法是可获得的，并且是本领域技术人员公知的，并且尽管可以使用不止一种途径来施用特定的组合物，但是特定的途径通常可以提供比另一种途径更直接和更有效的反应。
治疗性组合物可以以药物组合物的形式施用。药物组合物包括适用于向哺乳动物例如人施用的制剂。当本发明的化合物作为药物向哺乳动物例如人施用时，它们可以本身给药或作为药物组合物给药，所述药物组合物含有例如0.1-99.5％(更优选0.5-90％)的活性成分以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是本领域已知的，包括适于向哺乳动物施用本公开的化合物的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。载体包括液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与将主题剂从一个器官或身体的一部分携带或转运到另一个器官或身体的另一部分。每种载体应该在与制剂的另外成分相容且对患者无害的意义上是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括:糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油类，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二元醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和药物制剂中使用的其它无毒相容性物质。湿润剂、乳化剂和润滑剂，诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例子包括：水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。药学上可接受的载体部分取决于所施用的特定组合物，以及用于施用该组合物的特定方法。因此，有多种合适的药物组合物制剂可供使用(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版,1989)。
在一些实施方案中，可将治疗性组合物单独或与其它合适的组分组合制成气溶胶制剂(即，它们可被“雾化”)以通过吸入施用。气溶胶制剂可被放入加压的可接受的喷射剂(诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等)中。
适于肠胃外施用(例如通过静脉内、肌内、皮内和皮下途径)的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌混悬剂，其可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。所公开的组合物可以例如通过静脉内输注、口服、局部、腹膜内、膀胱内或鞘内施用。化合物的制剂可存在于单位剂量或多剂量的密封容器诸如安瓿和小瓶中。注射液和混悬剂可由上述种类的无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。
对于治疗性应用，在本公开的说明书中，向受试者或待引入受试者的细胞施用的治疗性组合物的剂量应足以随时间推移在受试者中产生有益的治疗反应。另外，特定的剂量方案可用于确定实验环境中(例如功能基因组学研究以及细胞或动物模型中)的表型变化。剂量将由所用特定组合物的功效和Kd、靶细胞的核体积和受试者的状况以及待治疗的受试者的体重或表面积决定。剂量的大小还将取决于在特定受试者中施用特定化合物或寡核苷酸剂时所伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度。施用的剂量因受试者而异；“治疗有效剂量”可以例如通过监测症状或表型(诸如肿瘤的大小或生长速率或生长期的持续时间、肿瘤数目、癌细胞数目、生存力、生长速率和癌细胞的生长期的持续时间)来确定。在确定在治疗或预防疾病中待施用的治疗性组合物的有效量时，医生评估微泡和/或有效载荷的循环血浆水平、潜在毒性、疾病进展和抗治疗抗体的产生。可通过单次剂量或分次剂量完成施用。
在各种实施方案中，相对于阴性对照，本文所述的微泡组合物和/或药物递送方法可将核酸有效载荷的转染效率(例如，pDNA的表达)提高大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
包含微泡组合物的试剂盒
本文还公开了用于制备本文别处描述的一种或多种组合物的试剂盒。试剂盒可以在单独的储存容器(例如，小瓶、小袋等)中提供一种或多种组分，用于诸如本文所述的方法等应用中。在一些实施方案中，试剂盒包含如本文别处所述的精胺修饰的微泡组合物。有效载荷可包含在试剂盒中，也可以不包含在试剂盒中。在一些实施方案中，精胺修饰的微泡组合物预先装载了有效载荷。在一些实施方案中，微泡组合物未用精胺修饰，但是精胺分子在可以与微泡组合物组合的另一种组合物(例如，精胺修饰的聚合物组合物)中提供。在一些实施方案中，一种或多种组合物以溶液形式提供。溶液可被配置成在室温下呈液体形式。在一些实施方案中，溶液被配置成在储存期间被冷冻。在一些实施方案中，溶液被配置成在储存期间被冷藏。溶液可包含如本领域公知的稳定剂。储存容器可保护组合物免受光照。在一些实施方案中，一种或多种组合物以干燥或固体形式提供。例如，可通过冻干或喷雾干燥将包含组合物的一种或多种溶液制成干燥形式。在一些实施方案中，将用于将一种或多种干组合物复原成液体形式的试剂(例如，溶液)作为试剂盒的一部分提供。在一些实施方式中，微泡组合物适于用水溶液以及气体复原，以复原微泡的气体核心。该试剂盒可包含一种或多种组合任何组合物，诸如将精胺与微泡组合或将精胺修饰的微泡与有效载荷组合所需的剂。在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种进行声致穿孔所必需的试剂或工具。
如本文中所用，包括在以下实施例中，当提到微泡组合物中的“每一个”微泡或与微泡结合或在组合物中的“每一个”聚合物，或以其它方式表征单个微泡或聚合物时，应该理解的是，表征是基于整体微泡或聚合物组合物的性质/测量，假设微泡/聚合物组合物在整个组合物中基本上是同质的。因此，可以使用平均数(基于测量或估计的微泡总数和/或总的聚合物数或质量)来表征组合物中的“每一个”微泡或聚合物，应当理解，在每一个单独的微泡和/或聚合物之间预期会有一定的可变性。基本上组合物中的每一个/每个微泡或每一个/每个与微泡缔合的聚合物可以指例如组合物中的80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.99％或100％的微泡/聚合物(以质量或数量计)。基本上组合物中的每一个/每个微泡或每一个/每个与微泡缔合的聚合物可以指达到本文别处描述的任何有效载荷加载量所必需的量。
除非另有明确说明，否则本文公开的任何分子量平均值可以是数均或重均的。除非另有明确说明，否则本文公开的任何平均尺寸(例如，微泡尺寸)可以是数均的或尺寸平均的。
除非另有明确说明，否则本文公开的所有测量值或数值都应假定为近似值。被认为是“约”或“大约”的测量值或数值可由本领域技术人员在本公开的说明书中评估。例如，除非另有说明，否则本文公开的测量值或数值可具有不超过20％，优选不超过10％，更优选不超过5％的偏差，而不会实际偏离本文所述的主题。
实施例
实施例1:氧化的葡聚糖(O-Dex)的合成
O-Dex的合成通过图4所示的一系列反应中的第一个化学反应来说明。将高碘酸钾(1437mg,6.25mmol)加入到葡聚糖40k(1000mg,6.25mmol的葡萄糖单体)在milliQ水(20mL)中的溶液中。将反应物在室温下于黑暗中剧烈搅拌7h，然后使用Amicon旋转过滤器(MWCO＝10kDa)以4000g在4℃下旋转过滤两次，每次10分钟，用水洗涤。所得渗余物使用再生纤维素半透膜(MWCO 3.5-5kDa)对水透析1天，随后冷冻干燥2天，得到为浅黄色固体的O-Dex(80％的产率)。1H NMR(400MHz,D20)6(ppm)＝6.02-4.85(m,0.4H),4.71-4.25(m,0.5H),4.05-3.41(m,1H)，如图5顶部所示。
实施例2:缀合有精胺的葡聚糖的合成
由O-Dex合成Spe-Dex通过图4所示的一系列反应中的第二个和第三个化学反应来说明。将O-Dex(790mg,4.94mmol的葡萄糖单体)溶解在milliQ水(38mL)中，并通过注射泵在5h内加入到精胺(457mg,2.96mmol)于硼酸盐缓冲液(19mL,0.1M,pH＝11)中的溶液中。将所得溶液在室温下轻轻搅拌24h，然后在冰浴下加入NaBH4(359mg,9.48mmol)，并在室温下搅拌48h。然后加入另一份NaBH4(359mg,9.48mmol)，并在相同条件下继续搅拌24h。使用Spectra-Par Float-A-Lyzer(MWCO＝3.5-5kDa)将粗产物针对水透析2.5天，然后冻干2天，得到为白色蓬松固体的Spe-Dex。1H NMR(500MHz,DzO)6(ppm)＝3.66(s,1H),2.74(d,J＝49.5Hz,1.5H),1.86 -1.39(m,lH)，如图5底部所示。NMR表明葡聚糖中大约每隔一个葡萄糖分子就有一个精胺与之缀合。
实施例3:Spe-Dex胺的定量
使用TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)方法以精胺作为标准对Spe-Dex上的伯胺数量进行定量。TNBS与伯胺的反应产生发色团，其强度与聚合物中伯胺的浓度成正比。为了建立精胺标准，将20μL新鲜制备的TNBS水溶液(15mg/mL)分别加入到试管中，该试管含有溶解在600μL水中的范围为0.04至0.2μmol的不同量的精胺。向每个试管中加入200μL碳酸氢盐缓冲液(0.8M，pH＝8.5)，将混合物涡旋1分钟，然后在37℃下孵育2h。之后，向每个试管中加入600μL 1M HCl以猝灭反应，将混合物涡旋1分钟，然后轻轻超声以去除任何气泡。每次运行使用100μL样品，并在340nm处测量吸光度。使用不同质量的Spe-Dex重复该程序，并使用标准曲线的方程和标记的聚合物的吸光度来计算胺的数量。该方法报道了每毫克Spe-Dex有0.71μmol伯胺的计数。对于保持其40kDa的起始分子量的葡聚糖分子，每个所得精胺修饰的葡聚糖分子理论上将包含大约33个精胺、222个葡萄糖单位，并具有46.71kDa的分子量，其中假设葡聚糖分子之间没有交联，每6-7个葡萄糖分子中约有1个缀合于精胺。
实施例4:多聚复合物的尺寸测量
通过将1μg GFP pDNA(50μL,20μg/ml)与等体积的聚合物溶液以1:1、1:2、1:5和1:10的N:P比率涡旋，然后在室温下孵育30min来制备Spe-Dex/DNA多聚复合物。然后用MQ水(或10mM NaCl)将5μL的每种多聚复合物溶液稀释至1ml，使用ZetaView颗粒矩阵NTA系统测量平均尺寸和ζ电位。对于以1:1(左上)、1:2(右上)、1:5(左下)和1:10(右下)的N:P比率产生的多聚复合物，图6中描绘了Spe-Dex/DNA多聚复合物的粒度测量。尺寸测量显示所有比率的DNA的复合。每个比率的尺寸和ζ如下：1:1＝123.8nm,30.53mV；1:2＝191.5nm,27.51mV；1:5＝119.1nm,-25.55mV；1:10＝105.3nm,-34.18mV。
实施例5:凝胶电泳测定
在Tris-乙酸盐-EDTA缓冲液(TAE)中制备含有0.8μg/mL溴化乙锭(EtBr)的1％w/v琼脂糖凝胶。使用实施例4的方法以1:1、1:2、1:5和1:10的N:P比率制备Spe-Dex/DNA多聚复合物。用5μL 6xTriTrack DNA上样缓冲液稀释10μL的每种多聚复合物样品，并将所有15μL样品上样到凝胶上。将凝胶在70mV下运行30min，然后在100mV下再运行30min，使用BioDoc-lt2成像系统用UV照射器显现DNA条带，其结果如图7所示。凝胶测定证实了在N:P比率为1:1和1:2时DNA完全复合(如通过固定条带所示的)，但在比率为1:5和1:10时仅部分复合，其显示了游离DNA的条带。
实施例6：Spe-Dex硫醇化和FITC标记
用PBS 1X，5mM EDTA(0.5ml)溶解Spe-Dex(5mg,3.55mol NH2)。在剧烈搅拌下向该溶液中滴加1mg/ml的2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐水溶液(4.88mg,35.45μmol)。将所得混合物搅拌1h，透析48h(MWCO＝3.5kDa)，并冻干48h。使用胺反应性5/6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(NHS-荧光素)进行Spe-Dex聚合物的荧光标记。简言之，将Spe-Dex聚合物(5mg)溶解在1ml 1X硼酸盐缓冲液(50mM，pH＝8.5)中。将NHS-荧光素(5mg,10.562μmol)溶解在DMF(0.5ml)中，并在剧烈搅拌下滴加到Spe-Dex溶液中。将反应物搅拌1h，透析48h(MWCO＝3.5kDa)，冻干48h。
实施例7：Spe-Dex硫醇定量
使用Ellman试剂(5,5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸))以半胱氨酸作为标准，对Spe-Dex上的硫醇数量进行定量。Ellman's与硫醇的反应产生发色团，其强度与聚合物中硫醇的浓度成正比。为了建立标准，将50μL浓度为10-500uM的半胱氨酸加入到950μL溶解在0.1MTris-HCl pH 7.5中的0.1mM Ellman's中，并短暂涡旋。然后将样品在室温下孵育2min。每次运行使用100μL样品，并在412nm处测量吸光度。使用不同质量的Spe-Dex重复该程序，并使用标准曲线的方程和标记的聚合物的吸光度计算硫醇的数量。该方法报道了每毫克Spe-Dex有0.113μmol伯胺的计数。这相当于每6.28个伯胺中约有1个被硫醇化，假设葡聚糖分子之间没有交联，则每个葡聚糖分子中约有27.89个伯胺是游离的。
实施例8：微泡制剂
将1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2k)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](铵盐)(DSPE-PEG2k-Mal)各自以90:5:5的摩尔比溶解在250μL氯仿中，并加入到20mL闪烁管中。加入另外的氯仿(2mL)，用旋转蒸发器干燥溶液，以在小瓶周围形成脂质薄膜。将薄膜在真空干燥器中进一步干燥过夜，以除去任何残留的氯仿。将所得的干脂质薄膜重新悬浮于含有10％丙二醇和10％甘油的PBS 1X缓冲液中，并加温至70℃。在相同温度下对溶液进行超声处理，直至澄清。用十氟丁烷气体填充溶液的顶部空间，并以70％的振幅超声尖端5秒。然后用注射器抽取微泡溶液，并用PBS洗涤(pH＝6.5，1mM EDTA)以300g离心3次，每次3min。使用Beckman Coulter Multisizer 4获得微泡的平均尺寸和计数。每次运行用稀释到10ml lsoton中的2μL微泡溶液进行三次测量。马来酰亚胺官能化的微泡的平均尺寸为2.981μm+/-0.01μm，计数为2.22x 109+/-1.18x108MB/mL。
实施例9：微泡与Spe-Dex的缀合
通过将微泡表面上的马来酰亚胺端基共价偶联至Spe-Dex聚合物上的硫醇基而将Spe-Dex聚合物缀合到微泡上。简言之，首先在注射器中使用PBS pH＝6.5w 1mM EDTA将微泡稀释至1.10x109MB/mL的浓度。以1:20的马来酰亚胺:聚合物的摩尔比向其中加入Spe-Dex聚合物(10mg/mL，PBS pH＝6.5，1mM EDTA)。将悬浮液在室温下以20转/分钟的速度端对端旋转4h，然后用PBS 1x以300g洗涤3次，每次3min。Spe-Dex脱气微泡的平均尺寸为3.119μm，计数为3.42x 109MB/mL。将荧光显微镜检查用于证实Fl标记的Spe-Dex聚合物与微泡壳的缀合。
实施例10：通过荧光光谱法定量Spe-Dex与微泡的缀合
为了定量与微泡缀合的Fl-Spe-Dex的量，通过首先在DMSO(1:20的稀释度)中稀释10mg/mL的Fl-Spe-Dex溶液，然后在5mM NaOH(1:20的稀释度)中稀释来绘制标准曲线。进行系列稀释以在孔中获得介于40ng/mL与320ng/mL之间的Fl-Spe-Dex(N＝3)。校准曲线的线性回归得到方程y＝1.83×107x-546.7，其中R2值为0.9972。类似于标准品，通过在DMSO和5mM NaOH中稀释一定体积的微泡悬浮液来制备Fl-Spe-Dex微泡样品。然后将Fl-Spe-DexMb样品超声处理20s并涡旋以确保微泡被破坏并且Fl-Spe-Dex均匀分布在溶液中。溶液在488nm处被激发，在520nm处读取荧光强度。使用回归曲线，测得微泡样品中Fl-Spe-Dex的浓度为0.045mg/mL。根据实施例3中精胺-葡聚糖的计算，大约170,000个精胺修饰的葡聚糖分子连接到每个微泡上，每个微泡包含大约560万个精胺(470万个游离精胺，假设葡聚糖之间没有交联)。
实施例11：Spe-Dex-MB DNA加载
在1mL注射器中用PBS 1x将mCherry pDNA(0.403μg/μL)稀释至约0.05μg/μL。将Spe-Dex-MB溶液(20μL,2.4x 109MB/mL,4.6x 107总MB)缓慢加入注射器，以18转/分钟的速度旋转注射器15min，然后在室温下直立放置15min。将微泡以100g离心1min，弃去下层漂浮物(infranatant)。调整微泡的尺寸，其浓度为4x 108MBs/mL，总共具有1x 107个总MB。然后将MB/DNA样品超声处理20s并涡旋以确保微泡被破坏并且DNA均匀分布在溶液中。以一式两份使用Take3 Multi-Volume平板和2μL样品在260nm处读取样品的吸光度。使用由已知浓度的mCherry pDNA制备的标准曲线计算DNA浓度。使用这种方法，确定每个微泡的pDNA数量为31,788(N＝4)，与阳离子脂质(DSTAP)微泡相比，该数量是DNA负载的10倍的统计学上显著的增加(图8)。根据实施例10的计算，约每148个精胺装载大约一个pDNA分子。考虑到微泡的平均尺寸，获得了大约0.028pg/μm2的DNA负载能力，这为使用缀合有PEI的微泡获得的负载能力的约5.6倍，为在用阳离子脂质形成的微泡上获得的负载能力的至少4.6倍，如文献中所报道的。参见，Sirsi等人“Polyplex-Microbubble Hybrids for Ultrasound-GuidedPlasmid DNA Delivery to Solid Tumors”JControl Release；2012年1月30日；157(2)，该文献据此通过引用以其整体并入。
实施例12：靶向CD44或EpCAm的微泡的配制
也可将靶向部分(诸如透明质酸(针对CD44)和抗EpCAM抗体)缀合至Spe-Dex-MB上。为了靶向CD44，首先用含1mM EDTA的pH 6.5的PBS稀释Spe-Dex-MB，以达到1.10x109MB/mL的浓度。将10mg/mL的巯基化透明质酸溶液(MW＝10,000g/mol,CreativePegWorks)以1:5的马来酰亚胺:聚合物比率(假设所有的马来酰亚胺都是游离的)加入到微泡溶液中。将溶液旋转4h，用PBS 1x以250g洗涤3次，每次2min。为了靶向EpCAM，使用相同的程序，但是使用2:1的马来酰胺:抗体比率，将Spe-Dex-MBs与硫醇化的抗EpCAM(Biolegend)抗体(Ab)缀合。
实施例13：Spe-Dex-HA/Ab-MB结合实验
使用Circular Parallel Plate Flow Chamber试剂盒(GlycoTech Corporation)来证实Spe-Dex-HA-MB成功靶向HeLa细胞上表达的CD44。使含2％ BSA的PBS溶液(以防止非特异性结合)流过该室，直至其被饱和，然后施加真空，将生长在35mm培养皿中的HeLa细胞置于该室顶部。使用注射泵以450μL/min的流速在5分钟内注射2.5mL的5x 106MB/mL。注射后，用1.3mL 2％ BSA以相同的流速洗涤细胞，关闭真空并取出细胞。通过显微镜检查确认结合，使用ImageJ计算视野中的微泡的数量，并将其与非靶向Spe-Dex-MB进行比较。靶向显示视野中4134个微泡，而非靶向显示视野中815个微泡。
为了测试对EpCAM的靶向性，将Spe-Dex-Ab-MB与K562细胞在悬浮液中混合。将含有DNA的Spe-Dex-Ab-MB加入到1.65x 105个K562细胞中(50Mb/细胞)，通过温和吸打混合，并孵育1min。然后将MB/细胞溶液以300g离心5min，以分离任何非靶向微泡，并去除上清液。将所得沉淀重悬于PBS中，并在显微镜下观察任何靶向细胞的微泡。以非靶向Spe Dex-MB作为对照重复该程序。含有Spe-Dex-Ab-MB的沉淀显示出视野中145个MB，而含有未与EpCAM抗体缀合的Spe-Dex-MB的沉淀仅显示出视野中22个微泡。
实施例14：使用Spe-Dex-HA-MB对HeLa细胞进行声致穿孔
将HeLa细胞在定制的装置中进行声致穿孔，该装置由35mm的培养皿组成，其盖子上钻有两个孔，一个作为培养基的入口，另一个作为空气的出口。转染前24h，将HeLa细胞以500,000个细胞(于2mL完全EMEM、10％ FBS、1％ P/S中)接种于该培养皿中。转染当天，将2x107Spe-Dex-HA-MB加入到9.64μg eGFP pDNA(N:P 1:5)中，并以每分钟20转的速度旋转15min，然后在室温下孵育15min。然后通过以250g离心2min将微泡洗涤1次，除去下层漂浮物并保留用于结合定量。然后吸出细胞的培养基，并以20MB/细胞的终浓度滴加微泡。然后将孔上下翻转并孵育10min，以使微泡靶向细胞。之后，将孔翻转回来，用石蜡膜密封盖子以防止泄漏。在孔中填充OptiMEM，然后将其翻转过来。将US偶联凝胶施加至孔的底部，并在1W/cm2,50％ Dc下对细胞进行60秒的声致穿孔，同时横跨孔来回移动换能器。声致穿孔后4h，将OptiMEM吸出并用2mL完全EMEM更换。声致穿孔后3天使用荧光显微镜确认转染，并通过流式细胞术进行评估。与对照细胞相比，经声致穿孔的细胞显示FITC信号增加了14％。
实施例15：用Spe-Dex-ROR1-MB对JeKo-1细胞进行声致穿孔
将3x 107Spe-Dex-ROR1-MB加入28.93μg eGFP pDNA(N:P1:10)中，以每分钟20转的速度旋转15min，然后在室温下孵育15min。将2.5x 106个JeKo-1细胞离心，重悬于1mLRPMI中，并将500,000个细胞加入到12孔板的对照孔中。向剩余的细胞中加入微泡，将悬浮液旋转15min，以使微泡靶向细胞上的ROR1(约15MB/细胞)。之后，将悬浮液稀释至10mL，并向每个孔中加入2.5mL。将平板置于设定为35℃的热浴之上，使用50％ DC以1W/cm2或2W/cm2对孔进行30秒或60秒的声致穿孔。声致穿孔后2.5h，将细胞离心并重悬于1mL完全RPMI中。3天后，收集细胞用于流式细胞术(图9)。活细胞的门控显示，与阴性对照样品(下图；2W/cm2,50％ DC,60s)相比，经声致穿孔的细胞(上图)的GFP信号最大增加11％。在细胞计数器上绘制FITC对比PE通道的图允许在自发荧光与真实的GFP信号之间进行分离，这进一步证实了转染。然而，活细胞的门控仅去除了自发荧光信号。为了进一步证实转染，使用TRIzol方法从对照和经声致穿孔的细胞中分离DNA。使用PCR和eGFP的正向和反向引物扩增分离的DNA。将扩增的DNA连同DNA梯带在用EtBr染色的1％琼脂糖凝胶上运行，并用BioDoc-lt2成像系统可视化(图10)。凝胶对一些但不是所有的经声致穿孔的样品显示GFP带，而流式细胞术显示所有的经声致穿孔的样品为GFP阳性。这可能是因为当质粒被降解时，GFP蛋白仍存在于细胞中。
实施例16：用装载有mCherry编码质粒的Spe-Dex MB体内选择性转染T细胞
大鼠的体内转染：优化体内表达以最大化表达基因的细胞的比例和基因表达。考虑到通过介入组织和血流减少微泡/细胞复合物暴露时间的超声衰减，体内转染可依赖于体外优化的转染条件。通过声波作用于脾脏(30％的T细胞位于其中)和大的血液空间(诸如腔静脉或心脏)来转染T细胞。首先，对6只大鼠的脾脏(其中T细胞是静止的)进行声致穿孔。静脉内注射最佳微泡制剂和计数(假设为106个T细胞/mL和80mL血液/kg体重)，以达到最佳的微管/细胞比。该实验从微泡施用后10分钟的最佳离体超声暴露开始，通过测量72h时表达基因的循环T细胞的比例来评估体内转染，并如上所述定量基因表达。死后分析脾脏。首先评估脾脏的烧伤。然后将一半匀浆，将一半固定。在加入FITC-aCD3对T细胞染色后，通过荧光显微镜检查和流式细胞术对匀浆进行评估。用FITC-aCD3进行H&E和免疫组织化学染色以评估损伤并寻找mCherry和FITC的共定位。然后对接下来的6只大鼠增加超声SATA能量，并如前所述重新评估体内转染。然后将转染T细胞的比例和基因表达最大化而不损伤组织的暴露用于优化声波作用于血液时的暴露时间。
输注用于脾脏转染的相同微泡制剂和计数。离体测定并用于脾脏转染的最佳暴露时间用作起点，然后随着超声功率的增加而缩短暴露时间，以维持恒定的SATA，因为下腔静脉和门静脉在它们进入肝脏之前在肾脏水平上接受声波作用。如上所述，通过测量72h时表达基因的循环T细胞的比例并定量基因表达来评估体内转染。还如上所述，通过评估脾脏匀浆和组织荧光来评估脾脏。每次重复在6只大鼠中进行这些实验，并如上所述对差异进行统计分析。
从这些优化的体内T细胞转染实验中获得的数据可用于确定脾脏或血液的声致穿孔是否是更好的转染方法。除非另有明确说明，否则这两种方法都可用于本文另处描述的体内转染实验。相较于另一种方法产生<15％转染率的方法可被认为效率较低。
体内基因转染半衰期：为了计算体内基因转染半衰期，使用上述确定的最佳超声暴露和转染方法转染30只大鼠。在声致穿孔后的1天、2天、4天、7天和14天处死6只大鼠，并如上所述在血液和脾脏中测定转染的T细胞的比例。将转染的T细胞的平均比例和基因表达水平随时间作图，并确定基因表达半衰期。使用单因素方差分析对随时间的变化进行统计评估，并使用非配对学生t检验对数据点进行比较。如果在离体转染后转染的T细胞的比例低，则可在4mL大鼠血液的离体转染后，使用为离体转染确定的最佳参数来计算基因表达半衰期。在同窝出生仔畜中，在进行声致穿孔后，立即富集并注射2x106个T细胞。
使体内转染的T细胞的比例最大化：30只大鼠经历几次转染期(微泡输注和声致穿孔)，其中每隔T1/2/3、T1/2/2、T1/2、1.5 x T1/2或2 x T1/2处理每6只大鼠。另外六只大鼠作为对照。给大鼠输注载有mCherry和非特异性IgG标记的微泡，并在实验组的最短时间间隔进行声致穿孔。最后一次处理后一天，分析200μL血液中的转染的T细胞的比例，然后在第2天、第4天、第7天和第14天和第3次T1/2时再次分析，此时将处死动物，并如上所述分析血液和脾脏中的T细胞转染。为每个处理组绘制转染的T细胞的平均数，以确定转染的T细胞的血液计数，并使用双因素方差分析进行统计显著性分析，其中时间和处理组作为独立变量。细胞计数预计在较短的治疗间隔期内最大，当间隔期等于T1/2时达到平台期，当间隔期>>T1/2时减少。
体外转染的大鼠T细胞中活化和CAR表达的验证：使用离体转染的最佳条件在血液中转染T细胞，并分离和计数转染的T细胞。然后使用加入到含有最佳培养基的每个孔中的1x105个CAR T-细胞，将转染的T-细胞与将被包被在96孔培养板的底部的Fc-标记的CD19蛋白相互作用。在30min、2h、12h、24h和48h后，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量上清液中的IL2和IFN-γ细胞因子释放。在这些时间点，还收集CAR T细胞，并进行流式细胞术，通过测定CD69、CD62L、PD1、LAG3和TIM3表达来定量T细胞活化、记忆和耗竭的标志物。从未转染的血液中回收T细胞，用mCherry转染的T细胞作为阴性对照。用其它蛋白质包被的孔用于证明CAR-靶特异性。实验以一式三份进行。
验证表达CAR的大鼠T细胞的体外生物细胞毒性：使用正常大鼠血液的EasySepTM大鼠T细胞和B细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies),离体培养1x105个CAR T细胞，并用等数量的B细胞进行离体转染，以验证CAR-T细胞的生物细胞毒性。与未转染的T细胞一起培养的B细胞用作阴性对照。将利用AF488-CD19抗体和PI染色的流式细胞术用于估量与CAR T细胞混合之前和混合之后30min、2h、12h、24h和48h的活B细胞的数量。还使用CytoTox(PromegaTM)对b细胞裂解进行定量，CytoTox/>是一种非放射性比色细胞毒性测定。简言之，收集上清液并转移到新的96孔板中，加入CytoTox试剂。加入终止溶液以终止反应。使用酶标仪在490nm处测量吸光度。从不含CAR T细胞的孔中测量B细胞的自发乳酸脱氢酶(LDH)释放，从Triton X-100处理的样品中测量最大释放。细胞毒性百分比计算为100x[(实验LDH释放-自发LDH释放)/(最大LDH释放-自发释放)]。实验以一式三份进行。
体内T细胞转染和CD19+细胞耗竭的验证：用装载有CD19CART质粒的CD3靶向(n＝6)或非靶向微泡(n＝6)在12只大鼠体内转染T细胞。遵循可能在多次处理后产生最大比例的转染的T细胞的实验条件。在第12h、第24h、第48h和第72h收集200μL血液，并分析其B细胞的耗竭。将AF488-aCD19加入到血液样品中，使用流式细胞术和PI染色评估B细胞的生存力。收集肝脏、脾脏、骨髓、淋巴结和肺。将样品匀浆，剩余部分使用荧光标记的抗CD19抗体进行H&E和免疫组织化学(IHC)染色。如上所述，评估匀浆物以定量转染的T细胞的数量，并使用AF488-aCD19、AF-647-aCD3和SYTOXTM Orange通过流式细胞术评估活的B细胞。
在体外对表达CAR的ALL T细胞的活化、B细胞细胞毒性和无脱靶CAR转染的验证：为了评估CAR T-细胞活化和生物活性，但使用来自急性淋巴母细胞性白血病(ALL)患者的人血液，离体转染健康者和ALL患者的T-细胞，并且使用人B-细胞ALL异种移植的小鼠模型来验证治疗效果。使用来自ALL患者的血液样品，使用优化的条件离体转染T细胞，并对转染的T细胞进行计数。与对于大鼠血液一样，使转染的T-细胞与Fc-标记的CD19蛋白相互作用，并且在30min、2h、12h、24h和48h后，通过ELISA在上清液中测量IL2和IFN-γ细胞因子释放。在这些时间点，与对于大鼠血液一样，收集CAR T-细胞并进行流式细胞术以定量T-细胞活化、记忆和耗竭的标志物。从未转染的血液中回收的T细胞和用mCherry转染的T细胞用作阴性对照。用其它蛋白质包被的孔用于评估CAR-靶特异性。实验以一式三份进行。
体外验证表达CAR的人T细胞的生物细胞毒性：使用浮力技术，使用CD3或CD19靶向微泡分别分离T细胞和B细胞。离体转染T细胞，然后培养并扩增72h。然后分离T细胞，并将1x105个活的CAR T细胞与B细胞以1:1、5:1、10:1的B细胞与T细胞的比率混合，以评估生物细胞毒性。未转染的T细胞和与WBC(CD19-)混合的转染的T细胞用作阴性对照。通过ELISA测量上清液中释放的IL2和IFN-γ，并且将利用AF488-CD19抗体和PI染色的流式细胞术用于计数与CAR T细胞混合之前和混合之后30min、2h、12h、24h和48h的活的B细胞的数量。如上所述，使用CytoTox(PromegaTM)对B细胞裂解进行定量。测量并计算细胞毒性百分比。实验以一式三份进行。
B-ALL的人异种移植模型：在SCID小鼠中进行5x106个前B-ALL NALM-6细胞的异种移植。用250cGy的亚致死剂量对78只6-8周龄的小鼠全身进行辐射以改善植入，这通过在用抗人PE-CD19和抗人PE-CD45染色后，使用流式细胞术计数RBC裂解后外周血中以及肝脏、脾脏中浸润的人白血病细胞和骨髓有核细胞的数目，来在第6周和第8周各在3只小鼠进行评估。其它样品也用PE标记的非特异性抗体染色，以设置阳性染色的门。如上所述，离外转染从ALL血液中分离的T细胞以表达CD19-CAR，并培养72h。在ALL B细胞接种后第6周(N＝9)或第8周(N＝9),分离出2x106个活的CAR T细胞并将其静脉内注射到18只SCID小鼠中。在ALLB细胞接种后第6周(N＝9)或第8周(N＝9)，静脉内注射2x106个从ALL患者血液中分离的未转染的T细胞作为对照。T细胞施用后24h、48h和72h，对每组3只小鼠取血。将AF488-aCD19加入到血液样品中，使用流式细胞术和PI染色评估B细胞的存活力。收集肝脏、脾脏、骨髓、淋巴结和肺，并进行IHC以检测CD19+细胞的存在。还监测了经处理的小鼠(N＝18)对比对照小鼠(N＝18)的存活率。
实施例17：用Spe-Dex-MB对B细胞进行声致穿孔
用编码CD154的基因装载精胺-葡聚糖微泡(Spe-Dex-MB)，并如本文别处所述，通过将抗ROR-1抗体附着至微泡表面而将其靶向ROR-1。使用荧光素酶作为替代基因，优化微泡负载、剂量和超声参数以最大化基因表达，同时使体外细胞死亡减少至最少。使用B细胞恶性肿瘤的鼠模型，采用体外实验中优化的配方和超声条件，在体外转染之前和之后评估T细胞活化、增殖和恶性B细胞杀伤，然后体内评估T细胞活化、增殖和恶性B细胞杀伤。全身给予微泡后几分钟，它们应该附着于循环的恶性B细胞，然后通过将MB/细胞复合物暴露于超声场来转染它们，使用临床超声系统以FDA批准的发射功率或低于FDA批准的发射功率来递送所述超声场。CD154的产生将在不久后开始。当足够多的细胞被转染时，它们将诱导T细胞活化，开始恶性B细胞杀伤。
实施例18：TFA2-精胺的合成
TFA2-精胺的合成描绘于图11中。将三氟乙酸乙酯(1.47mL,12.36mmol)和水(0.089mL,4.94mmol)加入到精胺(500mg,2.47mmol)的乙腈(8mL)溶液中，并将所得混合物在90℃回流3h。此后，将反应混合物冷却至室温以形成白色沉淀，并逐渐加入冷DCM(2mL)以完成沉淀。过滤固体，用冷DCM洗涤，并在真空下干燥，得到为白色固体的TFA2-精胺。1H NMR(400MHz,D2O)δ(ppm)＝3.41(t,J＝6.8Hz,4H),3.10-3.01(m,8H),2.00-1.90(m,4H),1.78-1.70(m,4H)。
实施例19:BOC2-精胺的合成
BOC2-精胺的合成描绘于图12中。在氩气氛下，将精胺(70mg,0.346mmol)溶解在THF(1.05mL)中，并用冰浴冷却。向该溶液中滴加THF(2.11mL)中的BOC-ON(170mg,0.692mmol)，并将反应混合物在冰浴中搅拌2min，然后在室温下搅拌1h。然后用饱和碳酸钠(3.15mL)猝灭反应，并用DCM(每次6mL)提取3次。将有机层用硫酸钠干燥，蒸发，并使用12g15μm二氧化硅柱和5％的28％ NH4OH的乙醇溶液(作为洗脱剂)利用PuriFlash进行纯化，得到为粘性液体的BOC2-精胺。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)＝5.3-5.2(br,1H),3.2-3.1(m,2H),2.65(t,J＝6.4Hz,2H),2.6-2.5(m,2H),2.4-2.2(br,lH),1.64(t,J＝6.4Hz,2H),1.5-1.4(m,2H),1.40(s,9H)。
实施例20：聚二氨基乙烷(PolyDAE)的合成
PolyDAE的合成描绘于图13中。用亚甲基双丙烯酰胺与BOC-DAE作为概念证明。将BOC-DAE(100mg,0.624mmol)和亚甲基双丙烯酰胺(96mg,0.624mmol)加入到圆底烧瓶中，用氩气冲洗，并溶解在脱气的9:1v/v MeOH/H2O溶剂混合物(0.62mL)中。将反应混合物在氩气气囊下在60℃于黑暗中搅拌4天。然后，将反应物沉淀在25mL的冷乙醚中。过滤出固体，干燥，然后溶解在97.5:2.5v/vTFA/H2O(1mL)中，并搅拌45min以除去BOC保护基团。然后在25mL冷乙醚中再次沉淀产物，过滤，干燥，得到为粘性液体的PolyDAE。1H NMR(500MHz,D2O)δ(ppm)＝4.54(d,J＝4.0Hz,2H),3.58-3.29(m,10H),2.72(dt,J＝48.1,6.5Hz,4H)。
实施例21：多精胺的合成
多精胺的合成描绘于图14中。将BOC2-精胺(200mg,0.497mmol)和亚甲基双丙烯酰胺(77mg,0.497mmol)加入到圆底烧瓶中，用氩气冲洗，并溶解在脱气的9:1v/v MeOH/H2O溶剂混合物(0.75mL)中。将反应混合物在氩气下在60℃于黑暗中搅拌4天。然后，将反应物沉淀到30mL冷乙醚中。过滤出固体，干燥，然后溶解在1mL的95:5v/vTFA/H2O中，搅拌30min以除去BOC保护基团。将粗产物沉淀到30mL冷乙醚中，并在真空下干燥。通过将产物透析1天(MWCO＝1kDa),然后冻干来进一步纯化产物，得到为白色粉末的多精胺(33mg)。1H NMR(400MHz,D2O)δ(ppm)＝4.54(s,2H),3.00(p,J＝9.6,8.7Hz,8H),2.83-2.60(m,8H),2.49(t,J＝7.4Hz,4H),1.90(q,J＝8.2,7.7Hz,4H),1.52(s,4H)。
实施例22：双丙烯酰胺缩酮的合成
双丙烯酰胺缩酮的合成描绘于图15中。将双邻苯二甲酰亚胺酮醛胺(1000mg,2.37mmol)加入到装有回流冷凝器的圆底烧瓶中。加入6M NaOH(6.41mL)并将反应混合物在100℃回流过夜以除去邻苯二甲酰亚胺保护基团。然后用1:1v/v的CHCl3/iPrOH的混合物(3x，13mL)提取未保护的酮醛胺。然后将酮醛胺(384mg,2.37mmol)加入到冰浴中的RB烧瓶中，并用6M NaOH(11.5mL)溶解。以少量交替部分加入三乙胺(14.9mL，107mmol)和丙烯酰氯(2.87mL，35.5mmol)以保持pH高于8。将所得混合物搅拌15min，随后加入冷的10％ K2CO3溶液(24mL)并再搅拌10min。用乙酸乙酯(3x，12mL)提取粗产物，并在二氧化硅柱上进行纯化(首先使用1:1的乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，然后使用100％乙酸乙酯)。然后用乙酸乙酯(105mg,21.4％)对终产物进行结晶。
实施例23：邻苯二甲酰亚胺-精胺的合成
邻苯二甲酰亚胺-精胺的合成描绘于图16中。将精胺(400mg,1.98mmol)和N-乙氧羰基邻苯二甲酰亚胺(867mg,3.95mmol)加入到圆底烧瓶中，并溶解在DCM(7mL)中。将反应混合物搅拌3h，然后蒸发至干。将残留物在二氧化硅柱上进行纯化(首先用10:1DCM/MeOH作为洗脱剂，然后用2:1DCM/MeOH作为洗脱剂)，得到为浅黄色固体的邻苯二甲酰亚胺-精胺。薄层色谱(TLC)Rf＝0.2(2:1v/vDCM/MeOH)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)＝7.85–7.63(m,8H),3.72(t,J＝6.8Hz,4H),2.68–2.52(m,8H),1.85(p,J＝7.0Hz,5H)。
实施例24:多精胺胱胺双丙烯酰胺(多精胺CBA)的合成
多精胺CBA的合成描述于图17中。将CBABOC2-精胺(341.9mg,0.849mmol)和胱胺双丙烯酰胺(221.13mg,0.849mmol)加入到RB烧瓶中，用氩气冲洗，并溶解在脱气的9:1v/vMeOH/H2O溶剂混合物(1.28mL)中。将反应混合物在60℃于氩气气囊下在黑暗中搅拌5天。此后，加入1mL 95:5v/v TFA/H2O，并将所得混合物搅拌45分钟以除去BOC保护基团。将粗产物透析1天(MWCO＝1kDa)，然后冻干，得到为白色粉末的多精胺CBA(66.7mg)。1H NMR(400MHz,D2O)δ(ppm)＝3.52(t,J＝6.5Hz,4H),3.26(t,J＝7.2Hz,3H),3.12-2.96(m,11H),2.82(t,J＝6.5Hz,4H),2.65(t,J＝7.2Hz,4H),2.09-1.97(m,4H),1.76-1.63(m,4H)。

Claims (94)

1.一种用于将有效载荷递送至一个或多个细胞的微泡组合物，所述微泡包含多个精胺修饰的微泡，其中每个所述微泡包含被表面活性剂壳包封的气体核心，并且其中多个精胺分子与每个微泡的表面活性剂壳的外表面缔合。
2.如权利要求1所述的微泡组合物，其中所述多个精胺分子非共价偶联至每个微泡的外表面。
3.如权利要求1所述的微泡组合物，其中所述多个精胺分子共价偶联至每个微泡的外表面。
4.如权利要求3所述的微泡组合物，其中所述多个精胺分子直接偶联至每个微泡的外表面。
5.如权利要求3所述的微泡组合物，其中所述多个精胺分子通过互连聚合物间接偶联至每个微泡的外表面。
6.如权利要求5所述的微泡组合物，其中所述互连聚合物通过一个或多个精胺分子与每个微泡的外表面共价交联。
7.如权利要求5所述的微泡组合物，其中所述互连聚合物是支架聚合物，所述多个精胺分子中的多个精胺分子共价偶联至每个支架聚合物。
8.如权利要求7所述的微泡组合物，其中所述支架聚合物是线性的。
9.如权利要求7所述的微泡组合物，其中所述支架聚合物是支化的。
10.如权利要求8或9所述的微泡组合物，其中所述支架聚合物是葡聚糖。
11.如权利要求10所述的微泡组合物，其中所述葡聚糖包含至少5kDa的平均分子量。
12.如权利要求11所述的微泡组合物，其中所述葡聚糖包含至少10kDa的平均分子量。
13.如权利要求12所述的微泡组合物，其中所述葡聚糖包含介于约20kDa与50kDa之间的平均分子量。
14.如权利要求13所述的微泡组合物，其中所述葡聚糖包含介于约35kDa与45kDa之间的平均分子量，任选地，其中所述平均分子量为约40kDa。
15.如前述权利要求中任一项所述的微泡组合物，其中所述气体核心包含全氟化碳。
16.如权利要求15所述的微泡组合物，其中所述全氟化碳是十氟丁烷。
17.如前述权利要求中任一项所述的微泡组合物，其中所述表面活性剂壳包含脂质。
18.如权利要求17所述的微泡组合物，其中所述脂质是磷脂。
19.如权利要求18所述的微泡组合物，其中所述磷脂包括1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)脂质中的一者或两者。
20.如前述权利要求中任一项所述的微泡组合物，其中所述表面活性剂壳包含聚乙二醇化的分子。
21.如前述权利要求中任一项所述的微泡组合物，其中所述表面活性剂壳包含暴露于所述表面活性剂壳的外表面上的多个反应性基团。
22.如权利要求21所述的微泡组合物，其中所述反应性基团是马来酰亚胺类。
23.如权利要求21或22所述的微泡组合物，其中所述反应性基团通过PEG接头与所述表面活性剂分子连接。
24.如权利要求5-23中任一项所述的微泡组合物，其中所述互连聚合物通过可生物降解的接头偶联至所述微泡，任选地，其中所述可生物降解的接头在溶酶体内部的pH下是可裂解的。
25.如前述权利要求中任一项的微泡组合物，其中每个微泡上的多个精胺分子与多个有效载荷分子缔合。
26.如权利要求25所述的微泡组合物，其中所述有效载荷分子包括蛋白质。
27.如权利要求25所述的微泡组合物，其中所述有效载荷分子包括核酸。
28.如权利要求27所述的微泡组合物，其中所述核酸包括DNA，任选地其中所述DNA是质粒。
29.如权利要求27或28所述的微泡组合物，其中所述微泡装载有至少约30,000个核酸/微泡或至少约0.025μg/μm2的核酸。
30.如前述权利要求中任一项所述的微泡组合物，其中所述微泡还在所述表面活性剂壳的外表面上包含靶向分子，所述靶向分子被配置成结合所述一个或多个细胞。
31.如权利要求30所述的微泡组合物，其中所述靶向分子包括抗体。
32.如前述权利要求中任一项所述的微泡组合物，其中所述微泡组合物的平均微泡尺寸介于约1μm与10μm之间。
33.如权利要求32所述的微泡组合物，其中所述平均微泡尺寸介于约1μm与约5μm之间。
34.如权利要求33所述的微泡组合物，其中所述平均微泡尺寸为约3μm。
35.如前述权利要求中任一项所述的微泡组合物，其中所述多个精胺分子包括多精胺类。
36.如前述权利要求中任一项所述的微泡组合物，其中一种或多种精胺通过可生物降解的接头与另一种精胺或交联聚合物连接，任选地，其中所述可生物降解的接头在溶酶体内部的pH下是可裂解的。
37.如权利要求36所述的微泡组合物，其中所述可生物降解的接头包括胱胺双丙烯酰胺或双丙烯酰胺缩酮。
38.如前述权利要求中任一项所述的微泡组合物，其中至少约5％、10％、15％、20％、25％或50％的所述微泡通过精胺与另一微泡交联。
39.如前述权利要求中任一项所述的微泡组合物，其中不超过约5％、10％、15％、20％、25％或50％的所述微泡通过精胺与另一微泡交联。
40.一种制备用于将有效载荷递送至一个或多个细胞的微泡组合物的方法，所述方法包括将包含精胺分子的溶液与微泡溶液混合，其中每个所述微泡包含被表面活性剂壳包封的气体核心。
41.如权利要求40所述的方法，其中制备微泡组合物的所述方法是用于制备权利要求1-39中任一项的微泡组合物的方法。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述包含精胺分子的溶液包含与聚合物缀合的精胺。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述聚合物是支架聚合物，多个精胺分子共价偶联至所述支架聚合物。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述支架聚合物是线性的。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述支架聚合物是支化的。
46.如权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述支架聚合物是葡聚糖。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述包含精胺分子的溶液由具有至少为5kDa的平均分子量的葡聚糖制成。
48.如据权利要求47所述的方法，其中所述平均分子量至少为10kDa。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述平均分子量介于约20kDa与50kDa之间。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述平均分子量介于约35kDa与45kDa之间。
51.如权利要求40-50中任一项所述的方法，其中所述包含精胺分子的溶液包含多精胺，任选地其中所述多精胺中的多个精胺通过可生物降解的接头连接。
52.如权利要求40-51中任一项所述的方法，其中将所述微泡溶液逐渐添加入到包含精胺分子的溶液中，以允许所述微泡被所述精胺分子饱和。
53.如权利要求52所述的方法，其中在所述混合过程中将所述微泡溶液加入到包含精胺分子的所述溶液中。
54.如权利要求40-51中任一项所述的方法，其中将包含精胺分子的所述溶液逐渐加入到微泡溶液中，以促进所述微泡通过所述精胺分子交联。
55.如权利要求40-55中任一项所述的方法，其中包含精胺分子的所述溶液包含多个第一反应性基团，并且所述微泡溶液包含暴露在所述微泡的表面活性剂壳外表面上的多个第二反应性基团，所述第一和第二反应性基团被配置成将所述精胺分子共价偶联至所述微泡。
56.如权利要求56所述的方法，其中所述第一反应性基团是硫醇，所述第二反应性基团是马来酰亚胺。
57.如权利要求56或57所述的方法，其中包含精胺分子的所述溶液和所述微泡溶液的所述混合物中第一反应性基团与第二反应性基团的摩尔比为至少2:1。
58.如权利要求58所述的方法，其中第一反应性基团与第二反应性基团的所述摩尔比为至少5:1。
59.如权利要求59所述的方法，其中第一反应性基团与第二反应性基团的所述摩尔比为至少10:1。
60.如权利要求60所述的方法，其中第一反应性基团与第二反应性基团的所述摩尔比为至少20:1。
61.如权利要求56-61中任一项所述的方法，其中所述微泡溶液中包含的第二反应性基团分子与表面活性剂分子的摩尔比为约1:20。
62.如权利要求40-62中任一项所述的方法，其中所述微泡溶液包含1x108至1x1010个微泡/mL。
63.如权利要求63所述的方法，其中所述微泡溶液包含大约1.10x109个微泡/mL。
64.如权利要求40-64中任一项所述的方法，所述方法还包括在包含有效载荷分子的溶液中混合。
65.如权利要求65所述的方法，其中在与所述微泡溶液混合之前，将所述有效载荷溶液与包含精胺分子的所述溶液混合。
66.如权利要求65所述的方法，其中在与所述有效载荷溶液混合之前，将包含精胺分子的所述溶液与所述微泡溶液混合。
67.如权利要求65-67中任一项所述的方法，其中将包含微泡的所述溶液逐渐添加到所述有效载荷溶液中，以允许所述微泡被所述有效载荷分子饱和。
68.如权利要求68所述的方法，其中在混合时将包含微泡的所述溶液添加到所述有效载荷溶液中。
69.如权利要求65-69中任一项所述的方法，其中所述有效载荷分子包括蛋白质。
70.如权利要求65-70中任一项所述的方法，其中所述有效载荷分子包括核酸。
71.如权利要求71所述的方法，其中所述核酸包括DNA，任选地，其中所述DNA是质粒。
72.如权利要求71或72所述的方法，其中包含微泡的所述溶液与所述有效载荷溶液的混合物中有效载荷质量与微泡数量的比率为至少1x 10-8μg/微泡、任选至少2x 10-8μg/微泡，和/或其中所述混合物中精胺胺:有效载荷磷酸盐(N:P)比率为约1:1、1:2、1:5或1:10。
73.如权利要求71-73中任一项所述的方法，其中所述方法产生平均具有至少5,000个、至少10,000个、至少20,000个或至少30,000个有效载荷分子/微泡的微泡组合物。
74.如权利要求74所述的方法，其中所述微泡组合物平均具有至少30,000个有效载荷分子/微泡。
75.如权利要求40-75中任一项所述的方法，其中所述方法产生精胺-葡聚糖修饰的微泡组合物，并且其中所述微泡组合物平均包含至少1.0x 10-14g精胺-葡聚糖/微泡。
76.如权利要求40-76中任一项所述的方法，所述方法还包括将包含靶向分子的溶液与包含所述微泡的溶液混合。
77.如权利要求77所述的方法，其中包含靶向分子的所述溶液是与包含精胺分子的所述溶液相同的溶液。
78.如权利要求77所述的方法，其中包含靶向分子的所述溶液是与所述有效载荷溶液相同的溶液。
79.如权利要求77所述的方法，其中将包含靶向分子的所述溶液在包含精胺分子的所述溶液之后加入到所述微泡溶液中。
80.如权利要求77所述的方法，其中将包含靶向分子的所述溶液在包含精胺分子的所述溶液之前加入到所述微泡溶液中。
81.如权利要求77-81中任一项所述的方法，其中所述靶向分子是抗体。
82.一种微泡组合物，其由权利要求40-82中任一项产生。
83.一种使用声致穿孔将有效载荷递送至一个或多个细胞的方法，所述方法包括将所述一个或多个细胞暴露于多个精胺修饰的微泡，然后将所述一个或多个细胞暴露于被配置成对所述一个或多个细胞进行声致穿孔的超声刺激。
84.如权利要求84所述的方法，其中所述超声以约1-2W/cm2递送，任选具有50％占空比(duty cycle)。
85.如权利要求84或85所述的方法，其中所述超声被递送约30至60秒。
86.如权利要求84-86中任一项所述的方法，其中在递送超声刺激之前，将所述细胞暴露于所述微泡至少约10分钟。
87.如权利要求84-87中任一项所述的方法，所述方法还包括在递送被配置成对所述一个或多个细胞进行声致穿孔的所述超声刺激之前使用超声来显现所述微泡，其中用于显现所述微泡的所述超声的强度小于所述超声刺激的强度。
88.如权利要求84-88中任一项所述的方法，其中所述方法是体内方法，将所述一个或多个细胞暴露于所述多个微泡包括向受试者施用包含所述多个微泡的组合物。
89.如权利要求84-88中任一项所述的方法，其中所述方法是体外方法。
90.如权利要求90所述的方法，其中将所述多个微泡以至少约5个、10个、15个、20个、25个或30个微泡/细胞的浓度与所述一个或多个细胞一起孵育。
91.如权利要求91所述的方法，其中将所述多个微泡以约15至约20个微泡/细胞的浓度与所述一个或多个细胞一起孵育。
92.如权利要求90-92中任一项所述的方法，其中将所述多个微泡与所述一个或多个细胞混合在一起。
93.如权利要求84-94中任一项所述的方法，其中所述多个微泡由权利要求1-39或83中任一项的微泡组合物提供。
94.一种试剂盒，其包含本文公开的任何微泡组合物和任选地用于与所述微泡组合物混合的有效载荷分子组合物。
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