CN116507912A - 用于游离硫醇检测的荧光ellman测定 - Google Patents

用于游离硫醇检测的荧光ellman测定 Download PDF

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Abstract

本公开涉及用于检测底物中的游离硫醇的方法和试剂盒以及用于定量底物中游离硫醇的量的方法。特别地，本公开提供了一种用于提高游离硫醇检测和定量的灵敏度的荧光Ellman测定。

Description

用于游离硫醇检测的荧光ELLMAN测定
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月28日提交的美国临时专利申请号63/106,569的优先权，该美国临时专利申请的内容全文以引用方式并入，并且要求其优先权。
技术领域
本公开涉及用于检测硫醇的方法。具体地，本公开提供了将传统Ellman方法增强为荧光Ellman方法，以提高游离硫醇检测的灵敏度。
背景技术
低分子量硫醇(诸如半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽)的水平通常对氧化还原信号传导和维持氧化还原稳态至关重要。这些硫醇(特别是同型半胱氨酸)的失衡与癌症、阿尔茨海默病和心血管疾病等疾病有关。氧化应激和衰老的迹象还可以表现为介于游离硫醇与其他硫醇形式(半胱氨酸化、谷胱甘肽化、次磺酸等)之间的在低分子量硫醇底物以及人血清白蛋白等蛋白质上的扭曲分布。游离硫醇或反应性巯基的定量方法是研究生物学和医学的关键分析工具。游离硫醇定量方法可用于高通量筛选新的乙酰转移酶抑制剂，乙酰转移酶是参与主要代谢途径和表观遗传调控的重要酶类。游离硫醇定量方法也已应用于在生物制药行业中监测蛋白质产品质量，在生物制药行业中游离硫醇有时被工程改造到蛋白质中以生产用于治疗或诊断目的的生物缀合物，或者游离硫醇无意中表现为不期望的翻译后修饰并被视为潜在关键质量属性。
在可用的定量方法中，使用了用于游离硫醇的光学传感方法，并开发了一大家族用于硫醇传感的光学探针。然而，用于硫醇传感的荧光性探针的一个共同的缺点是它们的灵敏度可能取决于硫醇底物。因此，用于硫醇传感的荧光性探针通常需要使用与测试品中底物相同的标准品进行校准，或者需要确定适当的响应因子。荧光性探针的其他缺点是它们可能在空间上体积庞大，并且通常在水中具有有限的溶解度。在另一方面，Ellman试剂、或5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、用于游离硫醇传感的经典光学探针，恰好是高度水溶性的，体积不大，并且其灵敏度与硫醇底物无关。Ellman方法的主要缺点是其定量限明显高于(3-4个数量级)大多数游离硫醇荧光性定量方法。这可能意味着为了获得定量的游离硫醇测量需要大量的样品(例如治疗性抗体的毫克数)，这是不切实际的，并且有时还非常昂贵。
发明内容
在某些实施方案中，本公开涉及用于检测游离硫醇的方法，其包括：a)使硫醇底物与5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)接触以化学计量地释放TNB2-；b)将释放的TNB2-与试剂接触以产生荧光信号，该试剂与释放的TNB2-相互作用；以及c)检测通过释放的TNB2-与试剂的相互作用发射的荧光信号，从而检测游离硫醇。在某些实施方案中，在本方法的上下文中使用的试剂为荧光性探针。在某些实施方案中，在本方法的上下文中使用的试剂为荧光探针。在某些实施方案中，将TNB2-分子与荧光性探针或荧光探针一起孵育使得形成荧光TNB-探针加合物或脱保护荧光探针和非荧光TNB加合物。在某些实施方案中，荧光信号由荧光TNB-探针加合物发射。在某些实施方案中，荧光信号由脱保护荧光探针发射。在某些实施方案中，荧光性探针或荧光探针为硫醇特异性探针。在某些实施方案中，硫醇特异性探针含有马来酰亚胺官能团。在某些实施方案中，硫醇特异性探针含有2,4-二硝基苯磺酰胺(DNBS)官能团。在某些实施方案中，荧光性探针为甲基马来酰亚胺基-苯并色烯-甲酸甲酯(MMBC)。在某些实施方案中，荧光性探针为ThioFluor 623。
在本文所述的游离硫醇检测方法的某些实施方案中，硫醇存在于低分子量硫醇底物上。在某些实施方案中，硫醇存在于高分子量硫醇底物上。在某些实施方案中，高分子量硫醇底物为多肽。在某些实施方案中，多肽为抗体。在某些实施方案中，抗体为IgG2。在某些实施方案中，抗体为双特异性抗体的一半。在某些实施方案中，高分子量硫醇底物为抗体-药物-缀合物(ADC)。
在某些实施方案中，本公开涉及用于确定硫醇底物的游离硫醇含量的方法，包括：a)使硫醇底物与5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)接触以化学计量地释放TNB2-；b)将TNB2-与试剂一起孵育以产生荧光信号，该试剂与释放的TNB2-相互作用；c)检测通过释放的TNB2-与试剂的相互作用发射的荧光信号，和d)通过将c)中检测到的信号与已知量的参考信号进行比较来定量分子的游离硫醇含量。
在本文所述的游离硫醇检测方法的某些实施方案中，试剂为荧光性探针。在某些实施方案中，试剂为荧光探针。在某些实施方案中，硫醇存在于高分子量硫醇底物上。在某些实施方案中，高分子量硫醇底物为多肽。在某些实施方案中，高分子量硫醇底物为抗体-药物缀合物。在某些实施方案中，多肽为抗体。在某些实施方案中，抗体为IgG2。在某些实施方案中，抗体为双特异性抗体的一半。在某些实施方案中，抗体为双特异性抗体。
在本文所述的游离硫醇检测方法的某些实施方案中，TNB2-与荧光性探针或荧光探针的孵育使得形成荧光TNB-探针加合物或脱保护荧光探针和非荧光TNB加合物。在某些实施方案中，荧光信号由荧光TNB-探针加合物发射。在某些实施方案中，荧光信号由脱保护荧光探针发射。在某些实施方案中，荧光性探针或荧光探针为硫醇特异性探针。在某些实施方案中，硫醇特异性探针含有马来酰亚胺官能团。在某些实施方案中，硫醇特异性探针含有2,4-二硝基苯磺酰胺(DNBS)官能团。在某些实施方案中，荧光性探针为马来酰亚胺基苯并色烯-甲酸甲酯(MMBC)。在某些实施方案中，荧光性探针为ThioFluor 623。
在本文所述的游离硫醇检测方法的某些实施方案中，通过将荧光信号与校准曲线进行比较以确定硫醇浓度并且通过将硫醇浓度除以硫醇底物的浓度来计算游离硫醇含量。
在某些实施方案中，本公开涉及用于硫醇化合物的检测的试剂盒，其包括：a)5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)；以及b)荧光性探针或荧光探针。在某些实施方案中，试剂盒包括用于生成校准曲线的含硫醇标准品。在某些实施方案中，含硫醇标准品选自半胱氨酸、谷胱甘肽和N-乙酰化半胱氨酸。在某些实施方案中，荧光性探针或荧光探针为硫醇特异性荧光性探针。在某些实施方案中，荧光性探针为马来酰亚胺基苯并色烯-甲酸甲酯(MMBC)。在某些实施方案中，硫醇特异性荧光性探针或荧光探针含有马来酰亚胺官能团。在某些实施方案中，硫醇特异性荧光性探针或荧光探针含有2,4-二硝基苯磺酰胺(DNBS)官能团。在某些实施方案中，荧光性探针为ThioFluor 623。在某些实施方案中，本公开的试剂盒包括变性缓冲液。在某些实施方案中，变性缓冲液是含有盐酸胍的3-(N-吗啉代)丙磺酸半钠(MOPS)缓冲液。
附图说明
图1描绘了用于荧光Ellman(“F.Ellman”)测定的示意图。硫醇底物与DTNB的孵育(步骤I)化学计量地释放TNB2-分子，该分子随后与硫醇特异性荧光性探针反应(步骤II)以产生荧光信号。这些荧光性反应通过形成荧光TNB-探针加合物(IIA)或通过产生脱保护荧光探针(IIB)来进行。
图2描绘了TNB2-和MMBC生成荧光TNB-MMBC加合物(精确的质量：578.0637Da，预期结构在最右侧)的反应示意图，遵循图1(IIA)所示的路径。
图3描绘了荧光TNB-MMBC加合物的发射光谱和激发光谱。(A)激发波长固定到385nm的发射光谱和(B)发射波长固定到510nm的激发光谱。
图4描绘了具有A)214nm紫外检测和B)375nm/510nm荧光检测的起始试剂(TNB、MMBC)和TNB-MMBC加合物的反相色谱图。带星号的峰表示与TNB或MMBC起始材料相关的杂质。C)较早洗脱和D)较晚洗脱TNB-MMBC加合物峰的质谱。
图5描绘了使用F.Ellman测定的半胱氨酸标准品随时间(MMBC试剂在0时引入)变化的荧光光谱。
图6描绘了在A)天然条件和B)变性条件下使用半胱氨酸(cys)、N-乙酰化半胱氨酸(NAC)和谷胱甘肽(gsh)的F.Ellman校准曲线。引入MMBC试剂30分钟后取荧光读数。两个图中的不可知底物的线性回归(趋势线)均基于所有绘制的数据点。
图7描述了在F.Ellman(变性)与NcHM标记RPLC测定(一种用于抗体的总游离硫醇定量的正交方法)之间的桥接数据集。F.Ellman的中间精确度是用具有代表一个标准偏差的误差条的前七个分子(IgG1-A/B/C/D/E、IgG4-A、双特异性IgG)确定的。F.Ellman变异系数对于每一个中间精确度的分子都<8％。
图8描绘了TNB2-和ThioFluor 623以按照图1(IIB)中所示的路径生产脱保护的荧光ThioFluor 623的反应示意图。
图9描绘了与TNB2-反应30分钟后MMBC(空心圆，左y轴)与ThioFluor 623(实心圆，右y轴)的灵敏度。需注意，由此产生的MMBC荧光强度是ThioFluor 623荧光强度的大约40倍。
图10描述了在4M盐酸胍存在下，将磷酸盐与MOPS缓冲液的缓冲能力进行比较的酸碱滴定图(磷酸盐缓冲液：100mM磷酸盐、4M盐酸胍、1mM EDTA，pH 7.4；MOPS缓冲液：100mMMOPS，4M盐酸胍，1mM EDTA，pH 7.4)。用1N HCl进行酸滴定，并且用1N NaOH进行碱滴定。
具体实施方式
以下详细描述可以结合附图来理解，该详细描述以示例的方式给出，但不旨在将当前公开的主题限制为所描述的特定实施方案。
本公开的主题提供了检测硫醇的方法，包括：a)使硫醇底物与5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)接触以化学计量地释放TNB2-；b)使释放的TNB2-与试剂接触以产生荧光信号，该试剂与释放的TNB2-相互作用以及c)检测通过释放的TNB2-与试剂的相互作用发射的荧光信号，从而检测游离硫醇。本公开的主题还提供了定量硫醇底物的游离硫醇含量的方法，该方法包括：a)使硫醇底物与5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)接触以化学计量地释放TNB2-；b)将TNB2-与试剂一起孵育以产生荧光信号，该试剂与释放的TNB2-相互作用；c)检测通过释放的TNB2-与试剂的相互作用发射的荧光信号；以及d)通过将c)中检测到的信号与已知量的参考信号进行比较来定量分子的游离硫醇含量。本公开的主题还提供了用于检测硫醇化合物的试剂盒，其包括：a)5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)；以及b)荧光性探针或荧光探针。
本公开的主题至少部分基于以下发现：通过在Ellman方法末尾添加具有荧光性探针马来酰亚胺基苯并色烯-甲酸甲酯(MMBC)的孵育步骤，有效地将紫外(UV)吸收信号转换为荧光信号，并将Ellman方法的定量限提高了大约4倍，即使由于MMBC添加而稀释了2倍。
本说明书和示例描述了本公开的主题的非限制性实施方案。
1.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学术语旨在具有本公开所属领域的技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为清晰起见和/或为便于参考，本文定义了具有通常理解含义的术语，并且与现有技术中通常理解的术语定义相比，本文包含的这些定义不一定解释成表示与本领域的通常理解存在明显差异。
本文所使用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“具备”、“可以”，“含有”及其变体旨在是开放式的过渡性短语、术语或词语，并不排除附加行为或结构的可能性。除非另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”及“该/所述”包括复数个指代物。本公开还考虑其他实施方案“包括”本文所提出的实施方案或元件、“由其构成”和“基本上由其构成”，无论是否明确提出。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指在如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述可接受误差范围将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，按照本领域中的实践，“约”可以意谓3个或多于3个标准偏差。另选地，“约”可以表示给定值的至多20％，优选地至多10％，更优选地至多5％，并且更优选地至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指在某一值的某一数量级内，优选地在5倍以内，更优选地在2倍以内。
如本文所用，“多肽”通常是指具有超过约十个氨基酸的肽和蛋白质。多肽可以与宿主细胞同源或优选地可以是外源性的，这意味着对于所利用的宿主细胞而言，这些多肽是异源的，即，是外来的，诸如中国仓鼠卵巢细胞产生的人蛋白质、或由哺乳动物细胞产生的酵母多肽。在某些实施方案中，使用哺乳动物多肽(最初源自哺乳动物生物体的多肽)，更优选那些直接分泌到培养基中的多肽。
术语“蛋白质”意为其链长足以产生更高水平的三级和/或四级结构的氨基酸序列。这是为了与“肽”或其他不具有此类结构的小分子量药物区分开。通常，本文的蛋白质将具有至少约15至20kD的分子量，优选至少约20kD。本文定义中涵盖的蛋白质的示例包括所有哺乳动物蛋白质，特别是治疗性蛋白质和诊断性蛋白质，诸如治疗性抗体和诊断性抗体，并且一般是含有一个或多个二硫键的蛋白质，包括包含一个或多个链间和/或链内二硫键的多链多肽。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体(例如，由单个重链序列和单个轻链序列组成的抗体，包括此类配对的多聚体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
2.方法
本公开的主题提供了用于检测硫醇的方法。在某些实施方案中，该方法包括：a)使硫醇底物与5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)接触以化学计量地释放TNB2-；b)使释放的TNB2-与试剂接触以产生荧光信号，该试剂与释放的TNB2-相互作用；以及c)检测通过释放的TNB2-与试剂的相互作用发射的荧光信号，从而检测游离硫醇。
本公开的主题还提供了定量硫醇底物的游离硫醇含量的方法，该方法包括：a)使硫醇底物与5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)接触以化学计量地释放TNB2-；b)将TNB2-与试剂一起孵育以产生荧光信号，该试剂与释放的TNB2-相互作用；c)检测通过释放的TNB2-与试剂的相互作用发射的荧光信号；以及d)通过将c)中检测到的信号与已知量的参考信号进行比较来定量分子的游离硫醇含量。
在某些实施方案中，试剂为荧光性探针。在某些实施方案中，试剂为荧光探针。在某些实施方案中，TNB2-分子与荧光性探针或荧光探针的孵育使得形成：a)荧光TNB-探针加合物；或b)脱保护荧光探针和非荧光TNB加合物。在某些实施方案中，荧光信号由荧光TNB-探针加合物发射。在某些实施方案中，荧光信号由脱保护荧光探针发射。在某些实施方案中，荧光性探针或荧光探针为硫醇特异性探针。在某些实施方案中，硫醇特异性探针含有马来酰亚胺官能团。在某些实施方案中，硫醇特异性探针含有2,4-二硝基苯磺酰胺(DNBS)官能团。在某些实施方案中，荧光性探针为马来酰亚胺基苯并色烯-甲酸甲酯(MMBC)。在某些实施方案中，荧光性探针为ThioFluor 623。在某些实施方案中，硫醇存在于低分子量硫醇底物上。在某些实施方案中，硫醇存在于高分子量硫醇底物上。在某些实施方案中，高分子量硫醇底物为多肽。在某些实施方案中，其中多肽为抗体。在某些实施方案中，抗体为IgG2。在某些实施方案中，抗体为双特异性抗体的一半。在某些实施方案中，高分子量硫醇底物为抗体-药物-缀合物(ADC)。在某些实施方案中，通过将荧光信号与校准曲线进行比较以确定硫醇浓度并且通过将硫醇浓度除以硫醇底物的浓度来计算游离硫醇含量。
3.试剂盒
本公开的主题提供了用于检测硫醇化合物的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包括5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和荧光性探针或荧光探针。在某些实施方案中，试剂盒包括无菌容器；此类容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、囊、泡罩包装或本领域中已知的其他合适的容器形式。此类容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适合盛放药物的其他材料制成。在某些实施方案中，试剂盒包括用于生成校准曲线的含硫醇标准品。在某些实施方案中，含硫醇标准品选自半胱氨酸、谷胱甘肽和N-乙酰化半胱氨酸。在某些实施方案中，荧光性探针或荧光探针为硫醇特异性荧光性探针。在某些实施方案中，荧光性探针为马来酰亚胺基苯并色烯-甲酸甲酯(MMBC)。在某些实施方案中，硫醇特异性荧光性探针或荧光探针含有马来酰亚胺官能团。在某些实施方案中，硫醇特异性荧光性探针或荧光探针含有2,4-二硝基苯磺酰胺(DNBS)官能团。在某些实施方案中，荧光性探针为ThioFluor 623。在某些实施方案中，试剂盒包括变性缓冲液。在某些实施方案中，变性缓冲液是含有盐酸胍的3-(N-吗啉代)丙磺酸半钠(MOPS)缓冲液。
4.本公开的示例性实施方案
在某些实施方案中，本公开涉及用于检测游离硫醇的方法，其包括：a)使硫醇底物与5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)接触以化学计量地释放TNB2-；b)将释放的TNB2-与试剂接触以产生荧光信号，该试剂与释放的TNB2-相互作用；以及c)检测通过释放的TNB2-与试剂的相互作用发射的荧光信号，从而检测游离硫醇。在某些实施方案中，在本方法的上下文中使用的试剂为荧光性探针。在某些实施方案中，在本方法的上下文中使用的试剂为荧光探针。在某些实施方案中，将TNB2-分子与荧光性探针或荧光探针一起孵育使得形成荧光TNB-探针加合物或脱保护荧光探针和非荧光TNB加合物。在某些实施方案中，荧光信号由荧光TNB-探针加合物发射。在某些实施方案中，荧光信号由脱保护荧光探针发射。在某些实施方案中，荧光性探针或荧光探针为硫醇特异性探针。在某些实施方案中，硫醇特异性探针含有马来酰亚胺官能团。在某些实施方案中，硫醇特异性探针含有2,4-二硝基苯磺酰胺(DNBS)官能团。在某些实施方案中，荧光性探针为甲基马来酰亚胺基-苯并色烯-甲酸甲酯(MMBC)。在某些实施方案中，荧光性探针为ThioFluor 623。
在本文所述的游离硫醇检测方法的某些实施方案中，硫醇存在于低分子量硫醇底物上。在某些实施方案中，硫醇存在于高分子量硫醇底物上。在某些实施方案中，高分子量硫醇底物为多肽。在某些实施方案中，多肽为抗体。在某些实施方案中，抗体为IgG2。在某些实施方案中，抗体为双特异性抗体的一半。在某些实施方案中，高分子量硫醇底物为抗体-药物-缀合物(ADC)。
在某些实施方案中，本公开涉及用于确定硫醇底物的游离硫醇含量的方法，包括：a)使硫醇底物与5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)接触以化学计量地释放TNB2-；b)将TNB2-与试剂一起孵育以产生荧光信号，该试剂与释放的TNB2-相互作用；c)检测通过释放的TNB2-与试剂的相互作用发射的荧光信号，和d)通过将c)中检测到的信号与已知量的参考信号进行比较来定量分子的游离硫醇含量。
在本文所述的游离硫醇检测方法的某些实施方案中，试剂为荧光性探针。在某些实施方案中，试剂为荧光探针。在某些实施方案中，硫醇存在于高分子量硫醇底物上。在某些实施方案中，高分子量硫醇底物为多肽。在某些实施方案中，高分子量硫醇底物为抗体-药物缀合物。在某些实施方案中，多肽为抗体。在某些实施方案中，抗体为IgG2。在某些实施方案中，抗体为双特异性抗体的一半。在某些实施方案中，抗体为双特异性抗体。
在本文所述的游离硫醇检测方法的某些实施方案中，TNB2-与荧光性探针或荧光探针的孵育使得形成荧光TNB-探针加合物或脱保护荧光探针和非荧光TNB加合物。在某些实施方案中，荧光信号由荧光TNB-探针加合物发射。在某些实施方案中，荧光信号由脱保护荧光探针发射。在某些实施方案中，荧光性探针或荧光探针为硫醇特异性探针。在某些实施方案中，硫醇特异性探针含有马来酰亚胺官能团。在某些实施方案中，硫醇特异性探针含有2,4-二硝基苯磺酰胺(DNBS)官能团。在某些实施方案中，荧光性探针为马来酰亚胺基苯并色烯-甲酸甲酯(MMBC)。在某些实施方案中，荧光性探针为ThioFluor 623。
在本文所述的游离硫醇检测方法的某些实施方案中，通过将荧光信号与校准曲线进行比较以确定硫醇浓度并且通过将硫醇浓度除以硫醇底物的浓度来计算游离硫醇含量。
在某些实施方案中，本公开涉及用于硫醇化合物的检测的试剂盒，其包括：a)5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)；以及b)荧光性探针或荧光探针。在某些实施方案中，试剂盒包括用于生成校准曲线的含硫醇标准品。在某些实施方案中，含硫醇标准品选自半胱氨酸、谷胱甘肽和N-乙酰化半胱氨酸。在某些实施方案中，荧光性探针或荧光探针为硫醇特异性荧光性探针。在某些实施方案中，荧光性探针为马来酰亚胺基苯并色烯-甲酸甲酯(MMBC)。在某些实施方案中，硫醇特异性荧光性探针或荧光探针含有马来酰亚胺官能团。在某些实施方案中，硫醇特异性荧光性探针或荧光探针含有2,4-二硝基苯磺酰胺(DNBS)官能团。在某些实施方案中，荧光性探针为ThioFluor 623。在某些实施方案中，本公开的试剂盒包括变性缓冲液。在某些实施方案中，变性缓冲液是半钠3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液。
实例
实例1：材料和方法
材料
测试的所有抗体和抗体-药物-缀合物(ADC)均由Genentech(基因泰克公司)(South San Francisco,CA)生产。测试的两种ADC包括一种与还原链间二硫化物缀合的药物(ADC-A)和另一种与工程化未配对半胱氨酸缀合的药物(ADC-B)。DTNB、半胱氨酸、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、二甲基亚砜(DMSO)、磷酸钠、3-(N-吗啉代)丙磺酸半钠(MOPS)和乙二胺四乙酸(EDTA)均购自购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。盐酸胍购自EMD Millipore(Burlington,MA)。TNB2-购自Biovision(Milpitas,CA)。MMBC(马来酰亚胺基苯并色烯-甲酸甲酯)购自Combi-Blocks(San Diego,CA)；1mM的MMBC储备液在DMSO中制备，并在-20℃下冷冻保存直至使用。MMBC的工作溶液(20μM)是通过用100mM磷酸钠(pH 7.4)稀释1mM储备液制备的。其他测试的探针购自表1中列出的供应商。使用的其他消耗品和设备包括来自Corning(Corning,NY)的NBS 96孔半体积黑板和96孔半体积透明底板、来自Agilent(SantaClara,CA)的Poroshell 120-C18反相柱(2.7μm粒径，3.0x 100mm)和1290UHPLC、来自Thermo Scientific(Waltham,MA)的Nanodrop 2000和Fusion混合质谱仪、SpectraMax i3酶标仪(San Jose,CA)、和Mettler-Toledo InLab超微量pH计(Columbus,OH)。
表1.测试的荧光探针/荧光性探针列表
筛选荧光性探针和荧光探针
评估了包括MMBC在内的七种荧光探针或荧光性探针(表1)其将TNB2-转变成荧光信号的能力(图1，步骤II)。简而言之，探针根据其制造商的建议与各种浓度的TNB2-(范围为0–2μM)(其由溶解在水中的TNB2-粉末直接制备)反应。使用制造商推荐的激发/发射波长对(表1)，在45分钟内监测荧光。
TNB-MMBC加合物的表征
为了验证所得TNB-MMBC加合物的性质，确定了TNB-MMBC加合物的发射光谱和激发光谱。将10μM TNB2-标准品用20μM MMBC溶液1:1稀释，并在室温下在黑暗中孵育30分钟，然后使用酶标仪进行读数。测试了一系列从425nm到600nm的发射波长，同时将激发固定在荧光探针制造商推荐值385nm处(图3)。最大荧光强度是通过监测在510nm处的发射来实现的，因此随后测试了一系列从325nm到475nm的激发波长，本次将发射固定在510nm处。通过在375nm处激发实现最大荧光强度。
使用LC-MS进一步质询了TNB-MMBC加合物的结构。将10μM TNB2-标准品和20μMMMBC溶液的等体积混合物(均在20mM磷酸钠、pH 7.4中制备)在室温下在黑暗中孵育30分钟。在注入用10％溶剂B预平衡的Poroshell 120EC-C18反相色谱柱之前，通过将10％的甲酸酸化至1％甲酸的最终浓度来淬灭反应(流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸的乙腈溶液)。保持初始条件2分钟后，用从10％至60％溶剂B的梯度分离5分钟，使起始试剂和反应产物分离。将LC洗脱液与荧光检测器以及配有电喷雾源(轨道阱Fusion)的Thermo质谱仪联用。值得注意的是，质谱仪参数包括3700V的喷雾电压、325℃的离子转移温度、60K的轨道阱(Orbitrap)分辨率和1e5计数的AGC目标。
传统的Ellman方法
分别在天然条件(111mM MOPS，1mM EDTA，pH 7.25)或变性条件(天然条件+4M盐酸胍)中制备半胱氨酸标准品(范围从0到40μM)和蛋白质样品(以20μM的游离硫醇浓度为目标)。使用Nanodrop(用匹配基质使分光光度计空白)和相应蛋白质的消光系数测量样品蛋白质浓度。然后将样品和标准品与0.58mM DTNB在室温下避光孵育60分钟。将一百微升的每种样品和标准品以三重复的方式转移到Corning 96孔半体积透明底板中。在Spectramaxi3酶标仪上获取在412nm处的吸光度读数。每个蛋白质样品中的硫醇浓度是通过参考其吸光度读数与使用半胱氨酸标准品得出的校准曲线(线性)来确定的。基于摩尔每摩尔计的游离硫醇含量可以通过将样品硫醇浓度除以通过Nanodrop确定的样品蛋白质浓度来计算。在此过程中，尽可能使用多通道移液。
荧光Ellman方法
分别在天然条件(111mM MOPS，1mM EDTA，pH 7.25)或变性条件(天然条件+4M盐酸胍)中制备半胱氨酸标准品(范围从0到10μM)和蛋白质样品(以5μM的游离硫醇浓度为目标)。使用Nanodrop(用匹配矩阵空白分光光度计)和相应蛋白质的消光系数测量蛋白质浓度。然后将样品和标准品与0.58mM DTNB在室温下避光孵育60分钟。将五十微升的每个样品和标准品一式三份转移到Corning NBS 96孔半体积黑色板中，其中目标孔包含20μM MMBC溶液的50μL。通过移液管的插入实现混合。荧光读数(发射波长：375nm，激发波长：510nm)在Spectramax i3酶标仪上采集。每个蛋白质样品中的硫醇浓度是通过参考其荧光读数与使用半胱氨酸标准得出的校准曲线(线性)来确定的。基于摩尔每摩尔计的游离硫醇含量，可以通过将样品硫醇浓度除以通过Nanodrop2000确定的样品蛋白质浓度来计算。在此过程中，尽可能使用多通道移液。
方法属性的评定
通过使用F.Ellman方法以生成校准曲线(0–10μM半胱氨酸)和测量0μM半胱氨酸标准品(即空白)的8个重复(单独的样品制备)来确定定量限和检测限。为了进行比较，使用传统Ellman方法生成校准曲线(0–40μM半胱氨酸)和测量0μM半胱氨酸标准品的8个重复。使用以下数学关系计算F.Ellman或传统Ellman方法的检测限(LOD)和定量限(LOQ)：
其中σh是8次空白测量的标准偏差，以及m是半胱氨酸校准曲线的斜率。
接下来评估F.Ellman方法对不同硫醇底物的敏感性。使用半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或谷胱甘肽作为硫醇底物，使用F.Ellman方法生成范围为0–10μM的校准曲线。该实验是在天然和变性条件下进行的。
为了评估方法准确性，在变性条件下使用F.Ellman方法确定11种分子(包括7种IgG1抗体、2种IgG4抗体、1种双特异性抗体和1种抗体Fab片段)上的游离硫醇含量。将F.Ellman结果与使用先前描述的NcHM标记的反相液相色谱测定所确定的相同的11个分子的游离硫醇值进行比较(Wei,B等人Development of a Rapid Reversed-Phase LiquidChromatographic Method for Total Free Thiol Quantitation in Protein Therapeutics.J.Pharm.Biomed.Anal.2020,No.June,113434)。选择后一种测定作为合适的对照，因为它依赖于与F.Ellman方法正交的游离硫醇检测机制(即使用NcHM的游离硫醇的衍生化跟随着由于NcHM疏水性而具有增强的选择性的反相分离和紫外吸收峰检测)。F.Ellman在简化样品组(11种分子中的7种)上的中间精确度由两名不同的分析人员在不同的日期，使用不同的试剂进行确定。
在4M盐酸胍存在下磷酸盐缓冲液的缓冲能力与MOPS缓冲液的缓冲
能力比较
用1N盐酸(一次10μL，最多40μL)分别对变性的MOPS缓冲液(100mM MOPS、4M盐酸胍、1mM EDTA，pH 7.4)和变性的磷酸盐缓冲液(100mM磷酸钠、4M盐酸胍、1mM EDTA，pH 7.4)的一mL等分试样进行酸滴定。用1N氢氧化钠(每次10μL，最多40μL)分别对相同的MOPS缓冲液和磷酸盐缓冲液的单独的1mL等分试样进行滴定。每次添加酸/碱滴定剂后，使用微型pH计进行pH测量。
实例2：荧光Ellman测定
结果
在本公开中描述了对于Ellman方法的增强，称为F.Ellman测定。在Ellman方法末尾添加具有荧光性探针(例如，马来酰亚胺基苯并色烯甲酸甲酯(MMBC))或的荧光探针的孵育步骤有效地将紫外吸收信号转换为荧光信号，并将Ellman方法的定量限提高了大约4倍，即使由于MMBC添加而稀释了2倍。F.Ellman测定的准确性和一般有效性在其对各种低分子量硫醇底物(即半胱氨酸、N-乙酰化半胱氨酸、谷胱甘肽)以及几种复杂的高分子量硫醇底物(诸如单克隆抗体)的应用中得到证明。
该测定的示例性2步骤反应示意图在图1示出。在第一步骤(图1，步骤I)中，样品中的游离硫醇与DTNB交换，以化学计量地产生TNB2-(如在传统的Ellman方法中)。在第二步骤(图1，步骤II)中，引入了硫醇特异性荧光性探针，其与TNB2-反应以通过形成荧光TNB-探针加合物(图1，步骤IIA)或通过释放脱保护荧光探针(图1，步骤IIB)来产生荧光信号。为了开发可行的F.Ellman测定，筛选了可商购的硫醇特异性荧光性探针。证明了F.Ellman方法的可行性，评定了将紫外吸收信号转换为荧光信号所获得的灵敏度的提高，并通过确定复杂治疗性抗体样品中的游离硫醇含量评估了该方法的有效性。
用TNB2-测试了七种可商购的硫醇特异性荧光探针/荧光性探针，以证实F.Ellman测定的可行性。其中这些探针中的五种未能产生任何剂量依赖性荧光。两种荧光性探针(ThioFluor 623和MMBC)成功地对TNB2-产生了剂量依赖性荧光，证明了概念的验证(图9)。在这两种探针中，MMBC(也称为ThioGlo-1)产生了大约40倍的更多信号，并被选为用于进一步开发的探针。
TNB2-与MMBC之间的反应产生了一种产物，该产物在375nm/510nm(图3)的激发和发射对处发出荧光。图2显示了基于硫醇(TNB2-)对马来酰亚胺(MMBC)的亲核攻击的可能反应产物。与荧光检测和质谱联用的反相液相色谱用于监测反应并确认该反应产物。TNB2-和MMBC起始材料都不具有明显的荧光，但结合TNB2-和MMBC经由反相分离产生两个强荧光色谱峰(图4B)。对应于两个荧光峰的质量相同，将两个峰作为异构体连接，并且该质量(579.0706m/z，MH+，图4C)与提出的TNB-MMBC加合物一致，在理论质量(579.0710m/z，MH+)的1ppm之内。荧光峰的后期保留时间也与TNB-MMBC加合物一致，这可能比TNB2-或MMBC起始材料更具疏水性。
图5显示了当将F.Ellman测定应用于一组半胱氨酸标准品时荧光发射随时间的变化(在图1中的步骤II中)。F.Ellman测定给出了响应于硫醇底物的剂量依赖性荧光信号，并且荧光读数在引入MMBC后30分钟开始稳定，因为此时反应完成。通过选择30分钟时间点作为终点读数，构建了将半胱氨酸浓度与荧光相关的线性校准曲线(图6)。该校准曲线的斜率与空白测量的变化(即噪声)一起产生0.4μM半胱氨酸的定量限(LOQ)，与我们目前的传统Ellman方法的LOQ(1.6μM半胱氨酸)相比，提高了4倍(表2)。
表2.F.Ellman与传统Ellman的检测限和定量限
荧光Ellman 传统Ellman
LOD(μM SH) 0.14 0.55
LOQ(μM SH) 0.42 1.67
如图6所示，用使用其他硫醇底物(即谷胱甘肽和N-乙酰化半胱氨酸)的F.Ellman测定可以生成可比较的校准曲线。在为这些其他硫醇底物引入MMBC后的30分钟，荧光读数稳定，这表明与DTNB的硫醇交换反应(图1中的步骤II)已完成，并且MMBC在所有情况下都与TNB2-反应。鉴于F.Ellman测定对不同硫醇底物的相似敏感性和F.Ellman测定的提出的机制，假设测定如所述进行，无论底物的性质如何，0.4μM的F.Ellman测定LOQ都可以普及到所有硫醇。此外，F.Ellman测定在天然和变性条件下的表现相似(图6)。在表现三级结构的样品(诸如蛋白质样品)中，F.Ellman测定可以用于选择性地质询在天然折叠底物中溶剂可及的游离硫醇，或者质询总游离硫醇(包埋的+溶剂可及的)。
使用一组基于抗体的蛋白质(在变性条件下)来评定F.Ellman测定的测定准确性和精确度，并且其基于摩尔每摩尔计的总(包埋的+溶剂可及的)游离硫醇示于图7。这些蛋白质样品的荧光读数在引入MMBC探针后30分钟也保持稳定。F.Ellman测定的中间精确度使用简化组(11种蛋白质中的7种)进行了证明，并且变异系数均<8％(图7)。使用正交NcHM标记的反相色谱测定对整组蛋白质进行了质询，并且总游离硫醇值与F.Ellman测定结果一致(图7)，表明这两种方法的测量准确性相当，尽管它们的检测模式有显著差异。
与传统Ellman类似，F.Ellman测定能够确定色谱上具有挑战性的分子(表3)(其中可以包括ADC和IgG2分子)的游离硫醇含量。ADC具有缀合疏水性药物，由于显著的非特异性相互作用，该缀合疏水性药物通常会阻止反相分离，而IgG2含有二硫键同等型，其导致反相分离上的多个峰且使分析复杂化。两种类型的样品都适合通过F.Ellman测定进行分析，但不适合通过NcHM标记的反相色谱测定进行分析。表3显示了使用变性F.Ellman测定的色谱上具有挑战性的分子的游离硫醇值。色谱上具有挑战性的分子可以包括：抗体-药物缀合物(ADC)，其含有通常由于非特异性相互作用而阻止反相分离的缀合疏水性药物；以及IgG2分子，其含有导致反相分离上的多个峰且使分析复杂化的二硫键同等型。
表3.
分子 SH:蛋白质
ADC-A 0.39
ADC-B 0.29
IgG2-A 0.61
讨论
虽然F.Ellman测定是传统Ellman方法在概念上的简单增强，但鉴于TNB2-的特性，它是否可以实际实施是完全不可预测的。吸电子官能团和电子离域-这使DTNB具有异常低的键解离能(Oae,S.Organic Sulfur Chemistry:Structure and Mechanism,1st Ed.；Doi,J.,Ed.；CRC press:Boca Raton,FL,1992)并使其非常适合作为硫醇交换剂-也使TNB2-成为弱亲核试剂。此外，TNB2-的吸电子官能团和电子离域可能通过各种机制(包括光诱导电子转移、内部电荷转移等)潜在地猝灭缀合的TNB-荧光性探针的荧光(Chen,X等人,Chem.Soc.Rev.2010,39(6),2120–2135；Escudero,D.Acc.Chem.Res.2016,49(9),1816–1824；Daly,B.等人,Chem.Soc.Rev.2015,44(13),4203–4211)。因此，所测试的七种探针中的五种未能对TNB2-产生合适的剂量依赖性反应也就不足为奇了。然而，本文概述的结果表明TNB2-可以在荧光性探针ThioFluor 623或MMBC的帮助下转化为荧光信号(图9)。
ThioFluor 623是一种带有2,4-二硝基苯磺酰胺(DNBS)官能团的荧光性化合物，并且其荧光取决于通过硫醇底物的该DNBS基团的释放(图8)。脱保护的ThioFluor 623在水性介质中以0.01的量子产率发出适度的荧光(Bouffard,J.等人,Org.Lett.2008,10(1),37–40)。选择性地与苯硫酚反应的替代性含DNBS荧光性探针是已知的，并且可用于相比ThioFluor623具有显著更好的量子产率的即时策略(Wang,Z.等人,Anal.Chem.2012,84(11),4915–4920；Jiang,W.等人,Angew.Chemie-Int.Ed.2007,46(44),8445–8448；Lin,W.等人；Long,L.；Tan,W.A Highly Sensitive Fluorescent Probe for Detection ofBenzenethiols in Environmental Samples and Living Cells W.2010,1503–1505)。MMBC是一种具有马来酰亚胺官能团的荧光性化合物，并且其荧光取决于硫醇底物对该马来酰亚胺的亲核攻击(图1A)。与半胱氨酸反应后，MMBC以0.65的量子产率发出强烈的荧光(Yang,J.-R等人,Journal of Heterocyclic Chemistry.1991,pp 1177–1180)。
我们确定F.Ellman和传统Ellman测定的LOQ分别为0.4μM和1.6μM SH，表明MMBC增强将定量限提高了约4倍(表2)。这种观察到的性能增强可以通过荧光测量与紫外吸光度测量相比较低的背景信号来解释，尽管当考虑到荧光测定通常达到比紫外吸光度测定低3-4个数量级的LOQ时，增强的幅度似乎不大。F.Ellman测定LOQ的进一步改进可能受到背景DTNB水解的限制，这会在荧光测量中引入更多噪声。尽管如此，改进的LOQ加上F.Ellman测定需要一半的样品体积，与传统Ellman相比，用F.Ellman测定进行硫醇确定仅需要约1/8的材料。
值得注意的是，对于1.6μM的传统Ellman方法，我们的LOQ确定值高于之前报道的传统Ellman方法的LOQ，其在0.6–0.9μM的范围内(Wright,S.K.等人,Anal.Biochem.1998,265(1),8–14；Riener，C.K.等人,Anal.Bioanal.Chem.2002,373(4–5),266–276)。然而，方法上的一个重要区别是我们将我们的样品与DTNB一起孵育60分钟(与那些之前的研究中的5分钟相反)。我们故意选择了更长的孵育时间，以使蛋白质上的游离硫醇与DTNB能够充分反应(Wright,S.K.等人,Anal.Biochem.1998,265(1),8–14)。但由于孵育时间较长，对于DTNB水解和背景噪音的机会也更多，因此在我们的研究中传统Ellman方法的LOQ更高。为了在本研究范围内公平地比较它们方法的性能，在可能的情况下，我们在F.Ellman测定与传统Ellman方法之间保持相同的方法(即试剂、耗材、仪器等)。据我们所知，F.Ellman测定的增强代表了传统Ellman方法自60多年前问世以来灵敏度的最大提升。
值得注意的是，F.Ellman测定成功地保留了传统Ellman方法相对于其他荧光性游离硫醇测定的主要优势中的一个：假设DTNB和硫醇底物有足够的时间进行反应，F.Ellman测定的灵敏度与硫醇底物的性质无关(图6)。因此，无论底物或硫醇微环境的性质如何，都可以在F.Ellman测定中使用单一的通用校准曲线(例如用半胱氨酸)来定量一组不同样品中的硫醇。例如，如果我们使用MMBC(不含DTNB)直接测定硫醇底物，则这种方法是不可能的，因为当MMBC与不同底物缀合时，表现出不同的荧光效率(Hoff,S.等人,Analyst 2013,138,2096–2103)。在这项研究中，我们成功地使用单半胱氨酸校准曲线和F.Ellman试验来准确地确定7种不同IgG1、一种双特异性IgG、一种IgG2、2种IgG4、2种抗体-药物缀合物、一种Fab片段，和各种小分子中的硫醇含量。
使用MMBC的F.Ellman测定有一些限制。首先，MMBC在水溶液中的溶解度为20μM，并且限制了F.Ellman测定的上底物范围。其次，F.Ellman测定应使用校准曲线进行，以控制背景DTNB水解和校准荧光响应，而如果依赖TNB2-的消光系数，则传统的Ellman实验则不需要校准曲线，尽管由于已知基质对TNB在412nm的消光系数的影响，这可能是不可取的(Riddles,P.W.等人,Methods Enzymol.1983,91(1979),49–60)。
最后，当在变性条件下进行F.Ellman测定(或传统Ellman)时，值得讨论关于缓冲液的重要考虑。先前的报告描述了在中性pH磷酸盐缓冲液中使用高浓度盐酸胍来创造变性环境(Robotham,A.C.等人,MAbs 2019,0(0),1–10；Riddles,P.W.等人,MethodsEnzymol.1983,91(1979),49–60；Aitken,A.等人,In Protein Protocols Handbook,The；Walker,J.M.,Ed.；Humana Press:New Jersey,2002；pp 595–596)。然而，鉴于磷酸盐的pKa对离子强度的显著依赖性，磷酸盐在这些条件下作为缓冲液系统是一个糟糕的选择(Scatchard,G.Chem.Rev.1936,19(3),309–327；Pitzer,K.S.；Pitzer,K.S.Thermodynamics of Electrolytes.1972,3965(1969),268–277)。在图10中，我们比较了磷酸盐缓冲液和MOPS缓冲液在4M盐酸胍存在下的缓冲能力。虽然MOPS缓冲液(Good缓冲液)能够合理缓冲酸和碱的干扰，但在中性pH下磷酸盐缓冲液在如此强的电解质环境中几乎没有缓冲能力。与盐酸胍相比，高浓度尿素不会显著提高溶液的离子强度，并且因此应与中性pH磷酸盐缓冲液相容。缓冲液注意事项很容易被忽视，然而不兼容的缓冲液系统对F.Ellman和传统Ellman检测的准确性和精确度将具有重大影响。

Claims (47)

1.一种用于检测游离硫醇的方法，所述方法包括：
a)使硫醇底物与5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)接触以化学计量地释放TNB2-；
b)使释放的TNB2-与试剂接触以产生荧光信号，所述试剂与所述释放的TNB2-相互作用；以及
c)检测通过所述释放的TNB2-与所述试剂的相互作用发射的所述荧光信号，由此检测所述游离硫醇。
2.根据1所述的方法，其中所述试剂为荧光性探针。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为荧光探针。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中将TNB2-分子与所述荧光性探针或所述荧光探针一起孵育使得形成：
a)荧光TNB-探针加合物；或者
b)脱保护荧光探针和非荧光TNB加合物。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述荧光信号由荧光TNB-探针加合物发射。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述荧光信号由脱保护荧光探针发射。
7.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述荧光性探针或所述荧光探针为硫醇特异性探针。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述硫醇特异性探针含有马来酰亚胺官能团。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述硫醇特异性探针含有2,4-二硝基苯磺酰胺(DNBS)官能团。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述荧光性探针为马来酰亚胺基苯并色烯-甲酸甲酯(MMBC)。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述荧光性探针为ThioFluor623。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述硫醇存在于低分子量硫醇底物上。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述硫醇存在于高分子量硫醇底物上。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述高分子量硫醇底物为多肽。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述多肽为抗体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体为IgG2。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体为双特异性抗体的一半。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述高分子量硫醇底物为抗体-药物-缀合物(ADC)。
19.一种定量硫醇底物的游离硫醇含量的方法，所述方法包括：
a)使所述硫醇底物与5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)接触以化学计量地释放TNB2-；
b)将所述TNB2-与试剂一起孵育以产生荧光信号，所述试剂与释放的TNB2-相互作用；
c)检测通过所述释放的TNB2-与所述试剂的相互作用发射的荧光信号；以及
d)通过将c)中检测到的所述信号与已知量的参考信号进行比较来定量分子的所述游离硫醇含量。
20.根据19所述的方法，其中所述试剂为荧光性探针。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述试剂为荧光探针。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述硫醇存在于高分子量硫醇底物上。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述高分子量硫醇底物为多肽。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述高分子量硫醇底物为抗体-药物缀合物。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述多肽为抗体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体为IgG2。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体为双特异性抗体的一半。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体为双特异性抗体。
29.根据权利要求20或21所述的方法，其中将TNB2-与所述荧光性探针或所述荧光探针一起孵育使得形成：
a)荧光TNB-探针加合物；或者
b)脱保护荧光探针和非荧光TNB加合物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述荧光信号由所述荧光TNB-探针加合物发射。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述荧光信号由所述脱保护荧光探针发射。
32.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述荧光性探针或所述荧光探针为硫醇特异性探针。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述硫醇特异性探针含有马来酰亚胺官能团。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述硫醇特异性探针含有2,4-二硝基苯磺酰胺(DNBS)官能团。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述荧光性探针为马来酰亚胺基苯并色烯-甲酸甲酯(MMBC)。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述荧光性探针为ThioFluor623。
37.根据权利要求19所述的方法，其中通过将所述荧光信号与校准曲线进行比较以确定硫醇浓度并将所述硫醇浓度除以所述硫醇底物的浓度来计算所述游离硫醇含量。
38.一种用于检测硫醇化合物的试剂盒，其包括：
a)5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)；和
b)荧光性探针或荧光探针。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其进一步包括用于生成校准曲线的含硫醇标准品。
40.根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述含硫醇标准品选自半胱氨酸、谷胱甘肽和N-乙酰化半胱氨酸。
41.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述荧光性探针或荧光探针为硫醇特异性荧光性探针。
42.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述荧光性探针为马来酰亚胺基苯并色烯-甲酸甲酯(MMBC)。
43.根据权利要求38所述的试剂盒，其中硫醇特异性荧光性探针或荧光探针含有马来酰亚胺官能团。
44.根据权利要求38所述的试剂盒，其中硫醇特异性荧光性探针或荧光探针含有2,4-二硝基苯磺酰胺(DNBS)官能团。
45.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述荧光性探针为ThioFluor623。
46.根据权利要求38所述的试剂盒，其包括变性缓冲剂。
47.根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述变性缓冲剂为半钠3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲剂。
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