CN116490515A - 嵌合rsv和冠状病毒蛋白、免疫原性组合物和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明一般地涉及包含第一病毒融合蛋白(例如冠状病毒的刺突蛋白)的胞外结构域和任选地跨膜结构域和第二病毒融合蛋白(例如RSV)的细胞质结构域的嵌合病毒融合蛋白、包含这些嵌合蛋白的免疫原性组合物和其使用方法。

Description

嵌合RSV和冠状病毒蛋白、免疫原性组合物和使用方法

相关申请的交叉参考

本申请要求于2020年6月17日提出申请的美国临时专利申请第63/040193号、于2021年3月12日提出申请的美国临时专利申请第63/160445号、和于2021年5月27日提出申请的美国临时专利申请第63/194092号的权益和优先权，这些申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

序列表

本申请包含以ASCII格式的电子方式提交的序列表，现将其以全文引用的方式并入本文中。该ASCII副本创建于2021年6月16日，名为MSA-007WO_SL.txt，大小为1822459字节。

技术领域

本发明一般地涉及关于嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)和非RSV蛋白(例如非肺炎病毒科，例如冠状病毒)、包含这些嵌合蛋白的免疫原性组合物和其使用方法。

现有技术

冠状病毒科是负责鸟类、鱼类和哺乳动物的呼吸道和胃肠道疾病的一个大的、有包膜的单链RNA病毒家族。该家族的名字来源于在电子显微镜下病毒颗粒表面上类似冠状的刺突蛋白的标志性外观，在1960年代发现第一个冠状病毒(CoV)株时有报道(Kahn等人(2005)The Pediatric Infectious Disease Journal，24(11)，S223-S227)。CoV共有的核心特征包括100-160nm的病毒颗粒直径、上文所提及的与宿主细胞结合的刺突(S)蛋白、膜(M)糖蛋白、包膜(E)蛋白、核衣壳(N)蛋白、和长度为27-32kb的正义单链RNA基因组(Cui等人(2019)NatureReviewsMicrobiology，17(3)，181-192)。基于遗传系统发育，所有已知的人类冠状病毒(HCoV)皆属正冠状病毒亚科、尤其是α和β冠状病毒属。

某些HCoV是全球流行的，且导致季节性上呼吸道或下呼吸道感染，在有免疫能力的宿主中，这些感染的严重程度为亚临床至中度。该四种毒株(HCoV-229E、-NL63、-OC43和-HKU1)共同导致10％至30％的成人上呼吸道感染(Paules等人(2020)JAMA，323(8)，707-708)，且已在8.2-10.8％患有急性呼吸疾病的儿童中检测到(Varghese等人(2018)Journalof the Pediatric Infectious Diseases Society，7(2)，151-158)。在2002年和2012年，两种高致病性β-冠状病毒自动物宿主中出现而感染人类，触发危及生命的严重呼吸疾病的跨国流行。由严重急性呼吸症候群(SARS)-CoV引起的大流行在29个国家中导致超过8000名感染对象，其面临11％的累积致死率(CFR)(世界卫生组织(WHO)2020年)，八个月后才得到控制。相比之下，中东呼吸症候群(MERS)-CoV仍在阿拉伯半岛流行，其已在27个国家造成近2500例病例，其中CFR为34％，超过850例死亡(WHO 2019)。无可用于SARS-CoV或MERS-CoV的经许可的治疗性或预防性疫苗。

COVID-19全球大流行是由高传播性严重急性呼吸症候群冠状病毒2(SARS-CoV-2，Coronaviridae Smdy Group of the International Committee on Taxonomy ofViruses(2020)Nat Microbiol.5(4)：536-544)引起。COVID-19在老年人和患有严重基础医学病况(例如心脏病或肺病和糖尿病)的患者中具有约2％的总死亡率。截至2021年5月18日，全世界共有163312429例SARS-CoV-2感染确诊病例，总共3386825例死亡(WHO仪表板，网站为covid19.who.int/)。

SARS-CoV-2是有包膜的RNA病毒，其依赖其表面糖蛋白刺突进入宿主细胞(Letko等人(2020)Nat Microbiol.5(4)：562-569，Shang等人(2020)Proc Natl Acad Sci U SA.117(21)：11727-11734)。刺突蛋白是I型融合蛋白且形成在病毒膜上突出的三聚体，从而使病毒在电子显微镜下具有冠的特征外观(等人(2020)Science 370(6513)：203-208；Li(2005)Annu Rev Virol.3(1)：237-261)。血管收缩肽转化酶2(ACE2)鉴别为SARS-CoV-2刺突的细胞受体(Letko等人，上文文献；Hoffmann等人(2020)Cell 181(2)：271-280)。破坏ACE2和刺突的受体结合结构域(RBD)的相互作用是疫苗设计和治疗剂的核心。目前，在美国已批准三种COVID-19疫苗紧急使用(CDC，网站cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/vaccines/different-vaccines.html的“Authorized and RecommendedVaccines”)。该三种疫苗是基于SARS-CoV-2刺突蛋白，且其水平的功效已验证刺突为保护性抗原。然而，尽管有现有疫苗，但截至2021年5月20日，仅施用15.6亿个疫苗剂量，相当于每100人施用20个剂量。一些国家尚未报道任何疫苗剂量的施用。

目前使用的所有EUA疫苗皆是肌内递送，且无一是活的减毒的。减毒活疫苗(LAV)通常使用与其靶向的病原体相同的进入途径，并在宿主体内复制，模拟自然感染而不引起疾病。因此，LAV在感染部位产生黏膜免疫性，从而在感染的早期阻断病原体，由此有助于控制全身性传播(Holmgren等人(2005)Nat Med.11(4Suppl)：S45-53)。在流行性感冒感染的情形下，已显示相对于其他疫苗类型，LAV诱发更佳黏膜IgA和细胞介导的免疫性，从而引发更持久更广泛的更类似于自然免疫性的免疫反应(Cox等人(2004)Scand J Immunol.59(1)：1-15)。此外，小鼠中肌肉和鼻内施用的针对SARS-CoV的疫苗的比较显示，仅在鼻内疫苗接种后诱发血清IgA(参见等人(2006)J Gen Virol.87(Pt 3)：641-650)，且仅鼻内疫苗接种在上呼吸道和下呼吸道二者中提供保护(Hassan等人(2020)Cell 183(1)：169-184.e13)。特别是对于SARS-CoV-2而言，据报道早期抗体反应由IgA主导，且黏膜IgA具有高度中和性(Sterlin等人(2021)Sci Transl Med.13(577)：eabd2223)，强调开发能够引发黏膜免疫性的鼻内疫苗的重要性。根据WHO疫苗追踪系统，目前有101种疫苗处于临床试验，其中仅3种是鼻内减毒活疫苗(“The Landscape of candidate vaccines in clinicaldevelopment”，网站who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines as of May 14，2021，由WHO编写)。然而，这些候选减毒活疫苗可能容易受到冠状病毒中观察到的高比率的RNA重组影响，这会导致在与野生型冠状病毒共感染期间减毒的丧失。

因此，本领域需要免疫原性组合物，包括疫苗，以预防或减轻COVID-19疾病的严重程度。需要不易重组且产生可以高产率产生黏膜和体液免疫反应的无针鼻内疫苗。

发明内容

本公开内容部分是基于嵌合蛋白的发现，该嵌合蛋白包含两种病毒融合蛋白的部分，该两种病毒融合蛋白可用于免疫原性组合物(例如疫苗)中以预防病毒感染。本文所述的嵌合蛋白可用于疫苗构建体，该疫苗构建体包括RSV病毒的组分(例如由密码子去优化的RSV基因编码的蛋白质)，但在病毒表面表达融合蛋白。具有第一融合蛋白的一部分(例如融合蛋白的胞外结构域)和第二融合蛋白的一部分(例如第二融合蛋白的胞质尾区)的嵌合蛋白促进嵌合蛋白正确组装至RSV颗粒中。

在某些实施方案中，本公开内容涉及嵌合蛋白，其包含来自非RSV病毒(不为RSV的任何病毒)的融合蛋白，例如冠状病毒刺突蛋白或“S蛋白”，例如SARS-CoV-2刺突蛋白；和RSV F蛋白，该嵌合蛋白可用于免疫原性组合物(例如疫苗)中以预防冠状病毒感染(例如SARS-CoV-2感染)。本文所述的嵌合蛋白可用于疫苗构建体，该疫苗构建体包括RSV病毒的组分(例如密码子去优化的RSV蛋白)，但在病毒表面上表达非RSV融合蛋白(例如嵌合冠状病毒S蛋白/RSV F蛋白)。具有非RSV融合蛋白的一部分(例如胞外结构域和任选地跨膜部分)和RSV F蛋白的一部分(例如胞质尾区部分)的嵌合蛋白促进嵌合蛋白正确组装至RSV颗粒中。

在其他实施方案中，胞质尾区部分是非RSV融合蛋白，例如正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流行性感冒病毒)的HA蛋白；反转录病毒科(Retroviridae)的Env蛋白；副黏液病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流行性感冒、麻疹和腮腺炎病毒)的F和/或HN蛋白；冠状病毒科(Coronaviridae)的S蛋白；丝状病毒科(Filoviridae)的GP蛋白；沙粒病毒科(Arenaviridae)的GP和/或SSP蛋白；披膜病毒科(Togaviridae)的E1/E2蛋白；黄病毒科(Flaviviridae)的E(例如在TBEV中)或E1/E2(例如在HCV中)蛋白；布尼亚病毒科(Bunyaviridiae)的GN/GC蛋白；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(VSV和狂犬病病毒)的G蛋白；疱疹病毒科(Herpesviridae)的gB、gD和/或gH/L蛋白；痘病毒科(poxviridae)中8种蛋白质的复合物中的一种或多于一种；和肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)的S和/或L蛋白。

在某些实施方案中，本公开内容涉及免疫原性组合物，其包含如本文所述的嵌合蛋白和一种或多于一种RSV蛋白(例如，NS1和NS2蛋白，其中NS1和/或NS2蛋白任选地由密码子去优化的基因编码)。尽管在某些实施方案中，本文所述的免疫原性组合物可包括G基因，但在其他实施方案中，免疫原性组合物(例如疫苗)不包括RSV G基因。不期望受限于理论，据信不需要RSV G基因，此是因某些融合蛋白例如冠状病毒S蛋白介导受体附着和病毒-细胞融合。事实上，冠状病毒刺突蛋白对于病毒进入是完全功能性的、必要的和充分的。如本文实施例2所述，缺乏G和F蛋白的重组RSV-刺突病毒可进入宿主细胞，指示重组病毒完全依赖嵌合冠状病毒刺突/RSV F蛋白进入。此外，通过去除RSV G和F，所得免疫原性组合物将不受预先存在的RSV免疫性抑制，此是因已知的RSV中和抗体主要针对F或G。

在某些实施方案中，本公开内容涉及包含如本文所述的嵌合融合蛋白的疫苗，其是经鼻内施用的，这是一种有利于全球免疫的无针途径。鼻内途径类似于SARS-CoV-2的自然感染途径，且在无任何佐剂制剂的情况下在AGM中产生黏膜和体液免疫反应。基于本文公开的疫苗的生产产率的建模预测，在使用高强度生物反应器系统的中等规模设施中，潜在剂量输出为每年数亿剂量。黏膜递送的减毒活疫苗例如本文所述的那些需要最少的下游处理，且生产成本可低于现有疫苗。另外，无针递送降低供应风险。本文所述的疫苗适合作为初级疫苗或异源加强剂。

因此，在一个方面，本公开内容涉及包含SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域和RSV融合(F)蛋白的胞质尾区部分的嵌合蛋白。在某些实施方案中，嵌合蛋白在N-末端至C-末端方向上包含SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域和RSV融合(F)蛋白的胞质尾区部分。在某些实施方案中，嵌合蛋白还包含SARS-CoV-2刺突蛋白的跨膜结构域。在某些实施方案中，嵌合蛋白还包含RSV融合蛋白的跨膜结构域。

在某些实施方案中，嵌合蛋白包含选自SEQ ID NO：1-6、62、68、74、80、86、92、98和110的序列、或与选自SEQ ID NO：1-6、62、68、74、80、86、92、98和110的序列具有至少约85％(例如至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％)序列一致性的其变体。

在另一个方面，本公开内容涉及包含活的(例如活的减毒)嵌合病毒的免疫原性组合物，该嵌合病毒包含编码嵌合蛋白的核酸，该嵌合蛋白包含SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域和RSV融合(F)蛋白的胞质尾区部分。在某些实施方案中，核酸编码嵌合蛋白，该嵌合蛋白在N-末端至C-末端方向上包含SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域和RSV融合(F)蛋白的胞质尾区部分。在某些实施方案中，核酸包含进一步包含SARS-CoV-2刺突蛋白的跨膜结构域的嵌合蛋白。在某些实施方案中，核酸包含进一步包含RSV融合蛋白的跨膜结构域的嵌合蛋白。

在某些实施方案中，核酸编码嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含选自SEQ ID NO：1-6、62、68、74、80、86、92、98和110的序列、或与选自SEQ ID NO：1-6、62、68、74、80、86、92、98和110的序列具有至少约85％(例如至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)序列一致性的其变体。在某些实施方案中，核酸包含选自SEQ ID NO：7-12、63、69、75、81、87、93、99和111的序列、或与选自SEQ ID NO：7-12、63、69、75、81、87、93、99和111的序列具有至少约85％(例如至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)序列一致性的其片段或变体、或上述任一项的RNA对应体、或上述任一项的互补序列。

应理解，对于表达为DNA序列的病毒核酸序列(即，使用“T”核苷酸)，亦考虑相应RNA序列，其中“U”核苷酸取代“T”核苷酸。另外，应理解，在提供反基因组序列(例如，如在表达载体中所发现)的情况下，亦考虑如在免疫原性组合物中发现的互补序列(例如，病毒的基因组和/或疫苗序列)。

在某些实施方案中，活的嵌合病毒进一步包含RSV的NS1和/或NS2蛋白。在某些实施方案中，活的嵌合病毒不包含编码RSV G蛋白的基因。

在某些实施方案中，免疫原性组合物进一步包含佐剂和/或其他药学上可接受的载剂。在某些实施方案中，佐剂是铝凝胶、铝盐或单磷酰脂质A。在某些实施方案中，佐剂是任选地包含α-生育酚、角鲨烯和/或表面活性剂的水包油乳液。

在另一个方面，本公开内容涉及使对象针对SARS-CoV-2病毒免疫的方法，该方法包括向对象施用有效量的如本文所述的免疫原性组合物。在某些实施方案中，施用是经鼻内施用。在某些实施方案中，免疫原性组合物是以约10³至约10⁶的剂量施用。在某些实施方案中，免疫原性组合物的施用诱发SARS-CoV-2刺突特异性黏膜IgA反应或产生血清中和抗体。

在另一个方面，本公开内容涉及编码如本文所述的嵌合蛋白的核酸。在某些实施方案中，核酸包含选自SEQ ID NO：7-12、63、69、75、81、87、93、99和111的序列、或与选自SEQID NO：7-12、63、69、75、81、87、93、99和111的序列具有至少约85％(例如至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)序列一致性的其片段或变体、或上述任一项的RNA对应体、或上述任一项的互补序列。

在另一个方面，本公开内容涉及包含如本文所述的核酸的载体。在某些实施方案中，载体选自质粒或细菌人工染色体。在某些实施方案中，载体是包含选自SEQ ID NO：54-59、66、67、72、73、78、79、84、85、90、91、96、97、102、103、114、115和131-136的序列、或与选自SEQ ID NO：54-59、66、67、72、73、78、79、84、85、90、91、96、97、102、103、114、115和131-136的序列具有至少约85％(例如至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)序列一致性的其变体的BAC。

在另一个方面，本公开内容涉及分离的重组颗粒，其包含RSV的NS1和/或NS2蛋白和如本文所述的嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白-RSV融合(F)蛋白。在某些实施方案中，分离的重组颗粒包含活的减毒嵌合RSV-SARS-CoV-2基因组或反基因组。

在另一个方面，本公开内容涉及活的减毒嵌合RSV-SARS-CoV-2反基因组，其包含选自SEQ ID NO：13-18、65、71、77、83、89、95、101、104-109和113的序列、或与选自SEQ IDNO：13-18、65、71、77、83、89、95、101、104-109和113的序列具有至少约85％(例如至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)序列一致性的其变体、或上述任一项的RNA对应体、或上述任一项的互补序列。

在以下描述和权利要求中阐述本发明的这些和其他方面和特征。

附图的简要说明

为了理解本发明并说明如何在实践中实施本发明，现在参考附图仅通过非限制性实例来阐释实施方案，在附图中：

图1是显示MV-014-212的设计的示意图。在MV-014-212中，NS1和NS2基因经去优化，且RSV SH、G和F基因缺失且由编码嵌合蛋白刺突-F的基因替换。接合处的氨基酸序列如下方块图形所示。刺突的跨膜结构域向左以浅灰色表示，且F的胞质尾区向右以深灰色绘示。在第一基因位置中编码荧光蛋白mKate2的报道病毒MVK-014-212示意性示于底部或图中。NTD：N-末端结构域。RBD：受体结合结构域。S1：亚基S1。S2：亚基S2。S1/S2和S2’：蛋白酶切割位点。FP：融合肽。IFP：内部融合肽。HR1和2：七肽重复序列1和2。TM：跨膜结构域。CT：胞质尾区。图1公开SEQ ID NO：139。

图2是绘示候选物的C-末端序列的示意图，其显示RSV F蛋白胞质尾区与SARS-CoV-2刺突蛋白跨膜结构域之间接合的不同位置。候选物经设计以含有mKate2基因作为荧光标记物，以随后在培养中进行拯救和繁殖。该图(和表3)中列出的7个候选物通过其拯救能力(定义为红色荧光灶的产生)和生长至10⁵PFU/mL或高于10⁵PFU/mL的效价的能力进行评估。选择MV-014-212进行进一步研究。SARS-CoV-2刺突的序列显示SEQ ID NO：23的氨基酸1198-1273。MV 014-210的序列显示SEQ ID NO：1的氨基酸1198-1278。MV 014-211的序列显示SEQ ID NO：2的氨基酸1198-1278。MV 014-212的序列显示SEQ ID NO：3的氨基酸1198-1290。MV 014-213的序列显示SEQ ID NO：98的氨基酸1198-1284。MV 014-220的序列显示SEQ ID NO：4的氨基酸1198-1275。MV 014-230的序列显示SEQ ID NO：5的氨基酸1198-1268。MV 014-240的序列显示SEQ ID NO：6的氨基酸1198-1271。MV 014-215的序列显示SEQID NO：110的氨基酸1198-1260。RSV F(RSV F蛋白的C-末端部分)的序列显示且提供于SEQID NO：130。

图3是显示用于产生嵌合RSV/冠状病毒疫苗的BAC_DB1_mKate载体的设计的示意图。

图4A-4C提供细胞单层的明场和荧光影像，其显示由融合刺突-F蛋白介导的MV-014-210的繁殖。

图5是显示重组MV-014-212病毒和其衍生的病毒的拯救的示意图。

图6提供显示由MV-014-212和衍生的重组病毒形成的合胞体的显微照片。显微照片是在相衬下或使用TRITC过滤器以100倍的总放大倍数拍摄的。

图7显示冠状病毒刺突蛋白、其糖基化位点(短黑条)和其弗林蛋白酶切割位点的示意图。

图8A是显示缺乏弗林蛋白酶切割位点的全长纯化SARS-CoV-2刺突蛋白(泳道1)、MVK-014-212(泳道2)、MV-014-212(泳道3)、模拟感染的Vero细胞溶解产物(泳道4)、空白(水，泳道5)的蛋白质印迹。分子量标记对应于BIO-RAD精密度加蛋白质双色标准品(目录号1610374)的迁移。图8B是显示MV-014-212与RSVA2相比在无血清Vero细胞中的多周期复制动力学的图。以0.01的MOI感染细胞，并在32℃下培育。在感染后0、12、24、48、72、96和120小时收集细胞和上清液。通过Vero细胞中的噬斑分析测定样品的效价。数据点代表两个重复孔的平均值，且误差棒代表标准偏差。图8C是显示MV-014-212与MVK-014-212相比在无血清Vero细胞中的多周期复制动力学的图。以0.01的MOI感染细胞，并在32℃下培育。在感染后0、3、24和72小时收集细胞和上清液。通过Vero细胞中的噬斑分析测定样品的效价。数据点代表三个重复孔的平均值，且误差棒代表标准偏差。图8D是显示短期热稳定性分析的结果的图。将在Williams E+SPG中制备或在单独SPG中制备的MV-014-212的病毒原液在-80℃、4℃、-20℃和室温下培育6h，且通过噬斑分析测定培育后的效价。

图9显示实施例3中阐述的遗传稳定性实验的示意图。简言之，通过体外连续传代检查MV-014-212的遗传稳定性。用MV-014-212的等分试样感染三个烧瓶的亚汇合Vero细胞，并使3个谱系平行传代10代。使用RT-PCR、之后Sanger测序，确定所有谱系的起始原液(第0代)和第10代的整个基因组的序列。未检测到变体累积，表明候选MV-014-212疫苗是稳定的。

图10是对接种MV-014-212、wt(野生型)RSV或PBS的非洲绿猴(AGM)实施的SARS-CoV-2攻击测试的示意概述。在第1天至第12天获得鼻拭子(NS)。在第2、4、6、8、10和12天收集支气管肺泡灌洗液(BAL)。使用新鲜样品通过噬斑分析来确定NS和BAL样品中的病毒脱落。在接种后第28天，用wt SARS-CoV-2攻击AGM。自第29天至第38天，每天获得鼻拭子。在第30天开始至第38天每隔一天获得支气管肺泡灌洗液。RT-qPCR用于检测NS和BAL样品中的SARS-CoV-2脱落。

图11A-B提供显示在非洲绿猴(AGM)的上呼吸道和下呼吸道中MV-014-212减毒的图。通过对Vero细胞的噬斑分析测量接种MV-014-212或wtRSVA2后的AGM的鼻拭子(图11A)或支气管肺泡灌洗液(BAL)(图11B)中的病毒效价。在接种后第1天至第12天，将鼻拭子收集于补充有SPG的Williams E中。在接种后第2、4、6、8、10和12天测量BAL中的病毒效价。图中的框限定第25和第75百分位数，其中误差棒显示最大值和最小值。框中的水平线是每一时间点的数据点的平均值。虚线表示LOD(50PFU/mL)。

图12A-D显示在棉鼠中实施的两个独立实验的结果的图。在实验1中，棉鼠(每组n＝5)接种1X10⁵PFU的生物衍生的TN-12、Memphis 37(M37)或重组A2(rA2)RSV毒株。在第3、5和7天，将棉鼠的鼻和肺组织在HBSS+10％SPG中匀浆化，以通过噬斑分析测定效价。在该实验中，对于rA2组，仅收集第5天的鼻和肺组织。在实验2中，棉鼠(n＝6)接种5×10⁵PFU的rA2。在第2、5和7天，将棉鼠的鼻和肺组织在HBSS+10％SPG中匀浆化，以通过噬斑分析测定效价。使用在EMEM稀释的澄清鼻和肺匀浆在HEp-2细胞中实施噬斑分析。在实验1中通过用RSV多克隆抗体免疫染色和在实验2中通过结晶紫染色来可视化噬斑。图12A显示TN-12、M37和rA2在鼻中的复制动力学。图12B比较TN-12、M37和rA2在第5天的鼻效价。图12C显示生物TN-12和Memphis 37和rA2在肺中的复制动力学。图12D比较TN-12、M37和rA2在第5天的肺效价。结果显示，rA2鼻效价与生物衍生的TN12和M37相当，但rA2肺效价比生物衍生的RSV毒株低约2log。

图13提供说明保护接种MV-014-212疫苗的AGM免受wt SARS-CoV-2攻击的图。攻击后接种MV-014-212、wt RSVA2或PBS(模拟)的AGM的鼻拭子样品中的wt SARS-CoV-2sgRNA。在第28天，通过鼻内和气管内接种，用1.0×10⁶TCID₅₀的wt SARS-CoV-2攻击动物。显示用wtSARS-CoV-2攻击后第1、2、4和6天收集的鼻拭子。通过RT-qPCR测定SARS-CoV-2sgRNA的含量。虚线代表50个基因组当量(GE)/mL的LOD。(sgRNA＝亚基因组RNA。)

图14A是显示用于量测刺突特异性鼻IgA的夹心法分析的示意图。SARS-CoV-2刺突蛋白用作结合样品(例如鼻拭子样品)的IgA的抗原(2)。通过用IgA捕获Ab替换刺突蛋白产生IgA标准曲线(图14B)，其中Y轴是“450nm处的OD”，x轴是“[IgA](pg/mL)”。

图15A提供显示接种MV-014-212的AGM中的刺突特异性血清IgG的图。使用在第25天自接种MV-014-212、wt RSV A2或PBS(模拟)的AGM收集的血清，通过ELISA量测对SARS-CoV-2刺突蛋白具有特异性的抗体。效价以ELISA单位(ELU)/mL表示，其是通过与自汇集的人类恢复期血清产生的标准曲线进行比较来计算的。图15B提供显示通过ELISA使用接种后第25天收集的鼻拭子测量对SARS-CoV-2刺突蛋白具有特异性的IgA抗体的结果图。显示第25天获得的值与第1天获得的值的比的Log2。使用捕获ELISA自总纯化人类IgA产生的标准曲线获得计算的ELU/mL浓度。图15C提供显示用MV-014-212免疫的两种AGM的血清在用MV-014-212免疫前(“pre”)和免疫后25天(“imm”)的中和效价(NT50)的图。WHO std是100IU/mL的人类恢复期血清混合物对照。NT50是由将抑制曲线拟合至GraphPad Prism中的选项“[抑制剂]对归一化反应-可变斜率”而获得的。WHO Std.是100IU/mL的恢复期血清池。抑制％是如实施例3中所述计算的，且抑制曲线示于图16中。对应于样品AGM#1Pre(所有病毒)和AGM#2(RSV)的曲线未显示显著抑制且无法拟合。LOD为5，用水平虚线表示。数据表示两个重复的平均值，且误差棒对应于S.D.。右边的表格显示每一报道病毒的平均NT50。

图16提供显示中和曲线的图。如方法中所述计算抑制百分比。下文显示的抑制曲线是使用非线性回归利用GraphPad Prism中的选项“[抑制剂]对归一化反应-可变斜率”来拟合。测量值对应于2个重复的平均值，且误差棒是SD。对应于每一分析的报道病毒显示在顶部。WHO STD是100IU/mL的恢复期血清池。

图17提供显示用MV-014-212免疫之前(“pre”)和免疫后25天(“imm”)用来自AGM#1和#2的血清的中和分析的图。WHO std是100IU/mL的人类恢复期血清混合物对照。图显示利用血清或对照的最高浓度(1∶5)所达到的抑制。如方法中所述计算抑制百分比。数据表示两个重复的平均值，且误差棒对应于S.D.。

图18是如实施例3中所述的中和分析的示意图。

图19A-D提供显示MV-014-212在ACE-2小鼠中引发Th1偏向的免疫反应的图。图19A显示ACE-2小鼠中产生IFNg(左)或IL-5(右)的细胞的ELISpot结果。在接种后第28天收集自表达hACE-2的小鼠(n＝5)分离的脾细胞，并用跨越SARS-CoV-2刺突蛋白(池)、培养基或促分裂伴刀豆球蛋白A(Con A)的肽池刺激。通过ELISpot分析定量表达IL-5或IFNγ的T细胞。表达hACE-2的小鼠在第0天经由鼻内途径接种MV-014-212或PBS。对照组小鼠在第-20天和第0天通过肌内注射用加入明矾的纯化SARS-CoV-2刺突蛋白进行疫苗接种。图19B提供显示表达IFNγ的细胞对表达IL-5的细胞的比的对数的图(如图19A中所示)。图19C提供显示IgG1和IgG2a ELISA的结果的图。相应于hACE-2小鼠的第28天血清的IgG2a(左图)和IgG1(右图)的含量，如通过ELISA所测定，该hACE-2小鼠鼻内接种PBS或MV-014-212疫苗或肌内接种刺突-明矾疫苗。由用纯化SARS-CoV-2刺突特异性单克隆IgG2a或IgG1抗体产生的标准曲线确定每一免疫球蛋白同种型的浓度。图19D提供显示IgG2a/IgG1的比的对数的图(如图19C中所示)。统计分析是配对t-检验。***P＜0.0005

详细说明

本公开内容部分基于嵌合蛋白的发现，该嵌合蛋白包含两种病毒融合蛋白的部分，该两种病毒融合蛋白可用于免疫原性组合物(例如疫苗)中以预防病毒感染。本文所述的嵌合蛋白可用于疫苗构建体，其包括RSV病毒的组分(例如密码子去优化的RSV蛋白)，但在病毒表面上表达嵌合融合蛋白。具有第一融合蛋白的一部分(例如融合蛋白的胞外结构域)和第二融合蛋白的一部分(例如第二融合蛋白的胞质尾区)的嵌合蛋白促进嵌合蛋白正确组装至RSV颗粒中。

在某些实施方案中，本公开内容涉及嵌合蛋白，其包含非RSV融合蛋白(例如，冠状病毒刺突蛋白或“S蛋白”；例如SARS-CoV-2刺突蛋白)和RSV F蛋白，该嵌合蛋白可用于免疫原性组合物(例如疫苗)中用于预防病毒感染(例如SARS-CoV-2感染)。本文所述的嵌合蛋白可用于疫苗构建体，该疫苗构建体包括RSV病毒的组分(例如密码子去优化的RSV蛋白)，但在病毒表面上表达融合蛋白(例如S蛋白)。具有非RSV融合蛋白的一部分(例如冠状病毒S蛋白)和RSV F蛋白的一部分的嵌合蛋白促进嵌合蛋白正确组装至RSV颗粒中。

本公开内容还涉及关于编码嵌合蛋白的核酸和包含其的免疫原性组合物(例如疫苗)，该嵌合蛋白包含第一融合蛋白的一部分(例如胞外结构域)和第二融合蛋白的一部分(例如胞质尾区)。在某些实施方案中，免疫原性组合物包含除了或不同于F基因的RSV基因，其可经密码子去优化。尽管在某些实施方案中，本文所述的免疫原性组合物可包括G基因，但在其他实施方案中，免疫原性组合物(例如疫苗)不包括RSV G基因。不期望受限于理论，据信不需要RSV G基因，这是因为某些融合蛋白例如冠状病毒S蛋白介导受体附着和病毒-细胞融合。事实上，冠状病毒刺突蛋白对于病毒进入是完全功能性的、必要的和充分的。如本文实施例2所述，缺乏G和F蛋白的重组RSV-刺突病毒可进入宿主细胞，指示重组病毒完全依赖嵌合冠状病毒刺突/RSV F蛋白进入。此外，通过去除RSV G和F，所得免疫原性组合物将不受预先存在的RSV免疫性抑制，这是因为已知的RSV中和抗体主要针对F或G。

在说明书通篇中，如果将组合物阐述为具有、包括或包含特定组分，或如果将过程和方法阐述为具有、包括或包含特定步骤，则考虑另外存在基本上由所列举组分组成或由其组成的本发明组合物，且存在基本上由所列举处理步骤组成或由其组成的本发明的过程和方法。

在本申请中，如果据称要素或组分包括在所列举的要素或组分的清单中和/或选自所列举的要素或组分的清单，应理解，要素或组分可为所列举的要素或组分中的任一项，或要素或组分可选自两个或更多列举的要素或组分。

此外，应理解，本文所述的组合物或方法的要素和/或特征可以多种方式组合，而不脱离本发明的精神和范围，无论在本文中是明确的或隐含的。举例而言，如果提及特定化合物，除非自上下文中另有解释，否则该化合物可用于本发明的组合物的各种实施方案和/或本发明的方法中。换言之，在本申请中，以能够书写和绘制清楚和简洁的申请的方式阐述和绘示实施方案，但旨在且应理解，在不脱离本教导和发明的情况下，可不同地组合或分离实施方案。举例而言，应理解，本文阐述和绘示的所有特征皆可适用于本文阐述和绘示的本发明的所有方面。

应理解，除非自上下文和使用中另有解释，否则表述“至少一个”包括表述之后的个别地每个列举的对象和两个或多于两个列举的对象的各种组合。除非自上下文中另有理解，否则结合三个或多于三个列举的对象的表述“和/或”应理解为具有相同的含义。

除非自上下文中另外具体陈述或理解，否则术语“包括”、“具有”、“含有”的使用应通常理解为开放式和非限制性的，例如，不排除额外未列举的要素或步骤。

除非另有明确说明，否则当术语“约”的使用是在数量值之前时，本发明也包括具体的数量值本身，除非另有具体说明。除非另有指示或推测，否则如本文所使用，术语“约”是指与标称值相差±10％。

应理解，只要本发明保持可操作，各步骤的次序或实施某些动作的次序并不重要。此外，可同时执行两个或多于两个的步骤或动作。

除非要求保护，否则本文使用的任何和所有示例或示例性语言，例如“例如”或“包括”，仅仅意欲更好地阐释本发明，而非对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必要的。

除非另有指示，否则在阐述各个实施方案之前，提供且应使用以下定义。

术语“蛋白质”和“多肽”是指包含经由肽键连结的氨基酸的化合物，且可互换使用。

当术语“部分”用于指蛋白质(如在“给定蛋白质的一部分”中)时，是指该蛋白质的片段。片段的大小范围可为四个氨基酸残基至缺少一个氨基酸的整个氨基酸序列。

术语“嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)”或“嵌合冠状病毒/RSV”是指含有足够RSV基因以允许基因组或反基因组在宿主细胞(例如Vero细胞)中复制的核酸，且序列核酸经改变以包括至少一个含有非RSV(例如冠状病毒)基因序列或片段的核酸区段。嵌合RSV可包括非RSV(例如冠状病毒)和/或RSV基因，其中密码子变为不同于那些天然存在的密码子，即使该基因产生的多肽具有与那些天然表达的多肽相同的氨基酸序列。不同毒株的嵌合RSV会有不同核苷酸序列，且表达含具有相似功能的不同氨基酸序列的蛋白质。因此，嵌合RSV包括非RSV(例如冠状病毒)基因和/或RSV基因，其中来自一个毒株的一或多于一个基因由替代或第二毒株中的基因替换，使得整个非RSV或RSV基因组的核酸序列与自然界中发现的非RSV(例如冠状病毒)或RSV不同。在某些实施方案中，嵌合RSV包括为了截短蛋白质表达而在起始翻译的密码子后缺失核酸的那些毒株，条件是在天然存在的病毒中未发现基因组的该截短模式。在某些实施方案中，嵌合RSV包括具有传染性并能在人类对象中复制的那些。如本文所用术语“非RSV”是指任何不是RSV的病毒。在某些实施方案中，非RSV是不属肺炎病毒科的病毒(即，是非肺炎病毒)。在某些实施方案中，本文中存在的术语“非RSV”的任何情况可经术语“肺炎病毒科以外的病毒”或“不属肺炎病毒科的病毒”取代。

术语“嵌合体”或“嵌合”在提及多肽使用时是指自不同来源获得的两个或多于两个编码序列的表达产物，使得其在自然环境中不一起存在，它们一起克隆，且在翻译后用作单个多肽序列。编码序列包括自相同或不同物种的生物体获得的那些。本公开内容涉及嵌合RSV蛋白，例如非RSV(例如冠状病毒)/RSV蛋白。在某些实施方案中，嵌合RSV蛋白包含非RSV融合蛋白或其部分或变体和RSV F蛋白或其部分(例如胞质尾区部分)或变体。

术语“融合蛋白”是指介导病毒膜和细胞膜的融合、从而允许病毒进入并感染细胞的病毒蛋白。考虑用于本文的嵌合蛋白中的融合蛋白包括以下的至少一部分：正黏液病毒科(例如流行性感冒病毒)的HA蛋白；反转录病毒科的Env蛋白；副黏液病毒科(例如副流行性感冒、麻疹和腮腺炎病毒)的F和/或HN蛋白；冠状病毒科的S蛋白；丝状病毒科的GP蛋白；沙粒病毒科的GP和/或SSP蛋白；披膜病毒科的E1/E2蛋白；黄病毒科的E(例如在TBEV中)或E1/E2(例如在HCV中)蛋白；布尼亚病毒科的GN/GC蛋白；弹状病毒科(VSV和狂犬病病毒)的G蛋白；疱疹病毒科的gB、gD和/或gH/L蛋白；痘病毒科中8种蛋白质的复合物中的一或多于一种；和肝脱氧核糖核酸病毒科的S和/或L蛋白

术语“冠状病毒”是指一组引起疾病(例如，在哺乳动物和鸟类中)的RNA病毒。冠状病毒引起季节性上呼吸道或下呼吸道感染，在有免疫能力的宿主中，这些感染的严重程度为亚临床至中度。人类冠状病毒包括HCoV-229E、-NL63、-OC43、-HKU1、严重急性呼吸症候群(SARS)-CoV、中东呼吸症候群(MERS)-CoV和SARS-CoV-2。其中本文中使用术语冠状病毒，则考虑SARS-CoV-2作为具体实施方案。

术语“同源物”或“同源”在提及多肽使用时是指两种多肽之间的高度序列一致性，或三维结构之间的高度相似性，或活性位点与作用机制之间的高度相似性。在一个较佳实施方案中，同源物与参照序列具有大于60％的序列一致性、且更佳大于75％的序列一致性、且仍更佳大于90％的序列一致性。

当应用于多肽或多核苷酸时，术语“基本上一致”意指两个肽或核苷酸序列在例如通过程序“GAP”(Genetics Computer Group，Madison，Wis.)、“ALIGN”(DNAStar，Madison，Wis.)、Jotun Hein(Hein(2001)Proc.Pacific Symp.Biocomput.179-190)、使用缺省空位权重进行最佳比对时，共享至少80％序列一致性、较佳至少90％序列一致性、更佳至少95％序列一致性、例如至少96％一致性、至少97％一致性、至少98％一致性、至少99％一致性、至少99.5％一致性、至少99.9％一致性。较佳地，残基位置因保守氨基酸取代而不一致。较佳地，对于多肽，不相同的残基位置因保守的氨基酸取代而不同。

术语“变体”和“突变体”当提及多肽(或编码该多肽的多核苷酸)使用时是指与另一通常相关的多肽相差一或多于一个氨基酸的氨基酸序列(或编码的氨基酸序列)。变体可具有“保守”变化，其中经取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质。一种类型的保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。举例而言，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。较佳保守氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。更罕见地，变体可具有“非保守”变化(例如，用色氨酸替换甘氨酸)。相似微小变化还可包括氨基酸缺失或插入(换言之，添加)或两者。可使用本领域熟知的计算机程序例如DNAStar软件发现确定可取代、插入或缺失哪些氨基酸残基和多少氨基酸残基而不消除生物活性的指南。变体可在功能分析中进行测试。较佳变体具有小于10％、且较佳小于5％、且仍更佳小于2％的变化(无论是取代、缺失等)。

术语“基因”是指核酸(例如DNA或RNA)序列，其包含产生核糖核酸、多肽或其前体(例如，胰岛素原)所需的编码序列。功能多肽可由全长编码序列或编码序列的任何部分编码，只要保留多肽的期望活性或功能性质(例如酶活性、配体结合、信号转导等)即可。术语“部分”在提及基因时是指该基因的片段。片段的大小可为几个核苷酸至整个基因序列减去一个核苷酸。因此，“包含基因的至少一部分的核苷酸”可包含基因的片段或整个基因。

术语“基因”还涵盖结构基因的编码区，并包括位于5’和3’端上的编码区附近的序列，每端距离约1kb，使得该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5’且存在于mRNA上的序列称为5’非翻译序列。位于编码区3’或下游且存在于mRNA上的序列称为3’非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有夹杂有称为“内含子”或“插入区”或“间插序列”的非编码序列的编码区。内含子是转录成核RNA(mRNA)的基因的片段；内含子可含有调控元件，例如增强子。自核转录本或初级转录本去除或“剪接出”内含子；因此，信使RNA(mRNA)转录本中不存在内含子。mRNA在翻译期间起作用，以指定新生多肽中氨基酸的序列或次序。

除了含有内含子之外，基因的基因组形式也可包括位于RNA转录本上存在的序列的5’和3’端的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区(这些侧翼序列位于mRNA转录本上存在的非翻译序列的5’或3’)。5’侧翼区可含有调控序列，例如控制或影响基因转录的启动子和增强子。3’侧翼区可含有指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷酸化的序列。

术语“异源基因”是指编码不在其自然环境中(即，已经人手改变)的因子的基因。举例而言，异源基因包括自一个物种引入另一物种的基因。异源基因还包括生物体天然的基因，该基因已经以某种方式改变(例如，突变、以多个拷贝添加、与非天然启动子或增强子序列连接等)。异源基因与内源基因的区别在于，异源基因序列通常与包含调控元件(例如启动子)的核苷酸序列连结，这些核苷酸序列未发现与异源基因编码的蛋白质的基因或染色体中的基因序列天然相关，或者这些核苷酸序列与自然界中未发现的染色体的部分(例如，在正常地不表达基因的基因座中表达的基因)相关。

术语“多核苷酸”是指包含两个或多于两个、较佳多于三个、通常多于十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。确切大小取决于许多因素，而这些因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。多核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、反转录或其组合。术语“寡核苷酸”通常是指短长度的单链多核苷酸链，但其也可与术语“多核苷酸”互换使用。

术语“核酸”是指如上文所述的核苷酸的聚合物或多核苷酸。该术语用于命名单个分子或分子的集合。核酸可为单链或双链，且可包括如下文所述的编码区和各种控制元件区。

术语“编码基因的核酸”或“编码指定多肽的核酸”是指包含基因的编码区的核酸序列，或换言之，编码基因产物的核酸序列。编码区可以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸、多核苷酸或核酸可为单链(即有义链)或双链。若允许转录的正确起始和/或初级RNA转录本的正确处理需要，可将适宜控制元件例如增强子/启动子、剪接接合处、多聚腺苷酸化信号等放置于紧靠基因的编码区。或者，本公开内容的表达载体中利用的编码区可含有内源性增强子/启动子、剪接接合处、间插序列、多聚腺苷酸化信号等、或内源性和外源性控制元件的组合。

术语“重组”在提及核酸分子是指包含由经由分子生物学技术链接在一起的核酸的片段的核酸分子。术语“重组”在提及蛋白质或多肽时是指使用重组核酸分子表达的蛋白质分子。

术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即核苷酸的序列)。举例而言，对于序列“A-G-T”，与序列“T-C-A”互补。互补可为“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可存在“完全”或“总的”互补。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著效应。这在扩增反应和依赖于核酸之间的结合的检测方法中特别重要。

术语“同源性”在关于核酸使用时是指互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即一致性)。“序列一致性”是指两种或多于两种核酸或蛋白质之间的相关性的量度，并以相对于总比较长度的百分比给出。一致性计算考虑在各别较大序列中相同且处于相同相对位置的那些核苷酸或氨基酸残基。一致性计算可通过包含于计算机程序(例如“GAP”(Genetics Computer Group，Madison，Wis.)和“ALIGN”(DNAStar，Madison，Wis.)中的算法来实施。部分互补序列是至少部分抑制完全互补序列与靶核酸的杂交(或与完全互补序列竞争与靶核酸的杂交)的序列，且使用功能术语“实质上同源”提及。可在低严格性条件下使用杂交分析(Southern印迹法或Northern印迹法、溶液杂交和诸如此类)来检查完全互补序列与靶序列杂交的抑制。实质上同源的序列或探针将在低严格性条件下竞争并抑制与靶完全同源的序列的结合(即杂交)。此并不是说低严格性条件允许非特异性结合；低严格性条件要求两个序列彼此的结合是特异性(即选择性)相互作用。可通过使用甚至缺乏部分互补性程度(例如，小于约30％一致性)的第二靶标来测试非特异性结合的缺乏；在不存在非特异性结合的情况下，探针不会与第二非互补靶杂交。

以下术语用于阐述两个或多于两个多核苷酸之间的序列关系：“参照序列”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”和“实质一致性”。“参照序列”是用作序列比较的基础的定义序列；参照序列可为更大序列的子集，例如作为序列表中给出的全长cDNA序列的片段，或可包含完全基因序列。通常，参照序列的长度为至少20个核苷酸，通常长度为至少25个核苷酸，且通常长度为至少50个核苷酸。由于两个多核苷酸可各自(1)包含两个多核苷酸之间相似的序列(即，完全多核苷酸序列的一部分)，且(2)还可包含两个多核苷酸之间不同的序列，两个(或多于两个)多核苷酸之间的序列比较通常是通过在“比较窗”内比较两个多核苷酸的序列来实施，以鉴别和比较序列相似的局部区。本文所用的“比较窗”是指概念上至少20个邻接核苷酸位置的片段，其中多核苷酸序列可与至少20个邻接核苷酸的参照序列进行比较，且其中比较窗中的多核苷酸序列的部分可包含与参照序列(不包含添加或缺失)相比20％或少于20％的添加或缺失(即，间隙)，以最佳比对两个序列。通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981))、通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970))、通过Pearson和Lipman的相似性方法的研究(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.)85：2444(1988))、通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics Software PackageRelease 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575ScienceDr.，Madison，Wis.)、或通过检查来执行用于比对比较窗的序列的最佳比对，且选择通过各种方法产生的最佳比对(即，在比较窗内产生最高百分比的同源性)。术语“序列一致性”意指在比较窗内两个多核苷酸序列是相同的(即，在逐个核苷酸的基础上)。

在某些实施方案中，术语“序列一致性百分比”是通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列、确定两个序列中相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)出现的位置数以产生匹配位置数、将匹配位置数除以比较窗中的位置总数(即窗大小)、并将结果乘以100以产生序列一致性百分比来计算。

在某些实施方案中，序列“一致性”是指序列比对中比对的两个序列之间完全匹配的氨基酸数量(以百分比表示)，其是使用相同位置的数量除以最短序列或除悬突之外的等同位置的数量中的较大者来计算，其中内部间隙计数为等同位置。举例而言，多肽GGGGGG(SEQ ID NO：19)和GGGGT(SEQ ID NO：20)具有5分之4或80％的序列一致性。举例而言，多肽GGGPPP(SEQ ID NO：21)和GGGAPPP(SEQ ID NO：22)具有7分之6或85％的序列一致性。在某些实施方案中，本文表示的序列一致性的任何叙述皆可替代序列相似性。“相似性”百分比用于定量比对的两个序列之间的相似性。该方法与确定一致性相同，只是某些氨基酸不必相同才具有匹配。根据以下氨基酸组，若氨基酸属具有相似性质的组，则这些氨基酸分类为匹配：芳香族-F Y w；疏水-AV I L；带正电：R K H；带负电-D E；极性-S T N Q。

如本文所用术语“基本上一致性”表示多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包含在至少20个核苷酸位置的比较窗内、通常在至少25个至50个核苷酸的窗口内，与参照序列相比，具有至少85％序列一致性、较佳至少90％至95％序列一致性、更通常至少99％序列一致性的序列，其中序列一致性的百分比是通过将参照序列与多核苷酸序列进行比较来计算的，该多核苷酸序列可包括在比较窗内总共20％或少于20％的参照序列的缺失或添加。参照序列可为更大序列的子集，例如，作为本公开内容中要求保护的组合物的全长序列的片段。

当提及双链核酸序列例如cDNA或基因组克隆使用时，术语“基本上同源”是指在上述低至高严格性条件下能与双链核酸序列的任一或两条链杂交的任何探针。

当提及单链核酸序列使用时，术语“基本上同源”是指在上述低至高严格性条件下能与单链核酸序列杂交的任何探针，即，它是单链核酸序列的互补体。

术语“以可操作的组合”、“以可操作的次序”和“可操作连接”是指核酸序列以产生能够指导给定基因的转录和/或期望蛋白质分子的合成的核酸分子的方式的连接。该术语亦是指氨基酸序列以产生功能蛋白的方式的连接。

术语“调控元件”是指控制核酸序列的表达的一些方面的遗传元件。举例而言，启动子是促进可操作连接的编码区转录起始的调控元件。其他调控元件是剪接信号、多聚腺苷酸化信号、终止信号等。

真核生物中的转录控制信号包含“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用的DNA序列的短组组成(Maniatis等人，Science236：1237，1987)。启动子和增强子元件已自包括酵母、昆虫、哺乳动物和植物细胞的各种真核来源中的基因分离出。启动子和增强子元件亦已自病毒分离出并在原核生物中发现。特定启动子和增强子的选择取决于用于表达感兴趣的蛋白质的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其他在有限的细胞类型子集中起作用(关于综述，参见Voss等人，Trends Biochem.Sci.，11：287，1986；和Maniatis等人，上文文献1987)。

如本文所用术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指例如用作开关、激活基因表达的DNA序列。若基因经激活，据称其经转录，或参与转录。转录包括自基因的mRNA的合成。因此，启动子用作转录调控元件，且亦为基因转录成mRNA提供起始位点。

启动子可为组织特异性的或细胞特异性的。术语“组织特异性”在应用于启动子时是指在不同类型的组织(例如，叶)中相对缺乏相同的感兴趣的核苷酸序列表达的情况下，能够将感兴趣的核苷酸序列的选择性表达引导至特定类型的组织(例如，种子)的启动子。启动子的组织特异性可通过以下来评估：例如将报道基因可操作地连接至启动子序列以产生报道基因构建体、将报道基因构建体引入生物体的基因组中使得将报道基因构建体整合至所得转基因生物体的每个组织中、和检测报道基因在转基因生物体的不同组织中的表达(例如，检测报道基因编码的mRNA、蛋白质或蛋白质的活性)。相对于报道基因在其他组织中的表达程度，在一或多于一个组织中检测到更大的报道基因表达程度，显示启动子对检测到更大表达程度的组织具有特异性。术语“细胞类型特异性”在应用于启动子时是指在相同组织内不同类型细胞中相对缺乏相同的感兴趣的核苷酸序列表达的情况下，能够在特定类型细胞中引导感兴趣的核苷酸序列的选择性表达的启动子。术语“细胞类型特异性”当应用于启动子时亦意指能够促进单一组织内的区域中感兴趣的核苷酸序列的选择性表达的启动子。启动子的细胞类型特异性可使用本领域熟知的方法例如免疫组织化学染色来评估。简言之，将组织切片包埋在石蜡中，并使石蜡切片与对由感兴趣的核苷酸序列编码的多肽产物具有特异性的第一抗体反应，感兴趣的核苷酸序列的表达由启动子控制。使对第一抗体具有特异性的标记的(例如，过氧化物酶结合的)第二抗体与切片组织结合，并通过显微镜检测特异性结合(例如，与抗生物素蛋白/生物素)。

启动子可为组成型的或可调控的。术语“组成型”当提及启动子时意指该启动子能够在不存在刺激(例如，热休克、化学物质、光等)的情况下引导可操作连接的核酸序列的转录。通常，组成型启动子能够引导转基因在实质上任何细胞和任何组织中的表达。

相反，“可调控的”或“可诱导的”启动子是在存在刺激(例如，热休克、化学物质、光等)的情况下能够引导可操作连接的核酸序列的转录程度的，该转录程度不同于不存在刺激的情况下可操作连接的核酸序列的转录程度。

增强子和/或启动子可为“内源”或“外源”或“异源”的。“内源”增强子或启动子是与基因组中给定基因天然连接的增强子或启动子。“外源”或“异源”增强子或启动子是经由遗传操纵(即分子生物学技术)与基因并列放置的，使得基因的转录由连接的增强子或启动子指导。举例而言，可分离、去除与第一基因可操作组合的内源启动子，并将其与第二基因可操作组合放置，由此使它成为与第二基因可操作组合的“异源启动子”。考虑多种这些组合(例如，第一和第二基因可来自相同物种，或来自不同物种)。

重组DNA序列在真核细胞中的有效表达可需要表达引导所得转录本的有效终止和多聚腺苷酸化的信号。转录终止信号通常在多聚腺苷酸化信号的下游发现，且长度为几百个核苷酸。如本文所用术语“聚(A)位点”或“聚(A)序列”表示引导RNA转录本的终止和多聚腺苷酸化二者的DNA序列。重组转录本的有效多聚腺苷酸化是合理的，此乃因缺乏聚(A)尾的转录本是不稳定的且快速降解。表达载体中利用的聚(A)信号可为“异源”或“内源”的。在基因组中给定基因的编码区的3’端天然发现内源聚(A)信号。异源聚(A)信号是自一个基因中分离出并位于另一基因的3’端的。常用异源聚(A)信号是SV40聚(A)信号。SV40聚(A)信号包含于237bp BamHI/BclI限制性片段上，并引导终止和多聚腺苷酸化。

术语“载体”是指将DNA片段自一个细胞转移至另一细胞的核酸分子。术语“运载体”有时与“载体”互换使用

术语“表达载体”或“表达盒”是指含有期望编码序列和用于在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列的适当核酸序列的重组核酸。用于在原核生物中表达的核酸序列通常包括启动子、操作子(任选)和核糖体结合位点，通常和其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子、和终止和多聚腺苷酸化信号。

术语“宿主细胞”是指能够复制和/或转录和/或翻译异源基因的任何细胞。因此，“宿主细胞”是指任何真核或原核细胞(例如细菌细胞(例如大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)，无论位于体外或体内。举例而言，宿主细胞可位于转基因动物中。

“可选标记物”是导入重组载体的核酸，其编码赋予适合人工选择或鉴别的性状的多肽(亦参见下文的“报道基因”)，例如β-内酰胺酶赋予抗生素抗性，这允许表达β-内酰胺酶的生物体在存在抗生素下在生长培养基中存活。另一实例是胸苷激酶，其使宿主对更昔洛韦选择敏感。其可为可筛选的标记物，该标记物允许人们基于预期颜色的存在或不存在来区分想要和不想要的细胞。举例而言，lac-z-基因产生β-半乳糖苷酶，其在X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)存在下赋予蓝色。若重组插入使lac-z-基因失活，则所得群落是无色的。可存在一种或多于一种可选标记物，例如，可补充表达生物体不能合成其生长所需的特定化合物的酶(营养缺陷型)，和能够将化合物转化为另一种对生长有毒的化合物的酶。URA3是一种乳清酸-5′磷酸去羧酶，它是尿嘧啶生物合成所必需的，且可补充尿嘧啶营养缺陷型的ura3突变体。URA3还将5-氟乳清酸转化为有毒化合物5-氟尿嘧啶。额外考虑的可选标记物包括赋予抗菌抗性或表达荧光蛋白的任何基因。实例包括但不限于以下基因：ampr、camr、tetr、杀稻瘟菌素(blasticidinr)、neor、hygr、abxr、新霉素磷酸转移酶II型基因(nptII)、p-葡萄糖醛酸酶(gus)、绿色荧光蛋白(gfp)、egfp、yfp、mCherry、p-半乳糖苷酶(lacZ)、lacZa、lacZAM15、氯霉素乙酰基转移酶(cat)、碱性磷酸酶(phoA)、细菌荧光素酶(1uxAB)、双丙胺膦抗性基因(bar)、磷酸甘露糖异构酶(pmi)、木糖异构酶(xylA)、阿拉伯糖醇脱氢酶(atlD)、UDP-葡萄糖：半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶I(galt)、邻氨基苯甲酸合成酶的反馈不敏感α亚基(OASA1D)、2-脱氧葡萄糖(2-DOGR)、苄基腺嘌呤-N-3-葡糖苷酸、大肠杆菌苏氨酸脱胺酶、谷氨酸1-半醛转胺酶(GSA-AT)、D-氨基酸氧化酶(DAAO)、盐耐受基因(rstB)、铁氧化还原蛋白样蛋白(pflp)、海藻糖-6-P合酶基因(AtTPS1)、赖氨酸消旋酶(1yr)、二氢二吡啶甲酸合酶(dapA)、色氨酸合酶β1(AtTSB1)、脱卤素酶(dhlA)、甘露糖-6-磷酸还原酶基因(M6PR)、潮霉素磷酸转移酶(HPT)、和D-丝氨酸解氨酶(dsdA)。

“标记”是指与另一分子(例如抗体或蛋白质)直接或间接结合以促进该分子的检测的可检测的化合物或组合物。标记的具体、非限制性实例包括荧光标签、酶连接和放射性同位素。在一个实例中，“标记受体”是指在受体中纳入异源多肽。标记包括纳入放射性标记的氨基酸或将生物素部分共价连接至可由标记的抗生物素蛋白(例如，含有荧光标记物或可通过光学或比色方法检测酶活性的链霉抗生物素蛋白)检测的多肽。本领域已知且可使用标记多肽和糖蛋白的各种方法。多肽的标记的实例包括但不限于：放射性同位素或放射性核苷酸(如35S或131I)荧光标记(例如异硫氰酸荧光黄(FITC)、玫瑰红、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记物、生物素基团、由次级报道基因识别的预定多肽表位(例如；亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)或磁性试剂，例如钆螯合物。在一些实施方案中，标记通过不同长度的间隔臂连接，以减少潜在空间位阻。

“免疫原性组合物”是指能够在对象中引起免疫反应的一种或多于一种核酸或蛋白质。免疫原性组合物可包括例如病毒或其部分(例如活病毒或死病毒、病毒颗粒或病毒样颗粒(VLP))，在某些实施方案中，可作为疫苗施用。

在某些实施方案中，本公开内容涉及关于包含本文公开的序列或其变体或融合体的重组多肽，其中氨基酸序列的氨基末端或碳末端任选地连接至异源氨基酸序列、标记或报道基因分子。

在某些实施方案中，本公开内容涉及关于包含编码本文公开的多肽或其融合蛋白的核酸的重组载体。

在某些实施方案中，重组载体任选地包含哺乳动物、人类、昆虫、病毒、细菌、细菌质粒、酵母相关的复制起点或基因，例如基因或反转录病毒基因或慢病毒LTR、TAR、RRE、PE、SLIP、CRS和INS核苷酸片段或选自tat、rev、nef、vif、vpr、vpu和vpx的基因或选自gag、pol和env的结构基因。

在某些实施方案中，重组载体任选地包含基因载体元件(核酸)，例如选择标记物区、lac操纵子、CMV启动子、杂交鸡B-肌动蛋白/CMV增强子(CAG)启动子、tac启动子、T7RNA聚合酶启动子、SP6RNA聚合酶启动子、SV40启动子、内部核糖体进入位点(IRES)序列、顺式作用土拨鼠后调控元件(WPRE)、支架附着区(SAR)、反向末端重复序列(ITR)、FLAG标签编码区、c-myc标签编码区、金属亲和标签编码区、链霉抗生物素蛋白结合肽标签编码区、聚His标签编码区、HA标签编码区、MBP标签编码区、GST标签编码区、多聚腺苷酸化编码区、SV40多聚腺苷酸化信号、SV40复制起点、Col E1复制起点、f1起点、pBR322起点、或pUC起点、TEV蛋白酶识别位点、loxP位点、Cre重组酶编码区、或多个克隆位点，例如在少于50或60个核苷酸的连续区段内具有5、6、或7个或多于7个限制位点，或者在少于20或30个核苷酸的连续区段内具有3或4个或多于4个限制位点。

术语“报道基因”是指编码可分析的蛋白质的基因。报道基因的实例包括(但不限于)经修饰的katushka、mkate和mkate2(例如，参见Merzlyak等人，(2007)Nat.Methods 4，555-557和Shcherbo等人(2008)Biochem.J.418，567-574)、荧光素酶(例如，参见deWet等人，(1987)Mol.Cell.Biol.7：725和美国专利第6074859号、第5976796号、第5674713号和第5618682号；所有这些都以引用方式并入本文中)、绿色荧光蛋白(例如基因库登录号U43284；许多GFP变体是可商购获得自ClonTech Laboratories，Palo Alto，Calif.)、氯霉素乙酰基转移酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。

术语“野生型”在提及基因时是指具有自天然来源分离的基因的特征的基因。术语“野生型”在提及基因时是指具有自天然来源分离的基因产物的特征的基因产物。如本文所用术语“天然存在的”在应用于目标时是指可在自然界中发现目标的事实。举例而言，存在于可自自然界来源分离且尚未在实验室中经人类有意修饰的生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。野生型基因是在群体中最常观察到的基因，且因此任意地命名为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”或“突变”在提及基因或基因产物时分别是指在与野生型基因或基因产物相比时，展示序列和/或功能性质(即改变的特征)的修饰的基因或基因产物。注意，可分离天然存在的突变体；这些突变体是通过以下事实得以鉴别：在与野生型基因或基因产物相比时，其具有改变的特征。

术语“反义”或“反基因组”是指核苷酸残基的序列相对于有义链中的核苷酸残基的序列处于相反的5’至3’取向的核苷酸序列。DNA双链体的“有义链”是指DNA双链体中由处于自然状态的细胞转录成“有义mRNA”的一条链。因此，“反义”序列是与DNA双链体中的非编码链具有相同序列的序列。

术语“分离的”是指生物材料(例如病毒、核酸或蛋白质)实质上不含在其天然环境中通常伴随或与其相互作用的组分。分离的材料任选地包含在其自然环境(例如细胞)中未发现的材料。举例而言，若材料处于其自然环境例如细胞中，则该材料已放置在细胞(例如基因组或遗传元件)中并非在该环境中发现的材料所固有的位置。举例而言，天然存在的核酸(例如，编码序列、启动子、增强子等)若通过非天然存在的方式被引入并非该核酸所固有的基因组(例如载体，例如质粒或病毒载体、或扩增子)的基因座，则该天然存在的核酸经分离。这些核酸亦称为“异源”核酸。举例而言，分离的病毒在不同于野生型病毒的天然环境(例如，受感染对象的鼻咽)的环境中(例如，细胞培养系统，或自细胞培养物纯化)。

病毒或减毒病毒的“免疫有效量”是足以增强对象(例如人类)自身对随后暴露于试剂的免疫反应的量。诱发的免疫性的水平可通过(例如)测量中和分泌和/或血清抗体的量来监测，例如通过噬斑中和、补体结合、酶联免疫吸附或微中和分析。

针对病毒的“保护性免疫反应”是指当对象随后暴露于和/或感染野生型病毒时，个体(例如人类)表现的对严重下呼吸道疾病(例如肺炎和/或细支气管炎)具有保护性的免疫反应。

RSV

天然存在的RSV颗粒通常含有螺旋核壳内的病毒基因组，该核壳由基质蛋白和含有糖蛋白的包膜包围。人类野生型RSV的基因组编码蛋白质NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2和L。G、F和SH是糖蛋白。RSV聚合酶活性由大蛋白(L)和磷蛋白(P)组成。病毒M2-1蛋白是在转录期间中使用且可能是转录酶复合物的组分。病毒N蛋白用于在复制过程中用蛋白质壳体包裹新生RNA。

基因组在宿主细胞的细胞质中转录和复制。宿主细胞转录通常产生十个甲基化和多聚腺苷酸化mRNA的合成。反基因组是复制期间产生的基因组的正义RNA互补体，其进而用作基因组合成的模板。病毒基因侧接保守的基因起始(GS)和基因终止(GE)序列。在基因组的3’和5’端是前导序列和尾序列核苷酸。野生型前导序列在3’端含有启动子。当病毒聚合酶到达GE信号时，聚合酶多聚腺苷酸化并释放mRNA，并在下一GS信号处重新开始RNA合成。据信，L-P复合物负责启动子的识别、RNA合成、mRNA的5’末端的加帽和甲基化和其3’端的多聚腺苷酸化。据信聚合酶有时会在接合处与基因分离。由于聚合酶在基因组的3’端起始转录，产生表达的梯度，基因组的3’端的基因比5’端的基因转录得更频繁。

为了复制基因组，聚合酶对顺式作用的GE和GS信号不反应，并产生基因组的正义RNA互补体，即反基因组。在反基因组的3’端是含有启动子的尾序列的互补体。聚合酶利用此启动子产生基因组有义RNA。与以裸RNA形式释放的mRNA不同，反基因组和基因组RNA在合成时经病毒核蛋白(N)用蛋白质外壳包裹。

病毒mRNA翻译后，产生全长(+)反基因组RNA作为(-)RNA基因组复制的模板。传染性重组RSV(rRSV)颗粒可自转染的质粒回收。RSVN、P、L和M2-1蛋白和全长反基因组RNA的共表达对于RSV复制足矣。参见Collins等人，(1995)Proc Natl Acad Sci U SA.92(25)：11563-11567和美国专利第6790449号。

嵌合蛋白

在某些实施方案中，本公开内容涉及嵌合蛋白，其包含来自一种病毒的胞外结构域的至少一部分和第二病毒的胞质尾区。在某些实施方案中，嵌合蛋白进一步包含来自第一或第二病毒的跨膜结构域。举例而言，在某些实施方案中，胞外结构域的至少一部分和任选地跨膜结构域是源自正黏液病毒科(例如流行性感冒病毒)的HA蛋白；反转录病毒科的Env蛋白；副黏液病毒科(例如副流行性感冒、麻疹和腮腺炎病毒)的F和/或HN蛋白；冠状病毒科的S蛋白(例如SARS-CoV-2)；丝状病毒科的GP蛋白；沙粒病毒科的GP和/或SSP蛋白；披膜病毒科的E1/E2蛋白；黄病毒科的E(例如在TBEV中)或E1/E2(例如在HCV中)蛋白；布尼亚病毒科的GN/GC蛋白；弹状病毒科(例如VSV和狂犬病病毒)的G蛋白；疱疹病毒科的gB、gD和/或gH/L蛋白；痘病毒科中8种蛋白质的复合物中的一种或多于一种；和肝脱氧核糖核酸病毒科的S和/或L蛋白。在某些实施方案中，胞质尾区是源自正黏液病毒科(例如流行性感冒病毒)的HA蛋白；反转录病毒科的Env蛋白；副黏液病毒科(例如副流行性感冒、麻疹和腮腺炎病毒)的F和/或HN蛋白；冠状病毒科的S蛋白(例如SARS-CoV-2)；丝状病毒科的GP蛋白；沙粒病毒科的GP和/或SSP蛋白；披膜病毒科的E1/E2蛋白；黄病毒科的E(例如在TBEV中)或E1/E2(例如在HCV中)蛋白；布尼亚病毒科的GN/GC蛋白；弹状病毒科(例如VSV和狂犬病病毒)的G蛋白；疱疹病毒科的gB、gD和/或gH/L蛋白；痘病毒科中8种蛋白质的复合物中的一种或多于一种；和肝脱氧核糖核酸病毒科的S和/或L蛋白。

举例而言，在某些实施方案中，本公开内容提供嵌合蛋白，其包含非RSV融合蛋白和RSV F蛋白的至少一部分；和编码该嵌合蛋白的核酸。在某些实施方案中，本公开内容涵盖包含编码这些蛋白质的核酸的重组载体和包含这些载体的细胞。在某些实施方案中，载体包含可选标记物或报道基因。

在某些实施方案中，本公开内容涉及嵌合蛋白，其包含非RSV融合蛋白的胞外结构域和RSV F蛋白胞质尾区。在某些实施方案中，嵌合蛋白进一步包含非RSV融合蛋白或RSVF蛋白的跨膜结构域。在某些实施方案中，非RSV融合蛋白是SARS-CoV-2刺突蛋白。

在某些实施方案中，本公开内容涉及嵌合蛋白，其包含第一非RSV融合蛋白(例如冠状病毒刺突蛋白)的胞外结构域和第二非RSV融合蛋白的胞质尾区，第二非RSV融合蛋白例如正黏液病毒科(例如流行性感冒)的HA蛋白；副黏液病毒科(例如副流行性感冒、麻疹和腮腺炎病毒)的F和/或HN蛋白；冠状病毒科(例如SARS-CoV-2)的S蛋白；丝状病毒科的GP蛋白；沙粒病毒科的GP和/或SSP蛋白；披膜病毒科的E1/E2蛋白；黄病毒科的E(例如在TBEV中)或E1/E2(例如在HCV中)蛋白；布尼亚病毒科的GN/GC蛋白；弹状病毒科的G蛋白；疱疹病毒科的gB、gD和/或gH/L蛋白；痘病毒科中8种蛋白质的复合物中的一种或多于一种；和肝脱氧核糖核酸病毒科的S和/或L蛋白。在某些实施方案中，嵌合蛋白进一步包含第一或第二非RSV融合蛋白的跨膜结构域。在某些实施方案中，第一非RSV融合蛋白是SARS-CoV-2刺突蛋白。

在某些实施方案中，本公开内容涉及嵌合蛋白，其包含(1)SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域和任选地跨膜结构域和(2)流行性感冒病毒HA蛋白、副流行性感冒病毒F或HN蛋白、麻疹病毒F或HN蛋白、腮腺炎病毒F或HN蛋白、水疱性口炎病毒(VSV)G蛋白或狂犬病病毒G蛋白的胞质尾区。在某些实施方案中，嵌合蛋白进一步包含流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒(VSV)或狂犬病病毒的跨膜结构域。流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒(VSV)和狂犬病病毒的跨膜和细胞质结构域的序列为本领域已知。上述示例性胞质尾区序列提供于表1中。其他考虑的胞质尾区序列包括与表1中的胞质尾区序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列一致性的那些。

表1-胞质尾区序列

用于嵌合蛋白中的冠状病毒刺突蛋白和其部分

在某些实施方案中，本公开内容涉及包含冠状病毒(例如SARS-CoV-2)刺突蛋白的至少一部分和RSV F蛋白的至少一部分的嵌合蛋白的某些期望序列和编码其的重组核酸。在某些实施方案中，本公开内容涵盖包含编码这些多肽的核酸的重组载体和包含这些载体的细胞。在某些实施方案中，载体包含可选标记物或报道基因。

在某些实施方案中，本公开内容涉及包含冠状病毒(例如SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白胞外结构域和跨膜结构域和RSV F蛋白胞质尾区的嵌合蛋白。

如图1中示意性显示(参见刺突基因部分)，冠状病毒刺突蛋白包含由弗林蛋白酶切割位点分开的S1结构域和S2结构域(S1/S2)。S1结构域含有两个亚结构域：N-末端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)。S2结构域含有两个七肽重复序列(HR1和HR2)、S2’切割位点和CD26相互作用结构域(“CD”)、融合肽(FP)、和跨膜结构域(TM)。

在某些实施方案中，冠状病毒刺突蛋白包含

或其一部分或变体。

在某些实施方案中，冠状病毒刺突蛋白的部分包含SEQ ID NO：23的氨基酸1-1210、SEQ ID NO：23的氨基酸1-1254、SEQ ID NO：23的1-1241、SEQ ID NO：23的1-1240或SEQ ID NO：23的1-1260。

在某些实施方案中，冠状病毒刺突蛋白的部分包含弗林蛋白酶切割位点的缺失(PRRA(SEQ ID：137))(参见SEQ ID：23的氨基酸681-684和图9的示意图)、或弗林蛋白酶切割位点的突变(例如R682Q，其将弗林蛋白酶切割位点自PRRA(SEQ ID：137)改变为PQRA(SEQID：138))。在某些实施方案中，冠状病毒刺突蛋白的部分包括氨基酸P的缺失、两个R氨基酸之一的缺失、氨基酸A的缺失、弗林蛋白酶切割位点的氨基酸PR、RR、RA、PRR或RRA的缺失。在某些实施方案中，冠状病毒刺突蛋白的部分包含氨基酸P的取代、两个R氨基酸中的一者或两者的取代、氨基酸A的取代或其任意组合。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割位点的氨基酸经氨基酸Q取代。

在某些实施方案中，冠状病毒刺突蛋白的部分包含对应于L5、S13、L18、T19、T20、P26、A67、D80、T95、D138、G142、W152、E154、F157、R158、R190、D215、D253、R246、K417、L452、L453、S477、T478、E484、N501、F565、A570、D614、H655、Q677、P681、A701、T716、T791、T859、F888、D950、S982、T1027I、Q1071、D1118、V1176的位置处的一个或多于一个氨基酸取代、和/或氨基酸69和70、144、156和157中的一个或多于一个的缺失，其中氨基酸编号对应于SEQID NO：23。在某些实施方案中，冠状病毒刺突蛋白的部分包含以下氨基酸取代中的一个或多于一个：L5F、S13I、L18F、T19R、T20N、P26S、A67V、D80A、D80G、T95I、D138Y、G142D、W152C、E154K、F157S、R158G、R190S、D215G、R246I、D253G、K417N、K417T、L452R、S477N、T478K、E484K、E484Q、N501Y、F565L、A570D、D614G、H655Y、Q677H、P681H、P681R、A701V、T716I、T791I、T859N、F888L、D950H、D950N、S982A、T1027I、Q1071H、和D1118H、V1176F，其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO：23。

在某些实施方案中，冠状病毒刺突蛋白的部分包含表2中列出的任何变体中所示的氨基酸取代和/或缺失的组合。

表2

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在某些实施方案中，嵌合蛋白包含如本文所述的冠状病毒刺突蛋白、或其部分(例如包含至少约200个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约800个氨基酸、至少约900个氨基酸、至少约1000个氨基酸、至少约1100个氨基酸、至少约1200个氨基酸、至少约1210个氨基酸、至少约1220个氨基酸、至少约1230个氨基酸、至少约1240个氨基酸、至少约1250个氨基酸、至少约1260个氨基酸或至少约1270个氨基酸的其片段)、或其变体(例如与其包含至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％序列一致性的冠状病毒刺突蛋白)。在某些实施方案中，刺突蛋白截短约1-100个氨基酸、约1-90个氨基酸、约1-80个氨基酸、约1-70个氨基酸、约1-60个氨基酸或约1-50个氨基酸，例如约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、或约10个氨基酸。

在某些实施方案中，冠状病毒刺突蛋白由SEQ ID NO：24或与其具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％序列一致性的其部分或变体编码。

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用于嵌合蛋白的RSV F蛋白和其部分

在某些实施方案中，嵌合蛋白包含RSV胞质尾区(CT)结构域或其部分。F蛋白的RSV胞质尾区(CT)结构域的位置和结构为本领域已知(例如，参见Baviskar等人(2013)J Virol87(19)：10730-10741)。在某些实施方案中，且如本领域常用，术语F蛋白的RSV胞质尾区(CT)结构域是指序列KARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：25)或KARSTPITLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：26)(例如，参见图2)。

在某些实施方案中，RSV F蛋白胞质尾区(CT)的一部分是指包含SEQ ID NO：25或26或与SEQ ID NO：25或26包含至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列一致性的序列的至少约15个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约21个氨基酸、至少约22个氨基酸或至少约23个氨基酸的RSV F蛋白CT的片段。在某些实施方案中，RSV CT结构域在N-和/或C-末端截短约1-15个胺基、约1-10个氨基酸、约1-5个氨基酸、约1-3个氨基酸、约5-15个氨基酸或约5-10个氨基酸，例如约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、或约10个氨基酸。

在某些实施方案中，嵌合蛋白包含RSV F蛋白胞质尾区(CT)结构域和RSV跨膜(TM)结构域或其部分。RSV跨膜结构域(TM)的位置和结构为本领域已知(例如，参见Collins等人(1984)PNAS 81：7683-7687，图3)且可包括序列IMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYC(SEQ ID NO：27)或IMITAIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYC(SEQ ID NO：28)。在某些实施方案中，嵌合蛋白包含RSV跨膜(TM)结构域的部分(例如包含SEQ ID NO：27或28、或与SEQ ID NO：27或28包含至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列一致性的序列的至少约15个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约21个氨基酸、至少约22个氨基酸、至少约23个氨基酸、至少约24个氨基酸或至少约25个氨基酸的RSV跨膜(TM)结构域的片段)。在某些实施方案中，RSV TM结构域在SEQ ID NO：27或28的N-和/或C-末端截短约1-15个氨基酸、约1-10个氨基酸、约1-5个氨基酸、约1-3个氨基酸、约5-15个氨基酸或约5-10个氨基酸，例如约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个氨基酸。

在某些实施方案中，嵌合蛋白包含在RSV F蛋白的跨膜(TM)结构域的N-末端的RSVF蛋白质序列的至少一部分，例如GKSTTN(SEQ ID NO：29)。因此，在某些实施方案中，嵌合蛋白包含选自GKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：30)和GKSTTNIMITAIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKARSTPITLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：31)或上述中的任一项的一部分的RSV F蛋白质序列的至少一部分。举例而言，RSV F蛋白质序列的一部分可包括序列GLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO∶32)、YCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：33)、CKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：34)、KARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：35)、ARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：36)、GLLLYCKARSTPITLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：37)、YCKARSTPITLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：38)、CKARSTPITLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：39)、KARSTPITLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：40)、ARSTPITLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：41)、或上述中任一项的一部分(例如包含至少约15个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约21个氨基酸、至少约22个氨基酸、至少约23个氨基酸、至少约24个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约26个氨基酸、至少约27个氨基酸、至少约28个氨基酸、或至少约29个氨基酸或与其包含至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列一致性的序列的上述中的任一项的片段)。在某些实施方案中，RSV CT结构域在N-或C-末端截短约1-15个氨基酸、约1-10个氨基酸、约1-5个氨基酸、约1-3个氨基酸、约5-15个氨基酸或约5-10个氨基酸，例如约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个氨基酸。

在某些实施方案中，嵌合冠状病毒S蛋白-RSV F蛋白中所用的F蛋白的部分是来自A2RSV毒株。在某些实施方案中，使用来自RSV系19毒株的更加热稳定的F蛋白。不期望受限于理论，使用来自RSV系19的F蛋白可为有利的，此是因已针对F蛋白的前体F构形诱导高效RSV中和抗体，且系19F蛋白在病毒颗粒表面上维持相对高含量的前体F。

嵌合冠状病毒S-RSV F蛋白

在某些实施方案中，本公开内容提供嵌合冠状病毒-RSV蛋白，其包含冠状病毒S蛋白的N-末端部分和RSV F蛋白的C-末端部分。在某些实施方案中，嵌合冠状病毒-RSV蛋白的N-末端部分包含如本文所述的冠状病毒刺突蛋白、或其变体(例如与本文所述的冠状病毒刺突蛋白包含至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列一致性的冠状病毒刺突蛋白)的至少约200个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约800个氨基酸、至少约900个氨基酸、至少约1000个氨基酸、至少约1100个氨基酸、至少约1200个氨基酸、至少约1210个氨基酸、至少约1220个氨基酸、至少约1230个氨基酸、至少约1240个氨基酸、至少约1250个氨基酸、至少约1260个氨基酸或至少约1270个氨基酸。在某些实施方案中，刺突蛋白的N-末端部分截断约1-100个氨基酸、约1-90个氨基酸、约1-80个氨基酸、约1-70个氨基酸、约1-60个氨基酸或约1-50个氨基酸，例如约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个氨基酸。在某些实施方案中，嵌合冠状病毒-RSV蛋白的C-末端部分包含RSV F蛋白的C-末端部分的约10至约100个氨基酸、RSV F蛋白的C-末端部分的约20至约50个氨基酸、C-末端部分的约25至约50个氨基酸、RSV F蛋白的C-末端部分的约20至约40个氨基酸、C-末端部分的约25至约40个氨基酸、RSV F蛋白的C-末端部分的约20至约30个氨基酸、C-末端部分的约25至约30个氨基酸、或RSV F蛋白的C-末端部分的约24个氨基酸。

在某些实施方案中，嵌合冠状病毒-RSV蛋白中所用的冠状病毒(例如SARS-CoV-2)和RSV序列的部分包含与野生型蛋白的相应部分的约70％或大于70％、约75％或大于75％、约80％或大于80％、约85％或大于85％、约90％或大于90％、约95％或大于95％、约96％或大于96％、约97％或大于97％、约98％或大于98％或约99％或大于99％的序列一致性。

在某些实施方案中，嵌合冠状病毒-RSV蛋白包含选自SEQ ID NO：1-6、62、68、74、80、86、92、98和110的序列，或包含与选自SEQ ID NO：1-6、62、68、74、80、86、92、98和110的蛋白质的约80％或大于80％、约85％或大于85％、约90％或大于90％、约95％或大于95％、约96％或大于96％、约97％或大于97％、约98％或大于98％、或约99％或大于99％的序列一致性的蛋白质。

在某些实施例中，嵌合冠状病毒-RSV蛋白由包含选自SEQ ID NO：7-12、63、69、75、81、87、93、99和111的序列的核酸序列、或包含与选自SEQ ID NO：7-12、63、69、75、81、87、93、99和111的核酸的约80％或大于80％、约85％或大于85％、约90％或大于90％、约95％或大于95％、约96％或大于96％、约97％或大于97％、约98％或大于98％或约99％或大于99％的序列一致性的核酸序列、或上述任一项的RNA对应体、或上述任一项的互补序列编码。

嵌合RSV

用于储存RSV的常见载体包括质粒和细菌人工染色体(BAC)。通常，细菌人工染色体包含一个或多于一个选自因子F的oriS、repE、parA和parB基因的基因与可选标记物的可操作组合，可选标记物例如，对抗生素提供抗性的基因。核酸序列可为任选地突变的病毒例如任选地突变的RSV毒株的基因组或反基因组序列。

在大肠杆菌中培养RSV可通过利用细菌人工染色体(BAC)来完成。用于储存和遗传工程化RSV的BAC载体报道于Stobart等人，Methods Mol Biol.，2016，1442：141-53和美国专利申请公开第2012/0264217号中。公开的BAC含有除F基因外的呼吸道合胞病毒(RSV)株A2的完整反基因组序列，该F基因是RSV毒株19系的反基因组序列。

因此，本文公开的嵌合蛋白(例如，嵌合冠状病毒-RSV蛋白)可使用BAC例如Stobart等人(2016)，上文文献中报道的BAC来储存和培养，其中F基因和任选地G基因经编码嵌合蛋白的核苷酸序列替换。

包含嵌合RSV的质粒或BAC可与辅助质粒一起用于反向遗传学系统中，以回收传染性病毒。质粒上的反基因组序列可在病毒回收之前进行突变，以产生具有期望突变的病毒。

在某些实施方案中，本公开内容涉及产生嵌合RSV颗粒(例如，嵌合冠状病毒-RSV颗粒)的方法，其包括将具有BAC基因和嵌合RSV反基因组(例如，冠状病毒-RSV反基因组)的载体插入分离的真核细胞中，并在使得形成RSV病毒颗粒的条件下向细胞中插入一种或多于一种选自以下的载体(例如辅助质粒)：编码RSV的N蛋白(例如NS1或NS2)的载体、编码RSV的P蛋白的载体、编码RSV的L蛋白的载体和编码RSV的M2-1蛋白的载体。在某些实施方案中，编码N蛋白、P蛋白、L蛋白或MS-1蛋白的载体经密码子去优化。将载体插入细胞中可通过在使得载体进入细胞的条件下物理注射、电穿孔或混合细胞和载体来进行。

考虑嵌合RSV(如嵌合冠状病毒-RSV)包括某些突变、缺失或变体组合，例如RSV的冷传代(cp)非温度敏感(ts)衍生物，cpRSV，例如rA2cp248/404/1030ASH。rA2cp248/404ΔSH含有4个独立的减毒遗传元件：cp，其是基于N和L蛋白中共同赋予cpRSV的非ts减毒表型的误义突变；ts248，L蛋白中的误义突变；ts404，M2基因的基因起始转录信号中的核苷酸取代；和ΔSH，SH基因的完全缺失。rA2cp248/404/1030ΔSH含有独立的减毒遗传元件：存在于rA2cp248/404ΔSH中的那些；和ts1030，L蛋白中的另一误义突变。参见Karron等人，(2005)JInFectDis.191(7)：1093-1104，其以引用方式并入本文中。

在某些实施方案中，考虑嵌合RSV反基因组(例如冠状病毒-RSV反基因组)可含有非必需基因(例如G、SH、NS1、NS2和M2-2基因)或其组合中的缺失或突变。举例而言，在某些实施方案中，基因SH不存在。在某些实施方案中，SH基因与G基因之间的基因间区不存在。在某些实施方案中，基因G不存在。不期望受限于理论，据信SH基因和SH基因与G基因之间的基因间区的排除可增加嵌合RSV F蛋白(例如，嵌合冠状病毒S蛋白/RSV F蛋白)的转录，并在体内使病毒减弱。

在某些实施方案中，RSV G基因在氨基酸48包含Met至Ile突变，以消除G蛋白的分泌形式。不期望受限于理论，据信G蛋白的分泌形式用作抗原诱饵，且对于体外复制并非必需的，因此消除G蛋白的分泌形式可为有利的。

由于遗传密码的冗余，个别氨基酸由多个密码子序列编码，有时称为同义密码子。在不同物种中，同义密码子使用较频繁或较不频繁，有时称为密码子偏好。将表达不足的同义密码子遗传工程化至基因的编码序列中已显示会导致蛋白质翻译速率降低，而蛋白质的氨基酸序列没有变化。Mueller等人报道通过密码子偏好性的变化来减弱病毒。参见Science，2008，320：1784。还参见WO/2008121992，WO/2006042156，Bums等人(2006)JVirology 80(7)：3259和Mueller等人(2006)J Virology 80(19)：9687。

RSV中密码子去优化的使用报道于Meng等人，MBio 5，e01704-01714(2014)和美国专利申请公开第2016/0030549号中。在某些实施方案中，本公开内容涉及分离的核酸、具有密码子去优化的重组冠状病毒-RSV、由其产生的疫苗和与其相关的疫苗接种方法。在某些实施方案中，密码子去优化包括使用在人类中使用较不频率的密码子。在某些实施方案中，密码子去优化在非结构基因NS1和NS2中，且任选地在基因L中。

在某些实施方案中，密码子去优化在编码选自以下的嵌合冠状病毒-RSV蛋白质序列的核酸中：SEQ ID NO：1-6、62、68、74、80、86、92、98和110或其变体。

在某些实施方案中，本公开内容涉及包含野生型人类RSV或其变体的去优化RSV基因(例如，NS1和/或NS2、和任选地基因L)的分离的核酸，其中核苷酸经取代，使得产生Gly的密码子是GGT，产生Asp的密码子是GAT，产生Glu的密码子是GAA，产生His的密码子是CAT，产生Ile的密码子是ATA，产生Lys的密码子是AAA，产生Leu的密码子是CTA，产生Asn的密码子是AAT，产生Gln的密码子是CAA，产生Val的密码子是GTA，或产生Tyr的密码子是TAT，或其组合。在某些实施方案中，分离的核酸中的基因进一步包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或所有个别密码子的组合。在某些实施方案中，分离的核酸中的基因包含至少20、30、40或50种或多于50种密码子。

在某些实施方案中，本公开内容涉及包含野生型人类RSV或其变体的去优化RSV基因(例如，NS1和/或NS2，任选地基因L)的分离的核酸，其中核苷酸经取代，使得产生Ala的密码子是GCG，产生Cys的密码子是TGT，产生Phe的密码子是TTT，产生Pro的密码子是CCG，产生Arg的密码子是CGT，产生Ser的密码子是TCG，或产生Thr的密码子是ACG，或其组合。在某些实施方案中，含有基因的核酸包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17种或所有个别密码子的组合。在某些实施方案中，分离的核酸中的基因进一步包含至少20、30、40或50种或多于50种密码子。

在某些实施方案中，密码子去优化NS1基因包含序列：

在某些实施方案中，密码子去优化NS2基因包含序列：

不期望受限于理论，NS1和NS2的密码子去优化可为有利的，此是因已知NS1和NS2蛋白干扰宿主干扰素对感染的反应，且对于体外复制并非必需的。

在某些实施方案中，本公开内容涉及编码嵌合非RSV/RSV F蛋白例如嵌合冠状病毒S蛋白和RSV F蛋白的去优化基因的分离的核酸。嵌合冠状病毒S蛋白和RSV F蛋白可具有选自SEQ ID NO：1-6、62、68、74、80、86、92、98和110的序列或其变体，其中核苷酸经取代，使得产生Gly的密码子是GGT，产生Asp的密码子是GAT，产生Glu的密码子是GAA，产生His的密码子是CAT，产生Ile的密码子是ATA，产生Lys的密码子是AAA，产生Leu的密码子是CTA，产生Asn的密码子是AAT，产生Gln的密码子是CAA，产生Val的密码子是GTA，或产生Tyr的密码子是TAT，或其组合。在某些实施方案中，分离的核酸中的基因进一步包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或所有个别密码子的组合。在某些实施方案中，分离的核酸中的基因包含至少20、30、40或50种或多于50种密码子。

Glenn等人报道健康育龄妇女中R呼吸道合胞病毒重组融合(F)纳米颗粒疫苗的随机化、盲法、对照、剂量范围研究((2016)J InFect Dis.213(3)：411-22)。在某些实施方案中，本公开内容涉及病毒颗粒和类病毒颗粒(VLP)，其含有包含非RSV融合蛋白(例如冠状病毒S蛋白)的一部分和RSV F蛋白的一部分的嵌合蛋白，和一种或多于一种如本文所述足以形成VLP的RSV核心结构蛋白，嵌合蛋白例如包含选自SEQ ID NO：1-6、62、68、74、80、86、92、98和110的序列或其变体的嵌合冠状病毒S蛋白和RSV F蛋白。病毒颗粒通常用作灭活疫苗(或杀死的疫苗)。RSV可在培养物中生长，且然后使用诸如加热或甲醛等方法杀死。减毒活疫苗通常被削弱，使得复制和/或感染的速度较慢。

在某些实施方案中，本公开内容考虑嵌合RSV颗粒(例如，嵌合冠状病毒-RSV颗粒)作为全病毒疫苗，例如，暴露于热、化学物质或辐射使得嵌合RSV的基因组是非复制性或非传染性的整个病毒颗粒。在某些实施方案中，本公开内容考虑分裂的病毒疫苗中的嵌合RSV颗粒(例如，嵌合冠状病毒-RSV颗粒)，该分裂的病毒疫苗是通过使用清洁剂破坏病毒并通过纯化出本文公开的嵌合蛋白作为抗原来刺激免疫系统对病毒产生反应而产生。

在某些实施方案中，本公开内容涉及活的减毒嵌合RSV-SARS-CoV-2反基因组，其包含选自SEQ ID NO：13-18、65、71、77、83、89、95、101、104-109和113的序列或与选自SEQID NO∶13-18、65、71、77、83、89、95、101、104-109和113的序列具有至少约85％(例如至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)序列一致性的其变体、或上述任一项的RNA对应体、或上述任一项的互补序列。

VLP与成熟病毒颗粒非常相似，但其不含病毒基因组物质(即病毒基因组RNA)。因此，VLP本质上是不可复制的。此外，VLP可在VLP的表面上表达蛋白质。此外，由于VLP类似于完整病毒颗粒且是多价颗粒结构，故VLP可有效地诱发针对表面蛋白的中和抗体。VLP可反复施用。

在某些实施方案中，本公开内容考虑包含表面上的本文公开的嵌合RSVF蛋白(例如嵌合冠状病毒S蛋白-RSV F蛋白)和流行性感冒病毒基质(M1)蛋白核的VLP。Quan等人报道产生由流行性感冒病毒基质(M1)蛋白核和表面上的RSV-F构成的病毒样颗粒(VLP)的方法(2011)J Infect Dis.204(7)：987-995。可生产表达RSV F和流行性感冒M1的重组杆状病毒(rBV)，并将其转染至昆虫细胞中用于生产。

使用方法

在某些实施方案中，本公开内容涉及免疫原性组合物，其包含免疫有效量的嵌合RSV(例如嵌合冠状病毒-RSV)、RSV和/或非RSV(例如冠状病毒)多肽、嵌合RSV(例如嵌合冠状病毒-RSV)颗粒、嵌合RSV病毒样颗粒(例如嵌合冠状病毒/RSV VLP、和/或本文公开的核酸。在某些实施方案中，本公开内容涉及刺激对象的免疫系统以产生针对非RSV病毒(例如冠状病毒，例如SARS-CoV-2)的保护性免疫反应的方法。在某些实施方案中，将免疫有效量的本文公开的嵌合RSV(例如嵌合冠状病毒-RSV)、多肽和/或核酸在生理可接受的载剂中施用给对象。

在某些实施方案中，本公开内容涉及包含本文公开的核酸的药剂和疫苗产品，其用于本文公开的用途。

在某些实施方案中，本公开内容涉及本文公开的核酸或载体用于制造用于本文公开的用途的药剂和疫苗产品的用途。

本公开内容亦提供分析其他类型的减毒突变并将其纳入嵌合RSV(例如嵌合冠状病毒-RSV)用于疫苗或其他用途的能力。举例而言，小鼠肺炎病毒的组织培养适应非致病毒株(RSV的鼠对应体)缺乏G蛋白的胞质尾区(Randhawa等人，(1995)Virology 207：240-245)。以此类推，糖蛋白、HN、G和SH中的每一者的细胞质和跨膜结构域可缺失或经修饰以达到减毒。

用于本公开内容的传染性嵌合RSV(例如，嵌合冠状病毒/RSV)的其他突变包括在嵌合RSV小基因组(例如，冠状病毒-RSV小基因组)的突变分析期间鉴别的顺式作用信号的突变。举例而言，前导和尾曳序列和侧翼序列的插入和缺失分析鉴别病毒启动子和转录信号，并提供一系列与不同程度的RNA复制或转录减少相关的突变。这些顺式作用信号的饱和诱变(其中每一位置进而经修饰成核苷酸替代物中的每一者)亦已鉴别许多减少(或在一种情形下增加)RNA复制或的突变。这些突变中的任一项皆可插入如本文所述的完整反基因组或基因组中。其他突变包括基因组的3’端经来自反基因组的对应体替换，此与RNA复制和转录的变化相关。此外，基因间区(Collins等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4594-4598，以引用方式并入本文中)可缩短或延长或改变序列内容，且天然存在的基因重叠(Collins等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5134-5138，以引用方式并入本文中)可通过本文所述的方法去除或变为不同基因间区。

对于疫苗用途，根据本公开内容阐述的病毒可直接用于疫苗制剂，或若期望使用本领域技术人员熟知的冻干方案冻干。冻干的病毒通常维持在约4℃。当准备使用时，将冻干的病毒在有或没有佐剂的稳定溶液，例如盐水或包含SPG、Mg和HEPES中重构。

通常，本公开内容的嵌合RSV疫苗(例如冠状病毒-RSV疫苗)含有免疫遗传学有效量的如本文所述产生的嵌合病毒作为活性成分。可用生理上可接受的载剂和/或佐剂将经修饰的病毒引入对象中。有用的载剂为本领域所熟知，且包括例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、玻尿酸和诸如此类。所得水溶液可经包装以按原样使用或冻干，在施用前将该冻干制剂与无菌溶液组合，如上文所提及。组合物可视需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调整和缓冲剂、张力调整剂、润湿剂和诸如此类，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、去水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和诸如此类。可接受的佐剂包括不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾，其是本领域熟知的材料。

在某些实施方案中，嵌合RSV疫苗(例如冠状病毒-RSV疫苗)可调配于无菌、非辅助、缓冲的水溶液中，并填充至聚丙烯冷冻瓶中。制剂可包含Williams E无血清培养基、蔗糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、L-谷氨酸和氢氧化钠，以将pH调整至pH 7.9。

在经由气溶胶、液滴、口服、局部或其他途径用如本文所述的嵌合RSV组合物(例如冠状病毒-RSV组合物)免疫时，对象的免疫系统通过产生对病毒蛋白例如S糖蛋白具有特异性的抗体来对疫苗作出反应。由于疫苗接种，对象变得对冠状病毒感染至少部分或完全免疫，或对特别是下呼吸道感染的发生的中度或重度冠状病毒感染具有抵抗力。

施用疫苗的对象可为易受非RSV(例如冠状病毒，例如SARS-CoV-2)或密切相关病毒感染的任何哺乳动物，且该对象能够对疫苗接种毒株的抗原产生保护性免疫反应。因此，适宜对象包括人类、非人类灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、兔类动物、啮齿动物等。因此，本公开内容提供用于产生用于多种人类和兽医用途的疫苗的方法。

将含有本公开内容的嵌合RSV(例如冠状病毒-RSV)的疫苗组合物施用给易受冠状病毒感染或以其他方式处于冠状病毒感染风险下的对象，以增强对象自身的免疫反应能力。该量定义为“免疫原性有效剂量”。在此使用中，精确量再次取决于对象的健康状态和体重、施用方式、制剂的性质。疫苗制剂应提供足以有效保护目标患者免受严重或危及生命的感染的量的本公开内容的嵌合冠状病毒-RSV。

根据本公开内容产生的嵌合RSV(例如冠状病毒-RSV)可与其他亚组或毒株的病毒组合，以实现针对多个非RSV(例如冠状病毒)亚组或毒株的保护，或这些毒株的保护性表位可工程化为如本文所述的一种病毒。通常，将不同病毒混合在一起并同时施用，但亦可分开施用。举例而言，由于冠状病毒亚组的S糖蛋白的氨基酸序列不同，故此相似性是如在用嵌合冠状病毒-RSV或S抗原免疫并用异源毒株攻击的动物中观察到的交叉保护性免疫反应的基础。因此，用一种毒株免疫可保护抵抗相同或不同亚组的不同毒株。

在一些情况下，可期望将本公开内容的嵌合RSV疫苗(例如，嵌合冠状病毒-RSV疫苗)与诱导对其他试剂的保护性反应的疫苗组合。举例而言，本公开内容的嵌合RSV疫苗(例如，嵌合冠状病毒-RSV疫苗)可与流行性感冒疫苗同时施用。

可实施本公开内容的疫苗组合物的单次或多次施用。在某些实施方案中，单剂量的疫苗组合物足以产生免疫性。在某些实施方案中，不需要佐剂。可需要多次连续施用以引发足够的免疫性程度。施用可在生命的第一个月内开始，或在约两个月龄之前开始，通常不晚于六个月龄，并在整个儿童期中以间隔、例如两个月、六个月、一年和两年施用，如维持针对天然(野生型)感染的足够程度的保护所必需。类似地，特别易于反复冠状病毒感染或严重冠状病毒感染的成年人，例如健康照护工作者、日托提供者、老年护理提供者、老年人(超过55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁或90岁)或心肺功能受损的对象可需要多次免疫来建立和/或维持保护性免疫反应。诱发的免疫性的程度可通过量测中和分泌抗体和血清抗体的量来监测，并视维持期望保护程度所需调整剂量或重复接种疫苗。此外，不同疫苗病毒可对不同接受者群体是有利的。举例而言，表达富含T细胞表位的额外蛋白质的工程化毒株对除婴儿外的成人可特别有利。

施用通常是通过气溶胶、雾化器或其他局部应用于所治疗患者的呼吸道。重组嵌合RSV(例如嵌合冠状病毒-RSV)是以足以产生治疗或预防水平的期望基因产物表达量施用的。在该方法中施用的代表性基因产物的实例包括编码例如尤其适合瞬时表达的那些的那些基因产物，例如介白素-2、介白素-4、γ-干扰素、GM-CSF、G-CSF、促红细胞生成素、和其他细胞介素、葡糖脑苷脂酶、苯丙氨酸羟化酶、囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、细胞毒素、肿瘤抑制基因、反义RNA和疫苗抗原。

在某些实施方案中，本公开内容涉及免疫原性组合物(例如疫苗)，其包含免疫有效量的本公开内容的重组嵌合RSV(例如嵌合冠状病毒-RSV)(例如活的减毒重组嵌合RSV或灭活的非复制嵌合RSV)、免疫有效量的本文公开的多肽和/或免疫有效量的本文公开的核酸。

在某些实施方案中，本公开内容涉及刺激对象的免疫系统以产生针对冠状病毒的保护性免疫反应的方法。在这些方法中，将免疫有效量的本文公开的重组嵌合RSV(例如嵌合冠状病毒-RSV)、免疫有效量的本文公开的多肽和/或免疫有效量的本文公开的核酸在生理可接受的载剂中施用给对象。

通常，载剂或赋形剂是药学上可接受的载剂或赋形剂，例如无菌水、水性盐水溶液、水性缓冲盐水溶液、水性右旋糖溶液、水性甘油溶液、乙醇或其组合。确保无菌性、pH、等渗性和稳定性的这些溶液的制备是根据本领域确立的方案实现。通常，选择载剂或赋形剂以使过敏和其他不期望效应最小化，并适合特定施用途径，例如皮下、肌内、鼻内、口服、局部等。所得水溶液可例如经包装以原样使用或冻干，在施用前将该冻干制剂与无菌溶液组合。

在某些实施方案中，嵌合RSV(例如嵌合冠状病毒/RSV)或其组分(例如嵌合非RSV/RSV融合蛋白，例如嵌合冠状病毒S蛋白-RSV F蛋白)是以足以刺激对非RSV(例如冠状病毒)的一种或多于一种毒株具有特异性的免疫反应的量施用。换言之，在某些实施方案中，施用免疫有效量的嵌合RSV(例如冠状病毒-RSV)或其组分，例如嵌合非RSV/RSV融合蛋白(例如嵌合冠状病毒S蛋白-RSV F蛋白)。较佳地，施用嵌合RSV(例如，嵌合冠状病毒/RSV)引发保护性免疫反应。本领域技术人员已知引发保护性抗病毒免疫反应的剂量和方法，其适用于产生针对非RSV(例如冠状病毒)和/或RSV的保护性免疫反应。参见(例如)美国专利第5922326号；Wright等人(1982)InFect.Immun.37：397-400；Kim等人(1973)Pediatrics52：56-63；和Wright等人(1976)J.Pediatr.88：931-936。举例而言，病毒可以每剂量施用约10³-10⁷pfu(噬菌斑形成单位)提供(例如，每剂量施用10³-10⁷pfu、10³-10⁶pfu、10³-10⁵pfu、10⁴-10⁷pfu、10⁴-10⁶pfu或10⁴-10⁶pfu)。在某些实施方案中，病毒以每剂量施用约10³pfu的量提供。在某些实施方案中，病毒以每剂量施用约10⁴pfu的量提供。在某些实施方案中，病毒以每剂量施用约10⁵pfu的量提供。在某些实施方案中，病毒以每剂量施用约10⁶pfu的量提供。在某些实施方案中，病毒以每剂量施用约10⁷pfu的量提供。通常，基于例如年龄、身体状况、体重、性别、饮食、施用方式和时间和其他临床因素来调整剂量。

疫苗制剂可例如通过使用针和注射器或无针注射装置皮下或肌肉注射全身施用。疫苗制剂可气管内施用。较佳地，疫苗制剂例如通过滴剂、气溶胶(例如，大颗粒气溶胶(大于约10微米))、或喷雾鼻内施用至上呼吸道上。尽管上述施用途径中的任一项产生保护性全身免疫反应，但鼻内施用赋予在病毒进入部位引发黏膜免疫性的额外益处(即，可产生黏膜和体液免疫反应)。尽管体液免疫性(循环抗体)对于预防严重肺病是重要的，但黏膜抗体对于阻断呼吸道病毒的感染和传播是重要的。对于鼻内施用，减毒活病毒疫苗通常较佳，例如减毒、冷适应和/或温度敏感性重组病毒。此外，与临床前和临床开发中的许多候选SARS-CoV-2疫苗不同，在某些实施方案中，如本文所述的活的、减毒、复制的嵌合冠状病毒/RSV疫苗的单次鼻内接种可足以产生免疫性。此外，另外在某些实施方案中，不存在佐剂，避免对额外制剂组分的需要和在临床研究中评估佐剂活性的需要。

作为减毒活病毒疫苗的替代或补充，可使用例如杀死的病毒疫苗、核酸疫苗和/或多肽亚基疫苗，如Walsh等人(1987)J.Infect.Dis.155：1198-1204和Murphy等人(1990)Vaccine 8：497-502所建议。

在某些实施方案中，减毒重组嵌合冠状病毒-RSV如在疫苗中使用且经充分减毒，使得感染的症状或至少严重感染的症状不会发生在用减毒病毒免疫(或以其他方式感染)的大多数对象中-在其中病毒组分(例如，本文的核酸或多肽)用作疫苗或免疫原性组分的实施方案中。然而，通常充分消除毒力，使得轻度或严重下呼吸道感染通常不会发生在接种疫苗或偶然对象中。

尽管较佳用单剂量刺激保护性免疫反应，但可通过相同或不同途径施用额外剂量，以达到期望预防效应。例如，在新生儿和婴儿中，可需要多次施用以引发足够免疫性程度。施用可在整个儿童期中持续间隔施用，如维持针对野生型冠状病毒感染的足够程度的保护所必需。类似地，特别易于反复冠状病毒感染或严重冠状病毒感染的成年人例如健康照护工作者、日托提供者、老年护理提供者、老年人(超过55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁或90岁)和心肺功能受损的对象可需要多次免疫来建立和/或维持保护性免疫反应。诱发的免疫性的程度可例如通过量测病毒中和分泌抗体和血清抗体的量来监测，并视引发和维持期望保护程度所需调整剂量或重复接种疫苗。

或者，可通过用病毒离体或体内靶向树突状细胞来刺激免疫反应。举例而言，将增殖树突细胞以足够量和足够时间段暴露于病毒，以允许树突细胞捕获冠状病毒抗原。然后将细胞转移至对象中，以通过标准静脉移植方法进行疫苗接种。

任选地，用于疫苗施用的制剂亦含有一种或多于一种佐剂，用于增强对冠状病毒抗原的免疫反应。考虑的佐剂包括铝盐，例如和/>考虑的佐剂包括水包油乳液，其中油在水相中用作溶质并形成由乳化剂稳定的孤立液滴。在某些实施方案中，乳液含有角鲨烯或α-生育酚(维生素E)和额外乳化剂，例如去水山梨醇三油酸酯和聚山梨醇酯-80(PS80)作为表面活性剂。在某些实施方案中，乳液含有吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。GLA可与嵌合冠状病毒-RSV、颗粒或嵌合冠状病毒S蛋白-RSV F蛋白单独或在基于角鲨烯的水包油稳定乳液(SE)中调配。Iyer等人报道使用RSV F蛋白的不同粒径的水包油佐剂((2015)Hum Vaccin Immunother 11(7)：1853-1864)。

适宜佐剂包括例如：完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂素、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液、卡介苗(BCG)、小棒状杆菌和合成佐剂QS-21。

若期望，嵌合冠状病毒-RSV的预防性疫苗施用可与一种或多于一种免疫刺激分子的施用联合实施。免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增强和促发炎活性的各种细胞介素、淋巴介质和趋化介素，例如介白素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如颗粒球-巨噬细胞(GM)-群落刺激因子(CSF))；和其他免疫刺激分子，例如巨噬细胞发炎因子、Flt3配体、B7.1；B7.2等。免疫刺激分子可以与嵌合冠状病毒-RSV在同一制剂中施用，或可单独施用。可施用蛋白质或编码蛋白质的表达载体以产生免疫刺激效应。

尽管用特定亚组的特定毒株的嵌合冠状病毒-RSV对对象进行疫苗接种可诱发针对不同毒株和/或亚组的病毒的交叉保护，但若期望，可通过用来自至少两个毒株例如其中的每一个代表不同亚组的减毒冠状病毒对对象进行疫苗接种来增强交叉保护。类似地，嵌合冠状病毒-RSV疫苗可任选地与诱发针对其他传染原的保护性免疫反应的疫苗组合。

冠状病毒减毒活疫苗的潜在挑战是重组(遗传不稳定性)。自然基因组重组是冠状病毒和网巢病毒目(Nidovirales order)中的其他正义病毒的共同特征。相比的下，自然重组对于负义单股反链病毒目的病毒(如RSV和麻疹病毒(野生型或疫苗株))是罕见的。此外，活的减毒RSV活疫苗已显示是遗传稳定的(Stobart(2016)，上文文献)，这可能是由于减毒突变是通过广泛密码子去优化或病毒基因的缺失。因此，在某些实施方案中，如本文所述的嵌合冠状病毒-RSV说明很少或没有遗传不稳定性。

此外，SARS冠状病毒和RSV共同具有疫苗相关的增强呼吸疾病(VAERD)的潜在风险，该疫苗相关的增强呼吸疾病与某些类型的疫苗(例如非复制(例如亚基)疫苗类型)相关。然而，与其他疫苗技术(例如固定全病毒、亚基和一些载体疫苗)相比，活的减毒冠状病毒疫苗尚未说明VAERD。因此，在某些实施例中，如本文所述的嵌合冠状病毒-RSV不增加VAERD的风险。VAERD可在临床前动物模型中通过评价发炎标记物来量测，这些发炎标记物包括过度肺免疫细胞浸润物、升高的Th2发炎细胞介素含量和通过组织病理学的肺损害。

在某些实施方案中，如本文所述的嵌合RSV(例如嵌合冠状病毒-RSV)表现出(1)相对于结合、非中和抗体的高含量的病毒中和抗体，和(2)具有典型Th1抗病毒细胞介素的T细胞反应和/或不表现针对高含量Th2细胞介素的不平衡。

实施例

以下实施例仅仅是说明性的，并不意欲以任何方式限制本发明的范围或内容。

实施例1-嵌合冠状病毒刺突蛋白-RSV融合蛋白的构建

通过克隆SARS-CoV2刺突蛋白(毒株USA-WA1/2020)代替源自MV-012-968的减毒RSV载体中的RSV G和F蛋白，构建一系列候选减毒活疫苗(attRSV-CoV-2，MV-014系列)(图1)。RSV主链含有mKate2荧光蛋白的基因，且称为DB1Quad mKate。(参见(Rostad等人，(2018)Journal of Virology 92(6)e01568-17)。)

RSV F的胞质尾区是RSV传染性子代组装所需的(Baviskar等人(2013)Journal ofVirology 87(19)，10730-10741)。因此，假设用全长S基因替换F会导致无法存活的病毒。因此，如图1中所绘示，产生嵌合刺突基因，其中刺突的胞质尾区经RSV F的胞质尾区(绿色S基因的蓝色CT部分)替换。SARS-CoV-1的胞质尾区并非刺突假型病毒传染性所需的(Broer等人(2006)Journal of Virology 80(3)，1302-1310)。然而，SARS-1刺突的跨膜区和近膜区对于组装和进入至关重要，但机制尚未完全清楚(Corver等人(2009)Virology Journal 6(1)，230；Godeke等人(2000)Journal of Virology 74(3)，1566-1571)。与RSV F的胞质尾区融合的刺突的跨膜结构域的氨基酸序列(下划线文字)绘示于图1的底部。

设计6个含有与SARS-CoV2刺突蛋白胞外结构域融合的RSV F的不同C-末端序列的构建体，并设计1个野生型刺突构建体(关于完整序列，参见图2和附录)。

嵌合刺突-F基因经设计为含有侧翼AatII和SalI位点，用于克隆至BAC DB1 QuadmKate主链中(参见图3中的示意图，且BAC DB1Quad mKate的序列是SEQ ID NO：46)，替换涵盖RSV G和F蛋白的基因的DNA片段(nt 5111至nt 8015)。

插入物210(SEQ ID NO：47)、220(SEQ ID NO：50)、230(SEQ ID NO：51)、240(SEQID NO：52)和300(SEQ ID NO：53)是通过Genscript合成的，且插入物211(SEQ ID NO：48)和212(SEQ ID NO：49)是通过Twist Bioscience合成的并以冻干小球形式接收的。

用酶AatII和Sal I消化刺突-F插入物和DB1Quad mKate载体。自凝胶纯化对应于消化的刺突-F插入物(约4kb)和无G和F的DB1Quad mKate(约20kb)的DNA，并用T4DNA连接酶连接。连接的产物用于转化One-shot Stabl3化学感受态细胞(Thermo C737303)。通过对BAC DNA测序来分析转化体。通过Genewiz使用74个引物对BAC中克隆的反基因组进行测序，这些引物为整个构建体提供约2(平均)的覆盖率。

编码RSV-冠状病毒基因组候选疫苗(具有mKate2标记物)的BAC的序列提供于SEQID NO：54-59(分别对应插入物210、211、212、220、230和240)中。编码具有野生型冠状病毒刺突蛋白(插入物300)的RSV-冠状病毒基因组的BAC的序列位于SEQ ID NO：60。BAC构建体中所含有的含mKate的病毒的反基因组序列提供于SEQ ID NO：104-109(分别对应插入物210、211、212、220、230和240)。

使用限制性克隆构建无标记蛋白mKate2的这些构建体的形式。具体而已，含有mKate2的基因的BAC的片段经由用酶KpnI(在BAC中切割)和AatII(在反基因组内部切割)消化而释放。用相同酶消化无mKate2的DB1 Quad，且无mKate2的片段用于替换MV-014构建体中具有mKate2的片段。包含RSV-冠状病毒基因组候选疫苗(无mKate2标记物)的BAC的序列提供于SEQ ID NO：131-136(分别对应插入物210、211、212、220、230和240)中。

无mKate2和具有插入物210、211、212、220、230和240的MV-014构建体分别提供于SEQ ID NO：13-18中，其是候选疫苗的反基因组序列。

使用Macherey Nagel NucleoBond Xtra BAC或Zymo Research ZymoPureIIMaxiPrep试剂盒自500ml过夜培养物制备所有克隆的BAC。如实施例2所述，获得的BAC DNA(具有或无mKate标记物)进一步用于组织培养中的病毒拯救。

实施例2-病毒拯救

在补充有4mM谷氨酰胺的无血清MEM中培养Vero RCB2细胞。将细胞以7.5×10e5个/孔接种在含有2mL培养基的6孔培养皿中，并在加湿培育器中于37℃、5％CO₂下培育过夜。第二天，去除培养基，且用Opti-MEM洗涤细胞单层两次，并在加湿培育器中于37℃和5％CO₂下与2mL Opti-MEM一起培育。

为了拯救病毒，用表达DB1-Quad-mKate2RSV或MV-014-210(如实施例1所述具有插入物210的DB1-Quad-mKate2RSV)的反基因组的质粒连同表达密码子去优化的RSV N、P、M2.1和L且克隆至pXT7载体中的辅助质粒和表达T7RNA聚合酶的质粒来转染Vero RCB2细胞。

通过将15uL Lipofectamine 2000CD混合至250uL Opti-MEM中并将混合物于室温下培育5min，针对每一条件组装转染混合物。在单独管中，将含有DB1-Quad-mKate2(RSV载体)或MV-014-210(1.5ug)的反基因组的质粒DNA与表达RSV-N(1ug)、RSV P(1ug)、RSV M2-1(0.75ug)、RSV L(0.5ug)和T7RNA聚合酶(1.25ug)的质粒混合。将质粒DNA混合物添加至1.5mL微量离心管中的250uL Opti-MEM中，并于室温下培育5min。将DNA-Opti-MEM混合物与lipofectamine-Opti-MEM混合物混合，且涡旋5秒钟，然后于室温下培育30min。去除6孔板中的培养基，并将DNA-lipofectamine混合物缓慢添加至细胞单层中。将细胞于室温下在轻柔摇动下培育1h。在此培育结束时，向每一孔中添加2mL Opti-MEM，且将细胞在加湿培育器中于37℃、5％CO₂下培育过夜。

第二天去除培养基，且用2mL补充有10％胎牛血清和1x抗生素的1X MEM替换。

图4A和B提供用MV-014-210和RSV辅助质粒转染后多次传代的Vero细胞单层上病毒灶(TRITC)和细胞病变效应(明场)的荧光和明场影像。显示10倍放大的大病毒灶(图4A)和2.5倍放大的大量复制和扩散的证据(图4B)。使用TRITC过滤器组产生荧光影像，以可视化mKate2表达。当来自感染的Vero细胞的无细胞溶解产物用于在不同稀释度下感染24孔板中的新鲜Vero细胞单层时，制备病毒原液(图4C)。用无细胞溶解产物感染后灶的形成与经由嵌合刺突-F蛋白感染的完整传染性颗粒的分离一致。使用Celigo成像仪器组生成荧光影像，以检测mKate2表达。

该实验说明，编码具有嵌合冠状病毒刺突蛋白/RSV F蛋白的重组RSV的质粒适用于疫苗的制备。

实施例3-接种MV-014-212疫苗会保护灵长类动物免受SARS-CoV-2攻击并导致MVK-014-212和B.1.351变体的特异性中和

MV-014-212和MVK-014-212-B.1.351的设计和产生

MV-014-212是基于人类呼吸道合胞病毒(RSV)的针对SARS-CoV-2的新颖活的减毒重组疫苗(图1)。RSV的附着蛋白和融合蛋白G和F由嵌合蛋白替换，该嵌合蛋白由SARS-CoV-2刺突(毒株USA-WA1/2020)的胞外结构域和跨膜(TM)结构域和RSV F(19系毒株)的胞质尾区组成。刺突蛋白与F蛋白之间的接合处的氨基酸序列示于图1中。值得注意的是，嵌合刺突/RSV F蛋白保留功能，这是因为MV-014-212生长依赖于其与宿主细胞的附着和融合。评价接合位置不同的各种嵌合刺突构建体在Vero细胞中的生长(图2)。具体而言，评估具有整个天然SARS-CoV-2刺突的构建体(MV-014-300，图2)。尽管可拯救此构建体，但其在细胞培养物中不能有效繁殖。拯救实验的结果示于表3中。

表3

候选疫苗	拯救	达成的效价≥105PFU/mL
			MV-014-210	Y	Y
MV-014-211	Y	N.D.
			MV-014-212	Y	Y
MV-014-220	Y	N.D.
			MV-014-230	N	N
V-014-240	N	N
			MV-014-300	Y	N

在表达不同嵌合刺突/RSV F融合蛋白的构建体中，基于MV-014-212易于拯救和生长至临床前和临床研究可接受效价的能力，选择MV-014-212进行进一步评估。

用于产生MV-014-212的RSV主链通过编码抑制宿主先天免疫性的蛋白质NS1和NS2的基因的密码子去优化而在原代细胞中经减毒用于复制(Meng等人(2014)mBio5(5)：e01704-14)。另外，缺失短疏水糖蛋白SH以增加下游基因的转录(Bukreyev 1997)。

为了促进微中和分析的发展，还通过将编码荧光mKate2蛋白的基因(Hotard等人(2012)Virology 434(1)：129-36，Shchervo等人(2009)Biochem J.418(3)：567-74)插入NS1基因(MVK-014-212，对于mKate为K，图1，底部)的上游来构建源自MV-014-212的报道病毒。

SARS-CoV-2具有高突变率，且新变体迅速进化。最近，SARS-CoV-2的变异毒株引起关注，这是因为其在刺突RBD中存在突变，怀疑这些突变导致中和表位的损失，且因此逃避通过接种疫苗或自然感染SARS-CoV-2Wuhan-1或USA/WA2020(在刺突编码区中相同)的祖先毒株而产生的免疫性。值得注意的是变体B.1.351，其在刺突蛋白中携带8个突变，其中3个位于RBD：K417N、E484K和N501Y(Tegally等人。(2020)Nature 592(7854)：438-443)。具体而言，还经由在中和血清存在下重复传代以分离中和逃逸突变体来鉴别E484K(Andreano等人(2020)bioRxiv[Preprint].Dec 28：2020.12.28.424451)。若干研究已显示，与Wuhan-1株相比，由目前市场中的疫苗引发或存在于恢复期血清中的中和抗体在中和B.1.351变体方面更低效(Wang等人(2021)Nature 592(7855)：616-622；Liu等人(2021)N Engl JMed.2021年4月15日；384(15)：1466-1468；Madhi等人(2021)NEngl J Med.384(20)：1885-1898；Wibmer等人，(2021)NatMed.27(4)：622-625)。

因此，产生MVK-014-212的变体MVK-014-212-B.1.351，其包括SARS-CoV-2变体B.1.351中观察到的刺突的突变。MVK-014-212-B.1.351相对于MVK-014-212的变化列于表4中。

表4：SARS-CoV-2的B.1.351株相对于本研究中使用的USA/WA-2020毒株的突变。

将所有重组病毒构建体电穿孔至Vero细胞中，且拯救传染性病毒并繁殖用于进一步表征(Hotard(2012)，上文文献)。简言之，在CMV启动子的控制下，用编码MV-014-212(或报道病毒)的细菌人工染色体(BAC)和编码T7聚合酶和RSV蛋白N、P、M2-1和L的辅助质粒电穿孔Vero细胞(图5)。在自电穿孔回收期间，监测细胞的细胞病变效应(CPE)的证据。在MV-014-212中，CPE观察为多核体或合胞体的形成和最终的细胞脱离(图6)。使电穿孔的细胞扩增，直至CPE广泛存在，且收获病毒原液作为总细胞溶解产物。MV-014-212和衍生的病毒获得的效价相当，且在范围1-510⁵PFU/mL内。图6显示在MV-014-212和MVK-014-212的拯救期间拍摄的显微照片。

MVK-014-212-B.1.351中的嵌合冠状病毒刺突/RSV F蛋白的蛋白质序列提供于SEQ ID NO：62，且编码蛋白质的核酸序列提供于SEQ ID NO：63。MVK-014-212-B.1.351(含有mKate标记物)的全长病毒序列提供于SEQ ID NO：64，且MV-014-212-B.1.351(不含mKate标记物)的全长病毒序列提供于SEQ ID NO：65。包含MVK-014-212-B.1.351(含有mKate标记物)的BAC的序列提供于SEQ ID NO：66，且包含MV-014-212-B.1.351(不含mKate标记物)的BAC的序列提供于SEQ ID NO：67。

MV-014-212的体外表征

SARS-CoV-2刺突蛋白含有S1和S2结构域之间的切割位点，其由弗林蛋白酶样蛋白酶处理(图7和Hoffmann等人(2020)Mol Cell 78(4)：779-784.e5)。至于其他冠状病毒，据信SARS-CoV-2刺突的S1和S2亚基在切割后以融合前构象保持非共价结合(Walls等人(2020)Cell181(2)：281-292.e6，Burkard等人(2014)PLoS Pathog.10(11)：e1004502)。为了确定由MV-014-212编码的嵌合刺突蛋白是否表达和以蛋白水解方式经处理，利用蛋白质印迹分析自感染的Vero细胞的溶解物制备的病毒原液，并用针对SARS-CoV-2刺突蛋白的多克隆抗血清探测。MV-014-212和MVK-014-212病毒二者都表达嵌合刺突蛋白的全长和切割形式(图8A)，此与S1-S2接合处的部分切割一致，表观大小与预期一致(图8A，Ou等人(2020)Nat Commun.11(1)：1620，Erratum in：Ou等人(2021)Nat Commun 12(1)：2144；Peacock等人(2020)NatMicrobiol.doi：10.1038)。

在Vero细胞中将MV-014-212的生长动力学与野生型重组RSV A2进行比较(图8B)。将Vero细胞以0.01PFU/细胞的MOI感染，且在感染后0、12、24、48、72、96和120小时(hpi)通过噬斑分析对来自总细胞溶解产物的传染性病毒进行定量。MV-014-212相对于RSV A2表现出延迟的生长动力学，显示大约12小时的初始滞后期。两种病毒在72hpi时达到其峰值效价，且效价保持恒定直至120hpi。MV-014-212的峰值效价比RSVA2低了约一个数量级。为了确定mKate2基因的插入是否影响MVK-014-212的复制动力学，用MV-014-212或MVK-014-212以0.01PFU/细胞的MOI感染Vero细胞，并通过噬斑分析在3、24和72hpi测量传染性病毒。MVK-014-212的生长动力学与MV-014-212的生长动力学类似，至72hpi达到相当的峰值效价(图8C)。这些数据与在第一基因位置插入mKate2在体外未显著减毒RSVA2-line19F的报道一致(Hotard等人(2012)，上文文献)。

为了评估MV-014-212的短期热稳定性，将病毒原液的等分试样在不同温度下培育6小时，且通过噬斑分析来确定培育后的传染性病毒量。在本研究中比较在不同赋形剂中制备的MV-014-212的两种原液(图8D)。结果说明，在-80℃和室温下，MV-014-212在任一赋形剂中稳定至少6小时。

通过在Vero细胞中连续传代来检查MV-014-212的遗传稳定性。用MV-014-212的等分试样一式三份感染亚汇合Vero细胞，并传代10个连续代(图9)。自第0代和第10代分离病毒RNA，且通过RT-PCR扩增。通过Sanger测序确定病毒基因组的整个编码区的序列。结果显示，对于所有三个谱系，相对于起始原液(第0代)，在第10代未检测到变化。候选疫苗在体外是遗传稳定的。

MV-014-212复制在非洲绿猴中减毒且赋予针对wt SARS-CoV-2攻击的保护

非洲绿猴(AGM)支持wt SARS-CoV-2的复制(Woolsey等人(2021)Nat Immunol.22(1)：86-98，Cross等人(2020)Virol J.7(1)：125，Blair(2021)Am J Pathol.191(2)：274-282，Lee等人(2021)Curr Opin Virol.48：73-81)且支持RSV的复制(Taylor(2017)Vaccine35(3)：469-480)，且因此构成研究MV-014-212的减毒和保护性免疫性的适当非人类灵长类动物模型。

AGM研究设计绘示于图10中。在第0天，经由鼻内(IN)和气管内(IT)途径在每一位点用1.0mL 3×10⁵PFU/mL MV-014-212或wt RSV A2接种AGM，总剂量为6×10⁵PFU每只动物。AGM对SARS-CoV-2病毒和RSV二者仅是半允许的，因此需要气管内接种以容许肺中疫苗或攻击SARS-CoV-2病毒的复制。模拟组中的动物类似地用PBS模拟接种。免疫后第12天收集鼻拭子(NS)和支气管肺泡灌洗液(BAL)样品。通过使用未在研究地点冷冻的新鲜样品的噬斑分析来确定NS和BAL样品中的病毒脱落。图11A-B中所示的结果显示，接种MV-014-212的动物中传染性病毒的含量和鼻分泌物中脱落的持续时间低于接种RSV的动物(图11A)。RSV的平均峰值效价是接种MV-014-212的动物观察到的效价的约20倍。这些结果显示，与RSV相比，MV-014-212在AGM的上呼吸道中减毒。

在12天过程中，在接种MV-014-212或RSV毒株A2的动物的下呼吸道中亦观察到低至不可检测的病毒效价。两种病毒皆以低程度复制，但MV-014-212的峰值含量出现得更早。在该研究中，与文献报道的野生型RSV A2效价相比，RSV A2在AGM的下呼吸道中显示2至3个log的较低峰值效价(Cheng等人(2001)Virology 283(1)：59-68；Jin等人(2003)Vaccine21(25-26)：3647-52；Tang等人(2004)J Virol.78(20)：11198-207；Le等人(2014)Proc Natl Acad Sci U S A.111(36)：13169-74)，从而混淆说明MV-014-212在肺中减毒的能力。随后，相对于生物来源的RSV毒株，在棉鼠的肺中亦观察到较低rA2效价(参见实例4和图12A-D)，表明在该研究中使用的rA2在肺中减毒。

疫苗接种后第6天的鼻和BAL样品用于提取RNA用于MV-014-212的刺突基因的序列分析。使用Sanger测序，与MV-014-212的参照序列相比，未检测到刺突基因的变化。

在第28天，用1×10⁶TCID₅₀的wt SARS-CoV-2攻击AGM。攻击后收集NS和BAL样品达10天。通过E基因亚基因组SARS-CoV-2RNA(sgRNA)的RT-qPCR量测wt SARS-CoV-2的脱落(图13A-B)。

接种MV-014-212疫苗的猴在NS样品中具有低或不可检测的含量的wt SARS-CoV-2sgRNA，相较而言，接种wt RSV A2或PBS(模拟)的动物具有较高含量的SARS-CoV-2sgRNA。尽管SARS-CoV-2sgRNA的含量在大多数时间点在接种MV-014-212疫苗的动物中不可检测，但一只动物在第2天具有可检测的SARS-CoV-2sgRNA，且不同动物在攻击后第4天具有相似效价。对照RSV和PBS组中动物的NS中SARS-CoV-2的平均峰值效价分别是接种MV-014-212疫苗的动物的20倍和250倍。在RSV和模拟感染的动物中，自第4天至第10天，鼻分泌物中wtSARS-CoV-2sgRNA的脱落稳步减少，且截至第10天，两组中的所有动物都不具有可检测的SARS-CoV-2sgRNA。

与接种RSV A2或模拟接种PBS的动物相比，接种MV-014-212疫苗会增加肺中SARS-CoV-2的清除率。BAL样品中SARS-CoV-2的峰值效价出现在第2天，且在所有三个治疗组中相似。在第4天至第10天，在接种MV-014-212疫苗的动物中，肺效价不可检测，而在接种RSVA2或模拟接种PBS的动物中，容易量测到SARS-CoV-2。以前，在接种物中检测到少量sgRNA(BIOQUAL，未公布的结果)，因此脱落第1天检测到的一些信号可归因于接种物。

综上所述，这些数据显示，单次黏膜施用MV-014-212可保护AGM免受wt SARS-CoV-2攻击。

MV-014-212在AGM中引发刺突特异性抗体反应，其广泛中和并提供针对相关变体的中度保护。

在免疫后第25天，通过ELISA(参见图14A的示意图和图14B的IgA标准曲线)分别在来自用MV-014-212、RSV A2或PBS免疫的AGM的血清和鼻拭子中测量SARS-CoV-2刺突特异性血清IgG和鼻IgA。在研究开始时，所有动物对于RSV和SARS-CoV-2皆呈血清阴性。与接种RSVA2或PBS的具有接近检测限值的刺突特异性IgG含量的AGM相比，接种MV-014-212的AGM在血清中产生更高含量的SARS-CoV-2刺突特异性IgG(图15A)。

在接种MV-014-212的猴的鼻拭子中亦检测到刺突特异性IgA。接种疫苗25天后，接种MV-014-212疫苗的动物中的鼻刺突特异性IgA增加至8倍以上(图15B)。相比之下，RSV或模拟疫苗接种动物未显示明显IgA变化。

这些结果显示，黏膜接种MV-014-212诱发对功能性SARS-CoV-2刺突的鼻和全身抗体反应。

为了确定在接种MV-014-212疫苗的猴中是否引发针对野生型SARS-CoV-2刺突蛋白或B.1.351变体的中和抗体，使用报道病毒MVK-014-212和MVK-014-212-B.1.35执行微中和分析。包括额外报道病毒，即用mKate2标记的野生型重组RSV A2(rA2-mKate)作为阴性对照。接种疫苗前(“Pre”)和接种疫苗后(“Imm”)2个AGM的中和效价示于图15C中。观察到接种疫苗后同源报道基因(MVK-014-212)的中和显著增加(还参见图17)。还观察到针对B.1.351变体的中度交叉中和，变体的平均NT50是同源病毒的约7分之一。B.1.351变体的中和效价的此降低与关于其他疫苗所报道数量级相同(Planas等人(2021)Nat Med.27(5)：917-924，Liu等人(2021)，上文文献，Wang等人(2021)Nature 592(7855)：616-622)。

因此，该实施例说明感染MV-014-212会诱发SARS-CoV-2刺突特异性黏膜IgA反应，产生针对表达刺突的假病毒包括变体B.1.351的血清中和抗体，且针对上呼吸道和下呼吸道中的SARS-CoV-2攻击具有高度保护性。

讨论

MV-014-212是重组活的减毒COVID-19疫苗，其经设计用于鼻内施用，以刺激针对SARS-CoV-2的黏膜和全身免疫性。MV-014-212经工程化以在表达密码子去优化的NS1和NS2基因的减毒RSV毒株中表达功能性SARS-CoV-2刺突蛋白来代替RSV膜表面蛋白F、G和SH。事实上，在鼻和气管中黏膜施用后，MV-014-212的复制在非洲绿猴的呼吸道中减弱，并且它引发SARS-CV-2刺突特异性黏膜IgA和血清IgG。此外，接种MV-014-212疫苗会诱发血清中和抗体，并保护其免受SARS-CoV-2攻击。这些数据表明，在非人类灵长类动物中，用活的减毒COVID-19疫苗的单一黏膜免疫可诱发针对SARS-CoV-2的保护免疫性。

MV-014-212在遗传上是稳定的，且当病毒在Vero细胞中连续传代十次时，未检测到变体的累积。这与基于VSV主链的另一重组活的减毒COVID-19疫苗形成对比(Yahalom-Ronen等人(2020)Nat Commun.11(1)：6402)，其中在Vero E6细胞的第9代出现突变。这些突变之一发生在多碱基S1/S2弗林蛋白酶切割位点，且另一突变产生终止密码子，这导致刺突胞质尾区的24个氨基酸截短。当wt SARS-CoV-2(Ou，上文文献)或假型SARS-CoV-2(Case等人(2020)CellHost Microbe 28(3)：475-485.e5，Dieterle等人(2020)Cell HostMicrobe28(3)：486-496.e6)在组织培养物中繁殖时，也报道刺突胞质尾区的截短。还通过Sanger测序分析来自非洲绿猴的鼻拭子和BAL的MV-014-212的刺突基因，且与参照序列相比未观察到变化。因此，MV-014-212中的嵌合刺突基因在体外和体内似乎具有稳定基因型。

非洲绿猴对于RSV(Taylor，上文文献)和wt SARS-CoV-2复制(Woolsey等人，上文文献，Cross等人，上文文献，Blair等人，上文文献，Lee等人，上文文献)是半允许的，且经选择用于评估MV-014-212而使用恒河猴。与RSV和PBS免疫组相比，接种MV-014-212疫苗的猴在攻击后的NS样品中具有低或不可检测含量的wt SARS-CoV-2sgRNA。接种MV-014-212疫苗还增加肺中SARS-CoV-2的清除率。通过亚基因组E基因的RT-qPCR检测到的wt SARS-CoV-2脱落在RSV和PBS免疫组的上呼吸道和下呼吸道中在第1天或第2天早期达到峰值。这与Cross等人，上文文献和Woolsey等人，上文文献关于AGM中的wt SARS-CoV-2/INMI1-Isolate/2020/Italy所报道的通过病毒基因组的RT-qPCR和通过噬斑分析检测到的脱落动力学相似。在RSV和模拟接种组中观察到的SARS-CoV-2亚基因组RNA的峰值含量与在未接种疫苗的恒河猴中观察到的那些相当(Corbett等人(2020)Nature586(7830)：567-571，Vogel等人(2020)bioRxiv 2020(09.08.280818；doi：doi.org/10.1101/2020.09.08.280818)，Mercado等人(2020)Nature 586(7830)：583-588，van Doremalen等人(2020)Nature 586(7830)：578-582)。

用MV-014-212免疫AGM导致黏膜和全身抗体反应。与接受wt RSVA2或PBS接种的AGM相比，接种MV-014-212疫苗的AGM中的刺突特异性总血清IgG为约100倍。在MV-014-212免疫动物的鼻拭子中也检测到刺突特异性IgA。接种MV-014-212疫苗后25天，IgA浓度增加至约8倍。相比之下，RSV或模拟免疫的猴未显示IgA浓度上升。在实验性人类攻击研究中，低RSV F特异性黏膜IgA是比血清抗体含量更佳的血清阳性成人易受RSV攻击影响的预测因素(Habibi等人(2015)Am JRespir Crit Care Med.191(9)：1040-9)。事实上，刺突RBD特异性二聚体血清IgA显示在中和SARS-CoV-2方面比单体IgG更强效(Wang等人，上文文献)。由此推断，作为二聚体IgA存在于黏膜表面的分泌性IgA可在感染部位用作SARS-CoV-2的强效抑制剂。有趣的是，Sterlin等人((2021)Sci Transl Med.13(577)：eabd2223)最近报道，IgA抗体在人类SARS-CoV-2感染中主导早期体液反应，且具有黏膜归巢潜能的IgA浆母细胞在疾病发作的第三周期间达到峰值。检测到针对表达mKate2的MV-014-212病毒MVK-014-212的SARS-CoV-2中和抗体反应增加。还检测到针对具有来自南非的相关变体B.1.351的刺突的报道病毒的中和抗体反应。与同源USA-WA2020刺突相比，针对B.1.351的NT50低约7倍。AGM对于RSV和SARS-CoV-2病毒是半允许的，这不允许与在人类恢复期和疫苗接种后血清中观察到的与针对COVID-19的保护相关的效价进行直接比较。对于批准紧急使用的COVID-19疫苗，尚未在人体内建立保护相关性。然而，接种MV-014-212疫苗的AGM达到与恒河猴中利用EUA疫苗观察到的保护程度相当的保护程度(Corbett等人(2020)，上文文献，Vogel等人(2021)，上文文献，Mercado等人(2020)，上文文献，van Doremalen等人(2020)，上文文献)。

根据WHO于2020年5月14日编写的“The Landscape of candidate vaccines inclinical development”(参见网站who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines)，目前世界范围内有101种处于临床开发的COVID-19疫苗。在这些候选中，仅7种是鼻内疫苗(表5)。另外两种候选鼻内疫苗是减毒活病毒。与这些候选疫苗不同，MV-014-212是在自然界中不易重组的非分段负链RNA病毒。对于实验室环境中实验性共感染以外的非分段负链RNA病毒，RNA重组极为罕见，且无再重组机制(Spaan 2003，Han2011，Tan 2012)。

表52021临床开发中的鼻内COVID-19疫苗

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MV-014-212的疫苗概况在目前获得紧急用户许可证或正在临床开发的COVID-19疫苗中是独特的。MV-014-212通过鼻内施用，这是一种为全球免疫提供潜在优点的无针途径。鼻内途径类似于SARS-CoV-2的自然感染途径，且在无任何佐剂制剂的情况下在AGM中产生黏膜和体液免疫反应。基于1期临床研究材料生产的产率的模型预测，在使用高强度生物反应器系统的中等规模设施中，潜在剂量输出为每年数亿剂量。黏膜递送的减毒活疫苗例如MV-014-212需要最少的下游处理且预计商品成本低。另外，无针递送降低供应风险。总之，MV-014-212非常适合作为主要疫苗或异源加强剂在国内和全球部署。MV-014-212目前正作为单剂量鼻内疫苗在1期临床试验中进行评估(NCT04798001)。

材料和方法

细胞和动物

使Vero RCB1(WHO Vero RCB 10-87)细胞在含有10％胎牛血清(FBS，Corning)和1X Corning抗生素/抗真菌混合物的最低基本培养基9MEM，Gibco)中生长，该混合物由100I.U./mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素与0.085g/L NaCl组成。RCB2细胞来源于RCB1，并已适应在无血清培养基中生长。使本研究中使用的RCB2细胞在补充有4mML-谷氨酰胺(Gibco)的无血清培养基OptiPro(Gibco)中生长。两种Vero细胞都是在37℃、5％CO₂和95％湿度下培养的。

非洲绿猴(黑脸绿猴(Chlorocebus aethiops))是在St Kitts获得的，且年龄未定，体重约3-6kg。通过RSV微中和分析和刺突SARS-CoV-2ELISA(BIOQUAL)，对猴进行筛选，并证实其对于RSV和SARS-CoV-2呈血清阴性。在研究之前，兽医工作人员亦会对动物进行身体检查，以确认适当健康状况。每一AGM由纹身独特地鉴别。将一只雄性和三只雌性分配至MV-014-212和RSV组。将2只雌性和1只雄性分配至模拟组。笼侧观察包括死亡率、垂死率、总体健康状况和毒性体征。临床观察包括皮肤和皮毛特征、眼睛和黏膜、呼吸、循环、自主和中枢神经系统、躯体运动和行为模式。在施用时段开始前和每次镇静时记录每只猴的体重。与AGM的呼吸道中总体低程度的MV-014-212复制一致，接种疫苗后未观察到被认为与治疗相关的不良事件。在疫苗接种后第16天，接种MV-014-212的一只猴意外死亡。死亡发生在最后一次NS和BAL样品采集后4天。无法基于宏观或微观死后评估确定死亡原因的最终决定；然而，没有证据表明死亡与疫苗有关。此外，与该治疗组中的其他动物相比，减少的动物在NS样品中具有最低效价，其中仅一个拭子含有高于噬斑分析的检测限值(50PFU/mL)的病毒，且在评估的任何时间点BAL中无可检测到的传染性病毒。

雄性和雌性K18-hACE2Tg(毒株#034860，B6.Cg-Tg[K18-ACE2]2Prlmn/J)小鼠是自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)获得的，且疫苗接种时大约8-10周龄。

动物研究是按照所有相关的地方、州和联邦法规执行的，并得到BIOQUAL机构动物照护和使用委员会(IACUC)的批准。

质粒构建

在T7聚合酶启动子的控制下，将重组MV-014-212和衍生的病毒在细菌人工染色体(BAC)中以反基因组取向克隆(Hotard等人(2012)，上文文献)。含有重组MV-014-212和MVK-014-212序列的BAC是通过限制性消化和连接自DB1-QUAD和kRSV-DB1-QUAD质粒(分别编码具有或无mKate基因的减毒型RSV的反基因组，Rostad等人(2018)，上文文献)构建的。编码嵌合刺突蛋白的DNA序列经设计以含有兼容的克隆位点，且其是由Twist Biosciences合成的。用酶AatII和SalI(NEB)消化kRSV-DB1-QUAD质粒和刺突插入物，并在16℃下用T4DNA连接酶(NEB)连接过夜。用连接混合物转化Stabl3化学感受态细胞(Invitrogen)并在32℃下用氯霉素抗性筛选20-24小时。MV-014-212BAC是通过去除KpnI和AatII限制性位点之间的片段(约7kb，含有mKate基因)并将其用通过限制性消化和连接自DB1-QUAD提取的相应片段替换而衍生自MVK-014-212载体。对于所有构建体，经由Sanger测序确认整个编码病毒的序列。

质粒rA2-mkate(又名kRSV-A2)的构建阐述于Rostad等人(2016)J Virol.90(16)：7508-7518中。

病毒拯救和收获

通过用BAC质粒和基于pCDNA3.1表达质粒的5个辅助质粒电穿孔RCB2细胞拯救重组病毒，每个质粒编码以下之一：T7聚合酶、RSVA2N、RSVA2P、RSVA2M2-1或RSV A2L蛋白。将细胞在补充有4mM谷氨酰胺和10％胎牛血清(Hyclone)的SFM-OptiPro培养基中回收2代，然后在具有谷氨酰胺的无血清培养基中扩增，直至CPE广泛存在。

通过将感染的细胞直接刮入培养基中，在补充有SPG的Williams E(Hyclone)或单独SPG中收获重组病毒。将溶解物剧烈涡旋以释放病毒颗粒并急冻。实施一个解冻和涡旋循环以增加病毒的释放，之后将原液分成等分、急冻并在-70℃下储存直至使用。

SPG培养基的组成示于表6中。

表6-SPG的组成

所有使用的病毒的噬斑分析都是在具有Vero细胞的24孔板中进行。用100μl10倍连续稀释的病毒样品(10-1至10-6)接种70％汇合的细胞。接种在室温下在轻柔摇动下实施1h，之后添加溶于MEM中的0.75％甲基纤维素(Sigma)，该MEM补充有10％FBS和1X Corning抗生素/抗霉菌混合物。将细胞在32℃下培育4-5天，之后在甲醇中固定并免疫染色。对于MV-014-212和MVK-014-212，我们使用兔抗SARS-CoV-2刺突多克隆抗体(Sino Biological)和山羊抗兔缀合有HRP的第二抗体(Jackson ImmunoResearch)。对于rA2-mKate，所用的试剂是山羊抗RSV第一抗体(Millipore)和驴抗山羊缀合有HRP的第二抗体(JacksonImmunoResearch)。在所有情形下，用AEC(Sigma)染色病毒噬斑。检测限值为每孔1PFU，对应于100PFU/ml的最小可检测效价。

RNA测序

遵循制造商建议的方案，使用Viral RNA Mini试剂盒提取MV-014-212样品的RNA。通过凝胶电泳和UV分光光度法评估提取的RNA的质量和浓度。使用InvitrogenIV第一链合成系统，使用特异性引物或随机六聚体，将提取的RNA用作反转录(RT)的模板。用PlatinumTM SuperFiTM PCR Master Mix合成cDNA第二链。使用/>终止子v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)直接测序纯化的PCR产物。使用SephadexG-50纯化来纯化测序反应，并在ABI 3730xl DNA分析仪上分析。使用Sequencher软件组装序列轨迹，并人工确认组装。通过Avance Biosciences Inc.，Houston TX实施此研究的RNA测序。/>

蛋白质印迹

通过在95℃下加热10分钟用Laemmli样品缓冲液(AlfaAesar，WardHill，MA)使病毒和对照重组SARS-CoV-2刺突蛋白(LakePharma，San Carlos，CA)变性。在4-15％梯度凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质，并根据制造商的方案(BIO-RAD，Hercules，CA)使用转移装置转移至PVDF膜。转移后，在去离子水中洗涤印迹点，并根据制造商的方案使用iBind Flex系统进行探测。将兔抗SARS-CoV-2刺突(Sino Biological Inc，Beijing，China)以1∶1000的稀释于iBind溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。将缀合有HRP的抗兔IgG(JacksonImmunoResearch，Philadelphia，PA)以1∶5000稀释于iBind溶液中。在去离子水中洗涤印迹点，并根据制造商的方案用ECL系统(Azure Biosystems，Dublin，CA)显影。用再生蛋白质印迹剥离缓冲液(ThermoFisher，Carlsbad，CA)剥离印迹点，并用山羊抗RSV多克隆抗血清(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和特异性针对GAPDH(6C5)蛋白的单克隆抗体(ThermoFisher，Carlsbad，CA)重新探测。

用于检测AGM中的病毒脱落的噬斑分析

收集鼻拭子(NS)和支气管肺泡灌洗液(BAL)样品，并储存在冰上，直至通过噬斑分析来分析疫苗脱落。将Vero细胞以0.5mL每孔以1×10⁵个细胞/mL接种于24孔板中的培养基中。将板在含5％CO₂的加湿培育器中于37℃下培育过夜。通过向270μL DMEM中添加30μL鼻拭子或BAL在无血清的DMEM中稀释样品。在DMEM中自10-1至10-6制备总共六个10倍连续稀释液。自24孔板去除培养基，并将100μL每种稀释液添加至Vero细胞的24孔板中，一式两份孔。将板在室温下在Rocker 35EZ，型号Rocker 35D(Labnet，Edison，NJ)上持续摇动下培育1小时。在此培育结束时，向每个孔中添加1mL甲基纤维素培养基(补充有10％胎牛血清、1x抗生素/抗霉菌和0.75％甲基纤维素的MEM)。将板在含5％CO₂的加湿培育器中于34℃下培育6天。

通过使用RSV或SARS-CoV-2抗体的免疫染色来可视化噬斑。对于免疫染色，吸出甲基纤维素培养基，并在室温下用1mL PBS洗涤细胞单层。去除PBS，且通过向每个孔中添加1mL甲醇来固定细胞，并平板在室温下培育15分钟。去除甲醇，且用1mLPBS洗涤细胞，之后添加1mL Blotto溶液(Tris缓冲盐水中的5％脱脂奶粉，Thermo-Fisher)。将板在室温下培育1h。去除Blotto溶液，并将0.25mL在Blotto中以1比500稀释的第一山羊抗RSV多克隆抗体(Millipore，Hayward，CA)添加至RSV感染细胞中。用第一兔抗SARS-CoV-2刺突蛋白多株抗血清(Sino Biologicals，Beijing，CN)对感染MV-014-212的细胞进行染色。将板在室温下在持续摇动下培育1h。去除第一抗体，且用1mL Blotto溶液洗涤孔。

对于RSV感染的细胞，向每个孔中添加0.25mL以1：250稀释于Blotto中驴抗山羊缀合有HRP的多克隆抗血清(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)。对于MV-014-212感染的细胞，向每个孔中添加以1∶250稀释于Blotto中的山羊抗兔缀合有HRP的多克隆抗血清(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)。将板在室温下在持续摇动下培育1h。培育后，去除第二抗体，并用1mL PBS洗涤孔。通过将AEC底物以1∶50稀释于1x AEC缓冲溶液中来制备显影溶液。向一个孔中添加总共0.25mL显影溶液，且将板在室温下持续摇动下培育15至30分钟，直至肉眼可见红色免疫染色的噬斑。通过在自来水下冲洗板终止显影反应。列举噬斑，并计算效价。

用于检测攻击病毒的脱落的SARS-CoV-2亚基因组RNA的RT-qPCR

标准曲线是自冷冻的RNA原液制备，并稀释至每3uL含有106至10’个拷贝。使用不含RNA酶的水制备8个10倍连续稀释的对照RNA，以产生1至10’个拷贝/反应的RNA浓度。

将板置于Applied Biosystems 7500序列检测器中，并使用以下程序进行扩增：48℃达30分钟，95℃达10分钟，之后40个95℃达15秒和55℃下1分钟的循环。基于标准曲线计算每mL样品的RNA的拷贝数。

使用RNA-STAT 60(Tel-test“B”)/氯仿提取组织的总RNA，之后沉淀该RNA并重新悬浮于不含RNA酶的水中。为了检测SARS-CoV-2sgRNA，设计引物组和探针来检测来自SARS-CoV-2的前导序列和E基因RNA的区域。E基因mRNA在复制过程中经处理以含有5’前导序列，其是sgRNA所特有的(未包装至病毒颗粒中)，且因此可用于定量sgRNA。使用已知量的含有包括独特前导序列的E基因序列的质粒DNA制备标准曲线，以产生1至106个拷贝/反应的浓度。使用45μL含有2X缓冲液、Taq-聚合酶、反转录酶和RNA酶抑制剂的混合母液(Bioline，Memphis，TN)组装PCR反应物。引物对以2μM添加。在96孔板中将5μL样品RNA添加至每一反应中。在Applied Biosystems 7500序列检测器中使用以下条件扩增PCR反应物：48℃达30分钟，95℃达10分钟，之后95℃达15秒和55℃下1分钟的40个循环。

引物/探针序列显示如下：

SG-F：CGATCTTGTAGATCTGTTCCTCAAACGAAC(SEQ ID NO：127)

SG-R：ATATTGCAGCAGTACGCACACACA(SEQ ID NO：128)

FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ(SEQ ID NO：129)

AGM血清的SARS-CoV-2总IgG ELISA

将MaxiSorp免疫板(Thermo-Fisher，Waltham，MA)在4℃下与100μL 0.65μg/mL的在PBS中制备的SARS-CoV-2刺突(Pre-S SARS-CoV-2刺突，Nexelis)一起培育过夜。去除蛋白质溶液，且将板用250μL补充有0.05％吐温20的PBS(PBST)洗涤4次。以每孔200μL添加封闭溶液(含5％脱脂奶粉的PBST)，且将板在室温下培育1h。将SARS-CoV-2刺突特异性IgG(Nexelis)稀释于封闭溶液中，并用作标准品。阴性对照血清在封闭溶液中以1∶25稀释。血清样品以1：25稀释，之后在封闭溶液中进行八个2倍连续稀释。自板中取出封闭溶液，且用250μLPBST洗涤孔一次，之后添加100μL稀释的血清样品和对照，并将板在室温下培育1h。将板用250μL PBST洗涤4次，且在最后一个洗涤步骤后向每一孔中添加100μL稀释于封闭溶液中的缀合有HRP的山羊抗猴IgG抗体(PA1-8463，Thermo Fisher，Waltham，MA)。将板在室温下培育1h，且然后在250μLPBST中洗涤4次。向每一孔中添加含有3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物的显色溶液(1步Ultra TMB-ELISA底物溶液，ThermoFisher)，并将板在室温下培育30分钟以使颜色显色。通过添加100μLELISA停止溶液(Invitrogen)终止比色反应。通过分光光度法使用SpectraMax iD3酶标仪(Molecular Devices，San Jose，CA)读取450nm和650nm的吸光度。

AGM鼻拭子的SARS-CoV-2IgA ELISA

将纯化的融合前SARS-CoV-2刺突抗原(LakePharma)吸附至96孔MaxiSorp免疫微板(Thermo-Fisher)上。阳性对照是来自三个COVID-19恢复期对象的血清池(Nexelis)。自人类血清纯化的总IgA用作标准品(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。为了产生IgA标准曲线，将抗人类IgA捕获抗体单克隆抗体MT57(MabTech)吸附于板上，代替刺突抗原。培育后，用250μL PBST洗涤微板4次且用PBST中1％BSA封闭。然后添加纯化的人类IgA标准品、对照或样品稀释液，并在包被的微板中培育以允许结合。洗涤板，并向所有孔中添加对猴抗体具有交叉反应性的生物素化山羊抗人类IgA抗体(Mabtech)。通过洗涤去除过量生物素化抗IgA抗体，并添加缀合有链霉抗生物素蛋白的HRP(Southern Biotech)。添加TMB，并通过添加来自Invitrogen的停止溶液停止显色。在450nm测量每个孔的吸光度。在每一分析板上分析的标准总IgA抗体用于计算AGM样品中针对刺突蛋白的IgA抗体浓度，其以任意单位ELU/mL表示。一式两份实施测量且报告平均值与标准偏差。

微中和分析

如图18的示意图所示，将来自AGM的热灭活血清在具有非必需氨基酸(Gibco)和抗生素/抗霉菌的MEM中连续稀释。所有实验皆一式两份进行。向每一稀释液中添加200PFU的期望报道病毒，并在室温下培育1小时。用血清-病毒混合物感染生长在透明底部黑色96孔板(Grenier)中的汇合RCB1细胞，并在20℃下以1800x g离心(旋转)30分钟。将板在37℃和5％CO₂下培育20h。使用Celigo Image细胞计数器(Nexcelom)对每一孔中的荧光灶进行计数，并使用下式将其转化为抑制％：

其中MIN是在仅具有细胞(无病毒)的对照孔中获得的灶的平均数，且MAX是在仅具有病毒(无血清)的对照孔中自孔获得的灶的平均数。L是样品孔中的灶数量。使用GraphPadPrism(版本9.0.0)中的非线性回归选项“[抑制剂]对归一化反应-变量斜率”拟合抑制对血清稀释度的所得曲线。自拟合获得IC50，并计算NT50作为IC50的倒数。

实施例4-MV-014-212在hACE2小鼠中引发Th1偏斜细胞免疫反应

疫苗相关增强呼吸疾病(VAERD)的小鼠模型表明，向Th2反应偏斜的1型(Th1)和2型(Th2)T辅助细胞免疫性不平衡有助于攻击后增强的肺病理学(Boelen 2000)。为了评价接种MV-014-212疫苗后产生的Th1和Th2免疫性的平衡，表达人类ACE-2受体的转基因小鼠通过鼻内途径接种单剂量MV-014-212或PBS。对照组接受利用调配于明矾中的SARS-CoV-2刺突蛋白的肌内初免和加强疫苗接种，该蛋白已显示使免疫性偏向Th2反应(Corbett等人，上文文献)。在第28天，收集血清以通过ELISA量测总刺突特异性IgG、IgG2a和IgG1。此外，收集脾，且通过ELISpot分析量测表达干扰素-γ(IFNγ)和IL-5的脾细胞数量。IgG2a/IgG1的比率和产生IFNγ/IL-5的细胞的比率是Th1偏向的细胞免疫反应的指标(Corbet等人，上文文献，van der Fits等人(2020)NPJ Vaccines 5(1)：49)。

结果显示MV-014-212诱发刺突反应性脾细胞，如通过ELISpot分析所测量的(图19A)。重要的是，当用刺突肽池刺激细胞悬浮液时，MV-014-212诱发相对于IL-5更高数量的表达IFNγ的脾细胞，表明接种MV-014-212疫苗会产生Th1偏向的免疫反应。MV-014-212组中产生IFNγ的细胞对产生IL-5的细胞的比率比接种明矾辅助刺突蛋白疫苗的组高一个数量级以上(图19B)。与ELISpot数据一致，接种MV-014-212疫苗的动物血清中检测到的IgG2a/IgG1的比率高于接种明矾辅助刺突疫苗的对照组(图19C和图19D)。这些数据表明，鼻内接种活的减毒重组MV-014-212疫苗会诱发Th1偏向的抗病毒免疫反应。

讨论

在小鼠模型中，MV-014-212免疫引发Th1偏向的细胞免疫反应。在用MV-014-212免疫的hACE小鼠的脾细胞中检测到比分泌IL-5的T细胞更多的产生IFNγ的T细胞。此外，MV-014-212hACE2小鼠中IgG2a/IgG1同种型的比率是接受明矾辅助的刺突蛋白免疫的hACE2小鼠的约1000倍。对于批准紧急使用的COVID-19疫苗，尚未建立保护相关性。然而，接种MV-014-212疫苗的AGM达到与利用EUA疫苗观察到的保护程度相当的保护程度(Corbett等人，上文文献，Vogel等人，上文文献，Mercado等人，上文文献，van Doremalen等人，上文文献)。

材料和方法

SARS-Co V-2总IgG ELISA hA CE2-小鼠

将SARS-CoV-2刺突蛋白在N末端与刺突蛋白信号序列相连，并在蛋白质的C末端添加组氨酸标签。使SARS-CoV-2刺突蛋白在HEK293T细胞中表达，并在使用Ni-SepharoseExcel(GE)树脂(Global Life Sciences Solutions，Marlborough，MA)在AKTA层析系统上纯化至均质。将MaxiSorp免疫板(Thermo-Fisher，Waltham，MA)于4℃下与100μL 0.5mg/mL的于PBS中制备的SARS-CoV-2刺突一起培育过夜。去除蛋白质溶液，并用300μL补充有0.1％吐温20的PBS(PBST)洗涤板3次。以每孔200μL添加封闭溶液(含5％脱脂奶粉的PBST)，且将板在37℃下培育1h。将SARS-CoV-2刺突特异性IgG稀释于封闭溶液中，并用作标准品。阳性和阴性对照血清在封闭溶液中以1∶25稀释。通过用SARS-CoV-2RBD蛋白免疫小鼠在Nexelis产生阳性对照血清。阴性对照血清是自未处理小鼠获得。血清样品以1∶25稀释，之后在封闭溶液中进行八个2倍连续稀释。自板中取出封闭溶液，且用300μL PBST洗涤孔一次，之后添加100μL稀释的血清样品和对照。将板在37℃下培育2h。培育后，将用300μL PBST洗涤3次，且在最后一个洗涤步骤后向每一孔中添加100μL稀释于封闭溶液中的缀合有HRP的山羊抗小鼠抗体(A140-201P；Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)。将板在37℃下培育1h，且然后在300μL PBST中洗涤3次。向每个孔中添加含有3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物的显色溶液(BioRad，Hercules，CA)，并将板在37℃下培育30min以使颜色显现。通过添加100μL0.36N硫酸终止溶液终止比色反应。通过分光光度法使用SpectraMax iD3酶标仪(Molecular Devices，San Jose，CA)读取450nm和650nm的吸光度。

刺突特异性IgG1和IgG2a ELISA

在疫苗接种后第-21天和第28天收集小鼠的血清样品，以通过ELISA定量SARS-CoV-2刺突特异性IgG1和IgG2a抗体的含量。将纯化的灌注稳定的SARS-CoV-2刺突蛋白(SARS-CoV-2/人类/USA/WA1/2020，来自LakePharma)在PBS中稀释至1μg/mL，并将100μL添加至Maxisorp免疫板(Thermo-Fisher)的每个孔中，并在4℃下培育过夜。将板在PBST(PBS+0.05％吐温20)中洗涤4次，并将100μL封闭溶液(PBST+2％BSA)添加至每个孔中，并将板在室温下培育1小时。于封闭溶液中制备血清稀释液，其中以1：25第一次稀释用于IgG1分析或以1∶10-1∶100稀释用于IgG2a分析。将SARS-CoV-2刺突IgG1(Sino Biological)或抗刺突-RBD-mIgG2a(InvivoGen)稀释于封闭溶液中，并用作分析的标准品。

取出封闭溶液，且向每个孔中添加100uL稀释的抗体。将板在室温下培育1h，然后在PBST中使用洗板机洗涤4次。然后，向每个孔中添加分别以1∶32000和1∶1000稀释的100μL缀合有HRP的山羊-抗小鼠IgG1(Thermo Fisher)或缀合有HRP的山羊-抗小鼠IgG2a(ThermoFisher)第二抗体，并将板在室温下培育1h。将板在PBST中洗涤4次。向每个孔中添加100μL1-步超TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher)，且将板在定轨振荡器上持续摇动下培育30min。培育时段结束后，向每个孔中添加100μL终止溶液(Invitrogen)，并在450nm和620nm在Spectramax id3读板仪(Molecular Devices)上读取板。

接种MV-014-212疫苗的hACE2-小鼠的脾细胞的ELISPOT

接种后第28天收集接种ACE-2疫苗的小鼠的脾，并在冰上储存于含有10％FBS的DMEM中，直至处理。在含有培养基的无菌皮氏培养皿中均质化脾。经由100μm细胞截留器过滤匀浆，且将细胞悬浮液转移至冰上的无菌管中。通过在4℃下以200x g离心8min收集细胞。去除上清液，并用干净的纸巾吸干管边缘上的残余液体。通过将细胞团粒重新悬浮于2mLACK溶解缓冲液(155mM氯化铵、10mM碳酸氢钾、0.1mM EDTA)中并在室温下将样品培育约5min来溶解红细胞。以细胞悬液体积的2倍至3倍添加PBS，并通过在4℃下以200x g离心8min收集细胞。将细胞团粒在PBS中洗涤两次，并通过在4℃下以200x g离心8min收集细胞。去除上清液，并将团粒重新悬浮于2mM L-谷氨酰胺CTL-Test培养基(Cell TechnologyLimited，OH，USA)中。将悬浮液经由100μm细胞截留器过滤至新的15mL锥形管中，且使用血细胞计数器计数细胞，并以适当细胞浓度重新悬浮。将细胞在37℃下维持在具有5％CO₂的加湿培育器中，直至用于ELISpot分析。

使用小鼠IFNγ/IL-5双色ELISPOT分析试剂盒(Cell Technology Limited，OH，USA)实施ELISpot分析。根据制造商的方案(Cell Technology Limited，OH，USA)制备鼠类IFNγ/IL-5捕获溶液和70％乙醇。通过向每个孔中添加15μL 70％乙醇来活化板上的膜。将板在室温下培育不到1分钟，之后添加150μLPBS。去除暗渠以排出孔中的溶液，并用PBS洗涤每个孔两次。向每个孔中添加鼠类IFNγ/IL-5捕获溶液(80μL)捕获溶液，并用石蜡膜密平板，并在4℃下培育过夜。去除捕获溶液，并用150μL PBS洗涤板一次。以10mg/mL制备含有长度为15个氨基酸的肽的肽池，其跨越SARS-CoV-2刺突蛋白(PepMix^TM SARS-CoV-2刺突糖蛋白，JPT Peptide Technologies，Berlin DE)，并向每个孔中添加100μL。将含有伴刀豆球蛋白A(Con A)促分裂原(10μg/mL)的阳性对照添加至单独反应混合物中。将脾细胞与CTL-Test^TM培养基(Cell Technology Limited，OH，USA)混合，以产生3000000个细胞/mL的最终细胞密度，并使用大孔枪头向板中添加100μL/孔。将板在37℃下在含有9％CO₂的加湿培育器中培育24小时。将板用PBS洗涤两次，且然后用0.05％吐温-PBS洗涤两次，每次洗涤体积为200μL/孔，之后添加80μL/孔的抗鼠类FNγ/IL-5检测溶液(Cell Technology Limited，OH，USA)。将板于室温下培育2小时。将板用PBST洗涤三次，每次洗涤200μL/孔，之后添加80μL/孔的第三溶液(Cell Technology Limited，OH，USA)。将板于室温下培育一小时。将板用PBST洗涤两次，且然后用200μL/孔的蒸馏水洗涤两次。以80μL/孔添加蓝色显影液(CellTechnology Limited，OH，USA)，且将板在室温下培育15min。将板在自来水中冲洗三次以停止显影反应。最后一次洗涤后，以80μL/孔添加红色显影液(Cell Technology Limited，OH，USA)，且将板在室温下培育5-10min。冲洗板三次以停止显影反应。将板面朝下在工作台顶部上的纸巾上风干24小时。使用CTL-Immunospot读板仪(ImmunoSpot 7.0.23.2AnalyzerProfessional DC\ImmunoSpot 7，Cellular Technology Limited)和软件(CTLSwitchboard 2.7.2)对板上代表表达IFNγ(红色)或IL-5(蓝色)的脾细胞的印迹点进行定量。

实施例5一I期临床试验

在此实施例中，评估导致COVID-19疾病的新颖冠状病毒SARS-CoV-2的疫苗。疫苗以滴剂或喷雾剂的形式施用鼻中。具体而言，该研究分析疫苗在施用给18至69岁的健康成人(其对SARS-CoV-2呈血清阴性)时的安全性和免疫反应。

同类群组A(18-55岁)将首先入选。前10名参与者(第1组)将接受剂量1的疫苗。在审查第3天的第1组安全性数据后，接下来的20名参与者(第2组)接受剂量2的疫苗。在审查第3天的第2组安全性数据后，同类群组A中的最后一组50名参与者(第3组)接受剂量3的疫苗。第3组中的亚组经由鼻喷雾剂接受剂量3的疫苗，而其余参与者通过滴鼻剂接受施用。同类群组A中的第二亚组在第36天接受第二剂相同的疫苗，而其余参与者接受单剂量的疫苗(在第1天)。

在审查第15天的同类群组A的安全性数据后，同类群组B(56-69岁)入选。前10名参与者(第4组)接受剂量1的疫苗。在审查第3天的第4组安全性数据后，接下来的20名参与者(第5组)接受剂量2的疫苗。在审查第3天的第5组安全性数据后，同类群组A中最后一组20名参与者(第6组)接受剂量3的疫苗。同类群组B中的所有参与者都接受单剂量的疫苗，并通过滴鼻剂施用。在同类群组A和B中的每一组内，将执行哨兵给药方法作为额外安全措施。

表7

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结果测量

确定的主要结果量测包括设定记录的不良事件(AE)、非设定记录的AE、严重不良事件(SAE)、医疗护理的不良事件(MAE)和针对疫苗编码的SARS-CoV-2S蛋白的血清中和抗体效价的变化。在疫苗接种后立即确定设定记录和非设定记录的AE。在整个研究持续时间(约1年)内SAE和MAE。自基线至第29天，平均五(5)周，确定针对疫苗编码的SARS-CoV-2S蛋白的中和抗体的血清效价变化。

测量设定记录的AE的频率，并按严重程度分类。设定记录的AE是疫苗施用后可发生的预定义AE。

测量未设定记录的AE的频率，并按严重程度分类。未设定记录的AE是在施用疫苗的参与者中发生的任何不良医学事件，无论与疫苗的因果关是如何。未设定记录的AE可包括与疫苗使用暂时相关的不利和非故意的体征(包括异常实验室发现)、症状或疾病。

测量SAE的频率，根据疫苗相关性分类。SAE是指危及生命或导致以下中的任一项的AE，无论是否被认为与疫苗因果相关：死亡、住院或延长现有住院时间、持续或显著失能或显著破坏执行正常生活功能的能力、或先天性异常/出生缺陷。

测量MAE的频率，根据疫苗相关性分类。MAE是具有非预定的医学护理就诊，例如紧急护理就诊、急性初级护理就诊、急诊科就诊或对医疗提供者的其他以前未计划的就诊的AE，无论是否被认为与疫苗因果相关。预定的医学拜访例如常规体检、健康检查、“体检”和疫苗接种不被视为MAE。

自基线至第29天平均五(5)周，测量每个参与者针对疫苗编码的SARS-CoV-2S蛋白的血清中和抗体(nAb)效价的变化。

确定的次要结果测量包括(1)针对疫苗编码的SARS-CoV-2S蛋白的血清结合抗体浓度的变化，(2)潜在疫苗病毒脱落的频率、量值和持续时间。

自基线至第29天平均五(5)周，测量每个参与者血清结合抗体浓度的变化。

自基线至第29天平均四(4)周，测量每个剂量组和整体的疫苗病毒的任何疫苗接种后脱落的频率(如通过病毒培养所检测)。若通过培养检测到疫苗病毒的疫苗接种后脱落，则自基线至第29天平均四(4)周，测量每个剂量组和整体的峰值病毒效价(以噬斑形成单位PFU测量)。若通过培养检测到疫苗病毒的疫苗接种后脱落，则自基线至第29天平均四(4)周，测量每个剂量组和整体的脱落持续时间(以天为单位)。

此研究的合格性准则

·研究合格的年龄：18岁至69岁

·研究合格的性别：所有

·是否基于性别：否

·接受健康志愿者：是

纳入准则：

·在签署知情同意书当天确定的≥18岁且＜56岁的健康成人(同类群组A)和≥56岁且＜70岁的健康成人(同类群组B)

·施用前第1天SARS-CoV-2RT-PCR(鼻拭子)阴性

·育龄妇女(WOCBP)或其配偶为WOCBP的男性对象必须同意自签署知情同意书开始，在最终MV-014-212施用后的至少3个月内，在其研究参与期间实施避孕。

·书面知情同意书

排除准则：

·慢性肺病(例如慢性阻塞性肺病、气喘、肺纤维化、囊性纤维化)的诊断。消退的儿童期气喘并不排除在外。

·由于合并症或研究方案中详述的其他病况导致的免疫受损

·鼻塞(包括解剖/结构原因、急性或慢性鼻窦炎或其他原因)

·健康护理工作者、长期护理或疗养院设施居民或员工、紧急反应团队成员或具有暴露于SARS-CoV-2的高风险的其他职业、和在家庭外从事面向客户职业的那些(例如服务员、收银员或店员、公共运输或出租车司机)

·筛选期间血清妊娠测试阳性和/或第1天尿液妊娠测试阳性

·研究参与的任何时段期间母乳喂养

·职业或家庭接触＜5岁儿童或免疫缺陷人员

·在PI看来排除研究参与的任何医学疾病或病况。此包括急性、亚急性、间歇性或慢性医学疾病或病况，其会将对象置于不可接受的损伤风险下，使对象无法满足方案的要求，或可干扰反应的评估或对象成功完成本试验

预计接种MV-014-212的对象将表现出针对疫苗编码的SARS-CoV-2S蛋白的中和抗体的血清效价增加，和针对疫苗编码的SARS-CoV-2S蛋白的血清结合抗体浓度增加。

本文的序列表中提供的序列示于表8中：

表8

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以引用方式并入

本文中提及的专利和科学文件中的每一个的整个公开内容出于所有目的以引用方式并入。

等效形式

可以其他具体形式来体现本发明，而不背离其精神或基本特性。因此，应在所有方面中将前述实施方案视为说明性而非限制本文中所阐述的本发明。因此，本发明的范围由所附权利要求而非由前述描述指示，且在权利要求的等效含义和范围内的所有变化皆旨在包含在其中。

Claims (23)

1.一种嵌合蛋白，其包含SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域和RSV融合(F)蛋白的胞质尾区部分。

2.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其中嵌合蛋白在N-末端至C-末端方向上包含SARS-CoV-2刺突蛋白的胞外结构域和RSV融合(F)蛋白的胞质尾区部分。

3.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其中嵌合蛋白进一步包含SARS-CoV-2刺突蛋白的跨膜部分。

4.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其中嵌合蛋白包含选自SEQ ID NO：1-6、62、68、74、80、86、92、98和110的序列或与选自SEQ ID NO：1-6、62、68、74、80、86、92、98和110的序列具有至少约85％(例如至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)序列一致性的其变体。

5.一种免疫原性组合物，其包含含有编码根据权利要求1至4中任一项所述的嵌合蛋白的核酸的活的嵌合病毒。

6.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其中核酸包含选自SEQ ID NO：7-12、63、69、75、81、87、93、99和111的序列或与选自SEQ ID NO：7-12、63、69、75、81、87、93、99和111的序列具有至少约85％(例如至少约90％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)序列一致性的其变体、或上述任一项的RNA对应体、或上述任一项的互补序列。

7.根据权利要求5或6所述的免疫原性组合物，其进一步包含RSV的NS1和/或NS2蛋白。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的免疫原性组合物，其中活的嵌合病毒不包含编码RSVG蛋白的基因。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂和/或其他药学上可接受的载剂。

10.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其中佐剂是铝凝胶、铝盐或单磷酰脂质A。

11.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其中佐剂是任选地包含α-生育酚、角鲨烯和/或表面活性剂的水包油乳液。

12.一种针对SARS-CoV-2病毒使对象免疫的方法，方法包括向对象施用有效量的根据权利要求4至11中任一项所述的免疫原性组合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中施用是鼻内施用。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中免疫原性组合物是以约103至约106的剂量施用的。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中免疫原性组合物的施用诱发SARS-CoV-2刺突特异性黏膜IgA反应，或产生血清中和抗体。

16.一种核酸，其编码根据权利要求1或2所述的嵌合蛋白。

17.根据权利要求16所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO：7-12、63、69、75、81、87、93、99和111的序列或与选自SEQ ID NO：7-12、63、69、75、81、87、93、99和111的序列具有至少约85％(例如至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)序列一致性的其变体、或上述任一项的RNA对应体、或上述任一项的互补序列。

18.一种载体，其包含根据权利要求16或17所述的核酸。

19.根据权利要求18所述的载体，其选自质粒或细菌人工染色体。

20.根据权利要求19所述的载体，其中载体是细菌人工染色体，包含选自SEQ ID NO：54-59、66、67、72、73、78、79、84、85、90、91、96、97、102、103、114、115和131-136的序列、或与选自SEQ ID NO：54-59、66、67、72、73、78、79、84、85、90、91、96、97、102、103、114、115和131-136的序列具有至少约85％(例如至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)序列一致性的其变体。

21.一种分离的重组颗粒，其包含RSV的NS1和/域NS2蛋白和权利要求1或2的嵌合F蛋白。

22.根据权利要求21所述的分离的重组颗粒，其包含活的减毒嵌合RSV-SARS-CoV-2基因组或反基因组。

23.一种活的减毒嵌合RSV-SARS-CoV-2反基因组，其包含选自SEQ ID NO：13-18、65、71、77、83、89、95、101、104-109和113的序列或与选自SEQ ID NO：13-18、65、71、77、83、89、95、101、104-109和113的序列具有至少约85％(例如至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)序列一致性的其变体、或上述任一项的RNA对应体、或上述任一项的互补序列。