CN116478814A - 一种原位杂交装置及靶标检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种原位杂交装置及靶标检测方法，包括上极板、空腔层与下极板，所述空腔层位于所述上极板与所述下极板之间；空腔层包括连通的储液单元与反应单元，储液单元用于储存反应试剂，反应单元用于供样本与反应试剂进行原位杂交反应；所述下极板包括基板，所述基板上设有电极结构，所述电极结构包括多个电极，多个电极用于驱动所述反应试剂在所述空腔层中移动。本申请采用小型化的原位杂交装置，通过电极结构自动化、并行化的液滴处理能力，驱动反应试剂与样本接触进行原位杂交反应，自动化程度高，检测方便快速，并且大大减少试剂消耗量，降低成本。

Description

一种原位杂交装置及靶标检测方法

技术领域

本申请涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种原位杂交装置及靶标检测方法。

背景技术

荧光原位杂交(FISH)是分子病理学临床上常用手段之一，其原理是使用荧光标记的单链核酸探针特异性地标记细胞内的靶基因分子，通过荧光信号可视化原位检测目标基因异常；FISH技术目前在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中具有较大优势，尤其是在肿瘤细胞基因多拷贝、融合、分裂等基因突变检测方面是临床金标准，其成本较低，不依赖复杂昂贵的设备，易于在医院推广普及；但FISH技术在操作过程中需要经历诸多人工操作阶段，操作繁琐且对人员专业素质极度依赖，影响该技术的广泛应用。

目前，实验室进行的样品分析化验大都依赖传统的仪器设备，台式设备占用空间大，并需要专业人士花费大量时间进行操作或样品配置及转移，检测过程耗时长，也容易出现失误，此外在一定程度上造成对人力资源的浪费。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本申请提供了一种原位杂交装置及靶标检测方法，自动化程度高，检测方便快速且成本低，能够广泛适用于多种复杂的生物化学分析。所述技术方案如下：

本申请提供了一种原位杂交装置，包括上极板、空腔层与下极板，所述空腔层位于所述上极板与所述下极板之间；

所述空腔层包括储液单元与反应单元，所述储液单元与所述反应单元连通，所述储液单元用于储存反应试剂，所述反应单元用于供样本与所述反应试剂进行原位杂交反应；

所述下极板包括基板，所述基板上设有电极结构，所述电极结构包括多个电极，所述多个电极用于驱动所述反应试剂在所述空腔层中移动。

进一步地，每个所述电极能够被单独控制。

进一步地，所述多个电极包括第一电极，每个所述储液单元与单个所述第一电极对应设置，所述第一电极用于驱动所述储液单元中的所述反应试剂分离得到反应试剂的液滴。

进一步地，所述多个电极包括第二电极，每个所述反应单元与单个所述第二电极对应设置，所述第二电极用于驱动所述液滴移入所述反应单元。

进一步地，所述下极板包括介电层，所述电极结构位于所述介电层与所述基板之间。

进一步地，所述原位杂交装置包括疏水层，所述疏水层位于所述上极板与所述介电层之间。

进一步地，所述反应单元对应的容积小于5μL。

本申请还提供一种靶标检测方法，基于如上任一项所述的原位杂交装置进行，包括：

向原位杂交装置中空腔层的反应单元提供样本；

向所述空腔层的多个储液单元分别移入一种反应试剂；所述反应试剂包括探针溶液，所述探针溶液包括具有荧光物质的单链核酸探针，所述探针用于通过所述荧光物质标记所述样本中的靶标物；

控制多个电极驱动所述储液单元中的反应试剂向所述反应单元移动，进行原位杂交反应，生成携带荧光物质的杂交产物；

对所述原位杂交装置中的所述杂交产物进行荧光检测，得到检测结果；所述检测结果包括所述样本中所述靶标物是否存在以及所述靶标物的含量。

进一步地，所述原位杂交反应包括：

通过对应的电极将多种浓度的乙醇溶液液滴依次移向所述反应单元，进行梯度脱水；

通过对应的电极将探针溶液的液滴移向反应单元，进行探针杂交；

通过对应的电极将染色液的液滴移向所述反应单元，进行染色。

进一步地，所述多个电极的驱动电压为100～400V。

实施本申请，具有如下有益效果：

1、本申请采用小型化的原位杂交装置，通过电极结构自动化、并行化的液滴处理能力，驱动反应试剂与样本接触自动进行标准化的原位杂交反应，代替人工操作，自动化程度高，交叉污染少，能够在4h内自动完成整个检测流程，检测方便快速且成本低；该原位杂交装置还能够用于检测多种不同的细胞系，广泛适用于多种复杂的生物化学分析。

2、本申请的空腔层容积小，反应单元对应的容积也小，能够大大减少试剂消耗量，降低检测成本。

附图说明

为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所使用的附图作简单的介绍，其中相同的零部件用相同的附图标记表示。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1为本申请提供的一种原位杂交装置的局部结构示意图；

图2为本申请的一个可选实施例提供的原位杂交装置的俯视图；

图3为本申请的可选实施例中通过不同工艺制备的下极板示意图；

图4为本申请提供的一种加热机构的结构示意图；

图5为本申请提供的一种靶标检测方法的逻辑流程图；

图6为本申请中电极结构的液滴操纵实验的示意图；

图7为本申请提供的一种原位杂交反应的逻辑流程图；

图8为本申请的一个具体实施例中靶标检测方法的检测结果对比示意图。

其中，图中附图标记对应为：1-上极板，2-空腔层，3-下极板，31-基板，32-电极，320-第一电极，321-第二电极，322-第三电极，33-介电层，34-疏水层，4-覆盖层，5-底板，6-加热组件，7-控制器件，8-显示器件。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例，因此不能理解为对本申请的限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便本申请的实施例能够以除了下述图示或下述描述以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或区域的过程、方法、系统、产品或服务器不必限于清楚地列出的那些步骤或区域，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或区域。

实施例

本申请提供一种原位杂交装置，用于进行原位杂交反应，如图1所示，该原位杂交装置包括上极板1、空腔层2与下极板3，空腔层2位于上极板1与下极板3之间，该空腔层2能够装载样本和反应试剂，空腔层2还用于供样本与反应试剂进行原位杂交反应；下极板3包括基板31，基板31上设有电极结构，该电极结构包括多个电极32，多个电极32用于驱动反应试剂在空腔层2中移动，以使得反应试剂能够移动到样本的位点，反应试剂与样本充分接触，使得原位杂交反应顺利进行。

具体地，该原位杂交装置是基于介电润湿的数字微流控芯片，该原位杂交装置无需在空腔层2中设置复杂的三维通道、阀门和泵等额外结构，即可通过电极结构进行液滴的生成、分配、移动、合并、分离与并行等液滴处理，极大地提高了该原位杂交装置进行靶标检测的精确性、稳定性和自动化程度；此外，介电润湿驱动是利用电压对导电液滴实施操控的驱动方式，通过对多个电极32分别施加电压在空腔层2的不同位置之间形成电压差，驱动至少部分反应试剂形成该反应试剂对应的液滴，图1空腔层2中的椭圆形结构代表液滴，该反应试剂以液滴的形式在空腔层2中移动，灵敏度高，控制精度高，有利于标准化的实验流程，并且，样本体积小于液滴体积，使得样本能够处于液滴中，有利于充分进行原位杂交反应。

可选地，上极板1的材质为氧化烟锡(ITO)玻璃，便于实验观察；在一个可选实施例中，上极板1表面还设有一层覆盖层4，该覆盖层4将上极板1与外界环境隔离，避免外界环境对原位杂交装置中的检测过程造成不良影响，可选地，该覆盖层4为透明玻璃。

具体地，如图1所示，相邻的电极32之间相互分隔，即电极32与电极32之间是不接触的，相邻行的电极32之间具有间隔，相邻列的电极32之间也具有间隔，每个电极32能够被单独控制；在一个可选实施例中，多个电极32之间并联，能够自由选择需要施加电压的电极数量与位置，从而精确控制液滴在该电极32对应的空腔层2位点上的移动；优选地，电极结构为图案化阵列电极，在每个电极32对应的空腔层2位点上均能够实现润湿效果，以使得液滴在不同的电极32之间移动，实现对每个数字液滴单独寻址操作的功能，重构性与可扩展性好；该图案化阵列电极能够对液滴进行精确控制，还能够控制阵列的通断，大大增强液滴处理的灵活性与高效性，操作简单方便快速，自动化程度高。

具体地，空腔层2的高度为150～300μm，能够避免上极板1和下极板3压住样本，也能够容纳更多液体，增加样本周围的反应试剂的量，有利于样本与反应试剂充分反应；可选地，空腔层2的高度为150～250μm；还可选地，空腔层2的高度为180～230μm；例如，在一个具体实施例中，空腔层2的高度为200μm。

具体地，空腔层2包括多个区域单元，单个区域单元与单个电极32相对应；多个区域单元包括储液单元与反应单元，其中储液单元用于储存反应试剂；可选地，空腔层2包括多个储液单元，多个储液单元用于储存多种不同的反应试剂，优选地，每个储液单元用于储存一种反应试剂。

反应单元能够容纳样本，且储液单元与反应单元连通，用于供反应试剂移动，则反应单元还用于在反应试剂移入后进行原位杂交反应；可选地，空腔层2包括至少一个反应单元；在一个具体实施例中，空腔层2包括一个反应单元，反应试剂均移向该反应单元进行原位杂交反应；在另一个可选实施例中，空腔层2包括多个反应单元，通过控制多个电极32中的至少一个电极32，多个反应单元中的至少一个反应单元工作，灵活性高，通过不同的多个电极32还能够控制多个反应单元中的至少两个反应单元工作，进行并行反应，实现高通量多通道同步检测，能够进一步提升检测效率与检测精确度。

需要说明的是，空腔层2为反应腔，该反应腔是一个整体连续的空腔结构，储液单元与反应单元均位于同一空腔结构中，空腔层2内部无需设置复杂的三维结构，储液单元与反应单元均为该空腔结构中位置不同的位点，相互之间不存在如图2中方格状结构的间隔，而如图2中方格状区域单元结构所示，方格状区域单元结构代表电极结构的各个电极32，各个区域单元是与各个电极32相对应的，则对应的电极32上方即各个区域划分的对应区域单元，以使得通过该区域单元底部的电极32控制液滴的移动和定点停留，精确性高。

具体地，上极板1开设第一进样孔，该第一进样孔用于供样本移入空腔层2中；可选地，上极板1包括至少一个第一进样孔；还可选地，上极板1包括至少两个第一进样孔，第一进样孔与反应单元对应设置，以使得样本通过该第一进样孔固定在反应单元中，定位准确，固定可靠，提升检测过程的稳定性。

具体地，上极板1开设第二进样孔，第二进样孔用于向储液单元输入反应试剂，以使得储液单元起到临时储存的作用；可选地，上极板1开设多个第二进样孔，第二进样孔与储液单元对应设置，避免反应试剂之间的相互污染。

具体地，如图2所示，多个电极32包括第一电极320，每个储液单元与单个第一电极320对应设置，该第一电极320用于驱动对应的储液单元中的反应试剂分离，得到该反应试剂的液滴，此时第一电极320通过电压驱动该第一电极320上方对应的储液单元中的反应试剂，从反应试剂中分离出一滴液滴使得该液滴离开储液单元，向其他的电极32对应的区域单元移动。

具体地，如图2所示，多个电极32包括第二电极321，每个反应单元与单个第二电极321对应设置，与反应单元对应的第二电极321用于与其他的电极32相配合将液滴移入该反应单元中，从而完成液滴在储液单元与反应单元之间的移动，即通过储液单元对应的第一电极320从储液单元中拉出反应试剂的一个液滴，通过储液单元与反应单元之间的多个电极32驱动该液滴向反应单元移动，最后配合反应单元对应的第二电极321使得液滴移入反应单元，以便于液滴与其中的样本进行反应。

具体地，如图2所示，储液单元与反应单元之间具有传输单元，储液单元与反应单元之间通过传输单元连通；多个电极32还包括第三电极322，即该传输单元的底部也对应设有多个第三电极322，该第三电极322位于第一电极320与第二电极321之间，在液滴生成和到达反应单元的过程中，该传输单元中对应的多个第三电极322用于驱动液滴在储液单元与反应单元之间移动，沿储液单元向反应单元的传输方向，通过对该传输方向上的多个第三电极322依次加电，使得液滴在不同的第三电极322上移动，导通储液单元与反应单元之间的输送路径，在该传输单元的范围内形成连通通路，将液滴移动至反应单元中；此外，该传输单元还能够用于混合反应试剂，通过对多个第三电极322往复加电，使得反应试剂的液滴在多个第三电极322对应的传输单元内往复移动，提升均匀性。

具体地，空腔层2还包括废液单元，用于收集反应单元中原位杂交反应的反应废液，该废液单元的底部也设有电极32，多个电极32还用于驱动反应单元中的反应废液移动到废液单元，以避免前次反应试剂影响后续反应步骤的进行。

具体地，电极结构组成液滴的操纵区域，电极结构的横截面积小于空腔层2的横截面积，即电极结构在平行于空腔层2方向上的边界均位于空腔层2在该方向上的边界之内，以使得空腔层2能够覆盖液滴的整个操纵区域，提升控制精度。

可选地，单个电极32的长度为1.5～9mm，宽度为1.5～4mm；还可选地，第一电极320的长度可选为5～9mm，宽度可选为1.5～4mm；第二电极321与第三电极322的长度可选为1.5～4mm，宽度可选为1.5～4mm。

还可选地，单个电极32的长度为2～8mm，宽度为2～3mm；例如，在一个具体实施例中，第一电极320的长度为7.2mm，宽度为3mm，第二电极321的长度为2.5mm，宽度为2.5mm，灵敏度高，控制精度好。

可选地，电极32的厚度为50～100μm；还可选地，电极32的厚度为60～80μm，能够形成具有预设体积的反应试剂的液滴，精确有效地驱动液滴移动；此外，在该长度、宽度与厚度范围内的多个电极32，能够配合较低的驱动电压，实现有效驱动和液滴的高移速，节省能源。

具体地，在一个可选实施例中，如图1所示，下极板3包括介电层33，电极结构位于介电层33与基板31之间，即电极结构位于介电层33中，各个相互分隔的电极32之间的空隙由介电层33的材料填充，保护电极结构。

具体地，如图1所示，在一个可选实施例中，上极板1与介电层33之间设有疏水层34，能够增大液滴初始接触角并减小液滴移动过程中受到的阻力，提升反应试剂移动的流畅性，提升电极结构对液滴操纵的可靠性与精确性。

可选地，疏水层34设置于空腔层2与介电层33之间，该疏水层34将空腔层2与下极板3隔离开。

还可选地，疏水层34设置于上极板1与空腔层2之间，该疏水层34将空腔层2与上极板1隔离；优选地，反应单元为亲水位点，与该反应单元对应的上极板1与空腔层2之间不具有疏水层34，而在其他区域对应的上级板1与空腔层2之间仍具有疏水层34，即疏水层34是不连续的，该亲水位点可选由lift-off工艺去除对应区域的疏水层34，以使上极板1直接覆盖反应单元的空腔结构。

可选地，疏水层34的厚度为5～40μm；还可选地，疏水层34的厚度为10～30μm；优选地，疏水层34的厚度为10～20μm，降低液滴在空腔层2中移动的阻力。

可选地，疏水层34的表面粗糙度Ra大于等于0.5，增大液滴的接触角，降低移动阻力；还可选地，疏水层34的表面粗糙度Ra大于等于0.8。

在一个可选实施例中，如图3(A)所示，原位杂交装置的基板31的材质为氧化烟锡(ITO)玻璃，成本低，并且ITO玻璃导电性能好，电极结构能够按照预设图案直接在ITO玻璃表面进行电极刻蚀得到，操作方便；相对应地，介电层33设置于ITO玻璃具有电极结构的一侧表面上，疏水层34位于介电层33上，构成原位杂交装置的下极板3；可选地，介电层33的材质为光刻胶，还可选地，疏水层34的材质为特氟龙，加工方便，成本低。

在另一个可选实施例中，如图3(B)所示，原位杂交装置的基板31的材质为石英玻璃，电极结构为金属电极，金属电极的材质包括铜、银、镍、铂、钯中的任一种，则该金属电极能够采用光刻工艺制作光刻胶图案，表面溅射金属，再通过lift-off工艺进行加工，完成图案化阵列电极结构，之后在电极结构上加工介质层与疏水层34得到下极板3。

在一个优选实施例中，如图3(C)所示，原位杂交装置的基板31为印刷电路板(PCB)，基于印刷电路板的电极结构加工方便，成本低，有利于提升电极结构的结构精度，且PCB布线灵活，能够增大原位杂交装置的有效面积并增加电极数目，提升控制精度；相对应地，介电层33的材质可选为聚四氟乙烯(PTFE)薄膜，并且PTFE薄膜疏水性好，能够发挥介质层和疏水层34的双重作用，无需再增设疏水层34，极大程度的降低加工难度以及成本，同时减小了原位杂交装置的整体厚度，有利于快速传热以进行反应。

在另一个优选实施例中，如图3(D)所示，电极结构由喷墨打印或墨水直写制成，基板31为薄玻璃，通过喷墨打印或墨水直写在薄玻璃上制作图案化阵列电极，加工速度快，且成本低无需净化间工艺，大大减小下级板厚度，利于快速传热散热，实现原位杂交装置内部快速控温。

具体地，反应单元对应的容积小于5μL，能够减少50～90％的试剂用量；可选地，反应单元对应的容积小于4μL；可选地，反应单元对应的容积小于3μL；还可选地，反应单元对应的容积小于2μL，大大减少反应试剂的消耗量，例如，单次检测仅使用小于2μL的探针溶液，与常规检测方法相比减少了80％以上的试剂用量，大大节省成本。

本实施例还提供一种原位杂交系统，该原位杂交系统包括加热机构与以上所述的原位杂交装置，如图4所示，该加热机构包括底板5、加热组件6与控制器件7，该加热组件6与控制器件7连接于底板5；其中，加热组件6包括测温电极与加热电极，测温电极用于测量原位杂交装置(空腔层2或下极板3)对应的实时温度，加热电极用于对原位杂交装置进行加热；控制器件7与加热组件6连接，用于控制加热组件6进行加热，加热组件6能够置于下极板3下方，即加热组件6的上表面用于放置原位杂交装置，以控制下极板3的温度，进而通过下极板3良好的导热性控制空腔层2中的温度，能够可靠调节原位杂交装置中的温度，使得温度能够快速精准地达到原位杂交反应中各个反应阶段对应的预设温度，变温快速精确，有利于原位杂交反应的稳定进行。

具体地，该加热机构的长度小于等于10cm，宽度小于等于10cm，小型化程度好，携带方便，能够达到21～40℃/s的升温速度和6～20℃/s的降温速度，既保证较高的变温效率，又避免灵敏度过高出现变温过度无法及时稳定温度的情况，控温快速，灵敏度好，控温精准度高。

具体地，加热组件6包括加热区域61，加热区域61上设有黏附层与电极层，其中，电极层包括测温电极与加热电极，电极层通过黏附层固定于加热区域61上；该加热区域61与电极结构对应设置，以对空腔层2中各个单元进行定位加热，传热效率高，有利于提升控温效率和控温精度；在一个可选实施例中，加热区域61的长度为6～30mm，宽度为6～30mm，占用面积小，集成化程度高。

可选地，电极层的电极材料包括金、银、铜、镍、铂与钯中的任一种；优选地，电极层为铂层，相对应地，黏附层为钛层，制备方便，成本低。

可选地，黏附层厚度为30～70nm，电极层的厚度为120～180nm，导热性能好；在另一个可选实施例中，黏附层厚度为40～60nm，电极层的厚度为140～160nm，有利于提升电极层对温度变化的灵敏度，提升温控效率与精度，避免过度升温或过度降温，也有利于降低成本。

具体地，底板5设有测温电路与温控电路，控制器件7通过测温电路与测温电极连接，该测温电路用于根据测温电极生成测温信号传输到控制器件7，可选地，测温电路为恒流源电路；控制器件7通过温控电路与加热电极连接，该控制器件7根据接收的测温信号得到温度控制信号，温控电路用于根据接收的温度控制信号导通或断开加热电极，控制温度变化，控温快速精确。

可选地，控制器件7基于PID控制算法进行调控，以提升温度控制信号对加热电极上所加电压的调控快捷性与精确性，进而提升该小型化的加热机构整体的温控效率、灵敏度以及温控精度；还可选地，控制器件7输出的温度控制信号为脉冲可调波信号(即PWM信号)，以数字波形的形式输出，该脉冲可调波信号为具有可变的信号占空比的控制信号，以满足不同的原位杂交反应过程对变温和保温的要求，灵活性好；控制器件7可选为小型化的MCU开发板，易于操作控制，且体积小，装配方便，成本低。

具体地，该加热机构还包括显示器件8，显示器件8与控制器件7连接，用于显示原位杂交反应中的多种实时数据；多种实时数据是能够反映原位杂交装置中原位杂交反应当前的反应阶段以及该反应阶段对应的实时环境条件的数据，以便捷、直观地提供原位杂交反应的信息；可选地，该实时数据包括实时温度和时间；在一个可选实施例中，显示器件8为有机电激光显示器件(OLED)。

本实施例还提供一种靶标检测方法，基于以上所述的原位杂交装置进行，能够用于进行多种靶标物的定性和定量检测，包括阴性对照和阳性对照，还可以用于检测离子、小分子、蛋白、核酸、激素、细胞、真菌、细菌和病毒等多种特定生物物质，适用范围广泛；如图5所示，该靶标检测方法包括：

S1，向原位杂交装置中空腔层的反应单元提供样本；

S2，向所述空腔层的多个储液单元分别移入一种反应试剂；所述反应试剂包括探针溶液，所述探针溶液包括具有荧光物质的单链核酸探针，所述探针用于通过所述荧光物质标记所述样本中的靶标物；

S3，控制多个电极驱动所述储液单元中的反应试剂向所述反应单元移动，进行原位杂交反应，生成携带荧光物质的杂交产物；

S4，对所述原位杂交装置中的所述杂交产物进行荧光检测，得到检测结果；所述检测结果包括所述样本中所述靶标物是否存在以及所述靶标物的含量。

在S1步骤中，首先提供原位杂交装置，在空腔层的反应单元中载入样本，之后将上极板与下极板组装为一体，完成样本的固定；在一个可选实施例中，在多个反应单元中分别装载样本，进行并行处理，以使得后续靶标检测过程能够可选地在多个反应单元中并行，提升检测效率与准确度；其中，多个反应单元中可选地装载同种样本，提升检测量，使得原位杂交装置中的荧光信号更为明显，同时重现性好，避免检测失误，提升检测准确度；多个反应单元中可选地装载不同种样本，以使得该原位杂交装置同时进行多种不同靶标物的同步检测，检测效率高，能够实现高通多通道同步检测，且每个反应单元中都能够提供足够的荧光信号，检测灵敏度高；此外，在一个可选实施例中，向空腔层中填充润滑剂，减少交叉污染，也有利于反应试剂的液滴移动。

其中，S2步骤中通过移液器从上极板的第二进样孔向储液单元中移入反应试剂，空腔层2中包括多个储液单元，每个储液单元用于储存一种反应试剂；例如，多个储液单元包括探针储液单元，该探针储液单元用于储存探针溶液，则移液器吸取探针溶液，移动到探针储液单元上方的第二进样孔，并通过第二进样孔将探针溶液注入探针储液单元中，以便于后续控制电极从探针储液单元中拉出探针溶液的液滴进行荧光原位杂交反应。

S3步骤自动控制多个电极驱动对应储液单元中的反应试剂移至反应单元，即驱动反应试剂向样本移动，在向反应单元移动的过程中，相邻的两个电极上分别施加不同的电压，且靠近储液单元的电极上施加的电压值大于靠近反应单元的电极上施加的电压值，以使得两个电压之间形成电势差，促使位于电极上方的液滴朝向低电势的方向移动，通过对储液单元向反应单元的路径上分布的多个电极依次加电，自动驱动反应试剂的液滴朝向反应单元移动，使得原位杂交反应能够在无需手动或人工干预的情况下自动进行，控制方便且控制精度高。

具体地，施加于多个电极上的驱动电压为100～400V，能够有效驱动液滴移动；可选地，驱动电压为100～300V；还可选地，驱动电压为100～250V，在该驱动电压的范围内，本实施例中的多个电极能够有效驱动预设体积的液滴分离并移动；优选地，驱动电压为110～200V，液滴移速明显，且能够有效避免介电层击穿，可靠性高，稳定性好；如图6所示，对该原位杂交装置施加驱动电压进行液滴操纵实验，可见，液体能够在2s之内快速生成液滴并从储液单元中移出，液滴控制高效精确。

具体地，驱动电压的频率大于等于1000Hz，一方面能够有效驱动液滴，移速明显，另一方面能够在驱动电压范围内形成预设体积的液滴，该反应试剂的液滴的预设体积为0.8～2.0μL，反应试剂用量少，能够极大地避免试剂浪费；此外，该频率范围内的驱动电压还能够提升各种反应试剂的液滴的预设体积均匀性，各种反应试剂的液滴对应的变异系数(CV)小于等于5％，液滴均匀性好，能够大大提升检测结果的稳定性和可靠性。

荧光原位杂交反应是使用同源互补的核酸探针经变性、退火、复性形成靶基因与核酸探针的杂交产物的反应，其中，样本含有靶标物，该靶标物即包括用于与核酸探针杂交的靶基因片段，通过荧光原位杂交反应，探针上携带的荧光物质通过反应进行转移，使靶标物携带上荧光物质，在原位杂交装置中生成具有荧光物质的杂交产物，该杂交产物能够在特定激光的激发下显示出特定的荧光信号，以便于根据荧光信号确定靶基因的存在。

具体地，如图7所示，S3步骤中的原位杂交反应包括：

S301，通过对应的电极将多种浓度的乙醇溶液液滴依次移向所述反应单元，进行梯度脱水；

S302，通过对应的电极将探针溶液的液滴移向反应单元，进行探针杂交；

S303，通过对应的电极将染色液的液滴移向所述反应单元，进行染色。

其中，反应试剂还包括去离子水、多种浓度的乙醇溶液和染色液，相对应地，储液单元包括去离子水储液单元、酶储液单元、乙醇储液单元和染色液储液单元；在一个可选实施例中，乙醇溶液浓度不同，多个储液单元中包括至少一个乙醇储液单元，可选地，多个储液单元中包括一个乙醇储液单元，该乙醇储液单元用于储存无水乙醇，通过将无水乙醇与去离子水分别按照不同的比例混合均匀得到多种浓度的乙醇溶液；还可选地，该空腔层2设有多个乙醇储液单元，每个乙醇储液单元用于储存一种浓度的乙醇溶液。

该原位杂交反应在反应单元中进行，即通过对应的电极将多种浓度的乙醇溶液液滴依次移向样本，进行梯度脱水；通过对应的电极将探针溶液的液滴移向样本，进行探针杂交；通过对应的电极将染色液的液滴移向所述样本，进行染色。

可选地，多种浓度的乙醇溶液包括第一浓度的乙醇溶液、第二浓度的乙醇溶液和第三浓度的纯乙醇，且第一浓度小于第二浓度，第二浓度小于第三浓度，则在一个可选实施例中，S301步骤包括：

通过对应的电极从乙醇储液单元中拉出无水乙醇到传输单元中，并通过对应的电极从储液单元中拉出去离子水到传输单元中进行混合，得到多种浓度的乙醇溶液；

依次驱动第一浓度的乙醇溶液的液滴、第二浓度的乙醇溶液的液滴和第三浓度的乙醇溶液的液滴到反应单元中，进行梯度脱水。

在另一个可选实施例中，S301步骤包括：

通过对应的电极从储液单元中拉出第一浓度的乙醇溶液的液滴到反应单元中，进行脱水；

通过对应的电极从储液单元中拉出第二浓度的乙醇溶液的液滴到反应单元中，进行脱水；

通过对应的电极从储液单元中拉出第三浓度的乙醇溶液的液滴到反应单元中，进行脱水。

其中，每一步在反应试剂各自对应的液滴移动到反应单元后，通过多个电极控制液滴在空腔层中移动，提升液滴与样本的混合均匀性；并且，每一步在混合均匀后，通过多个电极控制液滴移动到废液单元，以避免液滴影响后续处理的纯度。

在一个可选实施例中，第一浓度的乙醇溶液为50％～70％乙醇溶液，第二浓度的乙醇溶液为71％～95％乙醇溶液，第三浓度的乙醇溶液为100％纯乙醇，脱水效果好；在一个具体实施例中，70％乙醇溶液、80％乙醇溶液和100％纯乙醇。

在S302步骤之后，杂交产物已经携带上荧光标记，通过染色液进行染色，使得后续检测荧光信号时，荧光信号能够显示出特定的颜色，清晰明亮；可选地，染色液为DAPI染色液。

具体地，在一个可选实施例中，在S301步骤之前，原位杂交反应还包括：

通过对应的电极将酶溶液的液滴移向反应单元，加热进行酶消化。

其中，通过电极从储液单元中拉出酶溶液生成酶液滴，使得酶溶液以液滴的形式移向样本；相对应地，反应试剂还包括酶溶液，该酶溶液中的酶为蛋白酶，用于处理样本中的蛋白质，通过加热机构控制反应单元的温度达到酶消化对应的预设温度，以有效处理样本，避免影响后续反应步骤与荧光检测。

此外，在上述每一步步骤中，反应试剂的液滴在反应单元中进行处理之后，都通过多个电极控制从反应单元中移出，暂存在废液单元中，即经过酶消化后酶液滴移向废液单元，乙醇溶液的液滴完成梯度脱水后移出反应单元，探针溶液的液滴在完成杂交后移出反应单元，多余的染色液在完成染色后也离开反应单元，避免残留液滴影响后续步骤的稳定进行。

具体地，反应试剂还包括去离子水，该去离子水用于清洗反应单元，则在S301步骤之前，该荧光原位反应还包括：

通过对应的电极将去离子水的液滴移向反应单元，进行清洗。

即通过多个电极将去离子水的液滴移向样本，对反应单元对应的区域进行清洗，避免前次步骤在反应单元中的残留酶物质对后续步骤的不良影响。

具体地，反应试剂还包括洗涤液，该洗涤液用于洗去杂交后多余的探针溶液，避免影响染色结果，则在S303步骤之前，该荧光原位反应还包括：

通过对应的电极将洗涤液的液滴移向反应单元，进行洗涤。

在S4步骤的荧光检测过程中，将原位杂交装置置于荧光检测设备中进行显色，得到荧光信号，即检测结果由所述杂交产物显色出的荧光信号得到，该检测结果能够表征样本中靶标物是否存在，若原位杂交装置显现的荧光信号的颜色与靶基因的预设荧光信号的颜色相同，则说明原位杂交反应生成了携带荧光物质的杂交产物，该样本中存在靶标物，该靶标物中具有靶基因，否则说明在原位杂交装置中未生成杂交产物，该样本中不存在靶标物，该靶标物中不含有靶基因，完成靶标物的定性检测；通过该靶标检测方法，能够高效快速准确地检测出基因是否发生多拷贝、融合、分裂等基因突变；进一步地，该检测结构还能够表征样本中靶标物的含量，根据荧光信号的强弱以及分布，还能够确定靶基因的含量或者绝对浓度，以及靶标物或靶基因在样本中的分布状态，实现定量检测。

以一个具体应用为例，以EGFR基因作为靶基因，培养具有该EGFR基因的细胞作为样本，将细胞加载于原位杂交装置的反应单元并固定在该亲水位点，细胞不重叠且数量不少于200，按照上述靶标检测方法，依次进行酶消化、清洗、梯度脱水、探针杂交、洗涤和染色处理，检测完成探针杂交之后的原位杂交装置的荧光信号，拍摄得到荧光信号图像，并与常规台式实验扩增得到的荧光信号进行对比，台式实验是将细胞固定在黏性玻璃上进行的对照实验；如图8所示，图中左侧为原位杂交装置的荧光信号图像，可见细胞内红色探针数目与绿色探针的数目之比小于2，检测结果显示为阴性结果，即EGFR基因未发生扩增或多拷贝变异；图8中右侧为台式实验测得的荧光信号图像，可见两种检测方法得到的检测结果一致，该基于原位杂交装置的靶标检测方法能够替代传统大型台式检测有效检测出靶基因，使得原位杂交反应标准化，避免了复杂繁琐的手动操作，自动化程度高，检测准确度也高；基于该原位杂交装置的荧光原位杂交反应能够在15分钟内完成，大大提升反应速率，也提升整个检测流程的效率，缩短检测耗时，使得该靶标检测方法能够在4h内自动完成整个检测流程，检测效率高，检测准确度也高；并且，原位杂交装置小型化，单次仅消耗少于2μL/样本的探针溶液，与常规需要大于等于2μL/样本的检测方法相比减少了80％以上的试剂用量，甚至减少了高达87％的试剂用量，大大减少试剂消耗量和成本。

以上所描述的仅为本申请的一些实施例而已，并不用于限制本申请，本行业的技术人员应当了解，本申请还会有各种变化和改进，任何依照本申请所做的修改、等同替换和改进都落入本申请所要求的保护的范围内。

Claims (10)

1.一种原位杂交装置，其特征在于，包括上极板(1)、空腔层(2)与下极板(3)，所述空腔层(2)位于所述上极板(1)与所述下极板(3)之间；

所述空腔层(2)包括储液单元与反应单元，所述储液单元与所述反应单元连通，所述储液单元用于储存反应试剂，所述反应单元用于供样本与所述反应试剂进行原位杂交反应；

所述下极板(3)包括基板(31)，所述基板(31)上设有电极结构，所述电极结构包括多个电极(32)，所述多个电极(32)用于驱动所述反应试剂在所述空腔层(2)中移动。

2.根据权利要求1所述的原位杂交装置，其特征在于，每个所述电极(32)能够被单独控制。

3.根据权利要求1所述的原位杂交装置，其特征在于，所述多个电极(32)包括第一电极(320)，每个所述储液单元与单个所述第一电极(320)对应设置，所述第一电极(320)用于驱动所述储液单元中的所述反应试剂分离得到反应试剂的液滴。

4.根据权利要求3所述的原位杂交装置，其特征在于，所述多个电极(32)包括第二电极(321)，每个所述反应单元与单个所述第二电极(321)对应设置，所述第二电极(321)用于驱动所述液滴移入所述反应单元。

5.根据权利要求1所述的原位杂交装置，其特征在于，所述下极板(3)包括介电层(33)，所述电极结构位于所述介电层(33)与所述基板(31)之间。

6.根据权利要求5所述的原位杂交装置，其特征在于，所述原位杂交装置包括疏水层(34)，所述疏水层(34)位于所述上极板(1)与所述介电层(33)之间。

7.根据权利要求1所述的原位杂交装置，其特征在于，所述反应单元对应的容积小于5μL。

8.一种靶标检测方法，其特征在于，基于如权利要求1-7任一项所述的原位杂交装置进行，包括：

向原位杂交装置中空腔层的反应单元提供样本；

向所述空腔层的多个储液单元分别移入一种反应试剂；所述反应试剂包括探针溶液，所述探针溶液包括具有荧光物质的单链核酸探针，所述探针用于通过所述荧光物质标记所述样本中的靶标物；

控制多个电极驱动所述储液单元中的反应试剂向所述反应单元移动，进行原位杂交反应，生成携带荧光物质的杂交产物；

对所述原位杂交装置中的所述杂交产物进行荧光检测，得到检测结果。

9.根据权利要求8所述的靶标检测方法，其特征在于，所述原位杂交反应包括：

通过对应的电极将多种浓度的乙醇溶液液滴依次移向所述反应单元，进行梯度脱水；

通过对应的电极将探针溶液的液滴移向反应单元，进行探针杂交；

通过对应的电极将染色液的液滴移向所述反应单元，进行染色。

10.根据权利要求8所述的靶标检测方法，其特征在于，所述多个电极的驱动电压为100～400V。