CN116441551A - 金核银壳纳米颗粒、肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

金核银壳纳米颗粒、肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金核银壳纳米颗粒、肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条及其制备方法，属于免疫检测技术领域，包括以下步骤：将胶体金与4‑巯基苯甲酸的乙醇溶液混合均匀，离心，去离子水重悬，加入柠檬酸钠溶液，搅拌均匀，升温至50～75℃，加入抗坏血酸溶液，搅拌均匀，在搅拌下加入硝酸银溶液，搅拌均匀，得到金核银壳纳米颗粒溶液；包含金核银壳纳米颗粒的试纸条能实现肠炎沙门氏菌的快速高灵敏度检测。

Description

金核银壳纳米颗粒、肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条及其制备 方法
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种金核银壳纳米颗粒、肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性肠道杆菌，可感染各种动物，引起以腹泻、肠道出血等胃肠道症状和败血症为主要临床特征的沙门氏菌病。此外，沙门氏菌也是一种最常见的食源性致病菌，可通过污染的肉、蛋、奶等动物性食品或饮用水传播给人类，造成中毒，危害人类健康。据统计，由沙门氏菌引起的食品中毒病例在世界各地食物中毒病例中屡居首位，在美国，每年就有超过1500万人因感染沙门氏菌而发生中毒。肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)隶属于肠杆菌科沙门氏菌属肠道亚种肠炎血清型，是引起动物疾病和食物中毒最主要的沙门氏菌血清型，全球每年约40％～60％的人类感染沙门氏菌案例是由肠炎沙门氏菌引起。据我国2015年食源性监测报告显示，肠炎沙门氏菌是我国微生物性食源性疾病暴发的主要致病因子之一，对人类健康和安全的影响非常大。
沙门氏菌拥有广泛的宿主性，根据其对宿主的嗜性可以分为仅对特定的动物或人产生疾病的专嗜性沙门氏菌以及对人和动物都具有普遍致病性泛嗜性沙门氏菌。肠炎沙门氏菌属于泛嗜性沙门氏菌，能够感染人和各种动物，是人畜共患病的重要病原菌。沙门氏菌的传播不需要中间宿主，能够在人与人、人与动物、动物与动物之间进行水平传播，也可以垂直传播。沙门氏菌感染动物后，主要引起畜禽抵抗力减弱、免疫力下降、怀孕母畜流产等，进而使动物继发其他感染，严重情况下会导致畜禽大量死亡。一旦感染沙门氏菌，患病动物的血液、粪便、分泌物等都会带毒而成为传染源。人类误食被沙门氏菌污染的食物或水，会造成腹痛、恶心以及腹泻等，严重者可引起发热、胃肠炎甚至败血症等，对于幼童、老人和免疫缺陷疾病患者等免疫力低下人群的影响尤其严重，甚至可能危及生命。
沙门氏菌传统检测是指采用国家强制性标准GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行沙门氏菌分离鉴定的方法，需要对样品进行前处理，经过预增菌、增菌、分离、生化实验、血清学鉴定、血清学分型等步骤才能判定检测结果。例如，蔡标等按照此标准成功从食品样品中分离到两株沙门氏菌并对其进行了鉴定。该方法是实验室常用的比较成熟的检测方法之一，但此方法需在专门实验室由专业检验人员开展，且存在操作步骤繁杂，耗时较长的缺点，鉴定阳性样品通常需要7天左右的时间。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是指在体外使用引物选择性扩增目的DNA或RNA的检测技术。研究人员曲识同时使用PCR检测法和传统检测方法对210个样本进行检测，发现沙门氏菌检出率为30.95％，且PCR检测方法的灵敏度、特异性等都优于传统法(P＜0.05)。陆瑶等人设计了一对特异性引物，经过反应条件的优化后，建立了一种能够特异性检测鸡白痢沙门氏菌的PCR方法，对鸡白痢沙门氏菌具有高度的特异性，且检测限低至1×102cfu/mL，具有较高的灵敏度。蒋玥等根据4种养禽业常见沙门氏菌血清型的特异基因位点设计引物，建立了一种可同时检测鉴别鸡白痢、肠炎、鼠伤寒和伤寒的多重PCR方法，对这四种沙门氏菌血清型的最低检测限分别达到13.1pg/mL、12.5pg/mL、13.7pg/mL和12.3pg/mL。传统PCR检测法和荧光定量PCR能够在10h内得到检测结果，具有良好的特异性和灵敏度，但是此方法操作相对复杂，还需要专业人员操作和专门实验室及实验设备，且容易出现污染导致假阳性。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)是在PCR技术基础上改进而来在反转录酶和聚合酶的作用下以恒定的温度就能进行体外核酸扩增的一种新技术。吴佳林等针对沙门氏菌侵袭蛋白基因(invA)设计引物，建立了快速检测肠炎沙门氏菌的LAMP检测方法，该方法具有优异的灵敏度，检测限能够达到1×101cfu/mL。郭澍强等建立的LAMP检测方法对沙门氏菌纯培养物的灵敏度可达到1×101cfu/mL，灵敏度比普通PCR高10倍，且操作更加简单，反应结果易于观察。LAMP检测方法虽有着高灵敏度和高特异性，但是此方法需要提取细菌总DNA并且容易出现气溶胶污染，造成假阳性，而且检测成本较高。
酶联免疫吸附测定(ELISA)是先将抗体或者抗原固定到载体表面，将待测物与酶标抗体或抗原按照不同步骤与固定到载体表面的抗原或抗体反应，加入酶反应的底物后，底物被催化为有色底物，根据底物颜色反应进行定性或定量分析。伍燕华等使用抗沙门氏菌多抗与单抗建立了一种检测沙门氏菌的双抗体夹心ELISA方法，该方法可以检测多种类型的沙门氏菌，检测限为1×104cfu/mL，且不与其他菌产生非特异反应。张帅等利用基于杂交瘤技术制备的鼠源单克隆抗体，建立了一种可以检测6种沙门氏菌的双抗体夹心ELISA检测方法，检测模拟肉样中的沙门氏菌，检测限为800cfu/mL。ELISA检测法虽耗时短，具有良好的特异性与灵敏性，但操作步骤复杂，且需要酶标仪等精密仪器设备。
核酸探针技术是基于核苷酸碱基互补的原理，在已知序列的核苷酸片段上进行标记作为探针，并识别待测样品中的一段互补的分子片段。Almeida等建立了一种新颖的肽核酸探针结合荧光原位杂交方法对沙门氏菌进行了检测。应用该方法对血液、粪便、水以及婴儿奶粉样品中的沙门氏菌进行了检测，准确度高达100％。但由于核酸探针需要标记，技术要求较高，且沙门氏菌血清型众多，相关探针研究难度较大，目前尚未在临床上广泛推广与应用。
基因芯片技术是将分子生物学与计算机芯片技术相结合，根据分子杂交信号检测目标物的一种新型技术，可以同时对大量样品基因进行分析。许俊钢等利用基因芯片技术对包括沙门氏菌在内的4种常见的致病细菌进行检测，30个临床样本的检测结果均比较准确，8h即完成了全部细菌的检测，大大提高了检测效率。王振全等采用点样法制备杂交芯片，建立了一种可同时检测多种致病菌的基因芯片检测方法，此方法无交叉反应，特异性良好，对沙门氏菌检测的灵敏度在1.38×10-5pg/μL-151pg/μL之间。但此方法存在技术成本昂贵，重复性差等缺点，阻碍了基因芯片技术的进一步发展。
因此，如何提供一种快速高灵敏度的肠炎沙门氏菌检测技术成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种金核银壳纳米颗粒、肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条及其制备方法，包含金核银壳纳米颗粒的试纸条能实现肠炎沙门氏菌的快速高灵敏度检测。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种金核银壳纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将胶体金与4-巯基苯甲酸的乙醇溶液混合均匀，离心，去离子水重悬，加入柠檬酸钠溶液，搅拌均匀，升温至50～75℃，加入抗坏血酸溶液，搅拌均匀，在搅拌下加入硝酸银溶液，搅拌均匀，得到金核银壳纳米颗粒溶液。
作为本发明的优选实施方案，所述胶体金与4-巯基苯甲酸的乙醇溶液的体积比为10：(0.005～0.02)，所述4-巯基苯甲酸的乙醇溶液的摩尔浓度为0.5～2mM。
作为本发明的优选实施方案，所述胶体金与柠檬酸钠溶液的体积比为10：(0.5～2)，所述柠檬酸钠溶液的质量分数为0.5～2％。
作为本发明的优选实施方案，所述胶体金与抗坏血酸溶液的体积比为10：(0.2～1)；所述抗坏血酸溶液的摩尔浓度为0.05～0.2M。
作为本发明的优选实施方案，所述胶体金与硝酸银溶液的体积比为10：(0.01～0.05)；所述硝酸银溶液的摩尔浓度为5～20mM。
作为本发明的优选实施方案，所述胶体金与硝酸银溶液的体积比为10：0.04；所述硝酸银溶液的摩尔浓度为10mM。
本发明还提供了一种肠炎沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
将金核银壳纳米颗粒溶液与碳酸钾溶液混合均匀，而后与肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab2偶联，加入封闭剂封闭，离心，重悬，涂于结合垫上，得到固定有免疫标签的结合垫；
将样品垫、固定有免疫标签的结合垫、固定有T/C线抗体的NC膜、吸水纸与底板组装得到肠炎沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条；
所述金核银壳纳米颗粒溶液为上述所述的方法制备得到的金核银壳纳米颗粒溶液。
作为本发明的优选实施方案，所述金核银壳纳米颗粒溶液与碳酸钾溶液的体积比为1：(0.005～0.04)；所述碳酸钾溶液的摩尔浓度为0.05～0.2M。
作为本发明的优选实施方案，所述金核银壳纳米颗粒溶液与肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab2的液固比为1mL：(1.9～15.2)mg。
作为本发明的优选实施方案，所述固定有T/C线抗体的NC膜的制备方法为：将肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab1和羊抗鼠IgG多克隆抗体用10mM的PB稀释至0.5～2mg/mL，在三维划膜仪上将肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab1和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别固定于NC膜上作为T线和C线，得到固定有T/C线抗体的NC膜。
本发明的有益效果在于：(1)本发明将金与银结合起来制备的纳米颗粒，不仅能保留金的生物稳定性，还能获得银的SERS特性，提高SERS性能。在金纳米粒子表面连接拉曼信号分子后再包裹一层银壳形成金核-拉曼信号分子-银壳结构，具有较高的稳定性，不容易发生团聚，在纳米材料的尖端、夹缝、狭角等部位具有更多的热点(hot-spot)，有助于局域表面等离激元的共振，进而增强基底周围的电磁场，实现拉曼信号的显著提高。因此，在本研究制备的金核-拉曼信号分子-银壳(Au@4-MBA@Ag)纳米材料中，银材料本身优良的SERS加上金核-银壳中间的缝隙结构中存在的大量热点可显著增强纳米颗粒的SERS性能，进而实现检测灵敏度的提高；(2)由本发明的金核银壳(Au@4-MBA@Ag)纳米颗粒制备得到的试纸条，可在10min内完成对肠炎沙门氏菌的定性与定量检测，可视化最低检测限为1×105cfu/mL，通过拉曼信号测定的最低检测限为1×103cfu/mL。在1×103cfu/mL-1×107cfu/mL范围内，肠炎沙门氏菌浓度对数与T线拉曼信号强度的自然对数符合线性关系，线性方程为Log(肠炎沙门氏菌浓度)＝1.737ln(拉曼信号强度+540.84)-9.965，R2为0.996。此外，该试纸对不同来源的肠炎沙门氏菌均能特异检出，但与鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、伦敦沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、波茨坦沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌等其他沙门氏菌血清型和大肠杆菌、副溶血弧菌等其他常见病原无交叉反应，具有良好的特异性。同一批次的试纸条和不同批次的试纸条对相同样品的检测结果基本一致，对浓度为1×107cfu/mL和1×106cfu/mL的肠炎沙门氏菌检测的CV值为6.7％和7.1％，重复性良好，对粪便和蛋壳样品加标检测结果显示回收率在94.8％-104.7％之间，回收率良好。
附图说明
图1为实施例1制备得到的胶体金图，其中图1A为胶体金实物示意图，图1B为胶体金的TEM图；图1C为单个胶体金的放大示意图，图1D为胶体金紫外可光光谱图。
图2为不同体积下的AgNO3制备得到的纳米颗粒溶液的拉曼检测结果图；其中图2A为不同体积AgNO3条件下制备的纳米颗粒溶液的拉曼光谱图；图2B为不同体积AgNO3条件下制备的纳米颗粒溶液的在1078cm-1拉曼位移处的拉曼信号强度。
图3为不同体积下的AgNO3制备得到的纳米颗粒溶液的紫外检测结果图和实物图，其中图3A不同体积AgNO3条件下制备的纳米颗粒溶液的紫外图谱；图3B为不同体积AgNO3条件下制备的纳米颗粒溶液的实物图，从左到右浓度依次增加。
图4为纳米颗粒的TEM观察和元素分析结果图。
图5为不同体积的K2CO3溶液制备得到试纸检测结果图，从左到右1-6分别代表1mL体系中0.1MK2CO3的添加量为0、5、10、20、30和40μL，-表示阴性样品检测结果，+表示阳性样品检测结果。
图6为不同抗体标记浓度制备的免疫标签构建的SERS免疫层析试纸检测结果图，从左到右1-6依次为1mLAu@4-MBA@Ag纳米颗粒溶液中添加0.2、0.5、1、2、4和8μL 1.9mg/mL的肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab2。-代表表示阴性样品检测结果，+代表阳性样品检测结果。
图7为灵敏度考察结果图，图7A为可视化检测结果图；图7B为拉曼光谱图；图7C为标准拟合曲线图。
图8为特异性考察结果，图8A为可视化检测结果图；图8B为拉曼光谱图；图8C为特征位移1078cm-1处的拉曼信号强度结果，1-13分别为肠炎沙门氏菌1、肠炎沙门氏菌2、肠炎沙门氏菌3、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、伦敦沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、波茨坦沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和阴性对照。
图9为批间的重复性考察结果图，图9A为可视化检测结果图；图9B为拉曼光谱图。
图10为不同批次的重复性考察结果图，图9A为可视化检测结果图；图9B为拉曼光谱图。
图11为稳定性考察结果图，图11A为可视化检测结果图；图11B为特征位移1078cm-1处的拉曼信号强度结果图。
图12为加标回收实验结果图，图12A为肠炎沙门氏菌粪便加标试验结果，从左至右肠炎沙门氏菌浓度分别为3.16×106cfu/g、3.16×105cfu/g、3.16×104cfu/g和3.16×103cfu/g；图12B为肠炎沙门氏菌蛋壳加标试验结果，从左至右肠炎沙门氏菌浓度分别为3.16×106cfu/g、3.16×105cfu/g、3.16×104cfu/g和3.16×103cfu/g。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
在本发明中，具体的分散、搅拌处理方式没有特别限制。
本发明所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明实施例提供了一种金核银壳纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将胶体金与4-巯基苯甲酸的乙醇溶液混合均匀，离心，去离子水重悬，加入柠檬酸钠溶液，搅拌均匀，升温至50～75℃，加入抗坏血酸溶液，搅拌均匀，在搅拌下加入硝酸银溶液，搅拌均匀，得到金核银壳纳米颗粒溶液。
将金与银结合起来制备的纳米颗粒，不仅能保留金的生物稳定性，还能获得银的SERS特性，提高SERS性能。在金纳米粒子表面连接拉曼信号分子后再包裹一层银壳形成金核-拉曼信号分子-银壳结构，具有较高的稳定性，不容易发生团聚，在纳米材料的尖端、夹缝、狭角等部位具有更多的热点(hot-spot)，有助于局域表面等离激元的共振，进而增强基底周围的电磁场，实现拉曼信号的显著提高。因此，在本研究制备的金核-拉曼信号分子-银壳(Au@4-MBA@Ag)纳米材料中，银材料本身优良的SERS加上金核-银壳中间的缝隙结构中存在的大量热点可显著增强纳米颗粒的SERS性能，进而实现检测灵敏度的提高。
由本发明的金核银壳(Au@4-MBA@Ag)纳米颗粒制备得到的试纸条，可在10min内完成对肠炎沙门氏菌的定性与定量检测，可视化最低检测限为1×105cfu/mL，通过拉曼信号测定的最低检测限为1×103cfu/mL。在1×103cfu/mL-1×107cfu/mL范围内，肠炎沙门氏菌浓度对数与T线拉曼信号强度的自然对数符合线性关系，线性方程为Log(肠炎沙门氏菌浓度)＝1.737ln(拉曼信号强度+540.84)-9.965，R2为0.996。此外，该试纸对不同来源的肠炎沙门氏菌均能特异检出，但与鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、伦敦沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、波茨坦沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌等其他沙门氏菌血清型和大肠杆菌、副溶血弧菌等其他常见病原无交叉反应，具有良好的特异性。同一批次的试纸条和不同批次的试纸条对相同样品的检测结果基本一致，对浓度为1×107cfu/mL和1×106cfu/mL的肠炎沙门氏菌检测的CV值为6.7％和7.1％，重复性良好，对粪便和蛋壳样品加标检测结果显示回收率在94.8％-104.7％之间，回收率良好。
需要说明的是，本发明所提到的胶体金为现有的材料，例如CN114720690A实施例1中通过优化的Tris辅助法制备胶体金。
本发明采用抗坏血酸还原法在上述拉曼信号分子修饰金纳米球的外表面合成了一层银壳，制备了金核-拉曼信号分子-银壳纳米颗粒。这种核壳结构不仅保留了金纳米颗粒的生物稳定性，同时引入了银材料本身以及金和银之间缝隙结构热点数量多的拉曼增强效应，可有效提高SERS免疫层析试纸灵敏度。本研究中以金核-拉曼信号分子-银壳为标记材料建立了新型SERS免疫层析试纸，用于肠炎沙门氏菌的高灵敏定性和定量检测。
在其中一个实施方式中，所述胶体金与4-巯基苯甲酸的乙醇溶液的体积比为10：(0.005～0.02)，所述4-巯基苯甲酸的乙醇溶液的摩尔浓度为0.5～2mM。优选的，胶体金与4-巯基苯甲酸的乙醇溶液的体积比为10：0.01，所述4-巯基苯甲酸的乙醇溶液的摩尔浓度为1mM。
在其中一个实施方式中，所述胶体金与柠檬酸钠溶液的体积比为10：(0.5～2)，所述柠檬酸钠溶液的质量分数为0.5％～2％。
在其中一个实施方式中，所述胶体金与抗坏血酸溶液的体积比为10：(0.2～1)；所述抗坏血酸溶液的摩尔浓度为0.05～0.2M。
在其中一个实施方式中，所述胶体金与硝酸银溶液的体积比为10：(0.01～0.05)；所述硝酸银溶液的摩尔浓度为5～20mM。
银壳的厚度对Au@4-MBA@Ag纳米颗粒的SERS性能起着关键作用，通过调节反应体系中AgNO3的浓度可改变包裹在金球外面的银壳厚度。结果发现，随着反应体系中AgNO3浓度的增大，Au@4-MBA@Ag纳米颗粒的拉曼信号先是逐渐增强，但随着AgNO3的浓度的进一步增大，纳米颗粒的信号出现减弱。这可能是开始时，银壳厚度的增加，给金核表面的拉曼信号分子4-MBA提供了更好的SERS基底，同时在金核和银壳中间形成一个狭窄的缝隙结构，成为一个很好的热点区域，为位于其中的4-MBA提供很好的SERS能力，进而观察到增强的拉曼信号强度。但是，随着银壳的进一步增厚，过厚的银壳可能对位于其内部的拉曼信号分子的信号产生了屏蔽作用，导致信号减小。
在其中一个实施方式中，所述胶体金与硝酸银溶液的体积比为10：0.04；所述硝酸银溶液的摩尔浓度为10mM。本研究中在1mL反应体系中，AgNO3的最佳浓度0.4mM，在此条件下得到的银壳厚度为4nm，拉曼信号最强。
本发明一实施方式提供了一种肠炎沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
将金核银壳纳米颗粒溶液与碳酸钾溶液混合均匀，而后与肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab2偶联，加入封闭剂封闭，离心，重悬，涂于结合垫上，得到固定有免疫标签的结合垫；
将样品垫、固定有免疫标签的结合垫、固定有T/C线抗体的NC膜、吸水纸与底板组装得到肠炎沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条；
所述金核银壳纳米颗粒溶液为上述所述的方法制备得到的金核银壳纳米颗粒溶液。
在其中一个实施方式中，所述金核银壳纳米颗粒溶液与碳酸钾溶液的体积比为1：(0.005～0.04)；所述碳酸钾溶液的摩尔浓度为0.05～0.2M。
进一步优选的，所述金核银壳纳米颗粒溶液与碳酸钾溶液的体积比为1：0.02；所述碳酸钾溶液的摩尔浓度为0.1M。
抗体标记过程中的pH对抗体在纳米颗粒上的吸附有着重要影响，通常在抗体等电点±0.5的pH范围内，抗体基本不带电，不容易发生聚沉，与带负电的纳米颗粒直径的静电排斥力最小，有利于抗体与纳米颗粒之间的偶联。通过控制金核银壳纳米颗粒溶液与碳酸钾溶液的体积比为1：(0.005～0.04)，可以得到较佳的pH，特别是在所述金核银壳纳米颗粒溶液与碳酸钾溶液的体积比为1：0.02时，最适标记pH为8.5，效果更佳。
在其中一个实施方式中，所述金核银壳纳米颗粒溶液与肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab2的液固比为1mL：(1.9～15.2)mg。
在其中一个实施方式中，所述固定有T/C线抗体的NC膜的制备方法为：将肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab1和羊抗鼠IgG多克隆抗体用10mM的PB稀释至0.5～2mg/mL，在三维划膜仪上将肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab1和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别固定于NC膜上作为T线和C线，得到固定有T/C线抗体的NC膜。
提供了以下实施例以促进对本发明的理解。提供这些实施例不是为了限制权利要求的范围。
实施例1
1.胶体金的制备
1.1.1主要试剂和材料
主要试剂和材料如表1所示
表1
材料 公司
牛血清白蛋白(BSA) 美国Sigma公司
柠檬酸钠 国药集团化学试剂有限公司
四氯金酸 美国Sigma公司
磷酸氢二钠 国药集团化学试剂有限公司
Tris 上海生工生物工程有限公司
磷酸二氢钾 国药集团化学试剂有限公司
1.1.2主要溶液的配制
(1)10％BSA溶液：精确称取BSA固体粉末2g，溶解于20mL去离子水中，吹吸混匀，分装保存于-20℃备用。
(2)10mM pH7.4的PBS：准确称取NaCl 8g、KCl 0.2g、1.44g的Na2HPO4和0.24g的KH2PO4溶于800mL去离子水中，用稀盐酸调整pH值至7.4，加去离子水补足至1L。
1.1.2制备方法
量取140mL纯净水于三颈烧瓶中，放入搅拌子，将三颈烧瓶放置在油浴锅中油浴加热；三颈烧瓶上方连接冷凝管，设定磁力加热搅拌器温度为137℃，搅拌转速为900rpm；油浴温度到达100℃时，将10mL 1％柠檬酸钠溶液加入到三颈烧瓶中；继续加热40min，温度稳定于137℃附近，注入1mL的1wt％氯金酸溶液，60s后，将5mL 0.1M的Tris溶液注入溶液的漩涡中心处，继续反应30min；将温度调整为100℃，开启通风橱加快降温，油浴温度降到100℃时，将1mL 1wt％氯金酸注至漩涡中心处，反应30min，再注入1mL 1wt％氯金酸注至漩涡中心处，反应30min，反应结束后停止加热；在搅拌状态下自然冷却至室温，得到胶体金。
1.3胶体金的表征体金的制备与表征结果
所制备得到的胶体金颜色为酒红色，清澈无沉淀，溶液比较稳定，如图1A所示。图1B、图1C为胶体金的透射电子显微镜(TEM)拍摄图像，由图可见纳米颗粒大小均匀，形貌比较接近圆球状，平均粒径在25nm左右。紫外可见光谱图如图1D，在图中可以看到一个519nm左右的吸收峰，峰宽比较窄，由以上可以证明制得的胶体金颗粒均匀，符合TEM拍摄结果。
实施例2
1.材料与试剂
1.1.主要试剂如表2所示
表2
本实验所用肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab1和Ab2购于中美歆新生物科技有限公司，是以肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白为免疫原，通过杂交瘤技术生产并经过严格筛选的特异性抗体。本实验所用到的菌株和病毒来源见表3，沙门氏菌均由提供单位进行过标准血清型鉴定。临床样品来源于广西大学动物科学技术学院动物实验基地，无菌鸡蛋购于大型商业超市。
表3
菌株 来源 编号
鼠伤寒沙门氏菌 中国微生物菌种保藏中心 CMCC50015
鸡白痢沙门氏菌 广西壮族自治区兽医研究所 0923
斯坦利沙门氏菌 广西壮族自治区玉林市疾病预防控制中心 21SL011
伦敦沙门氏菌 广西壮族自治区玉林市疾病预防控制中心 21SL055
肯塔基沙门氏菌 广西壮族自治区产品质量检验研究院 08
波茨坦沙门氏菌 广西壮族自治区产品质量检验研究院 22
黄金海岸沙门氏菌 广西壮族自治区产品质量检验研究院 19
大肠杆菌 中国微生物菌种保藏中心 CMCC44102
副溶血弧菌 中国微生物菌种保藏中心 ATCC33787
溶藻弧菌 中国微生物菌种保藏中心 ATCC17802
PEDV 广西大学动物科学技术学院 PEDV-JX2022
1.2主要仪器如表4所示
仪器名称 型号 生产厂家或牌号
微量高速冷冻离心机 HR/T16MM 湖南赫西仪器装备有限公司
微电脑自动斩切机 ZQ2002 上海金标生物科技有限公司
数控裁条机 CTS300XYZ 上海金标生物科技有限公司
三维化膜喷金仪 HM3035 上海金标生物科技有限公司
赛默飞透射电子显微镜 F200S 美国赛默飞公司
紫外可见光分光光度计 UV-2700 日本岛津仪器有限公司
电子天平 ATY224 日本岛津仪器有限公司
水浴锅 DK-24 上海精宏实验设备有限公司
恒温摇床 TS-200B 常州市国旺仪器制造有限公司
生化培养箱 SPX-100 宁波江南仪器厂
超净工作台 SW-CJ-2FD 苏州安泰空气技术有限公司
冷冻冰箱 BCD-178 海尔集团公司
2.金核银壳纳米颗粒的制备与免疫层析试纸条的组装
2.1主要溶液配制：
(1)10mM4-MBA的乙醇溶液：准确称取1.54mg4-MBA粉末，充分溶解于1mL无水乙醇，现配现用。
(2)10mMAgNO3：微量分析天平称取AgNO3粉末16.9mg，加去离子水10mL，充分溶解，避光保存备用。
(3)0.1M抗坏血酸：微量分析天平称取抗坏血酸粉末176mg，充分溶解于10mL去离子水，4℃避光保存备用。
(4)10％BSA溶液：精确称取BSA固体粉末2g，溶解于20mL去离子水中，充分溶解，分装保存于-20℃备用。
(5)10mM pH7.4的PBS：准确称取NaCl 0.8g、KCl 0.02g、加到100mL10mMpH7.4的PB中，充分溶解。
(6)复溶液：称取0.3gBSA粉末、1g蔗糖溶于10mL10mM pH7.4的PBS缓冲液中，加吐温-20至0.25％，充分溶解后分装，置于冰箱-20℃冻存。
(7)结合垫处理液：取1g蔗糖、0.2gBSA、0.1gPVP、10μLTriton-X-100、100μL吐温-20溶于10mL去离子水中。
(8)0.1M的K2CO3溶液：准确称取13.8g K2CO3，溶于100mL去离子水中，充分溶解后常温保存。
2.2金核银壳纳米颗粒的合成
首先采用实施例1合成的胶体金，取10mL实施例1的胶体金于干净玻璃瓶中，加入10μL10mM的4-MBA-乙醇溶液，边加边搅拌，室温下反应1h，得到4-MBA修饰金纳米粒子Au@4-MBA溶液；
取10mL Au@4-MBA溶液，7000rpm离心20min，弃上清，用相同体积的去离子水重悬，然后将重悬后的溶液加入到干净玻璃瓶中，在搅拌状态下加入1mL 1wt％的柠檬酸钠溶液，室温下搅拌5min，然后开启加热功能，待温度上升至60℃时，加入500μL 0.1M的抗坏血酸溶液，继续搅拌5min后调高转速，在剧烈搅拌下滴加40μL 10mM的AgNO3溶液，每30秒滴加一滴。加完AgNO3溶液后，降低搅拌速度，继续反应30min，得到金核银壳纳米颗粒溶液(Au@4-MBA@Ag溶液)。
2.3不同银壳厚度的Au@4-MBA@Ag的合成
不同银壳厚度的Au@4-MBA@Ag的合成取6个干净的玻璃瓶子，分别加入1mL的Au@4-MBA，利用2.2的合成方法，分别添加0、10、20、30、40、50μL10mM的AgNO3，制备具有不同银壳厚度的Au@4-MBA@Ag。采用拉曼光谱仪测量其拉曼光谱，并采用紫外分光光度计测定紫外光谱，同时选取拉曼信号最强的Au@4-MBA@Ag进行TEM表征和元素分析。
2.4最适标记pH值的确定
在6个干净玻璃瓶中加入1mL的Au@4-MBA@Ag溶液，分别加入0、5、10、20、30、40μL0.1M的K2CO3，混匀后静置5min。然后分别加入2.28μg的肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab2，混匀后室温避光反应30min。在每个瓶子中加入100μL10％的BSA，混匀中室温封闭1h。然后，4℃7000rpm离心15min，弃去上清，沉淀用200μL复溶液重悬，滴涂于结合垫上，得到滴涂有免疫标签的结合垫，37℃烘干3h，然后组装试纸条并对阳性和阴性样品进行检测，根据检测结果确定最适标记pH值。
2.5最佳标记蛋白浓度的确定
在5个干净玻璃瓶中分别加入1mL的Au@4-MBA@Ag溶液，每瓶加入20μL上述配制的K2CO3，混匀，静置平衡5min。接着分别加入0.2、0.5、1、2、4、8μL1.9mg/mL的肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab2，混匀，室温避光反应30min。偶联结束后，每瓶加入100μL10％的BSA，混匀后室温封闭1h。封闭完成后，4℃7000rpm离心15min，弃去上清，沉淀用200μL复溶液重悬，并滴涂于结合垫上，37℃烘干3h。最后组装试纸条，对阳性和阴性样品进行检测，根据检测结果确定最佳标记蛋白量。
2.6试纸条的组装
将肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab1和羊抗鼠IgG多克隆抗体用10mM的PB稀释至1mg/mL，然后在三维划膜仪上将肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab1和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别固定于NC膜上作为T线和C线，37℃干燥2.5h。将样品垫和吸水纸用数控裁条机裁成200×20mm的规格，然后依次将固定有T线和C线的NC膜、滴涂有免疫标签的结合垫、样品垫和吸水纸粘贴到PVC底板上，并切割为宽3mm、长6.5cm的试纸条，干燥避光保存备用。
3.方法学考察
3.1灵敏度考察
将肠炎沙门氏菌用样品稀释液进行系列稀释，得到浓度为1×108cfu/mL、1×107cfu/mL、1×106cfu/mL、1×105cfu/mL和1×104cfu/mL的肠炎沙门氏菌稀释液。用移液枪各吸取60μL，滴加到制备好的肠炎沙门氏菌拉曼免疫层析试纸条的样品垫上，同时设阴性对照组。10min后，肉眼观察层析结果，同时采用拉曼光谱仪对T线位置的拉曼信号进行检测，重复三次，计算平均值，绘制标准曲线。
3.2特异性考察
分别准备浓度为1×107cfu/mL的肠炎沙门氏菌1、肠炎沙门氏菌2、肠炎沙门氏菌3、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、伦敦沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、波茨坦沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血弧菌的菌液，用移液枪各吸取60μL，滴加到制备好的肠炎沙门氏菌拉曼免疫层析试纸条的样品垫上，同时设阴性对照组，等待10min肉眼观察层析结果，拉曼光谱仪测定拉曼信号。
3.3重复性考察
3.3.1批内重复性的考察
从同一批次的肠炎沙门氏菌拉曼免疫层析试纸条中取9条试纸条，分别对1×107cfu/mL肠炎沙门氏菌样品、1×106cfu/mL肠炎沙门氏菌样品和阴性样品进行检测，反应结束后观察相同浓度下试纸条的显色情况，拉曼光谱仪测定拉曼信号，计算CV值，分析试纸的批内重复性。
3.1.3.2批间重复性的考察
从三批不同的肠炎沙门氏菌拉曼免疫层析试纸条中分别取3条，分别对1×107cfu/mL肠炎沙门氏菌样品、1×106cfu/mL肠炎沙门氏菌样品和阴性样品进行检测，反应结束后观察相同浓度下试纸条的显色情况，拉曼光谱仪测定拉曼信号，计算CV值，分析试纸的批间重复性。
3.4稳定性考察
将试纸条放在4℃保存，并分别在第一周、第二周、第三周、第四周和第五周用浓度为1×106cfu/mL的肠炎沙门氏菌溶液进行检测，同时做阴性对照，肉眼观察试纸条显色情况，并用拉曼光谱仪试纸条进行检测并分析，考察试纸条的稳定性。
3.5实际样品加标回收试验
在1g确定未含有肠炎沙门氏菌的鸡粪便样品或捣碎高压灭菌的蛋壳样品中加入一定量的肠炎沙门氏菌得到加标浓度分别为5×107cfu/g、5×106cfu/g和5×105cfu/g的临床样品，搅拌均匀之后，加入1mL样品处理液，混匀静置沉淀2-5min，然后取上清用SERS免疫层析试纸条进行检测，并设阴性对照，每个浓度做三个平行试验。肉眼检测结果并检测T线的拉曼信号值。计算每个样品的检测结果，计算回收率。
4.结果
4.1Au@4-MBA@Ag纳米颗粒的制备与表征：
图2为不同硝酸银浓度下制备的Au@4-MBA@Ag纳米颗粒的拉曼光谱图及在特征拉曼位移处(1078cm-1)的拉曼信号强度。可见，当Au@4-MBA表面覆盖不同厚度的银壳时，其拉曼光谱图基本一致，均在相同的拉曼位移处出现特征峰，但这些特征峰的强度则随着银壳厚度的增加而逐渐变强再逐渐变弱，当反应体系中添加10mMAgNO3的量为40μL/mL时，拉曼信号强度最强。因此，后续实验均采用此条件下合成的Au@4-MBA@Ag纳米颗粒。
接着采用紫外分光光度计对不同剂量AgNO3条件下制备的Au@4-MBA@Ag纳米颗粒进行分析，结果如图3所示。从图中可以看出，Au@4-MBA@Ag纳米颗粒的紫外光谱主要在520nm和400nm左右出现两个吸收峰，但光谱随着AgNO3剂量的增加而发生显著的变化。520nm附近的吸收峰主要由Au纳米颗粒产生，随着AgNO3剂量的增加逐渐变得不明显；相反，400nm左右由银壳产生的吸收峰则越来越明显，且逐步发生红移，当AgNO3的体积为40μL时，主要吸收峰出现在约420nm处，显著高于Au纳米核产生的吸收峰(图4-2A)。此外，Au@4-MBA@Ag纳米颗粒溶液的颜色也随着AgNO3剂量的增加而逐步发生变化，从胶体金最初的酒红色逐渐变成橙黄色，且橙黄色随着AgNO3剂量的增加而不断加深(图3B)。
图4为在1mL反应体系中添加40μL10mM AgNO3制得的Au@4-MBA@Ag纳米颗粒的TEM观察和元素分析结果。由图可见，Au@4-MBA@Ag纳米颗粒基本呈球型，性质和粒径较均一，且从图4B可清晰看出金核银壳结构，银壳厚度约为4nm。由元素分析结果(图4D至图4E)发现，在纳米颗粒内部主要为金元素，外面分布着大量银元素，与图4B结构观察一致，也与预期结果相符。
4.2最适标记pH的确定
图5为在1mLAu@4-MBA@Ag纳米颗粒溶液中添加不同体积的K2CO3(0.1M)制备的SERS免疫标签构建的SERS免疫层析试纸对肠炎沙门氏菌阴性和阳性样品的检测结果。
可见，所有条件下制备的试纸条对阴性样品的检测均无假阳性结果。随着pH的升高，检测阴性样品和阳性样品的C线显色均越来越弱，但检测阳性样品时显现的T线颜色则先逐渐变深然后再逐渐变浅，在K2CO3添加体积为20μLT线最清晰，此时Au@4-MBA@Ag纳米颗粒溶液的pH值为8.5，后续实验都基于此pH值进行。
4.3最佳蛋白标记浓度的确定
图6为在最佳标记pH时，以不同抗体标记浓度制备的免疫标签构建的SERS免疫层析试纸条对肠炎沙门氏菌阴性样品和阳性样品的检测结果。可见，随着标记抗体浓度的升高，C线的清晰度逐渐变强，并在抗体添加量为1μL1.9mg/mL时达到最清晰。对阳性样品的检测结果类似，在抗体添加量为1μL1.9mg/mL时，C线和T线均最清晰，且随着抗体浓度的进一步升高不再发生明显变化。考虑到抗体成本问题，将每1mLAu@4-MBA@Ag纳米颗粒溶液中添加1μL1.9mg/mL肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab2作为最小标记蛋白量。在此基础上增加20％，即抗体标记浓度为2.28μg/mL确定为最佳蛋白标记浓度，用于后续实验。
4.4灵敏度考察结果
图7为基于Au@4-MBA@Ag纳米颗粒的新型SERS免疫层析试纸对系列稀释的肠炎沙门氏菌的检测结果。由图7A可见，当肠炎沙门氏菌的浓度高于1×106cfu/mL时，T线清晰可见；当肠炎沙门氏菌浓度为1×105cfu/mL时，可见到较弱的T线；但当菌液浓度低于1×105cfu/mL时，无法观察到T线。因此，将可视化最低检测限定位1×105cfu/mL。由图7B，发现该SERS免疫层析检测不同浓度的肠炎沙门氏菌的拉曼光谱基本一致，仅特征拉曼位移处的拉曼信号强度发生变化。当肠炎沙门氏菌的浓度低至1×103cfu/mL时，1078cm-1和1583cm-1位移处的特征峰仍清晰可见。但当肠炎沙门氏菌的浓度低至1×102cfu/mL时，其拉曼信号强度486.51小于阈值518.50(阴性样品平均值﹢3SD)。因此，基于将该新型SERS免疫层析法的最低检测限定为1×103cfu/mL。接着，以肠炎沙门氏菌浓度的Log值为横坐标，1078cm-1位移处拉曼信号强度的自然对数为纵坐标绘制的拟合曲线，得到线性方程Log(细菌浓度)＝1.737ln(拉曼信号强度+540.84)-9.965，R2＝0.996(图7C)。
4.5特异性考察结果
利用基于Au@4-MBA@Ag纳米颗粒肠炎沙门氏菌SERS免疫层析试纸条对不同血清型的沙门氏菌和其他常见病原进行检测，结果如图8所示。该试纸可有效检测出由广西壮族自治区玉林市疾病预防控制中心提供的从食物中分离的肠炎沙门氏菌(肠炎沙门氏菌1)，也可检出广西壮族自治区兽医研究所提供的从畜禽粪便中分离的肠炎沙门氏菌(肠炎沙门氏菌2和肠炎沙门氏菌3)，T线区域均出现明显的黄色条带，且采用拉曼光谱仪测定T线拉曼信号时，均出现显著的拉曼特征峰。但是，用于检测鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、伦敦沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、波茨坦沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌等其他沙门氏菌血清型和大肠杆菌、副溶血弧菌等其他常见病原，T线区域不显示条带，且对应的拉曼光谱上也无特征拉曼峰，拉曼信号强度与阴性样品无差异，说明该试纸条特异性良好。
4.6重复性考察结果
从同一批制备的试纸条中随机抽取3条试纸条，对1×107cfu/mL、1×106cfu/mL的肠炎沙门氏菌和阴性样品进行检测，重复三次，考察基于Au@4-MBA@Ag纳米颗粒的肠炎沙门氏菌SERS免疫层析试纸的批内重复性。如图9所示，3组试纸条对对应浓度的肠炎沙门氏菌的检测结果基本一致，T线清晰度、拉曼光谱图和特征位移处的拉曼信号强度无差异，1×107cfu/mL的肠炎沙门氏菌检测的CV值为3.9％，1×106cfu/mL的肠炎沙门氏菌检测的CV值为6.7％，均小于10％，符合免疫层析体外诊断试剂的要求。
从三个不同批次的SERS免疫层析试纸条中分别随机抽取3条试纸条，对1×107cfu/mL、1×106cfu/mL的肠炎沙门氏菌和阴性样品进行检测，重复三次，考察基于Au@4-MBA@Ag纳米颗粒肠炎沙门氏菌SERS免疫层析试纸的批间重复性，结果如图10。3批试纸条对对应浓度的肠炎沙门氏菌的检测结果基本一致，T线清晰度、拉曼光谱图和特征位移处的拉曼信号强度无差异，1×107cfu/mL的肠炎沙门氏菌检测的CV值为4.6％，1×106cfu/mL的肠炎沙门氏菌检测的CV值为7.1％，均小于10％，符合免疫层析体外诊断试剂的要求。
4.7稳定性考察结果
图11为基于Au@4-MBA@Ag纳米颗粒肠炎沙门氏菌SERS免疫层析试纸条在4℃保存1周、2周、3周、4周和5周后，对浓度为1×106cfu/mL的肠炎沙门氏菌溶液的检测结果。由4-10A可以看出，在5个星期的保存时间内，对阴性样品检测时试纸条均未出现假阳性结果，C线清晰度基本无变化；检测阳性样品时，试纸条C线和T线清晰度一致，无肉眼可见的变化。此外，由拉曼光谱仪测得的T线在1078cm-1特征位移处的拉曼信号强度略微下降，但最高下降比例(第4个星期)仅为8％，说明，稳定性良好。
4.8实际样品加标回收试验结果
将不同浓度的肠炎沙门氏菌菌液添加到粪便和蛋壳样品中，用拉曼光谱仪测定T线的拉曼信号强度，根据标准曲线计算实际检测浓度，并与原浓度进行比较，计算加标回收率。如图12和表5所示，当往粪便和鸡蛋壳中添加的肠炎沙门氏菌浓度高于3.16×105cfu/g时，均出现明显的T线；而当添加的肠炎沙门氏菌浓度高于3.16×103cfu/g时，均能从T线的拉曼光谱图中观察到特征拉曼峰。根据T线的拉曼光谱图中1078cm-1特征位移处的拉曼信号强度，结合标准曲线，计算得到样品中试剂检测到的肠炎沙门氏菌浓度，并计算加标回收率，结果显示粪便样品中肠炎沙门氏菌的回收率为96.5％～104.7％，鸡蛋壳样品中肠炎沙门氏菌的加标回收率为94.8％～102.7％，均在可接受范围内。
表5
样品 加标浓度 检出浓度 回收率/％
粪便 3.16×106cfu/g 3.11×106cfu/g 98.4
粪便 3.16×105cfu/g 3.05×105cfu/g 96.5
粪便 3.16×104cfu/g 3.24×104cfu/g 102.5
粪便 3.16×103cfu/g 3.31×103cfu/g 104.7
粪便 0cfu/g 0cfu/g -
蛋壳 3.16×106cfu/g 3.15×106cfu/g 99.7
蛋壳 3.16×105cfu/g 2.99×105cfu/g 94.8
蛋壳 3.16×104cfu/g 3.25×104cfu/g 102.7
蛋壳 3.16×103cfu/g 3.21×103cfu/g 101.6
蛋壳 0cfu/g 0cfu/g -
5.结论分析
综上所述，银纳米粒子相较于其他贵金属如金纳米粒子具有更强的拉曼信号增强效果，但与金纳米粒子相比，银纳米粒子的生物稳定性较低，容易在溶液中发生聚集，限制了其应用。将金与银结合起来制备的纳米颗粒，不仅能保留金的生物稳定性，还能获得银的SERS特性，提高SERS性能。在金纳米粒子表面连接拉曼信号分子后再包裹一层银壳形成金核-拉曼信号分子-银壳结构，具有较高的稳定性，不容易发生团聚。通常认为，在纳米材料的尖端、夹缝、狭角等部位具有更多的热点(hot-spot)，有助于局域表面等离激元的共振，进而增强基底周围的电磁场，实现拉曼信号的显著提高。因此，在本研究制备的金核-拉曼信号分子-银壳(Au@4-MBA@Ag)纳米材料中，银材料本身优良的SERS加上金核-银壳中间的缝隙结构中存在的大量热点可显著增强纳米颗粒的SERS性能，进而实现检测灵敏度的提高。
银壳的厚度对Au@4-MBA@Ag纳米颗粒的SERS性能起着关键作用，通过调节反应体系中AgNO3的浓度可改变包裹在金球外面的银壳厚度。结果发现，随着反应体系中AgNO3浓度的增大，Au@4-MBA@Ag纳米颗粒的拉曼信号先是逐渐增强，但随着AgNO3的浓度的进一步增大，纳米颗粒的信号出现减弱。这可能是开始时，银壳厚度的增加，给金核表面的拉曼信号分子4-MBA提供了更好的SERS基底，同时在金核和银壳中间形成一个狭窄的缝隙结构，称为一个很好的热点区域，为位于其中的4-MBA提供很好的SERS能力，进而观察到增强的拉曼信号。但是，随着银壳的进一步增厚，过厚的银壳可能对位于其内部的拉曼信号分子的信号产生了屏蔽作用，导致信号减小。因此，本研究中在1mL反应体系中，AgNO3的最佳浓度0.4mM，在此条件下得到的银壳厚度为4nm。
抗体标记过程中的pH对抗体在纳米颗粒上的吸附有着重要影响，通常在抗体等电点±0.5的pH范围内，抗体基本不带电，不容易发生聚沉，与带负电的纳米颗粒直径的静电排斥力最小，有利于抗体与纳米颗粒之间的偶联。本研究中，根据试纸条对肠炎沙门氏菌的检测结果，确定了最适标记pH为8.5。抗体成本是免疫层析产品中材料成本占比最高的部分，显著高于NC膜、样品垫等材料，因此虽然标记体系中过量的抗体有助于获得稳定的免疫标签，但会造成产品成本的增加。本研究中，通过改变标记体系中的抗体量制备免疫标签，进而制备试纸条对样品进行检测，发现每毫升Au@4-MBA@Ag溶液中肠炎沙门氏菌单克隆抗体的浓度为1.9mg/mL或更高浓度时，检测结果基本一致，因此将该浓度定位最小蛋白标记浓度，为保证体系的稳定性，在此基础上增加20％，即2.28mg/mL作为Au@4-MBA@Ag纳米颗粒标记肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab2的最适蛋白浓度。在优化的条件下制备的肠炎沙门氏菌新型SERS免疫层析试纸条的可视化最低检测限达到1×105cfu/mL，通过拉曼信号检测的最低检测限达到1×103cfu/mL。不需要专业人员与设备，能够实现现场检测，这是这些实验室方法所无法实现的。此外，所制备的试纸与鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、伦敦沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、波茨坦沙门氏菌、黄金海岸沙门氏菌等沙门氏菌血清型以及大肠杆菌、副溶血弧菌等常见细菌没有交叉反应，特异性良好。加标实验表明，该试纸条在鸡粪便和鸡蛋壳样品中均可以检测到肠炎沙门氏菌且回收率良好，因此该试纸条在养殖场和食品检测中可以广泛应用，实现肠炎沙门氏菌的快速高灵敏度检测。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种金核银壳纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将胶体金与4-巯基苯甲酸的乙醇溶液混合均匀，离心，去离子水重悬，加入柠檬酸钠溶液，搅拌均匀，升温至50～75℃，加入抗坏血酸溶液，搅拌均匀，在搅拌下加入硝酸银溶液，搅拌均匀，得到金核银壳纳米颗粒溶液。
2.根据权利要求1所述的金核银壳纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述胶体金与4-巯基苯甲酸的乙醇溶液的体积比为10：(0.005～0.02)，所述4-巯基苯甲酸的乙醇溶液的摩尔浓度为0.5～2mM。
3.根据权利要求1所述的金核银壳纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述胶体金与柠檬酸钠溶液的体积比为10：(0.5～2)，所述柠檬酸钠溶液的质量分数为0.5～2％。
4.根据权利要求1所述的金核银壳纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述胶体金与抗坏血酸溶液的体积比为10：(0.2～1)；所述抗坏血酸溶液的摩尔浓度为0.05～0.2M。
5.根据权利要求1所述的金核银壳纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述胶体金与硝酸银溶液的体积比为10：(0.01～0.05)；所述硝酸银溶液的摩尔浓度为5～20mM。
6.根据权利要求1所述的金核银壳纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述胶体金与硝酸银溶液的体积比为10：0.04；所述硝酸银溶液的摩尔浓度为10mM。
7.一种肠炎沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将金核银壳纳米颗粒溶液与碳酸钾溶液混合均匀，而后与肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab2偶联，加入封闭剂封闭，离心，重悬，涂于结合垫上，得到固定有免疫标签的结合垫；
将样品垫、固定有免疫标签的结合垫、固定有T/C线抗体的NC膜、吸水纸与底板组装得到肠炎沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条；
所述金核银壳纳米颗粒溶液为权利要求1～7任一方法制备得到的金核银壳纳米颗粒溶液。
8.根据权利要求7所述的肠炎沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述金核银壳纳米颗粒溶液与碳酸钾溶液的体积比为1：(0.005～0.04)；所述碳酸钾溶液的摩尔浓度为0.05～0.2M。
9.根据权利要求7所述的肠炎沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述金核银壳纳米颗粒溶液与肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab2的液固比为1mL：(1.9～15.2)mg。
10.根据权利要求7所述的肠炎沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述固定有T/C线抗体的NC膜的制备方法为：将肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab1和羊抗鼠IgG多克隆抗体用10mM的PB稀释至0.5～2mg/mL，在三维划膜仪上将肠炎沙门氏菌单克隆抗体Ab1和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别固定于NC膜上作为T线和C线，得到固定有T/C线抗体的NC膜。
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