CN116439122A - 利用远缘杂交生产蝴蝶兰和多花指甲兰的杂交种子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)和多花指甲兰(Aerides rosea)之间的远缘杂交育种的方法，包括：(1)以蝴蝶兰为母本，多花指甲兰为父本，通过人工授粉进行杂交；以及(2)在授粉后120‑150天的时间内收获杂交种子。本发明的方法成功获得了以‘F1970’等为母本的蝴蝶兰品种与多花指甲兰的杂交种子，经无菌播种后，杂交种子能够萌发。本发明的方法提高了远缘杂交结实率，克服了属间杂交不亲和等问题，对于进一步提高蝴蝶兰的观赏价值和品质具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于杂交育种领域，尤其涉及通过远缘杂交利用多花指甲兰(Aeridesrosea)和蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)来生产杂交种子的方法。
背景技术
多花指甲兰是兰科(Orchidceae)指甲兰属(Aerides)植物。指甲兰属约有29个种，主要分布在印度、斯里兰卡、尼泊尔、不丹、缅甸、越南、老挝、泰国、马来西亚、菲律宾、印度尼西亚、巴布新几内亚，及我国南方等亚热带区域。我国共有多花指甲兰、香花指甲兰(Aerides odorata)、小蓝指甲兰(Aerides orthocentra)、扇唇指甲兰(Aeridesflabellate)和指甲兰(Aerides flacata)5种。指甲兰属植物具有较为奇特的花型，艳丽的花色，及宜人的芳香，又能与其近缘属杂交，是重要的远缘杂交育种材料。
蝴蝶兰属(Phalaenopsis)植物隶属兰科，其花形奇特、花色艳丽、色泽丰富、花序整齐、花期长，是目前世界上重要的观赏花卉之一，深受人们的喜爱。由于大部分蝴蝶兰品种抗性(包括抗病性和抗逆性)较差，且多数蝴蝶兰没有香味，严重限制了蝴蝶兰品质的提升和推广应用的范围。
因此，如果能通过远缘杂交将指甲兰的优良基因转移到蝴蝶兰中从而创造出新品种(例如兼具指甲兰的芳香和蝴蝶兰的花型、花色及长花期等特点的新品种)，对于提高蝴蝶兰的观赏价值和品质则将具有重要的意义。但这意味着需要克服属间杂交不亲和、杂交种子不能正常发育等一系列问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种蝴蝶兰和多花指甲兰之间的远缘杂交育种的方法。
在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：(1)以蝴蝶兰为母本，多花指甲兰为父本，通过人工授粉进行杂交；以及(2)在授粉后大约120-150天的时间内收获杂交种子。在一些实施方案中，步骤(2)包括在授粉后大约120天、大约125天、大约130天、大约135天、大约140天、大约145天、大约120-130天、大约120-125天、大约120-135天、大约125-140天或其间的任何范围和值内，收获杂交种子。
在本发明方法的一些实施方案中，步骤(1)中所述的人工授粉包括：(1a)选择开放3-6天的多花指甲兰的花朵，取其花粉块，用于对母本植株进行授粉。在一些实施方案中，选择例如盛花期，例如开放大约3-4天、4-6天、4-5天的父本植株的花朵并取其花粉块。在一些实施方案中，步骤(1a)包括：用消毒后的镊子从所选择的父本植株花朵的蕊柱上部的药帽中取出粘结的花粉块。
在本发明方法的一些实施方案中，步骤(1)中所述的人工授粉还包括：(1b)选择开放3-10天(例如盛花期，例如3-4天、6-9天、5-10天)的蝴蝶兰的花朵，去除其唇瓣及花粉块，以接收获自父本植株的花粉块。
在本发明方法的一些实施方案中，在每年的6-7月对亲本植株进行人工授粉。
在本发明方法的一些实施方案中，步骤(1)中所述的人工授粉还包括：(1c)将获自父本植株的花粉块放置到去除了唇瓣及花粉块的母本植株花朵的蕊腔内。
在一些实施方案中，本发明的方法还包括以下步骤：(3)将收获的杂交种子进行无菌播种。在一些实施方案中，步骤(3)包括：(3a)将包含所述杂交种子的果荚先冲洗干净，在乙醇(例如75％的乙醇)中均匀震荡，消毒(例如持续10min)，然后无菌水冲洗(例如3次)，并吸干水分。在一些实施方案中，步骤(3)还包括：(3b)将果荚内的种子均匀播种在1/2MS培养基中，待萌发成原球茎后，将其转移到继代培养基上进行培养。在一些实施方案中，所述继代培养基为：1/2MS+5g/L卡拉胶+20g/L蔗糖+100ml/L椰汁。在一些实施方案中，所述继代培养基的pH为约5.7-5.8，例如约5.7、约5.8等。
在一些实施方案中，所述杂交种子在播种5个月以后萌发。
在本发明方法的一些实施方案中，所述蝴蝶兰是蝴蝶兰品种。在一些实施方案中，所述蝴蝶兰品种选自：‘小茴紫’、‘F1970’、‘冰山美人’、‘贝瑞王子’、‘花蝴蝶’、‘绿丝绒’、‘三色鸟’、‘夕阳红’或其任意组合。一些实施方案中，所述蝴蝶兰品种选自：‘小茴紫’、‘F1970’、‘冰山美人’或其任意组合。
通过本发明的方法，获得了以‘F1970’、‘小茴紫’、‘冰山美人’等为母本的蝴蝶兰品种与多花指甲兰的杂交种子，经无菌播种后，杂交种子能够萌发。本发明的方法提高了远缘杂交结实率，克服了属间杂交不亲和等问题，对于进一步提高蝴蝶兰的观赏价值和品质具有重要的意义。本发明的方法在蝴蝶兰育种中具有重要的价值，有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的附图做简单的介绍。应当理解，下面所描述的附图仅仅是出于阐释本发明的目的，而非意在限制本发明的保护范围。
图1示出多花指甲兰的各花部特征。A：中萼片；B：侧萼片；C：花瓣；D：唇瓣；E：合蕊柱；F：成熟果荚。
图2示出处于不同开花进程的多花指甲兰。
图3示出用醋酸洋红染色法(A)和TTC染色法(B)测定花粉活力的显微镜检查结果。
图4示出将处于初花II期(A)、盛花期(B)和末花期(C)的多花指甲兰的柱头浸没在1％联苯胺：3％过氧化氢：水(4:11:22)反应液中后获得的显微镜图像。
图5示出2020-2021年其间杂交育种实验中涉及的部分蝴蝶兰亲本。按照从左到右的顺序，
第一行分别是：‘小梅花’、‘金蝶’、‘小猴子’、‘紫水晶’、‘金公主’、‘甜蜜蜜’、‘1837’、‘冰山美人’；
第二行分别是：‘红粉佳人’、‘甜格格’、‘夕阳红’、‘三色鸟’、‘贝瑞王子’、‘绿公主’、‘2049’、‘小茴紫’；
第三行分别是：‘金叶咖’、‘花蝴蝶’、‘大辣椒’、‘1772’、‘1984’、‘1949’、‘紫钻’、‘F1970’。
图6示出2020年杂交育种实验中四个组合的座果情况。A：以‘F1970’为母本所结的蒴果；B：以‘冰山美人’为母本所结的蒴果；C：以‘绿丝绒’为母本所结的蒴果；D：以‘小茴紫’为母本所结的蒴果。
图7示出2020年杂交育种实验中三个组合的杂交增殖苗。A：以‘F1970’为母本的增殖苗；B：以‘冰山美人’为母本的增殖苗；C：以‘小茴紫’为母本的增殖苗。
图8示出2021年杂交育种实验中四个组合的杂交果实膨大图。A：以‘夕阳红’为母本的果荚；B：以‘三色鸟’为母本的果荚；C：以‘贝瑞王子’为母本的果荚；D：以‘甜格格’为母本的果荚。
图9示出2021年杂交育种实验中四个组合的杂交F1代种子发育情况。A：以‘贝瑞王子’为母本的种子；B：以‘甜格格’为母本的种子；C：以‘三色鸟’为母本的种子；D：以‘夕阳红’为母本的种子。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1.多花指甲兰的开花进程、花粉活力以及柱头可授性
1.试验材料
试验所用的多花指甲兰种植于中国农业科学院蔬菜花卉所无土栽培温室，夏季温室每天加遮阳网、开风机与水帘降温；春秋季温室开天窗保持湿度；冬季温室有暖气供暖。通常3天给植株浇一次水，室内平均气温26～30℃，平均湿度为65～70％Rh。选取生长条件良好、无病虫害的植株进行试验。
2.开花进程观测
按照Dafni(1992)标准，选取盛花期内的植株进行开花物候的观测，在尚未开花时，对观察植株进行挂牌标记，在每个花序上记录花朵的开放、枯萎日期。中萼片开始扬起至花朵的形态发生变化，整体枯黄为结束这阶段记做单花花期。植株上第一朵花开花至最后一朵枯黄脱落为单株花期。
对温室内200多株的多花指甲兰进行开花物候的观测，经调查发现，多花指甲兰在5月底零星开放，群体花期在6-7月，单花花期7-10d左右，群体花期在15d左右。按Dafni的标准将多花指甲兰的开花进程分为了六个阶段：
a.花苞I期：(开花前5d-4d)花苞尚未开放，为不规则的椭圆形，同时中萼片和唇瓣闭合；
b.花苞II期：(开花前3d-2d)花苞开始开放，中萼片和唇瓣开始分离，有紫色的花瓣显现；
c.初花I期：(开花1d-2d)花苞开始开放，唇瓣与花瓣分离，横径距离1.5cm，有大量粘液分泌；
d.初花II期：(开花3d-4d)花苞大多开始开放，萼片微微卷曲，唇瓣向下竖起，花瓣和唇瓣纵径距离大于3.0cm，能明显看到雄蕊，柱头粘液量分泌达到峰值；
e.盛花期：(开花5d-6d)花苞全部开放，花瓣完全打开，花粉块由鹅黄变成深黄；
f末花期：(开花7d-8d)花朵枯黄萎缩，萼片卷曲，唇瓣凹陷，萼片和唇瓣的颜色变褐色；
g凋谢期：(开花9d-10d)花朵完全失去水分，整体呈现褐色，花粉块变硬，花朵枯萎。
多花指甲兰的各花部特征见图1；处于不同开花进程的多花指甲兰见图2。
3.花粉活力与柱头可授性
3.1.筛选测定多花指甲兰花粉活力的最适方法
分别采用以下方法测定多花指甲兰各时期新鲜花粉的花粉活力：
(1)于每天早上9:00-10:00时段采集多花指甲兰各生长阶段的新鲜花粉，使用醋酸洋红染色法，检测不同开花阶段的花粉活力。具体操作步骤为：将新鲜的花粉置于载玻片上，使用解剖针将花粉轻轻捣碎，滴上1-2滴的醋酸洋红染液后轻轻将其均匀分散开，盖上盖玻片，每次操作进行3次重复。10-15min后放在倒置显微镜下观察，选取6个不同视野并拍照。其中，花粉活力强的花粉会被染成红色，较淡的颜色被视为活力较弱。
(2)用氯化三苯四氮唑(1％的TTC)染色法对多花指甲兰的花粉活力进行测定。参照胡适宜的方法：将新鲜的花粉团置于2ml的试管中，用解剖针将其轻轻捣碎，后滴入一滴1％的TTC染色液，黑暗培养24h。摇晃试管，使得花粉块分散均匀，用移液枪吸取含有花粉的TTC染液，置于载玻片上后用解剖针轻轻将花粉细胞分散开，分布均匀，每次重复3次。拿至倒置显微镜下进行观察并拍照，选取6个不同的视野。以花粉细胞被染成红色为标准。
(3)参照欧阳英的花粉离体萌发法：以5％蔗糖+0.05％硼酸+0.001％氯化钙+5％椰汁为液体培养基。将培养后的花粉块用解剖针取下置于双面凹载玻片上并散开，用滴管吸取上述培养液滴加入含花粉的凹面里，后将载玻片放置于垫有3-5张湿润滤纸的培养皿中，盖上盖子置于组培室(室内温度25℃，相对湿度80％以上)培养48h，然后统计花粉萌发数。以花粉管长度超过花粉直径的2倍记为萌发。每阶段取3份样，制片后随机选取3个视野统计萌发数，试验重复3次。花粉萌发率(％)＝萌发的花粉数/视野内总花粉数×100％。
根据图3可知，TTC染色法所测得的结果略高于醋酸洋红染液测定的活力；而花粉离体萌发操作较为繁琐复杂，所耗时间较长，其对花粉活力的测定效率不如TTC染色法(结果未示出)。TTC染色法的操作方便简单，耗时短，因而TTC染色法可以作为多花指甲兰花粉测定的方法。
表1示出了TTC法测得的花粉活力，可以看出在盛花期花粉活力最高，可达74.57％，其次为初花II期。
表1.花粉活力与柱头可授性检测
注：“-”表示柱头不具可授性，“+/-”指部分柱头具可授性，“+”表示柱头具可授性，“++”表示柱头可授性较强。
不同的大写字母表示差异显著(p<0.01)
3.2.柱头可授性的检测
选取各开花阶段的柱头，采用联苯胺-过氧化氢法(1％联苯胺：3％过氧化氢：水＝4:11:22)进行测定。操作方法为：将柱头完全浸没在反应液中，5-10min后置于体式显微镜(OLYMPUS SZ)下观察并拍照。可根据被测定的柱头周围是否产生大量的气泡，作为柱头具有可授性的标准，并且可依据反应的强烈程度来对柱头可授性的强弱进行判定。
检测多花指甲兰的柱头可授性时发现(见图4以及表1)，在初花II期(开花3-4d)和盛花期(开花5-6d)，柱头有大量的分泌粘液，柱头的周围气泡较多，说明此阶段的柱头已成熟，可授性最强。可授性从花苞期已具备可授性，但此阶段的可授性较弱，此后柱头开始逐步成熟，在初花II期和盛花期时达到顶峰。在末花期和凋谢期，由于花朵逐渐枯黄脱落，此阶段不具备可授性。
实施例2.多花指甲兰种内的人工控制授粉
选择初花II期或盛花期的花粉和柱头进行授粉。成功授粉后的花朵，5-7天后可见柱头微微膨大，花瓣、唇瓣与萼片开始枯萎并逐步脱落；10天左右子房膨大。未能授粉成功的花朵在开花7天左右，出现花瓣开始枯黄，萎缩的情况，十几天后连同子房一起脱落。可以看出，授粉成功的花朵先于未成功授粉的花枯萎。授粉15天后，进行果荚结实情况的统计。
根据不同的授粉处理可知(见表2)：多花指甲兰无论是否去雄，套袋，进行自花授粉的座果率均为0；经过人工自花、同株异花和异株的授粉后，结实率分别为85.71％、88.00％、84.00％，无显著差异。这表明，多花指甲兰依靠传粉媒介进行传粉且坐果率较高，不存在自交不亲和、异交不亲和与无融合生殖现象。
表2.不同处理下的结实率
注：不同的大写字母表示差异显著(p<0.01)
实施例3.多花指甲兰与蝴蝶兰远缘杂交
1.杂交授粉实验材料
杂交亲本以多花指甲兰与蝴蝶兰属植物互为父母本进行正反杂交，其中蝴蝶兰属植物共计37个品种，分别是‘水晶’、‘紫水晶’、‘绿丝绒’、‘小茴紫’、‘小枫叶’、‘F1970’、‘friprince Yellow lip’、‘巧克力’、‘红牛’、‘冰山美人’、‘金桔’、‘花蝴蝶’、‘小孔雀’、‘初恋’、‘绿公主’、‘金叶咖啡’、‘1984’、‘紫钻’、‘小梅花’、‘三色鸟’、‘红粉佳人’、‘贝瑞王子’、‘满天红’、‘金蝶’、‘1873’、‘2031’、‘夕阳红’、‘甜格格’、‘绿熊’、‘大辣椒’、‘小猴子’、‘甜蜜蜜’、‘2049’、‘1326’、‘1772’、‘1921’、‘香玉’。多花指甲兰的自然花期是6-7月，引种同花期的蝴蝶兰。试验的亲本均种植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所的温室内。部分亲本照片见图5。
2.杂交授粉实验
分别于2020年6-7月、2021年6-7月，对多花指甲兰与蝴蝶兰互为亲本进行杂交授粉，其中每个组合授粉各5-7朵。参考陈和明与Kim等人的方法，选择开放3-4天的花朵进行授粉挂牌。取下位于蕊柱上部的药帽，将镊子进行消毒后取出粘结的花粉块，后将花粉块放入最先选取的母本植株中，每组进行3次重复。对杂交的花朵说明杂交的组合，同时标注授粉时间，观察子房变化，待果荚成熟时对其进行无菌播种，统计记录坐果率。
2.1.杂交结果的观测
在授粉7天后，每隔一周统计蒴果的长宽比以及膨大率与坐果率(胡伟荣，2021)。蒴果的膨大率＝膨大的蒴果数(授粉14天后的膨大蒴果)/杂交花朵数×100。坐果率＝结实蒴果数(授粉后成活时间大于120天的蒴果)/杂交花朵数×100。
2.2.杂交种胚萌发试验
在授粉120d后，待杂交的蒴果颜色呈现黄绿色且尚未开裂时进行采收。将采收的果荚置于超净工作台内进行无菌播种。果荚先冲洗干净，后在75％的乙醇中均匀震荡，消毒10min，用无菌水冲洗3次，吸干水分。切开果荚，取其内部的种子均匀的播撒在1/2MS培养基中。
离体培养后萌发成原球茎，将其转移到继代培养基上进行增殖。原球茎的继代培养基为：1/2MS+5g/L卡拉胶+20g/L蔗糖+100ml/L椰汁。PH＝5.7-5.8。
2.3.实验结果
2.3.1.2020年多花指甲兰与蝴蝶兰正反交实验结果
多花指甲兰与蝴蝶兰进行杂交后，从子房开始膨大到果实完全成熟的时间长短，因杂交亲本的不同而有较大的差异。一般情况下，蝴蝶兰蒴果的成熟需要120-150d，甚至更长的时间，若超过这个时间则蒴果较容易裂开，且蒴果内的种子细小且多，不利于后期的组培的工作。
在2020年6-7月，以多花指甲兰与13种蝴蝶兰为亲本进行正反杂交，杂交共17个组合，杂交具体结果见表3和图6。
由表3可知，在17个杂交组合中，6个是以多花指甲兰为母本，11个以蝴蝶兰为母本。以蝴蝶兰为母本的杂交组合中，有4个组合坐果，母本分别是‘F1970’、‘冰山美人’、‘小茴紫’和‘绿丝绒’。以‘小茴紫’、‘F1970’和‘冰山美人’做母本的组合获得了能够萌发的后代，说明这些蝴蝶兰品种与多花指甲兰的亲和性都较好。以蝴蝶兰为父本的杂交组合有6个，没有1个组合获得后代。可见，蝴蝶兰和多花指甲兰进行属间杂交时，应该把多花指甲兰作为父本，蝴蝶兰作为母本。‘绿丝绒’做母本的组合虽然获得果荚，但种子没有萌发，可能是因为受精过程中或种子发育过程中出现问题，需要反复授粉或者进行胚挽救。
表3. 2020年多花指甲兰与蝴蝶兰授粉成功的座果及种子萌发结果情况
蝴蝶兰属内杂交后代萌发较快，一般1-2个月可以明显看到很多原球茎，属间杂交种子萌发所需时间更长，种子开始萌发的时间都在5个月以上，且萌发时间的跨度较大。3个杂交组合在培养基中的萌发情况存在明显的差异。以‘小茴紫’和‘F1970’作为母本的坐果率较高。以‘冰山美人’作为母本的坐果率较低，但据观察其萌发率较高。
图6示出四个组合(分别以‘F1970’、‘冰山美人’、‘绿丝绒’、‘小茴紫’为母本)的座果情况。采收的杂交蒴果有的呈现绿色，有的呈现黄色，通过播种试验发现这两种状态下的果实都能形成胚并且种子形成原球茎而后长出组培苗。结果见图7。
2.3.2.2021年多花指甲兰与蝴蝶兰正反交实验结果
2021年6-7月，以多花指甲兰与蝴蝶兰互为父母本，共计杂交34个组合，共授粉622朵。杂交的具体结实情况见表4和表5以及图8-9。
由表4可知，以‘金叶咖啡’、‘1984’、‘小孔雀’为父本的杂交组合的果实都发生了膨大，其中‘金叶咖啡’的膨大率高于‘1984’，和‘小孔雀’，超过了70％，但三个组合在120d的坐果率均为0。‘小孔雀’为父本的组合的果实在杂交7d后就开始膨大，但在30d后逐渐萎缩，坐果率为0，‘花蝴蝶’、‘初恋’、‘绿公主’、‘小梅花’均在授粉14d后，果荚萎缩脱落。
由表5可知，以‘贝瑞王子’、‘三色鸟’、‘花蝴蝶’、‘夕阳红’为母本的杂交组合，蒴果均超过了120d，其中贝瑞王子的坐果率较高，超过了80％，高于‘三色鸟’、‘花蝴蝶’、‘夕阳红’这三个组合。这四个组合果实中的种子均呈现棉絮状，有胚率较低。
‘甜格格’为母本的组合在杂交30d后果实发生萎缩脱落，而‘紫水晶’和‘绿熊’在杂交14d后果荚枯萎脱落。其他几个组合均在授粉7d后，子房开始干瘪，未能形成膨大的果实，在保证花粉活力很高的前提下也未能发生膨大，可能是因为不亲和或者存在受精障碍的情况。
‘贝瑞王子’、‘花蝴蝶’、‘三色鸟’、‘夕阳红’与多花指甲兰的亲和性较好。虽然‘花蝴蝶’、‘三色鸟’和‘夕阳红’的结实率较低，但都获得了成熟的果实，然而种子没有萌发。这四个品种均可作为与多花指甲兰杂交的母本。但还需要进行进一步胚挽救才能获得后代。
表4. 2021年以多花指甲兰为母本，蝴蝶兰属为父本杂交坐果情况
表5. 2021年以蝴蝶兰属为母本，多花指甲兰为父本杂交坐果情况
如图9所示，播种六个月后，4个杂交组合在培养基中均未萌发。由图可知，‘甜格格’和‘三色鸟’的种子呈现棉絮状，‘夕阳红’的种子有少量的棉絮。由于萌发时间的跨度较大，因品种不同，萌发的时间也存在差异。因此，要保持培养基的湿润度，促进种子的萌发。
本试验历时两年，人工授粉共计947朵花，51个杂交组合，其中，‘F1970’、‘小茴紫’、‘冰山美人’三个作为母本的杂交组合已获得杂交后代。本发明的结果显示，蝴蝶兰作为母本的杂交成功率高于作为父本的杂交率。且杂交过程中，蝴蝶兰的亲本不同其坐果率差异也较大。
参考文献
[1]陈和明,吕复兵,肖文芳,等.蝴蝶兰与火焰兰远缘杂交育种初探[J].中国农业大学学报，2019,24(8):60-71.
[2]Kim M S,Lee Y R,Cho H R,et al.Breeding of small type and yellowcoloredPhalaenopsis“Yellow Dream”[J].Korean Journal of BreedingScience,2009,41:2；145-148.
[3]胡伟荣,吕英民.赏识兼用百合的杂交育种研究[硕士论文]。
Claims (8)
1.一种蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)和多花指甲兰(Aerides rosea)之间的远缘杂交育种的方法，包括以下步骤：
(1)以蝴蝶兰为母本，多花指甲兰为父本，通过人工授粉进行杂交；以及
(2)在授粉后120-150天的时间内收获杂交种子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中所述的人工授粉包括：
(1a)选择开放3-6天(例如开放3-4天、4-6天、4-5天)的多花指甲兰的花朵，取其花粉块，用于对母本植株进行授粉。
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(1)中所述的人工授粉还包括：
(1b)选择开放3-10天(例如开放3-4天、6-9天、5-10天)的蝴蝶兰的花朵，去除其唇瓣及花粉块，以接收获自父本植株的花粉块。
4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(1a)包括：用消毒后的镊子从所选择的父本植株花朵的蕊柱上部的药帽中取出粘结的花粉块。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)包括在授粉后120-130天的时间内收获杂交种子。
6.根据权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：
(3)将收获的杂交种子无菌播种在1/2MS培养基中，待萌发成原球茎后，将其转移到继代培养基上进行培养，其中所述继代培养基为：1/2MS+5g/L卡拉胶+20g/L蔗糖+100ml/L椰汁。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述继代培养基的pH为5.7-5.8。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述蝴蝶兰是蝴蝶兰品种，所述蝴蝶兰品种选自：‘小茴紫’、‘F1970’、‘冰山美人’、‘贝瑞王子’、‘绿丝绒’、‘花蝴蝶’、‘三色鸟’和‘夕阳红’。
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