CN116438452A - 高质量粒子的表征 - Google Patents
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Abstract
一种分析高质量(>1MDa)粒子的方法，包括：电离粒子以产生离子；通过使该离子穿过离子分离装置来根据质荷比分离该离子，在该离子分离装置中使用一个或多个时变电场来推动离子通过气体，使得离子根据质荷比分离；测量该离子通过该离子分离装置的渡越时间；以及由此确定该离子的漂移时间或质荷比分布。该方法还包括在该漂移时间或质荷比分布中识别一个或多个电荷包络，并且使用该一个或多个电荷包络来表征该粒子。
Description
相关申请的交叉引用
无。
技术领域
本发明整体涉及分析粒子的方法，并且具体地涉及使用质谱和/或离子迁移谱分析粒子的方法。
背景技术
一般而言，认为被配置为根据离子的质荷比(m/z)来分离离子的常规质谱仪在对高质量粒子的分析中具有有限的效用(除了作为检测器之外)，因为为了导出质量信息，必须存在确定所分析的离子的电荷状态的某种手段。这对于高质量粒子(其通常是高度带电的)可能是有问题的，其中不同的电荷状态在m/z上相对接近，并且其中样本不均匀性和/或加合可能使得它们不可分辨。通常，质量>1MDa的粒子可能出现这种情况。
申请人相信，对于分析高质量粒子的方法仍然存在改进的余地。
发明内容
根据一方面，提供了一种分析质量>1MDa的粒子的方法，该方法包括：
电离粒子以产生离子；
通过使离子穿过离子分离装置来根据质荷比分离离子，在该离子分离装置中使用一个或多个时变电场来推动离子通过气体，使得离子根据质荷比分离；
测量离子通过离子分离装置的渡越时间，并由此确定离子的漂移时间或质荷比分布；
在漂移时间或质荷比分布中识别一个或多个电荷包络；以及
使用一个或多个电荷包络来表征粒子。
申请人已经认识到(如下面将进一步描述的)存在多种情况，其中不需要离子的电荷状态分辨率来表征高质量(>1MDa)粒子的混合物，但是其中仅仅电荷包络分辨率就可以提供足够的信息以能够表征粒子的混合物。因此，根据各种实施方案，在所测量的漂移时间或质荷比分布中识别一个或多个电荷包络，并且使用该一个或多个电荷包络来表征高质量(>1MDa)粒子的混合物。
申请人还认识到这意味着可以使用具有相对较低的质荷比分辨率的分析仪器来表征高质量粒子的混合物。这继而意味着可以使用其中使用离子分离装置来实现质荷比分离的分析仪器来表征高质量粒子的混合物，在该离子分离装置中使用一个或多个时变电场来推动离子通过气体(诸如例如，在WO 2008/071967中描述的离子分离装置(Micromass UKLimited)，其内容以引用的方式并入本文)。
有益地(并且与常规质谱仪相比)，此类仪器不需要高真空泵送，不需要高电压或高精度电压控制，并且不需要快速离子检测器或快速信号数字化。因此，各种实施方案提供了一种分析高质量粒子的特别简单且低成本的方法，以及一种特别简单且低成本的分析仪器。
漂移时间或质荷比分布可包括其中粒子的不同电荷状态未分辨的漂移时间或质荷比分布。漂移时间或质荷比分布可以包括其中分布中的一个或多个、大多数或每个单独的(分辨的)峰对应于混合物中特定粒子的电荷包络的漂移时间或质荷比分布。
使用一个或多个电荷包络来表征粒子可以包括在不确定粒子的电荷或电荷分布的情况下使用一个或多个电荷包络来表征粒子。使用一个或多个电荷包络来表征粒子可以包括仅使用一个或多个电荷包络来表征粒子，诸如在不确定粒子的电荷、电荷分布、质量或质量分布的情况下使用一个或多个电荷包络来表征粒子。
粒子可包括针对其已知或预期从大多数或所有粒子(或从大多数或所有感兴趣粒子)产生的离子具有相同或类似的平均电荷和/或相同或类似的离子迁移率(不管质量如何)的粒子。
使用一个或多个电荷包络来表征粒子可以包括将一个或多个电荷包络与例如电荷包络信息库中的已知电荷包络信息进行比较。
粒子可各自具有>1MDa的质量。粒子可以是不同粒子的混合物，其中每种不同的粒子具有不同的质量(>1MDa)。粒子的混合物可包括具有第一质量(>1MDa)的第一粒子和具有不同的第二质量(>1MDa)的第二粒子的混合物。粒子的混合物可包括具有一个或多个不同的第三质量(>1MDa)的一个或多个第三粒子。第一质量可以大于第二质量。第二质量可以大于一个或多个第三质量。
使用一个或多个电荷包络来表征粒子的混合物可以包括使用一个或多个电荷包络来确定混合物中具有第一质量的粒子的数量与混合物中具有第二质量的粒子的数量的比率。
粒子可包括衣壳的混合物或病毒的混合物。
根据一方面，提供了一种分析衣壳的混合物的方法，该方法包括：
电离衣壳的混合物以形成离子；
通过使离子穿过离子分离装置来根据质荷比分离离子，在该离子分离装置中使用一个或多个时变电场来推动离子通过气体，使得离子根据质荷比分离；
测量离子通过离子分离装置的渡越时间，并由此确定离子的漂移时间或质荷比分布；
在漂移时间或质荷比分布中识别一个或多个电荷包络；以及
使用一个或多个电荷包络来表征衣壳的混合物。
衣壳的混合物可包括以下项中两者或更多者的混合物：(i)包封第一量的遗传物质的衣壳；(ii)包封不同的第二量的遗传物质的衣壳；和(iii)不含遗传物质的衣壳。遗传物质的第一量可以大于遗传物质的第二量。第一量的遗传物质可以是全部或完全量的遗传物质。第二量的遗传物质可以是部分或不完全量的遗传物质。
使用一个或多个电荷包络来表征衣壳的混合物可以包括使用一个或多个电荷包络来确定以下项中的一者或多者：
(i)混合物中包封第一量的遗传物质的衣壳的数量与(ii)混合物中包封第二量的遗
传物质的衣壳的数量的比率；
(i)混合物中包封第一量的遗传物质的衣壳的数量与(iii)混合物中不含遗传物质的衣壳的数量的比率；以及
(ii)混合物中包封第二量的遗传物质的衣壳的数量与(iii)混合物中不含遗传物质的衣壳的数量的比率。
该方法可以包括在根据质荷比分离离子之前减少离子的电荷。
根据一方面，提供了一种分析质量>1MDa的粒子的方法，该方法包括：
电离粒子以产生离子；
减少离子的电荷；
通过使离子穿过离子分离装置来根据质荷比分离电荷减少的离子，在该离子分离装置中使用一个或多个时变电场来推动离子通过气体，使得离子根据质荷比分离；
测量离子通过离子分离装置的渡越时间，并由此确定离子的漂移时间或质荷比分布；
使用漂移时间或质荷比分布来表征粒子。
离子分离装置可以是行波分离装置。
该方法可以包括将一个或多个电压连续地施加到该装置的不同电极以便形成一个或多个行进势垒，该一个或多个行进势垒沿着该装置移动以便推动离子通过气体进入。
该方法可包括将离子分离装置中的气体保持在≥0.1mbar的压力下。
该方法可包括在环境压力或大气压力下电离粒子。该方法可以使用分析仪器来执行。该方法可以包括在≥0.1mbar的压力下操作(整个)分析仪器。
根据一方面，提供了一种分析仪器，该分析仪器包括：
离子源，该离子源被配置为电离粒子以产生离子；
离子分离装置，该离子分离装置布置在该离子源的下游，其中该离子分离装置被配置为通过使用一个或多个时变电场来推动离子通过气体而根据质荷比分离离子；
离子检测器，该离子检测器布置在该离子分离装置的下游，其中该分析仪器被配置为使得可以通过该离子检测器检测从该离子分离装置洗脱的离子；
其中该分析仪器被配置为测量离子通过该离子分离装置的渡越时间，并由此确定离子的漂移时间或质荷比分布；并且
其中该分析仪器被配置为使用该漂移时间或质荷比分布来表征粒子。
分析仪器可被配置为在漂移时间或质荷比分布中识别一个或多个电荷包络，并且使用该一个或多个电荷包络来表征粒子。
离子分离装置可被配置为使得漂移时间或质荷比分布包括其中粒子的不同电荷状态未分辨的漂移时间或质荷比分布。
分析仪器可被配置为通过在不确定粒子的电荷或电荷分布的情况下使用漂移时间或质荷比分布来表征粒子，使用漂移时间或质荷比分布来表征粒子。
分析仪器可以包括一个或多个装置，该一个或多个装置被配置为减少布置在离子分离装置上游的离子的电荷。
离子分离装置可以是行波分离装置。
离子分离装置可被配置为使得离子分离装置中的气体保持在≥0.1mbar的压力下。
(整个)分析仪器可被配置为使得分析仪器在≥0.1mbar的压力下操作。
根据一方面，提供了一种在不需要电荷状态分辨率的情况下根据高质量粒子的整体m/z比分离和/或表征高质量粒子的方法，该方法包括：
任选地使用电喷雾电离产生气相离子；
基于离子的整体m/z比分离该离子；以及
将获得的整体m/z比模式与具有期望特性的代表性结果进行比较。
可使用包括设置在离子源与检测器之间的充气行波(TW)装置的设备来执行该方法。
离子可以以包的形式递送到TW装置，以用于随后的分离。
TW装置可以在这样的条件下操作，即使得在离子推进通过气体期间实现基本上暂时的m/z分离。
随后可检测离子。
附图说明
现在将仅以举例的方式并且参考附图来描述各个实施例，其中：
图1示意性地示出了根据实施方案配置的分析仪器；
图2示出了对于一维平滑移动行波装置，作为α和γ的函数的平均粒子速度的减少百分比；
图3示意性地示出了根据实施方案配置的分析仪器；
图4A示出了T波装置中假设球形衣壳的模拟漂移时间对质荷比结果，并且图4B示出了对应于空衣壳和全衣壳的质荷比的T波速度、振幅和对应的γ和α参数；
图5示出了空AAV8衣壳和全AAV8衣壳的实验漂移时间对质荷比数据；并且
图6A示出了空AAV8衣壳和全AAV8衣壳的实验漂移时间数据，并且图6B示出了空AAV8衣壳和全AAV8衣壳的实验漂移时间数据。
具体实施方式
一般而言，认为常规质谱仪(其被配置为基于离子的质荷比(m/z)来分离离子)在对非常大的物质的分析中具有有限的效用(除了作为检测器之外)，因为为了导出质量信息，必须存在确定所研究的离子的电荷状态的某种手段。这对于高质量粒子(其通常是高度带电的)是有问题的，其中不同的电荷状态在m/z上相对接近，并且其中样本不均匀性和/或加合可能使得不同的电荷状态不可分辨。通常，质量>1MDa的物质会出现这种情况。
申请人现已认识到，在许多情况下，不需要电荷状态分辨率来表征粒子的混合物，而仅需要足够的分辨率以能够确定存在的物质的电荷状态包络的差异。这意味着分辨率相对较低的质量分析器可用于表征高质量粒子混合物。例如，在实施方案中，离子分离装置可具有介于约10与1000之间(诸如介于约10与100之间)的分辨率。
因此，实施方案涉及使用m/z分离表征高质量粒子的混合物。实施方案提供了一种在不需要电荷状态分辨率的情况下根据高质量粒子的整体m/z比分离和表征高质量粒子的方法。
该方法可包括：(i)例如使用电喷雾电离(ESI)产生气相离子；(ii)基于离子的整体m/z比分离该离子；以及(iii)将获得的整体m/z比模式与具有期望特性的代表性结果进行比较。
图1示意性地示出了根据实施方案的质谱仪形式的分析仪器。
如图1所示，分析仪器包括离子源10、布置在离子源10下游的离子分离装置20以及布置在离子源10和离子分离装置20下游的检测器30。如图1所示，分析仪器可被配置为使得可由(从)离子源10经由离子分离装置20将离子提供(发送)到分析器30。
同样如图1所示，分析仪器可包括控制系统40，该控制系统被配置为控制分析仪器的操作，例如以本文所描述的各种实施方案的方式。控制系统可包括被配置为使得仪器以本文所描述的各种实施例的方式进行操作的合适的控制电路系统。控制系统可包括被配置为执行关于本文所描述的各种实施例的必要的处理和/或后处理操作中的任何一种或多种或全部操作的合适的处理电路系统。控制系统可包括合适的计算装置、微处理器系统、可编程FPGA(现场可编程门阵列)等中的一者或多者。
离子源10被配置为电离粒子以产生离子。离子源10可包括任何合适的离子源，诸如环境电离离子源，即被配置为在环境压力或大气压力下电离粒子的离子源。
离子源10可以是选自由以下项构成的组的离子源：(i)电喷雾电离(“ESI”)离子源；(ii)大气压力光电离(“APPI”)离子源；(iii)大气压力化学电离(“APCI”)离子源；(iv)基质辅助激光解吸电离(“MALDI”)离子源；(v)激光解吸电离(“LDI”)离子源；(vi)大气压力电离(“API”)离子源；(vii)硅上解吸电离(“DIOS”)离子源；(viii)电子冲击(“EI”)离子源；(ix)化学电离(“CI”)离子源；(x)场电离(“FI”)离子源；(xi)场解吸(“FD”)离子源；(xii)电感耦合等离子体(“ICP”)离子源；(xiii)快速原子轰击(“FAB”)离子源；(xiv)液体二次离子质谱(“LSIMS”)离子源；(xv)解吸电喷雾电离(“DESI”)离子源；(xvi)镍-63放射性离子源；(xvii)大气压力基质辅助激光解吸电离离子源；(xviii)热喷雾离子源；(xix)大气采样辉光放电电离(“ASGDI”)离子源；(xx)辉光放电(“GD”)离子源；(xxi)冲击器离子源；(xxii)实时直接分析(“DART”)离子源；(xxiii)激光喷雾电离(“LSI”)离子源；(xxiv)声波喷雾电离(“SSI”)离子源；(xxv)基质辅助入口电离(“MAII”)离子源；(xxvi)溶剂辅助入口电离(“SAII”)离子源；(xxvii)激光烧蚀电喷雾电离(“LAESI”)离子源；(xxviii)表面辅助激光解吸电离(“SALDI”)离子源；(xxix)低温等离子体(“LTP”)离子源；(xxxi)氦等离子体电离(“HePI”)离子源；(xxxi)快速蒸发电离质谱(“REIMS”)离子源；和/或(xxxii)激光辅助快速蒸发电离质谱(“LA-REIMS”)离子源。
在特定实施方案中，离子源10为电喷雾电离(ESI)离子源，诸如纳米ESI离子源。
分析仪器可任选地包括位于离子源10上游(并耦接到离子源)的色谱法分离装置或其它分离装置(图1中未示出)。色谱法分离装置可以包括液相色谱法装置或气相色谱法装置。另选地，分离装置可包括：(i)毛细管电泳(“CE”)分离装置；(ii)毛细管电色谱(“CEC”)分离装置；(iii)基本上刚性的陶瓷基多层微流体基底(“瓷砖”)分离装置；或(iv)超临界流体色谱分离装置。
检测器30被配置为检测从离子分离装置20接收到的离子。分析仪器可被配置为使得通过检测器30检测从离子分离装置20洗脱的离子。检测器30可被配置为检测在检测器30处接收的作为时间的函数的离子的数量和/或强度。
检测器30可包括任何合适的离子检测器，诸如例如(i)法拉第杯或圆柱形电极检测器；(ii)电子倍增器检测器；和/或(iii)光电倍增器或闪烁计数器检测器。
检测器30可以在相对较高的压力诸如与离子分离装置20相同的压力(如下所述)下操作(即，检测器30可以包括高压检测器)，在这种情况下，检测器30可以位于与离子分离装置20相同的室中。另选地，检测器30可以位于单独的室中，例如其中该单独的室通过传导限制孔连接到离子分离装置20的室或包含该离子分离装置的室。单独的室可例如通过独立地泵送该室而保持在相对较低的压力下。单独的室可保持在以下压力下：(i)<0.00001mbar；(ii)0.00001mbar至0.0001mbar；(iii)0.0001mbar至0.001mbar；(iv)0.001mbar至0.01mbar；或(iv)0.01mbar-0.1mbar。在特定实施方案中，单独的室可保持在约0.0001mbar的压力下。
该仪器还可以包括一个或多个数字化器(图1中未示出)，诸如一个或多个模数转换器(ADC)和/或一个或多个时间数字转换器(TDC)，其被配置为将由检测器30产生的信号数字化，即以便产生由检测器30产生的信号的数字化版本。
离子分离装置20被配置为从离子源10接收离子(任选地经由一个或多个离子导向器或其它离子光学元件)，根据质荷比(m/z)分离离子，并且然后将所分离的离子传递到检测器30以用于检测(任选地经由一个或多个离子导向器或其它离子光学元件)。当离子行进通过离子分离装置20时，离子可以在离子分离装置20内被分离。
离子分离装置20的分离区域可以填充有气体，诸如惰性(缓冲)气体，诸如氮气。当离子穿过气体时，可以根据离子的质荷比(m/z)在离子分离装置20内分离离子。
离子分离装置20(其分离区域)可以在任何合适的压力下操作(保持在该压力下)，诸如(i)<0.1mbar；(ii)0.1mbar至0.5mbar；(iii)0.5mbar至1mbar；(iv)1mbar至2mbar；(v)2mbar至5mbar；(vi)5mbar至10mbar；(vii)10mbar至15mbar；(viii)15mbar至20mbar；(ix)20mbar至25mbar；(x)25mbar至30mbar；或(xi)>30mbar。在特定实施方案中，离子分离装置20(其分离区域)保持在介于约0.1mbar与20mbar之间的压力下。使用被配置为在离子穿过(相对高压的)气体时分离离子的离子分离装置有利地意味着可以在不需要高真空泵送的情况下实现m/z分离。因此，实施方案提供了一种分析高质量粒子的特别简单且低成本的方法，以及一种特别简单且低成本的分析仪器。
离子分离装置20被配置为使用一个或多个时变电场来推动离子通过气体，使得离子根据质荷比(m/z)被分离。在特定实施方案中，离子分离装置20包括行波(TW)离子分离装置。
离子分离装置20可以包括多个电极，例如以离子导向器的形式。离子导向器的电极可限定离子路径，在使用中离子沿着该离子路径传输。
离子分离装置20可包括任何合适的离子导向器，诸如包括多个电极的离子导向器(诸如堆叠环(或堆叠板)离子导向器)或分段四极离子导向器，每个电极具有孔，在使用中离子通过该孔传输。分段四极离子导向器可提供电荷状态的更均匀的径向分布。离子导向器可以是线性(直的)离子导向器，或者闭环或循环离子导向器。
离子分离装置20可包括被配置为将电压施加到离子导向器的电极的一个或多个电压源。可将电压连续地施加到装置20的电极，以便形成沿装置在第一方向上移动的势垒的波，以便推动离子沿第一方向通过气体。
在离子导向器包括线性离子导向器的情况下，第一方向可为沿着离子导向器的长度的轴向方向。行波可以沿着装置20形成，沿着从分离装置20的入口端到出口端的方向移动。移动DC势垒可推动离子朝向分离装置20的出口端通过气体。在离子导向器包括闭环或循环离子导向器的情况下，第一方向可为围绕离子导向器的圆周的周向(方位角)方向。移动DC势垒可围绕离子导向器推动离子一次或多次。
离子可根据其质荷比进行分离，使得具有不同质荷比的离子在不同时间到达离子导向器的出口区域，例如使得具有相对较高的质荷比的离子先于具有相对较低的质荷比的离子到达出口区域(或使得具有相对较低的质荷比的值的离子先于具有相对较高的质荷比的值的离子到达出口区域)。
多个DC势垒可以被顺序地施加到分离装置20(并且沿着或围绕该分离装置行进)。DC电势的参数可以被选择为使得每个离子在其行进通过分离装置20时多次通过DC行进电势，即离子将滚过多个DC势垒。这可以例如通过针对DC势垒选择适当的速度和电压振幅来实现。
在实施方案中，每个DC电压的振幅可以是约(i)<1V；(ii)1V至10V；(iii)10V至20V；(iv)20V至30V；(v)30V至40V；(vi)40V至50V；(vii)50V至60V；(viii)60V至70V；(ix)70V至80V；(x)80V至90V；(xi)90V至100V；和(xii)>100V。每个电压可被施加到电极约10-4ms至5ms。波可以具有任何合适的速度，诸如约(i)<50m/s；(ii)50m/s至100m/s；(iii)100m/s至200m/s；(iv)200m/s至300m/s；(v)300m/s至400m/s；(vi)400m/s至500m/s；(vii)500m/s至1000m/s；(viii)1000m/s至1500m/s；(ix)1500m/s至2000m/s；或(x)>2000m/s。
行波(TW)诱导的离子传输取决于离子迁移率和质荷比(m/z)两者。如例如在US2020/0161119(其内容以引用的方式并入本文)中所描述的，m/z依赖性先前已经根据速度弛豫来表征，该速度弛豫(对于所选择的一组操作参数)随着离子的质荷比(m/z)而增加。因此，可以调整操作参数以产生由m/z或迁移率或这两者的组合支配的分离。
此类装置的分离特性方便地根据以下参数进行参数化：
其中V0是施加的波振幅，v是波速度，λ是波长，K和m/z分别是粒子的迁移率和质荷比。
图2示出了对于一维平滑移动行波装置，作为α和γ的函数的平均粒子速度的减少百分比。在其中离子可离轴移动且其中波以步进方式向前移动而非平滑移动的更现实的装置中的定性行为是类似的，且可通过数值或模拟来表征。
在较高的α值下，速度弛豫的程度(以及因此对m/z比的依赖性)增加。因此，在实施方案中，DC电势的参数可以被选择为使得离子(主要)根据质荷比被分离。
所施加的行波可以平滑地移动或步进。对于步进波，可以调整步长以优化质荷比(m/z)和离子迁移率分离的相对量。
离子分离装置20可在具有或不具有径向限制RF电压的情况下操作。当离子分离装置20在不具有径向限制RF电压的情况下操作时，可以选择行波条件以同时产生足够的m/z分离和限制。
当离子分离装置20在具有径向限制RF电压的情况下操作时，离子分离装置20可包括一个或多个另外的电压源，其被配置为向电极供应AC或RF电压。可以向连续电极施加AC或RF电压的相反相位。AC或RF电压可具有选自由以下项构成的组的振幅：(i)<50V峰-峰；(ii)50V峰-峰至100V峰-峰；(iii)100V峰-峰至150V峰-峰；(iv)150V峰-峰至200V峰-峰；(v)200V峰-峰至250V峰-峰；(vi)250V峰-峰至300V峰-峰；(vii)300V峰-峰至350V峰-峰；(viii)350V峰-峰至400V峰-峰；(ix)400V峰-峰至450V峰-峰；(x)450V峰-峰至500V峰-峰；和(xi)>500V峰-峰。AC或RF电压可具有选自由以下项构成的组的频率：(i)<100kHz；(ii)100kHz至200kHz；(iii)200kHz至300kHz；(iv)300kHz至400kHz；(v)400kHz至500kHz；(vi)0.5MHz至1.0MHz；(vii)1.0MHz至1.5MHz；(viii)1.5MHz至2.0MHz；(ix)2.0MHz至2.5MHz；(x)2.5MHz至3.0MHz；(xi)3.0MHz至3.5MHz；(xii)3.5MHz至4.0MHz；(xiii)4.0MHz至4.5MHz；(xiv)4.5MHz至5.0MHz；(xv)5.0MHz至5.5MHz；(xvi)5.5MHz至6.0MHz；(xvii)6.0MHz至6.5MHz；(xviii)6.5MHz至7.0MHz；(xix)7.0MHz至7.5MHz；(xx)7.5MHz至8.0MHz；(xxi)8.0MHz至8.5MHz；(xxii)8.5MHz至9.0MHz；(xxiii)9.0MHz至9.5MHz；(xxiv)9.5MHz至10.0MHz；和(xxv)>10.0MHz。
离子分离装置20可被配置为(接收和)分离离子包(组)。在离子源10包括脉冲离子源的情况下，可由离子源10产生离子包。
然而，在特定实施方案中(其中离子源10是脉冲离子源或连续离子源)，分析仪器还包括离子阱(图1中未示出)，该离子阱可以布置在离子源10与离子分离装置20之间。由离子源10产生的离子可以积聚在离子阱中，并且离子阱可被配置为将离子包传递到离子分离装置20，诸如通过周期性地将离子包传递到离子分离装置20。每个离子包可以包括待分析的粒子的混合物的离子。
离子阱可包括任何合适的离子阱，诸如例如(i)2D或线性四极离子阱；(ii)Paul或3D四极离子阱；(iii)彭宁离子阱；(iv)堆叠环离子阱；或(v)另一种类型的离子阱。
根据实施方案，测量离子通过离子分离装置20的渡越时间。这可以针对一个或多个离子包或针对每个离子包来进行，以便产生离子包的漂移时间或质荷比分布。针对多个离子包的测量可任选地组合以产生所分析的粒子的(最终)漂移时间或质荷比分布。
离子包被引入到离子分离装置20中的时间可以对应于初始时间(时间零点)，并且每个离子的传输时间可以被测量为初始时间与检测器30检测到该离子的时间之间的时间差。所得的时间分布可以被转换成质荷比分布。
在实施方案中，该装置可以例如使用校准曲线进行校准，使得漂移时间可以被转换成质荷比(m/z)和/或离子迁移率，该校准曲线是使用具有已知质荷比(m/z)和/或离子迁移率的粒子的测量结果构建的。
因此，特定实施方案采用用于质荷比分离的充气离子分离装置20，其中电压行波(TW)沿着装置20推进离子。装置20可在离子源10(例如电喷雾电离(ESI)离子源)与检测器30之间实现。离子可以以包的形式递送到TW装置20，以用于随后的分离。TW装置20可以在这样的条件下操作，即使得在离子推进通过气体期间实现基本上暂时的m/z分离。随后可检测离子。
这种布置不需要高真空级或常规质量分析器。各种实施方案的离子分离装置20有利地需要相对较低的电压，并且不需要这些电压的精确控制。因此，实施方案提供了一种分析高质量粒子的特别简单且低成本的方法，以及一种特别简单且低成本的分析仪器。
图3示意性地示出了根据这些实施方案的质谱仪形式的分析仪器。如图3所示，该仪器可包括纳米ESI离子源形式的环境离子源10。由离子源10产生的离子可以经由大气压力接口12被采样到仪器的初始真空室11中。
初始真空室11可以在任何合适的压力下操作(保持在该压力下)，诸如(i)<1mbar；(ii)1mbar至2mbar；(iii)2mbar至5mbar；(iv)5mbar至10mbar；(v)10mbar至15mbar；(vi)15mbar至20mbar；(vii)20mbar至25mbar；(viii)25mbar至30mbar；或(ix)>30mbar。在特定实施方案中，初始真空室11保持在介于约1mbar与20mbar之间的压力下。为此，如图2所示，初始真空室11可由前级泵(低真空泵)13泵送。
还如图2所示，在初始真空室11中提供了一个或多个离子导向器或其它离子光学元件14(例如，以双重联合离子导向器的形式)，其中一个或多个离子导向器或其它离子光学元件14被配置为将从大气压力接口12接收的离子转移到(并且通过)布置在初始真空室11与分析仪器的第二真空室21之间的孔15。
在图2所示的实施方案中，离子分离装置20是行波(TW)离子分离装置，其(如上所述)包括离子导向器22形式的多个电极。离子导向器22可布置于第二真空室22内，且第二真空室21可保持在介于约0.1mbar与20mbar之间的压力下。
一旦被离子分离装置20分离，离子经由布置在分析仪器的第二真空室21与第三真空室31之间的第二孔23传递到检测器30。
第三真空室容纳(至少)检测器30的检测表面32，并且可以保持在约0.0001mbar的压力下。为此，如图2所示，初始第三室31可由涡轮分子泵33泵送。
尽管已经根据T波质荷比分离描述了特定实施方案，但是可以采用在充气单元中利用时间依赖性电场的其它分离或过滤装置，例如其中至少部分离子运动表现出显著的速度弛豫。因此，例如，离子分离装置20可包括任选地由基本上脉冲的电场驱动的离子阱和/或扇形装置，诸如例如3D四极离子阱、线性离子阱、环形离子阱、脉冲扇形电过滤器、平行电极过滤器、同轴电极过滤器等。
如上所述，实施方案涉及高质量粒子的分析(表征)。如本文所用，“高质量粒子”包括各自具有>1MDa的质量的粒子。在实施方案中，粒子可各自具有以下质量：(i)1MDa至5MDa；(ii)5MDa至10MDa；(iii)10MDa至50MDa；(iv)50MDa至100MDa；(v)100MDa至150MDa；(vi)150MDa至200MDa；和/或(vii)>200MDa。
同样如上所述，当电离时，高质量粒子通常产生高度带电的离子，其中不同的电荷状态在m/z上相对接近。这意味着不同的电荷状态可能是不可分辨的。
申请人现已认识到存在多种情况，其中不需要离子的电荷状态分辨率来表征高质量(>1MDa)粒子的混合物，但是其中仅仅电荷包络分辨率就可以提供足够的信息以能够表征粒子的混合物。
因此，在实施方案中，漂移时间或质荷比分布可包括其中混合物中的粒子的不同电荷状态未分辨的漂移时间或质荷比谱。漂移时间或质荷比分布可以包括其中谱中的一个或多个、大多数或每个单独的(分辨的)峰对应于混合物中特定粒子的电荷包络的漂移时间或质荷比谱。如本文所用，“电荷包络”是所测量的漂移时间或质荷比分布中的(分辨的)峰，其包括来自相同粒子的多个不同电荷状态的贡献。
粒子的混合物可包括针对其已知或预期从混合物中的大部分或所有粒子(或从大部分或所有感兴趣粒子)产生的离子将具有相同的平均电荷(不管质量如何)的粒子。同样地，粒子的混合物可包括针对其已知或预期从混合物中的大部分或所有粒子(或从大部分或所有感兴趣粒子)产生的离子将具有相同的离子迁移率(不管质量如何)的粒子。对于此类粒子，漂移时间或质荷比分布中的电荷包络(其漂移时间或质荷比)的差异将(主要地)指示质量的差异。
根据实施方案，在漂移时间或质荷比分布中识别一个或多个电荷包络，并且使用该一个或多个电荷包络来表征粒子。
一个或多个电荷包络可以用于以任何合适的方式表征粒子。例如，一个或多个或每个电荷包络的(平均)质荷比、(最大)强度、宽度和/或面积可用于表征(识别)粒子。
在一些实施方案中，一个或多个电荷包络可用于指纹识别。因此，一个或多个电荷包络可以用于通过将一个或多个电荷包络与例如库中的一个或多个已知电荷包络进行比较来表征粒子。例如，可以将观察到的到达时间(或质荷比)分布(以统计方式、概率方式或使用多种多变量或机器学习方法)与库中的现有模式或范例模式进行比较。观察到的模式可以被识别为对应于库或范例模式，或者可以被识别为离群值(即新模式)。
在特定实施方案中，一个或多个电荷包络可用于通过确定两个或更多个不同电荷包络之间的强度或面积比来表征粒子。此类比率可用于确定混合物中具有不同质量的粒子的数量的比率。
例如，粒子可以是不同粒子的混合物，其中每种不同的粒子具有不同的质量(>1MDa)。粒子的混合物可包括具有第一质量(>1MDa)的第一粒子和具有不同的第二质量(>1MDa)的第二粒子的混合物。粒子的混合物可包括具有一个或多个不同的第三质量(>1MDa)的一个或多个第三粒子。第一质量可以大于第二质量。第二质量可以大于一个或多个第三质量。
可以使用一个或多个电荷包络来确定(i)混合物中具有第一质量的粒子的数量与混合物中具有第二质量的粒子的数量的比率；(ii)混合物中具有第一质量的粒子的数量与混合物中具有一个或多个第三质量的粒子的数量的比率；(iii)混合物中具有第二质量的粒子的数量与混合物中具有一个或多个第三质量的粒子的数量的比率；等等。
实施方案在筛选方法、过程分析和质量控制/保证方面具有特定效用。
一个特定示例是利用腺相关病毒(AAV)的治疗的质量保证(QA)和/或质量控制(QC)。
AAV衣壳是用于疫苗和基因疗法的常见递送载体，并且具有约3.5MDa的质量。在治疗剂的生产过程中(其中遗传物质被包封在衣壳中)，通常产生空衣壳、部分全衣壳和全衣壳的混合物。空/部分/全衣壳比率的测量是QA/QC过程的主要部分。
使用电荷检测质谱法(CDMS)的现有技术测量已经揭示空/部分/全AAV衣壳离子具有类似的平均电荷(由于它们具有类似的暴露半径/表面/形状)，并且由于基因组货物的并入，仅在质量上不同。这例如由Pierson等人的文章“Resolving Adeno-Associated ViralParticle Diversity with Charge Detection Mass Spectrometry”(Anal Chem.2016年7月5日；88(13):6718–6725)示出。
Pierson等人的图4(a)示出了针对具有sc-GFP基因组的腺相关病毒测量的CDMS谱。在3.7MDa处的峰是由于空衣壳，并且在5.1MDa处的峰是由于包封了全基因组的衣壳。
申请人已经认识到，根据Pierson等人的图4(a)中给出的数据，m/z分辨率为约20的装置足以确定空/部分/全衣壳比率。此类分辨率可以使用上述TW离子分离装置20以特别简单的方式获得。
因此，在实施方案中，分析衣壳的混合物，其中该混合物包括以下项中两者或更多者的混合物：(i)包封第一量的遗传物质的衣壳；(ii)包封不同的第二量的遗传物质的衣壳；和/或(iii)不含遗传物质的衣壳。遗传物质的第一量可以大于遗传物质的第二量。第一量的遗传物质可以是全部或完全量的遗传物质。第二量的遗传物质可以是部分或不完全量的遗传物质。
可以使用一个或多个电荷包络来确定以下项中的一者或多者：(i)混合物中包封第一量的遗传物质的衣壳的数量与混合物中包封第二量的遗传物质的衣壳的数量的比率；(ii)混合物中包封第一量的遗传物质的衣壳的数量与混合物中不含遗传物质的衣壳的数量的比率；(iii)混合物中包封第二量的遗传物质的衣壳的数量与混合物中不含遗传物质的衣壳的数量的比率；等等。
图4示出了在1.35Torr下操作的1m长T波装置中不同密度的假设球形衣壳(半径
150电荷)的SIMION模拟结果。
图4A示出了以m/z对T波漂移时间作图的结果。标记为“空”和“全”的虚线分别突出了质量为3.5MDa和5.0MDa的衣壳的T波分离。图4B示出了空衣壳和全衣壳的m/z比的T波速度、振幅和相应的γ和α参数。
图4A示出了在图4B中给出的一系列条件下操作的TW装置中进行分离的不同密度的假设球形衣壳(假设具有相同的平均电荷150和半径
)的模拟结果。空AAV衣壳和全AAV衣壳(3.5MDa和5MDa)预期的m/z比用垂直虚线标记。
如根据在375m/s的TW速度和27V的振幅下获得的数据集显而易见的，观察到空衣壳和全衣壳的基本分离，漂移时间分别为110ms和250ms。预期地，分离在TW条件下降低，导致较低的α参数(图4B)。
图5示出了对应于图4的模拟数据的实验数据。具体地，图5示出了空AAV8衣壳和全AAV8衣壳的ToF(m/z)对T波漂移时间数据。使用循环IMS装置在375m/s的TW速度和30V的振幅下获得数据。如根据数据显而易见的，观察到空衣壳和全衣壳的基本分离。
图6示出了空AAV8衣壳和全AAV8衣壳的混合物的T波分离的实验数据，其中图6A中的数据针对用与图6B中的数据不同的空衣壳和全衣壳比率制备的衣壳。使用循环IMS装置采集数据，采集时间为10分钟。如根据数据显而易见的，观察到空衣壳和全衣壳的不同比率。
使用通过使用TW分离器测量的漂移时间，并且假设空衣壳和全衣壳具有相同的半径和平均电荷，空衣壳和全衣壳的m/z可以使用分析表达式、经校准的分析表达式或来自数值或全离子光学模拟的查找表形式的数据来估计。分析表达式可以是或可以包括以下形式的项：
其中v是行波速度并且
是所测量的平均离子速度。
当已知离子的行波参数和离子迁移率K时，可以对该等式进行数值求解以得到α并且因此得到粒子的m/z比。另选地，当提供对应于导致不同程度m/z和迁移率分离的不同组行波条件的两个此类等式时，可同时对它们进行求解以获得m/z测量结果和迁移率测量结果两者。
可以通过包括与γ8、γ10等成比例的项来扩展以上表达式，并且/或者可以修改以上表达式以描述波步进效应。校准步骤可以例如包括重新缩放参数α或γ中的任一者或两者以适应与装置内部的标称压力或电压的偏差，或适应诸如波步进的效应。可包括附加的修改以描述可归因于不同质量和迁移率的离子群所采用的不同空间分布的效应。
查找表可包括在使用封装(诸如SIMION)的装置的现实模型中在多个α和γ值下从模拟离子轨迹获得的一组模拟平均相对离子速度。另选地，可使用通过描述粒子运动的微分等式的数值解获得的值或先前实验的结果来填充。
与常规方法(诸如分析超离心、透射电子显微镜、阴离子交换色谱等)相比，根据实施方案的方法可以在几秒或几分钟内产生结果，并且需要最少量的样本。
基于T波的装置的相对简单性和低成本是主要优点，特别是对于QC应用。例如，本文所述的T波装置可以在介于0.1mbar与20mbar之间的压力范围内操作，并且因此不需要高真空泵送。本文所述的T波装置可以以介于1V与100V之间的电压脉冲振幅和10-4ms至5ms的周期操作。周期和振幅电压两者所需的精度相对较低(1％)。此外，通过T波装置的渡越时间介于1ms与1000ms之间，因此允许相对较慢的离子检测器和信号数字化仪(0.01ms至10msFWHM脉冲宽度)。
这些要求与常规m/z分析器形成对比，常规m/z分析器需要高真空(10-4mbar至10- 9mbar)、精确的高电压源(几kV)、快速检测器(500ps FWHM脉冲宽度)和快速数字化仪(>1Gs/s)。
尽管已经就AAV的分析描述了特定实施方案，但是该方法可以用于宽范围的高质量分析物，诸如例如腺病毒(约150MDa)，当其用作疫苗和基因疗法等的递送载体时。通常，高质量粒子可包括任何高质量粒子的混合物，诸如例如病毒、衣壳、纳米粒子(诸如包含表面活性分子(例如囊泡、纳米盘)的纳米粒子)、脂蛋白粒子(例如胆固醇)、多氧金属化物和其它超分子构建体、金属簇、聚合物链等。
在一些实施方案中，由多于两个实验(例如，在不同的行波条件下)得出的结果可以被组合并且以概率或统计方式分析以进一步改善结果的质量。
(T波)m/z分离器20可以在至少两种不同的条件下操作，使得可以提取离子的迁移率和m/z。例如，该装置可以在最大化m/z依赖性的条件下使用(T波)分离来操作，并且还使用线性电场来获得“纯”迁移率分离。然后可以根据两个数据集估计m/z。
分离装置20可以使用具有已知m/z和离子迁移率的一种或多种物质来校准。这可以包括例如中空衣壳。到达时间与m/z比之间的关系可使用多项式函数、样条函数或任何其它合适的内插函数来参数化。
所测量的响应还可以使用已知浓度的标准样本来校准，以提高(相对)定量的准确性。
(T波)m/z分离器20可在独立配置中或在质谱仪系统中的不同点处实现。在一些实施方案中，若干(T波)m/z分离器可以按顺序布置，任选地在它们之间具有一个或多个激活、碰撞、碎裂、反应或解离阶段。
例如，(T波)m/z分离器20可以与快速m/z分离器(诸如飞行时间分离器)串联实现。离子可以在(T波)m/z分离器20中分离之后解离，并且由此可以获得前体离子和产物离子的2D相关图。
(T波)m/z分离器20可以在四极-T波-ToF配置中实现。前体离子可以在T波m/z分离之前部分解离，并且在ToF测量之前完全解离。
因此，在实施方案中，检测器30可以包括质量分析器，诸如飞行时间(ToF)质量分析器。
分析仪器可包括被配置为使离子激活、碎裂或反应的激活、碰撞、碎裂或反应装置(未示出)。激活、碰撞、碎裂或反应装置可布置在离子分离装置20与检测器30之间。
该激活、碰撞、碎裂或反应装置可以包括任何合适的装置，诸如一个或多个选自由以下项构成的组的激活、碰撞、碎裂或反应池：(i)碰撞诱导解离(“CID”)碎裂装置；(ii)表面诱导解离(“SID”)碎裂装置；(iii)电子转移解离(“ETD”)碎裂装置；(iv)电子捕获解离(“ECD”)碎裂装置；(v)电子碰撞或冲击解离碎裂装置；(vi)光诱导解离(“PID”)碎裂装置；(vii)激光诱导解离碎裂装置；(viii)红外辐射诱导解离装置；(ix)紫外辐射诱导解离装置；(x)喷嘴-撇取器接口碎裂装置；(xi)源内碎裂装置；(xii)源内碰撞诱导解离碎裂装置；(xiii)热源或温度源碎裂装置；(xiv)电场诱导碎裂装置；(xv)磁场诱导碎裂装置；(xvi)酶消化或酶降解碎裂装置；(xvii)离子-离子反应碎裂装置；(xviii)离子-分子反应碎裂装置；(xix)离子-原子反应碎裂装置；(xx)离子-亚稳离子反应碎裂装置；(xxi)离子-亚稳分子反应碎裂装置；(xxii)离子-亚稳原子反应碎裂装置；(xxiii)用于使离子反应以形成加合物或产物离子的离子-离子反应装置；(xxiv)用于使离子反应以形成加合物或产物离子的离子-分子反应装置；(xxv)用于使离子反应以形成加合物或产物离子的离子-原子反应装置；(xxvi)用于使离子反应以形成加合物或产物离子的离子-亚稳离子反应装置；(xxvii)用于使离子反应以形成加合物或产物离子的离子-亚稳分子反应装置；(xxviii)用于使离子反应以形成加合物或产物离子的离子-亚稳原子反应装置；和(xxix)电子电离解离(“EID”)碎裂装置。
分析仪器可包括例如布置在离子源10与离子分离装置20之间的滤质器，诸如四极滤质器。
尽管如上所述，在特定实施方案中，在不确定粒子的电荷或电荷分布的情况下使用一个或多个电荷包络来表征粒子，但是各种其它实施方案是可能的。
例如，(T波)m/z分离器20可以在分离之前与电荷减少装置结合使用。这样做可以(i)将离子电荷减少到可以区分电荷状态峰值的点，以及/或者(ii)增加m/z并且因此放大速度弛豫效应。电荷减少可通过任何合适的技术诱导，诸如例如溶液添加剂(电荷减少剂和/或电荷减少表面活性剂)和/或反应物蒸气(包含中性和/或电离分子)。溶液添加剂的蒸发也可导致形成合适的反应物蒸气。
尽管已参考优选实施例描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解，在不脱离如所附权利要求书中所阐述的本发明的范围的情况下，可以做出形式和细节上的各种改变。
Claims (20)
1.一种分析质量>1MDa的粒子的方法，所述方法包括：
电离粒子以产生离子；
通过使所述离子穿过离子分离装置来根据质荷比分离所述离子，在所述离子分离装置中使用一个或多个时变电场来推动离子通过气体，使得离子根据质荷比分离；
测量所述离子通过所述离子分离装置的渡越时间，并由此确定所述离子的漂移时间或质荷比分布；
在所述漂移时间或质荷比分布中识别一个或多个电荷包络；以及
使用所述一个或多个电荷包络来表征所述粒子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述漂移时间或质荷比分布包括其中所述粒子的不同电荷状态未分辨的漂移时间或质荷比分布。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用所述一个或多个电荷包络来表征所述粒子包括在不确定所述粒子的电荷或电荷分布的情况下使用所述一个或多个电荷包络来表征所述粒子。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述粒子包括针对其已知或预期从大多数或所有粒子产生的离子具有相同或类似的平均电荷和/或相同或类似的离子迁移率的粒子。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用所述一个或多个电荷包络来表征所述粒子包括将所述一个或多个电荷包络与已知电荷包络信息进行比较。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：
所述粒子包括具有第一质量的粒子和具有不同的第二质量的粒子的混合物；并且
使用所述一个或多个电荷包络来表征所述粒子的混合物包括使用所述一个或多个电荷包络来确定所述混合物中具有所述第一质量的粒子的数量与所述混合物中具有所述第二质量的粒子的数量的比率。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述粒子包括衣壳的混合物或病毒的混合物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：
所述粒子包括衣壳的混合物；
所述衣壳的混合物包括以下项中两者或更多者的混合物：(i)包封第一量的遗传物质的衣壳；(ii)包封不同的第二量的遗传物质的衣壳；和(iii)不含遗传物质的衣壳；并且
其中使用所述一个或多个电荷包络来表征所述衣壳的混合物包括使用所述一个或多个电荷包络来确定以下项中的一者或多者：
(i)所述混合物中包封所述第一量的遗传物质的衣壳的数量与(ii)所述混合物中包封所述第二量的遗传物质的衣壳的数量的比率；
(i)所述混合物中包封所述第一量的遗传物质的衣壳的数量与(iii)所述混合物中不含遗传物质的衣壳的数量的比率；以及
(ii)所述混合物中包封所述第二量的遗传物质的衣壳的数量与(iii)所述混合物中不含遗传物质的衣壳的数量的比率。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在根据质荷比分离所述离子之前减少所述离子的所述电荷。
10.一种分析质量>1MDa的粒子的方法，所述方法包括：
电离粒子以产生离子；
减少所述离子的所述电荷；
通过使所述离子穿过离子分离装置来根据质荷比分离所述电荷减少的离子，在所述离子分离装置中使用一个或多个时变电场来推动离子通过气体，使得离子根据质荷比分离；
测量所述离子通过所述离子分离装置的渡越时间，并由此确定所述离子的漂移时间或质荷比分布；
使用所述漂移时间或质荷比分布来表征所述粒子。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述离子分离装置是行波分离装置，并且其中所述方法包括将一个或多个电压连续地施加到所述装置的不同电极以便形成一个或多个行进势垒，所述一个或多个行进势垒沿着所述装置移动以便推动离子通过所述气体进入。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述离子分离装置中的所述气体保持在≥0.1mbar的压力下。
13.一种分析仪器，所述分析仪器包括：
离子源，所述离子源被配置为电离粒子以产生离子；
离子分离装置，所述离子分离装置布置在所述离子源的下游，其中所述离子分离装置被配置为通过使用一个或多个时变电场来推动离子通过气体而根据质荷比分离离子；
离子检测器，所述离子检测器布置在所述离子分离装置的下游，其中所述分析仪器被配置为使得可以通过所述离子检测器检测从所述离子分离装置洗脱的离子；
其中所述分析仪器被配置为测量离子通过所述离子分离装置的所述渡越时间，并由此确定所述离子的漂移时间或质荷比分布；并且
其中所述分析仪器被配置为使用所述漂移时间或质荷比分布来表征所述粒子。
14.根据权利要求13所述的分析仪器，其中所述分析仪器被配置为在所述漂移时间或质荷比分布中识别一个或多个电荷包络，并且使用所述一个或多个电荷包络来表征所述粒子。
15.根据权利要求14所述的分析仪器，其中所述分析仪器被配置为在不确定所述粒子的电荷或电荷分布的情况下使用所述一个或多个电荷包络来表征所述粒子。
16.根据权利要求14或15所述的分析仪器，其中所述分析仪器被配置为：
将所述一个或多个电荷包络与已知电荷包络信息进行比较；以及/或者
使用所述一个或多个电荷包络来确定具有第一质量的粒子的数量与具有第二质量的粒子的数量的比率。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的分析仪器，其中所述离子分离装置具有介于约10与1000之间的分辨率。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的分析仪器，所述分析仪器还包括一个或多个装置，所述一个或多个装置被配置为减少布置在所述离子分离装置上游的所述离子的所述电荷。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的分析仪器，其中所述离子分离装置为行波分离装置。
20.根据权利要求13至18中任一项所述的分析仪器，其中所述离子分离装置被配置为使得所述离子分离装置中的所述气体保持在≥0.1mbar的压力下。
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