CN116390940A - Tgfbr2-ecd突变体及包含其的融合蛋白与应用 - Google Patents

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Abstract

TGFBR2‑ECD突变体，以及包含其的融合多肽、靶向分子或融合蛋白，以及所述突变体、融合多肽、靶向分子或融合蛋白在制备用于治疗和/或预防肿瘤性疾病的药物中的用途。

Description

TGFBR2-ECD突变体及包含其的融合蛋白与应用
本申请要求2020年9月23日提交的，题为“TGFBR2-ECD突变体及包含其的融合蛋白与应用”的第202011011927.7号中国专利申请的优先权，该申请的内容整体援引加入本文。
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明提供了一种多肽，其为TGF-βRⅡ胞外区(TGFBR2-ECD)突变体，以及包含TGFBR2-ECD突变体的融合蛋白，以及其在制备药物中的用途。
背景技术
转化生长因子-β(TGF-β)具有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种高同源亚型，它们共同属于TGF-β超家族。TGF-β与膜上受体的高亲和力结合，可激活下游SMAD蛋白磷酸化通路参与疾病发生发展进程。
在肿瘤发展进程中，TGF-β调控肿瘤细胞增殖、分化和迁移等相关基因的异常表达而参与增强肿瘤组织血管生成、细胞转移和间充质转化等癌症进程，还参与人体免疫监测系统抑制而最终发挥促癌效应。TGF-β的异常表达改变了肿瘤组织微环境，其在体内的高表达水平与多种肿瘤不良预后相关。在结直肠癌中，TGF-β下游通路的SMAD活化可激活不良预后相关生物标志物的表达，TGF-β1和TGF-β3在患者体内的高表达与其不良预后呈显著相关。研究表明，TGF-β可促进Treg细胞生成，抑制CD8+T细胞以及NK细胞的激活和分化，也参与抑制第一代CAR-T和CD137共刺激信号的CAR-T增殖。此外，TGF-β与多种炎症和自身免疫性疾病密切相关：在炎症性肠病模型中，TGF-β通过诱导Th17细胞的大量分化，而导致Th17细胞相关自身免疫性疾病的恶化；在哮喘模型中，IL-13通过诱导产生TGF-β参与患者肺部纤维化进程。
TGF-β信号转导由TGF-β受体复合物介导。TGF-β受体复合物是由一个TGF-βⅠ型受体(TGF-βRⅠ)同源二聚体和一个TGF-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)同源二聚体组成。研究发现，两个TGF-βRⅡ的胞外区(TGFBR2-ECD)与TGF-β二聚体直接结合形成复合物。因此，TGFBR2-ECD可以用来开发TGF-βTrap，起到捕获TGF-β的作用，从而阻断TGF-β信号通路。
在肿瘤治疗中，对肿瘤微环境的TGF-β抑制已是一个公认的有效治疗靶点，但在临床研究中单用TGF-β抑制剂疗效不佳。现有技术中已经开发了一些包含TGF-βTrap的 双功能分子，例如包含抗PD-L1抗体和TGF-βTrap(参见例如WO2018/205985和WO2015/118175)的双功能分子，可以同时阻断TGF-β信号通路并抑制免疫检查点，用于癌症治疗。其中，WO2015/118175的方案采用野生型TGFBR2-ECD作为TGF-βTrap，其与PD-L1抗体融合形成的双功能分子在生产过程中易发生较严重的降解断裂，极大影响了药物成药性开发，对药物的有效性和安全性也产生了挑战。WO2018/205985的方案通过截去野生型TGFBR2-ECD的N端易断裂区，而获得了更为稳定的双功能分子，但是截短型的TGFBR2-ECD在体内环境中可能会因为缺乏N端的原始序列而形成与野生型蛋白差异较大的结构，而存在一些未知风险。
发明内容
本发明提供一种TGF-βRⅡ胞外区的突变体，其能够结合TGF-β，并且在N端带有一个或多个氨基酸突变，从而与野生型TGF-βRⅡ胞外区相比，所述突变体包含在易断裂区域的氨基酸突变和/或亲水性的改进。
在一实施方案中，本发明的突变体包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且在其N端第1-24位氨基酸中带有一个或多个氨基酸突变。
在一些优选的实施方案中，所述突变体在三个区域中的每一个中均包含氨基酸突变，并且在所述三个区域的每一个中包含至少一个S或T，其中所述三个区域包括：第一区域QKS(第6-8位氨基酸)、第二区域NNDMI(第10-14位氨基酸)以及第三区域DNNG(第17-20位氨基酸)。
在一些实施方案中，所述氨基酸突变包括用亲水性氨基酸、N-X-S/T基序或其组合在所述三个区域中的每一个中进行氨基酸取代，其中X为脯氨酸(P)以外的任何氨基酸。优选地，在所述三个区域中的每一个中至少取代一次。更优选地，在所述三个区域中的每一个中至少取代两次。在一些实施方案中，亲水性氨基酸选自G、T、S、N、E、Y或其组合。在一些实施方案中，N-X-S/T基序为N-A-S。
在一些实施方案中，所述氨基酸突变包括将第一区域QKS突变为GGS、TGS或NAS，将第二区域NNDMI突变为GGSGI、TGSGI或NASGI，以及将第三区域DNNG突变为GGSG、TGSG或GNAS。在一具体实施方案中，本发明的突变体具有选自SEQ ID NO:2-6的氨基酸序列。
在另一些优选的实施方案中，所述突变体在所述三个区域中的每一个中均包含氨基酸突变，并且在所述三个区域的每一个中包含至少一个S或T，并且还包含在所述三个区域上下游区域中的氨基酸突变。在这些实施方案中，所述氨基酸突变包括用G、S、E、T或其组合在所述三个区域的每一个中至少取代一个氨基酸，以及用T、Y或其组合在每个区域的上下游区域中至少取代一个氨基酸。在一些实施方案中，所述氨基酸突变包括将第一位氨基酸I突变为T，将第5-8位氨基酸(VQKS)突变为TQES或TQTS，将第9-15位氨基酸(VNNDMIV)突变为TSESMIT或TNNSMIT，以及将第17-24位氨基 酸(DNNGAVKF)突变为GESGATKY或GTSGATKY。在一具体实施方案中，所述突变体具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供一种靶向分子，其包含本发明的突变体和靶向部分，其中所述靶向部分与所述突变体的N末端共价连接，所述靶向部分所靶向的分子选自：生长因子及其受体、细胞因子及其受体、细胞表面抗原、免疫检查点分子、激素和其他体内生物活性成分。在一实施方案中，所述靶向部分为抗体或其抗原结合片段、拟抗体、配体、体内活性蛋白的配体结合结构域或功能活性结构域。在一实施方案中，所述靶向部分为Fc片段，优选人IgG1的Fc片段。在一实施方案中，将人IgG1的Fc片段融合至本发明的TGFBR2-ECD突变体的N末端以提供Fc-TGFBR2-ECD融合蛋白。在一具体实施方案中，所述Fc-TGFBR2-ECD融合蛋白包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，所述靶向部分为抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供一种融合多肽，其包含本发明的突变体和第一多肽，并且所述第一多肽的C末端与所述突变体的N末端共价连接。在一实施方案中，所述第一多肽包含抗体的至少一个重链可变区或抗体的至少一个轻链可变区。在一具体实施方案中，所述抗体为抗PD-L1抗体。
在又一方面，本发明提供一种融合蛋白，其包含本发明的融合多肽和第二多肽，其中所述第二多肽在与所述第一多肽组合时，形成靶向部分。在一实施方案中，所述第一多肽包含抗体的至少一个重链可变区，所述第二多肽包含抗体的至少一个轻链可变区。在又一实施方案中，所述第一多肽包含抗体的至少一个轻链可变区，所述第二多肽包含抗体的至少一个重链可变区。在一具体实施方案中，所述抗体为抗PD-L1抗体。在一具体实施方案中，本发明的融合蛋白形成二聚体。
在另一方面，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的靶向分子、融合多肽或者融合蛋白，以及药学上可接受的载剂。本发明还提供所述靶向分子、融合多肽、融合蛋白或者药物组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤性疾病的药物中的用途。
在又一方面，本发明还提供编码所述突变体、靶向分子、融合多肽或者融合蛋白的核酸分子，包含所述核酸分子的表达载体，以及包含所述核酸分子或表达载体的宿主细胞。
附图说明
图1A：抗PD-L1/TGF-βTrap的结构示意图以及野生型抗PD-L1/TGF-βTrap发生降解的示意图。
图1B：野生型抗PD-L1/TGF-βTrap及突变型抗PD-L1/TGF-βTrap的还原蛋白电泳，用银染法使蛋白条带显色：泳道1为抗PD-L1抗体，泳道2为野生型抗PD-L1/TGF-βTrap，泳道3为Mu5；HC，重链；LC，轻链；融合蛋白-HC，抗PD-L1的抗体重链和TGFBR2-ECD的融合多肽；融合蛋白-LC，抗PD-L1/TGF-βTrap中的抗体轻链，与抗PD-L1抗体轻链 一致；降解产物，融合蛋白-HC由于TGFBR2-ECD的N端断裂而产生的缺失TGFBR2-ECD产物。
图2：SEC-HPLC图谱示出野生型抗PD-L1/TGF-βTrap(WT)(2A)及突变型抗PD-L1/TGF-βTrap(Mu5)(2B)中各组分的比例；Mono，单体；LMW，低分子量降解物。
图3：非还原型CE-SDS毛细管电泳图谱示出野生型抗PD-L1/TGF-βTrap(WT)(3A)及突变型抗PD-L1/TGF-βTrap(Mu5)(3B)中各组分的比例：Fragment，非完整结构蛋白；Intact，完整蛋白。
图4：还原型CE-SDS毛细管电泳图谱示出野生型抗PD-L1/TGF-βTrap(WT)(4A)及突变型抗PD-L1/TGF-βTrap(Mu5)(4B)中各组分的比例：HC，抗PD-L1/TGF-βTrap中的抗体重链和TGFBR2-ECD的融合多肽；LC，抗PD-L1/TGF-βTrap中的抗体轻链；Fragment，非完整结构蛋白片段；Intact，完整蛋白。
图5：野生型抗PD-L1/TGF-βTrap(WT)及突变型抗PD-L1/TGF-βTrap(Mu5-11)对hPD-L1(5A)和hTGF-β1(5B)的结合活性的ELISA检测结果。
图6：野生型抗PD-L1/TGF-βTrap(WT)(6A)及突变型抗PD-L1/TGF-βTrap(Mu5)(6B)与hTGF-β1相互作用的分子动力学检测结果。
图7：在A549细胞系中检测野生型抗PD-L1/TGF-βTrap及突变型抗PD-L1/TGF-βTrap对EMT途径基因的表达抑制的结果：在hTGF-β1存在下，分别检测野生型抗PD-L1/TGF-βTrap及突变型PD-L1/TGF-βTrap对EMT途径基因的表达抑制，所检测的基因从左到右依次为：CDH2、MMP2、MMP3、MMP9、TWIST1、VIMENTIN；细胞样品分别为：(1)TGF-b1 2ng：培养基中加入终浓度为2ng/ml的hTGF-β1，培养48h，作为阴性对照；(2)TGF-b1+WT：TGF-b1 2ng/ml，同时加入5μg/ml野生型PD-L1/TGF-βTrap，培养48h；(3)TGF-b1+Mu5：TGF-b1 2ng/ml，同时加入5μg/ml Mu5，培养48h。
图8：在MC38/hPD-L1小鼠结肠癌细胞皮下移植瘤模型中检测突变型抗PD-L1/TGF-βTrap(Mu5)的体内肿瘤抑制活性；曲线示出随时间各组小鼠中的相对肿瘤体积。
具体实施方式
定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”可以表示1、2、3、4、5、6、7、8个(种)或更多个(种)。
如本文所用，“抗体”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然的或者部分或全部 合成(例如重组)产生的，其通过至少一个抗原结合位点特异性结合到抗原的表位。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体涵盖抗原结合片段。如本文所用，因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、单域抗体以及抗原结合片段，例如但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’) 2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、二硫键连接的Fab(dscFab)或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。
如本文所用，抗体的“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗原结合位点)，并且因此保留全长抗体的至少部分特异性结合抗原的能力。抗原结合片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及通过化学合成或基因工程技术(例如DNA重组技术)产生的衍生物。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’) 2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p 3-25,Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合抗原的抗体。
“传统”或“全长”抗体通常包含四个多肽：两个重链和两个轻链。每个链可以包含可变区和恒定区。每个轻链从N末端到C末端包含轻链可变区(V L)和轻链恒定区(C L)。每个重链从N末端到C末端包含重链可变区(V H)以及一个或多个重链恒定区(C H)，重链恒定区从N末端到C末端可以包括C H1、C H2和C H3，或C H1、C H2、C H3和C H4。每个V L和每个V H可以包含三个高度可变的“互补决定区(CDR)”和四个相对保守的“框架区(FR)”。在本文中，轻链可变区的CDR可以称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链可变区的CDR可以称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。本领域技术人员可以使用本领域熟知的方法识别CDR，例如使用Kabat或Chothia编码法(参见例如Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,and Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。通常认为包含六个CDR(即三个重链CDR和三个轻链CDR)的Fv片段是一个抗原结合位点的最小单位，但在某些情况下，包含少于六个CDR(例如三、四或五个)的其他片段(例如单域抗体，又称为纳米抗体)同样具有结合抗原的能力。
如本文所用，“Fv片段”是指包含一对VH和VL的抗原结合片段。可以通过肽接头 将VH和VL连接来获得“单链Fv(scFv)”。通过向Fv或scFv中引入二硫键可以分别获得“二硫键稳定的Fv(dsFv)”或“单链二硫键稳定的Fv(scdsFv或dsscFv)”。
如本文所用，“Fab”包含一个完整的抗体轻链(VL-CL)和抗体重链可变区和一个重链恒定区(VH-CH1，也称为Fd)。用肽接头将“Fab”中的CL和CH1连接可以获得单链“Fab(scFab)”。“F(ab’) 2”基本上包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段。“Fab'”为F(ab’) 2的一半，其可以通过还原F(ab’) 2铰链区的二硫键获得。
如本文所用，“Fc片段”是指全长抗体经木瓜蛋白酶消化的可结晶片段。一般而言，IgG的Fc片段可以包含部分铰链区、CH2和CH3。在本文中，Fc片段可以包含至少部分铰链区(例如铰链区的全部或部分)、CH2和CH3。本领域技术人员可以根据已知的算法和软件判断CDR、FR、VH、VL、CL、CH1、CH2、CH3和铰链区在抗体中的位置，可以应用的算法和软件的描述可以参见例如William R.Strohl,Lila M.Strohl,(2012),Therapeutic Antibody Engineering,Woodhead Publishing,pp.37-56。
如本文所用，“双抗体(diabody)”是指这样的抗体，其包含两个scFv，其中每个scFv中的V H和V L之间通过短肽接头(大约5-10个氨基酸残基)连接，使得V H和V L链间配对(即第一scFv的V H和第二scFv的V L配对，第一scFv的V L和第二scFv的V H配对)形成抗原结合位点。
如本文所用，“嵌合抗体”指这样的抗体，其中的一部分(例如CDR、FR、可变区、恒定区或其组合)与衍生自特定物种的抗体中相应序列相同或同源，剩余的部分与衍生自另一物种的抗体中相应序列相同或同源。嵌合抗体可以通过抗体工程化产生。抗体工程化的方法是本领域技术人员公知的。特别地，可以通过DNA重组技术生成嵌合抗体(例如参加Sambrook,J.,et al.(1989).Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y)。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指非人抗体经修饰以增加与人抗体的序列同源性的抗体。人源化抗体可以通过抗体工程化改造任何非人物种抗体或其中包含非人物种来源序列的抗体(例如嵌合抗体)来获得。由非人抗体获得人源化抗体的技术是本领域技术人员熟知的。
如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或使用本领域已知的任何技术制备的具有与由人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的定义涵盖完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一种人重链和/或轻链多肽的抗体。
如本文所用，“单域抗体(sdAb)”又称为“纳米抗体”，是指包含单个免疫球蛋白可变结构域(单可变结构域)作为功能性抗原结合片段的抗体。与全长抗体的可变区类似，单可变结构域通常包含形成抗原结合位点的CDR1、CDR2和CDR3以及起支持作用的框架区。
“亲和力”或“结合亲和力”用来衡量分子与其配体之间通过非共价作用力相互结合的强度，例如本发明的靶向部分与其靶点之间的结合强度，例如抗体或抗原结合片段与抗 原之间或者本发明的TGFBR2-ECD突变体与TGF-β之间的结合强度。亲和力的大小通常报告为平衡解离常数K D，常通过测量缔合常数(ka)和解离常数(kd)并计算kd除以ka的商来确定(K D＝kd/ka)。K D可以利用常规技术容易地测定，例如通过平衡透析；通过使用Octet RED96检测系统，利用制造商所列的一般方法；通过使用酶联免疫吸附测定(ELISA)；通过利用放射性标记的靶抗原进行放射免疫测定；或者通过技术人员已知的其他方法。
“特异性结合”是指两个分子之间以较高的亲和力相互结合，通常，特异性结合的两个分子之间的K D值可以为10 -6、10 -7、10 -8到10 -9M或更低。例如，抗体或抗原结合片段通过抗原结合位点与抗原的抗体结合位点之间可以以10 -6到10 -9M的K D值特异性结合，TGFBR2-ECD与TGF-β之间可以以10 -6到10 -9M的K D值特异性结合。
在多肽或蛋白中，合适的保守氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如Watson et al.,Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。
如本文所用，术语“多肽”指包含至少两个通过肽键连接的氨基酸或其衍生物的聚合物。“蛋白”可以由一条或更多条多肽以共价或非共价方式形成。
如本文所用，术语“突变”是指多肽或蛋白中包含一个或多个氨基酸的取代、缺失或增加。所述取代可以是保守或非保守取代。在本发明的实施方案中，可以用一个氨基酸取代另一氨基酸(例如用G取代Q)，也可以用一个氨基酸基序取代另一个氨基酸基序(例如用N-A-S基序取代Q-K-S基序)。在本文中，将取代一个位置上的氨基酸基序或一个位点上的氨基酸的事件描述为取代一次。在本文中，当指定突变位置时，第n位氨基酸指从多肽的氨基末端(即N末端)的第1个氨基酸开始数的第n个氨基酸。在本文中，突变位置的指定以SEQ ID NO:1为基准。
如本文所用，“野生型”多肽或蛋白是指天然存在的，未经人为改造的多肽或蛋白。多肽或蛋白的“突变型”或“突变体”相对于“野生型”的多肽或蛋白带有突变。例如，野生型TGF-βRⅡ胞外区包含SEQ ID NO:1的序列。TGF-βRⅡ胞外区的突变体相对于SEQ ID NO:1的序列带有突变。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
本发明的多肽、蛋白或核酸分子可以是“分离的”。表述“分离的”指多肽、蛋白或核酸分子可以例如是经过人工改造的，和/或与其天然存在的环境中的其他物质分离的。诸如cDNA分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。
如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水 平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色或银染，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制或扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达核酸或载体所编码的多肽。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、各种COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。
如本文所用，“载体”是用于将外源核酸导入宿主细胞的媒介，当载体转化入适当的宿主细胞时，外源核酸得以扩增或表达。载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。如本文所用，载体的定义涵盖质粒、线性化质粒、病毒载体、粘粒、噬菌体载体、噬菌粒、人工染色体(例如，酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体)等。如本文所用，载体可以在宿主细胞中表达或复制。
如本文所用，“表达载体”包括能够表达多肽的载体，其包含编码目标多肽的多核苷酸序列。编码目标多肽的多核苷酸序列与能够影响其表达的调控序列可操作地连接。这类调控序列可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体可以指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体载体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA或RNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
如本文所用，术语“靶向部分”指能特异性地结合靶点的分子。靶向部分可以将与其共价连接的分子(例如本发明的TGFBR2-ECD突变体)靶向到特定的靶点。靶向部分可以识别一个或多个靶点。
如本文所用，术语“配体”指能够调节特定的细胞生理活动的活性物质，其可以与特定体内活性蛋白结合，激活细胞内的生理生化反应。
如本文所用，“体内活性蛋白”指配体本身以及可以调节细胞生理活动，例如接受细胞外或细胞内配体并介导信号转导的蛋白，其可以具有配体结合结构域和/或功能性结构域。体内活性蛋白可以为配体、受体、激酶、离子通道或其他参与信号转导的蛋白。如本文所用，术语“配体结合结构域”指体内活性蛋白中能够特异性识别并结合配体的结构域。“功能性结构域”指体内活性蛋白中能够介导信号转导，激活细胞内的生理生化反应的结构域。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。同样，如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
如本文中所使用的，术语“个体”是指哺乳动物，例如人。
TGFBR2-ECD突变体
在一方面，本发明提供一种TGF-βRⅡ胞外区(TGFBR2-ECD)的突变体，其能够结合TGF-β，并且在N端带有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)氨基酸突变，从而与野生型TGF-βRⅡ胞外区相比，所述突变体包含在易断裂区域的氨基酸突变和/或亲水性的改进。
如本文所用，术语“TGF-βRⅡ胞外区”或“TGFBR2-ECD”具有相同含义，是指TGF-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)的胞外结构域，其具有结合TGF-β的活性。二聚化TGFBR2-ECD可以作为TGF-βTrap(参见例如WO2015/118175和WO2018/205985)结合和捕获TGF-β二聚体，从而抑制TGF-β信号通路以及消除TGF-β信号通路相关的免疫抑制。可以使用本领域已知的各种检测方法确定TGF-β信号通路的抑制，例如检测TGF-β信号通路控制的下游基因的表达。
野生型TGFBR2-ECD为136个氨基酸的肽段(SEQ ID NO:1)，其可以与其他多肽组合形成包含TGF-βTrap的双功能分子，例如抗PD-L1/TGF-βTrap(参见例如WO2015/118175和WO2018/205985)。但是，包含野生型TGFBR2-ECD的双功能分子易发生断裂，不利于后续的成药性开发。本发明的TGFBR2-ECD突变体为相对于野生型TGFBR2-ECD的改进型多肽。相比于包含野生型TGFBR2-ECD的双功能分子，包含本发明的TGFBR2-ECD突变体的双功能分子在生产过程中不易产生降解，具有更好的成药性。
发明人发现，野生型TGFBR2-ECD容易在N端第1-24位氨基酸中发生断裂。在一实施方案中，所述突变体包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且在其N端第1-24位氨基酸中带有一个或多个氨基酸突变，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个，优选9个或更多个。在另一实施方案中，所述氨基酸突变的数目为16个以下。
在一些优选的实施方案中，所述突变体在三个区域中的至少一个，优选每一个中均包含氨基酸突变。优选地所述突变体在所述三个区域的每一个中包含至少一个S或T。所述三个区域包括：第一区域QKS(第6-8位氨基酸)、第二区域NNDMI(第10-14位氨 基酸)以及第三区域DNNG(第17-20位氨基酸)。
在一些实施方案中，所述氨基酸突变包括用亲水性氨基酸、N-X-S/T基序或其组合在所述三个区域中的每一个中进行氨基酸取代，其中X为脯氨酸(P)以外的任何氨基酸。优选地，在所述三个区域中的每一个中至少取代一次。更优选地，在所述三个区域中的每一个中至少取代两次。在一些实施方案中，亲水性氨基酸选自G、T、S、N、E、Y或其组合。在一些实施方案中，N-X-S/T基序为N-A-S。
在一些实施方案中，所述氨基酸突变包括将第一区域QKS突变为GGS、TGS或NAS，将第二区域NNDMI突变为GGSGI、TGSGI或NASGI，以及将第三区域DNNG突变为GGSG、TGSG或GNAS。在一具体实施方案中，本发明的突变体具有选自SEQ ID NO:2-6的氨基酸序列。
在另一些优选的实施方案中，所述突变体在所述三个区域中的每一个中均包含氨基酸突变，并且在所述三个区域的每一个中包含至少一个S或T，并且还包含在所述三个区域上下游区域中的氨基酸突变。在这些实施方案中，所述氨基酸突变包括用G、S、E、T或其组合在所述三个区域的每一个中至少取代一个氨基酸，以及用T、Y或其组合在每个区域的上下游区域中至少取代一个氨基酸。在一些优选的实施方案中，所述氨基酸突变包括将第一位氨基酸I突变为T，将第5-8位氨基酸(VQKS)突变为TQES或TQTS，将第9-15位氨基酸(VNNDMIV)突变为TSESMIT或TNNSMIT，以及将第17-24位氨基酸(DNNGAVKF)突变为GESGATKY或GTSGATKY。在一具体实施方案中，所述突变体具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
靶向分子
在又一方面，本发明提供了一种靶向分子，其包含本发明的TGFBR2-ECD突变体和靶向部分，所述靶向部分与所述突变体的N末端共价连接。在一实施方案中，所述靶向部分靶向选自以下的靶点：生长因子及其受体、细胞因子及其受体、细胞表面抗原、免疫检查点分子、激素和其他体内生物活性成分。本发明的靶向分子又称为双功能分子，其可以起到同时阻断TGF-β信号通路和特异性结合特定靶点的双重作用。
靶向部分和TGFBR2-ECD突变体可以以任何方式共价连接形成靶向分子。例如，可以利用DNA重组技术将靶向部分中的一个或多个多肽与突变体以重组多肽或蛋白的方式共价连接，也可以利用化学偶联或酶催化偶联的方法将靶向部分共价连接。
在一实施方案中，所述靶向部分包含一个或多个多肽，并且其中至少一个多肽的C末端与所述突变体的N末端共价连接形成融合多肽。
在一些实施方案中，所述靶向分子还包含所述靶向部分和所述突变体之间的接头。优选的接头为肽接头。优选地，所述接头为(G 4S) nG，其中n为2-6的整数，优选为3-5的整数，更优选地为4。
靶向部分
靶向部分可以与其靶点特异性结合。在优选的实施方案中，靶向部分可以靶向肿瘤特异性标志物、肿瘤干细胞、肿瘤微环境、免疫检查点或肿瘤形成调控机制。靶向部分的靶点可以包括例如生长因子或其受体、细胞因子或其受体、细胞表面抗原、免疫检查点分子、激素或者其他体内生物活性成分等。免疫检测点分子可以包括例如PD1、CTLA4、LAG-3、BTLA、TIM-2、LAIR1、PD-L1、B7-DC、B7-H3、B7-H4、HVEM和TIM-4。在一优选实施方案中，靶向部分靶向肿瘤微环境，例如可以靶向本文所述的细胞因子或其受体或者生长因子或其受体。靶向部分的靶点的实例可以包括但不限于：CD13、CD19、CD22、CD25、CD27、CD30/TNFRSF8、CD33、CD37、CD44v6、CD56、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD117/KIT、CD123、CD138、CD142、CD174、CD227/MUC1、CD352、CLDN18.2、DLL3、CN33、GPNMB、ENPP3、Nectin-4、HER2/ErbB2、EGFR、FGFR、VEGFR、HGFR、PDGFR、VEGF、HGF、FGF、FGF-2、PDGF、EGF、Galectin-3、SLC44A4/AGS-5、CEACAM5、PSMA、TIM1、LY6E、LIV1、SLITRK6、SLAMF7/CS1、BCMA、AXL、NaPi2B、GCC、STEAP1、MUC16、Mesothelin、ETBR、EphA2、5T4、FOLR1、LAMP1、Cadherin 6、CA6、IntegrinαV、TDGF1、Ephrin A4、PTK7、NOTCH3、C4.4A、FLT3、PD1、CTLA4、LAG-3、BTLA、TIM-2、LAIR1、PD-L1、B7-DC、B7-H3、B7-H4、HVEM和TIM-4。
可以用于本发明的靶向部分包括但不限于例如，抗体或其抗原结合片段、拟抗体、配体、体内活性蛋白的配体结合结构域或功能活性结构域等。在一些实施方案中，靶向部分为配体。在一实施方案中，所述配体为细胞表面抗原、细胞因子、生长因子或激素。细胞表面抗原可以包括肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原。细胞因子可以选自：G-CSF、GM-CSF、eotaxin/CCL11、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL4、RANTES/CCL5、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、INFα、INFβ、INFγ和TNFα和TNFβ。生长因子可以选自：VEGF、HGF、FGF、FGF-2、PDGF、IGF、TGF、NGF、EPO和EGF。激素可以为肽类激素或甾体激素，优选为肽类激素。在一些实施方案中，靶向部分为体内活性蛋白的配体结合结构域。体内活性蛋白可以为受体(例如T细胞受体或其共受体、细胞因子受体、生长因子受体、激素受体等)、激酶、离子通道或其他参与信号转导的蛋白。优选地，所述配体结合结构域或功能性结构域为T细胞受体、细胞因子受体、生长因子受体、激素受体的配体结合结构域或功能性结构域。配体、配体结合结构域或功能活性结构域可以是野生型或突变型。
在一实施方案中，所述靶向部分为抗体或其抗原结合片段、拟抗体、配体、体内活性蛋白的配体结合结构域或功能活性结构域。
在一些实施方案中，靶向部分为Fc片段。优选地，靶向部分为人IgG1的Fc片段。可以修饰Fc片段以获得期望的体内活性，例如延长靶向分子的血清半衰期，或者增强或削弱靶向分子的效应功能(例如抗体依赖的细胞介导的毒性作用(ADCC)和补体依赖的 细胞毒性作用(CDC))。在一些实施方案中，人IgG1的Fc片段包含N297A突变，即人IgG1重链第297位的天冬酰胺(N)被突变为丙氨酸(A)。包含N297A突变的Fc片段失去与FcγR的结合能力，从而消除Fc片段介导的ADCC。在一实施方案中，人IgG1的Fc片段包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在一实施方案中，将人IgG1的Fc片段任选地通过接头融合至本发明的TGFBR2-ECD突变体的N末端以提供Fc-TGFBR2-ECD融合蛋白。在一具体实施方案中，所述Fc-TGFBR2-ECD融合蛋白包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
优选地，靶向部分为抗体或其抗原结合片段，例如与上述靶点特异性结合的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段可以选自合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、单域抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’) 2片段、Fv片段、dsFv片段、Fd片段、Fd’片段、scFv、scFab、双抗体。在一优选实施方案中，靶向部分为靶向肿瘤微环境的抗体或其抗原结合片段。在一具体实施方案中，所述靶向部分为抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。所述抗PD-L1抗体包括但不限于MSB0010718C、MEDI4736、BMS-936559、MPDL3280A以及WO 2019/233462中所描述的抗PD-L1抗体。
在一些实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。优选地，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段如上所述。
在一实施方案中，靶向部分包含抗体的V H和V L，并且V H和V L的C末端各自与两个突变体的N末端共价连接。在一实施方案中，所述抗体为如本文所述的抗PD-L1抗体。
在一实施方案中，靶向部分包含第一抗体的V H与V L和第二抗体的V H与V L，并且两个V H的C末端各自与两个突变体的N末端共价连接。第一抗体和第二抗体可以相同或不同。在一实施方案中，所述第一抗体和第二抗体为如本文所述的抗PD-L1抗体。
在一实施方案中，靶向部分包含抗体的V H-C H1和轻链，并且C H1和C L的C末端各自与两个突变体的N末端共价连接。在一实施方案中，所述抗体为如本文所述的抗PD-L1抗体。
在一实施方案中，靶向部分包含第一抗体的V H-C H1与轻链和第二抗体的V H-C H1与轻链，并且两个V H-C H1的C末端各自与两个突变体的N末端共价连接。第一抗体和第二抗体可以相同或不同。在一实施方案中，所述第一抗体和第二抗体为如本文所述的抗PD-L1抗体。
在一实施方案中，靶向部分包含第一抗体的重链与轻链和第二抗体的重链与轻链，并且两个重链的C末端各自与两个突变体的N末端共价连接。第一抗体和第二抗体可以相同或不同。在一实施方案中，所述第一抗体和第二抗体为如本文所述的抗PD-L1抗体。
抗PD-L1抗体
在一些优选的实施方案中，靶向部分为抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。示例性抗PD-L1抗体包括但不限于MSB0010718C、MEDI4736、BMS-936559、MPDL3280A以及WO 2019/233462中所描述的抗PD-L1抗体。在一些优选的实施方案中，所述抗PD-L1抗体为WO 2019/233462中所描述的抗PD-L1抗体B10、H12和B11，其相关内容整体援引加入本文。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体为B10抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中
所述重链可变区包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，
HCDR2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和
HCDR3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
LCDR1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，
LCDR2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在又一实施方案中，所述抗PD-L1抗体为B11抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中
所述重链可变区包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，
HCDR2，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，和
HCDR3，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
LCDR1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，
LCDR2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在另一实施方案中，所述抗PD-L1抗体为H12抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中
所述重链可变区包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，
HCDR2，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和
HCDR3，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
LCDR1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，
LCDR2，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在又一实施方案中，B10抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在又一实施方案中，B10抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一实施方案中，B11抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在又一实施方案中，B11抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一实施方案中，H12抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在又一实施方案中，H12抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在又一实施方案中，B10、B11或H12抗体包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在又一实施方案中，B10、B11或H12抗体还包含重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在一实施方案中，B11抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，B11抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
融合多肽
在另一方面，本发明提供了一种融合多肽，其包含TGFBR2-ECD突变体和第一多肽，并且所述第一多肽的C末端与所述突变体的N末端共价连接。
在一些实施方案中，所述第一多肽为如上所述的靶向部分。在一些实施方案中，所述第一多肽与其他的多肽形成如上所述的靶向部分。
在一些实施方案中，所述第一多肽包含抗体的至少一个重链可变区。在一实施方案中，所述抗体为如本文所述的抗PD-L1抗体。在一具体实施方案中，所述第一多肽包含抗体的重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:19、27和35的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，所述第一多肽还包含抗体的重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一多肽包含抗体的重链。在一实施方案中，所述抗体为如本文所述的抗PD-L1抗体。在一具体实施方案中，所述第一多肽包含抗体的重链，所述重链包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一多肽包含抗体的至少一个轻链可变区。在一实施方案中，所述抗体为如本文所述的抗PD-L1抗体。在一具体实施方案中，所述第一多肽包含抗体的轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:23、31和39的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，所述第一多肽还包含抗体的轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一多肽包含抗体的轻链。在一实施方案中，所述抗体为如本文所述的抗PD-L1抗体。在一具体实施方案中，所述第一多肽包含抗体的轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合多肽还包含所述第一多肽和所述突变体之间的接头。优选的接头为肽接头。优选地，所述接头为(G 4S) nG，其中n为2-6的整数，优选为3-5的整数，更优选地为4。
在一实施方案中，所述融合多肽包含选自SEQ ID NO:9-15的氨基酸序列。
融合蛋白
在又一方面，提供了一种融合蛋白，其包含本发明的融合多肽和第二多肽。本发明的融合蛋白可以是如上所述的靶向分子，其包含靶向部分和本发明的突变体。在一实施方案中，当所述第二多肽在与所述第一多肽组合时，形成本文所述的靶向部分。
在一些实施方案中，所述第一多肽包含抗体的至少一个重链可变区，所述第二多肽包含抗体的至少一个轻链可变区。在一些实施方案中，所述第一多肽包含抗体的至少一个轻链可变区，所述第二多肽包含抗体的至少一个重链可变区。
在一具体实施方案中，所述第一多肽包含抗体的重链，所述第二多肽包含抗体的轻链。
在一实施方案中，所述抗体为本文所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。因此，本发明还提供一种靶向PD-L1和TGF-β的双功能融合蛋白，又可以称为突变型抗PD-L1/TGF-βTrap。
在一实施方案中，所述融合蛋白包含：
(1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
(ⅰ)第一多肽，其包含重链可变区，所述重链可变区包含
HCDR1，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，
HCDR2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，
HCDR3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和
(ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
(2)第二多肽，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含
LCDR1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，
LCDR2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在又一实施方案中，所述融合蛋白包含：
(1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
(i)第一多肽，其包含重链可变区，其包含
HCDR1，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，
HCDR2，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，
HCDR3，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(ii)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
(2)第二多肽，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含
LCDR1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，
LCDR2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在另一实施方案中，所述融合蛋白包含：
(1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
(i)第一多肽，其包含重链可变区，所述重链可变区包含
HCDR1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，
HCDR2，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，
HCDR3，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和
(ii)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
(2)第二多肽，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含
LCDR1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，
LCDR2，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一实施方案中，所述融合蛋白包含：
(1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
(ⅰ)第一多肽，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和
(ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
(2)第二多肽，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
在又一实施方案中，所述融合蛋白包含：
(1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
(ⅰ)第一多肽，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，和
(ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
(2)第二多肽，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在另一实施方案中，所述融合蛋白包含：
(1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
(ⅰ)第一多肽，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和
(ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
(2)第二多肽，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:39的氨基酸 序列。
在又一实施方案中，所述融合蛋白包含：
(1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
(ⅰ)第一多肽，其包含重链可变区和重链恒定区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:19、27和35的氨基酸序列，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，和
(ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
(2)第二多肽，其包含轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:23、31和39的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，所述融合蛋白包含：
(1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
(ⅰ)第一多肽，其包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，和
(ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
(2)第二多肽，其包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含所述第一多肽和所述突变体之间的接头，优选地，所述接头为(G 4S) nG，其中n为2-6的整数，优选为3-5的整数，更优选地为4。
在一实施方案中，所述融合蛋白形成二聚体。
肿瘤性疾病
本发明的靶向分子、融合多肽、融合蛋白和药物组合物可以用于治疗和/或预防TGF-β家族相关通路引起的肿瘤、炎症、自身免疫等疾病。
本发明还涉及本发明的靶向分子、融合多肽、融合蛋白或药物组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤性疾病的药物中的用途。
本发明还涉及一种治疗和/或预防肿瘤性疾病的方法，其包括向有需要的个体给药本申请的靶向分子、融合多肽、融合蛋白或药物组合物。
本发明的靶向分子、融合多肽、融合蛋白(特别是抗PD-L1/TGF-βTrap)或药物组合物可以用于治疗和/或预防肿瘤性疾病。可以预防和/或治疗的优选的肿瘤性疾病(或癌症)包括一般对免疫治疗有应答的癌症，特别是PD-L1阳性的癌症。可治疗的癌症的非限制性的实例包括但不限于肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤。其他癌症的实例包括但不限于骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白 血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。本发明的融合蛋白和药物组合物也可用于治疗转移性癌，特别是表达PD-L1的转移性癌。在又一实施方案中，所述肿瘤性疾病(或癌症)为肺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌或骨肉瘤，特别是结直肠癌或非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，本发明的抗PD-L1/TGF-βTrap可以用于治疗癌症。在一些实施方案中，所述癌症为PD-L1阳性的癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自肺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤、结直肠癌和非小细胞肺癌。
核酸、载体和宿主细胞
在另一方面，本发明提供分离的核酸分子，其编码本发明的突变体、靶向分子、融合多肽或融合蛋白。所述核酸分子的核苷酸序列可以针对用于表达的宿主细胞进行密码子优化。
本发明还提供一种表达载体，其包含至少一种本发明的核酸分子。
本发明的一方面还提供一种宿主细胞，其包含至少一种本发明的核酸分子或表达载体。
融合多肽的生产方法
本发明的又一方面还涉及一种方法，其用于生产本发明的突变体、靶向分子、融合多肽或融合蛋白，所述方法包括：
(i)在适合核酸分子或表达载体表达的情况下培养本发明的宿主细胞，和
(ii)分离并纯化由本发明的突变体、靶向分子、融合多肽或融合蛋白。
药物组合物
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白以及药学上可接受的载剂。优选地，所述药物用于治疗和/或预防TGF-β家族相关通路引起的肿瘤、炎症、自身免疫等疾病。更优选地，所述药物用于治疗和/或预防如上所述的肿瘤性疾病。
本文使用的“药学上可接受的载剂”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载剂适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用 途径，可将活性化合物，例如本发明的融合蛋白，包裹于一种材料中，以保护其免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
可以通过灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。
药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合物中。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。
治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载剂中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
可以与载剂材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载剂材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载剂相组合。
可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一推注，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治 疗的对象的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载剂组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。
对于本发明的融合蛋白或药物组合物的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重，10mg/kg体重或20mg/kg体重，或在1-20mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短后期给药间隔加长。给药方式可以是静脉滴注。
或者，针对肿瘤的融合蛋白也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据药物分子在患者中的半衰期而不同。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。
药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。
“有效量”是指这样的剂量，其足以使疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的对象，“有效量”的本发明的融合蛋白或药物组合物优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。有效量的本发明的融合蛋白或药物组合物能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状如预防和/或治疗转移或复发。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。
本发明的融合蛋白或药物组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望 的结果而不同。优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，本发明的融合蛋白或药物组合物也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。
活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载剂一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。
本发明的融合蛋白还可以与诸如细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白等治疗性部分缀合。
细胞毒素包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括但不限于：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。
可用于缀合的治疗剂还包括，例如：抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)，烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，氨茴霉素类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
能与本发明的融合蛋白缀合的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、阿里他汀、和它们的衍生物。
可以利用本领域使用的接头技术将细胞毒素与本发明的融合蛋白缀合，例如与融合蛋白中的靶向部分(例如抗体)缀合。已经用于细胞毒素缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择，例如，在溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的接头，该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。
本发明的融合蛋白也可以与放射性同位素缀合，产生细胞毒性放射性药物，又称为放射性缀合物。能够与本发明的融合蛋白缀合的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。制备放射性缀合物的方法在本领域是公知的。
本发明的融合蛋白也可以与具有需要的生物活性的蛋白缀合。这样的生物活性蛋白 包括，例如：具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应调节物，如免疫调节因子，例如淋巴因子、白介素(例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-10)、趋化因子(例如ccl3、ccl26、cxcl7)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他免疫调节因子如IFN等。
联合治疗
本发明的融合蛋白或药物组合物可以与化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体联合施用。本发明的融合蛋白和所述化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体可以全部在一次施用或分开施用。当分开施用时(采用互相不同的施用方案的情况下)，它们可以连续施用而不中断或以预定的间隔施用。本发明的融合蛋白或本发明的药物组合物还可以与放疗联合，例如包括向患者施用电离辐射，其早于、在其过程中和/或晚于本发明的融合蛋白或药物组合物的施用过程。
试剂盒
本发明的范围内还包括试剂盒，其包括本发明的突变体、融合多肽、靶向分子、融合蛋白或者编码其的核酸分子或载体或其组合，以及使用说明。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途和/或使用方法的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。
有益效果
包含野生型TGFBR2-ECD的双功能分子易发生断裂，不利于后续的成药性开发。而包含截短型TGFBR2-ECD的双功能分子由于缺乏N末端的原始序列，在体内环境中可能会形成与野生型蛋白差异较大的结构，存在一些未知风险。
发明人针对野生型TGFBR2-ECD的易断裂特性，采用了与现有技术(如WO2018/205985)完全不同的突变型优化策略，在解决成药性风险的基础上尽可能的保留TGFBR2-ECD的原始序列。
与野生型TGFBR2-ECD相比，本发明的TGFBR2-ECD突变体包含在易断裂区域(QKS、NNDMI和DNNG)的氨基酸突变和/或亲水性的改进，但不影响对TGF-β1的亲和活性。更进一步地，本发明的TGFBR2-ECD突变体(特别是SEQ ID NO:2-8)，相比于野生型TGFBR2-ECD，在三个区域(见实施例1)和/或三个区域的上下游区域包含亲水性氨基酸(例如G、T、S、N、E和Y)和/或亲水且可发生潜在O/N糖基化修饰氨基酸取代。具体地，本发明的突变体在所述区域包含T/S和N-X-S/T(X可以是脯氨酸(P)以外的任何氨基酸)，以亲水性增强和潜在糖基化修饰保护为策略，可以提高融合蛋白的稳定性。
与包含野生型TGFBR2-ECD的融合蛋白相比，本发明的融合蛋白包含改进的 TGFBR2-ECD突变体，使得本发明的融合蛋白在生产过程中不易发生断裂和降解，表现出更高的稳定性。与包含截短型TGFBR2-ECD的融合蛋白相比，本发明的融合蛋白中的TGFBR2-ECD突变体与野生型TGFBR2-ECD更接近，可能有助于减少在体内环境中的潜在风险。更进一步的，本发明的融合蛋白(例如突变型抗PD-L1/TGF-βTrap)对TGF-β1和PD-L1有较高的亲和活性。因此本发明的TGFBR2-ECD突变体和包含其的融合蛋白，是其作为TGF-βTrap成药性开发的有益补充。
实施例
通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
除非另外指明，实施例部分中所用的试剂和仪器都是可商购的。
实施例1抗PD-L1/TGF-βTrap的构建与表达
经质谱检测发现，野生型抗PD-L1/TGFBR2-ECD的断裂点主要位于TGFBR2-ECD的N端(结构示意如图1A所示)，其序列为“IPPHV QKSV NNDMIVT DNNGAVKFPQL”。经质谱验证，野生型TGFBR2-ECD的降解位点主要位于三个区域，即第一区域Q-K-S和第二区域N-NDM-I(其中“-”表示断裂点)，以及第三区域“DNNG”。
由图1A可知，断裂产生的主要降解产物中抗体端结构完整，以常规Protein A介质无法有效去除降解产物，对下游纯化工艺的开发带来巨大挑战，严重影响分子成药性开发。发明人发现，当主要针对第一区域进行突变时(例如Mu1和Mu3)，主降解点会转移至第二区域；而只针对第一和第二区域进行改造时(例如Mu2和Mu4)，第三区域的序列“DNNG”会成为新的降解位点。因此，针对三个区域或三个区域及其上下游序列同时进行针对性的有效突变优化是获得高质量融合蛋白的必然选择。
本实施例中，采用抗PD-L1抗体作为靶向部分，TGFBR2-ECD野生型或突变体作为TGF-βTrap，构建了几种包含TGF-βTrap和抗PD-L1抗体的双功能分子(抗PD-L1/TGF-βTrap)。实施例中所用的抗PD-L1抗体为WO 2019/233462中描述的B11抗体，其相关内容整体援引加入本文。抗PD-L1抗体B11包含两个重链和两个轻链，两个重链各自包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，两个轻链各自包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。抗PD-L1/TGF-βTrap包含两个融合多肽和两个轻链，其中抗体B11的每个抗体重链(SEQ ID NO:43)的C末端都与一个TGFBR2-ECD(野生型或突变体)的N末端通过接头(G 4S) 4G连接形成融合多肽，抗PD-L1/TGF-βTrap的轻链为抗体B11的轻链(SEQ ID NO:42)。
包含TGFBR2-ECD突变体的融合蛋白Mu1-11，又称为突变型抗PD-L1/TGF-βTrap。 Mu1-4包含的TGFBR2-ECD突变体分别具有SEQ ID NO:44-47的氨基酸序列，融合多肽分别具有SEQ ID NO:48-51的氨基酸序列。Mu5-11包含的TGFBR2-ECD突变体分别具有SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列，TGFBR2-ECD突变体与抗体B11重链的融合多肽分别具有SEQ ID NO:9-15的氨基酸序列。与Mu5-11相比，Mu1-4仅在三个区域中的第一和/或第二区域中包含氨基酸突变(参见表1)。
还构建了包含TGFBR2-ECD野生型(SEQ ID NO:1)的野生型融合蛋白(WT)作为参比，又称为野生型抗PD-L1/TGF-βTrap(参见表1)。
由表2的结果可知，在所述三个区域或者所述三个区域及其上下游区域的同时突变改造是提高融合蛋白稳定性的关键。Mu5-9均是只针对三个区域的突变：Mu5在每个区域中均只包含一个亲水且可发生潜在O-糖基化修饰的氨基酸“S”；Mu6在每一区域中均包含两个亲水且可发生潜在O-糖基化修饰的氨基酸“S/T”；Mu7在Mu5的基础上，在第一区域中还包含一个亲水且可发生潜在N-糖基化修饰的氨基酸“N”，并形成潜在N-糖基化位点“N-A-S”；Mu8在Mu7的基础上，在第二区域中还包含一个亲水且可发生潜在N-糖基化修饰的氨基酸“N”，并形成潜在N-糖基化位点“N-A-S”；Mu9在Mu8的基础上，在第三区域中还包含一个亲水且可发生潜在N-糖基化修饰的氨基酸“N”，并形成潜在N-糖基化位点“N-A-S”。Mu10和Mu11在三个区域及其上下游区域引入广泛的亲水性氨基酸，特别是可发生潜在O-糖修饰的氨基酸“S/T”。
表1抗PD-L1/TGF-βTrap
Figure PCTCN2021119565-APPB-000001
Figure PCTCN2021119565-APPB-000002
注：Ab为抗PD-L1抗体，其具有两个轻链和两个重链，轻链具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列，重链具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列；三个区域用下划线示出；linker为接头(G 4S) 4G，每个重链的C末端通过其与一个突变体的N末端连接形成融合多肽；Mu1-11中的TGFBR2-ECD突变体中包含的氨基酸突变以加粗字体示出。
还构建了融合蛋白Fc-TGFBR2-ECD(SEQ ID NO:52)，其中TGFBR2-ECD突变体(SEQ ID NO:2)的N末端与人IgG1的Fc片段(SEQ ID NO:53)的C末端通过接头(G 4S) 4G连接。
将表达野生型及突变型抗PD-L1/TGF-βTrap或者融合蛋白Fc-TGFBR2-ECD的质粒瞬间转染到Expi-CHO细胞(Thermo Fisher)中。经过14天左右的无血清细胞培养，收获培养上清。检测培养上清中的抗体表达量，培养上清用Protein A介质进行纯化，获得目标融合蛋白并进行后续检测。
实施例2抗PD-L1/TGF-βTrap的稳定性检测
如实施例1所述的野生型和突变型抗PD-L1/TGF-βTrap经Protein A介质一步纯化后，通过还原蛋白电泳、SEC-HPLC和CE-SDS进行降解物含量检测。
还原蛋白电泳：取样品加入适量Loading buffer，其中一份样品加入DTT进行还原，还原样品70℃水浴加热10min后，上样2μg，经10％蛋白胶电泳分离。实验结果如图1B所示，泳道1为抗PD-L1抗体，泳道2为野生型抗PD-L1/TGF-βTrap，泳道3为Mu5。由结果可知，野生型抗PD-L1/TGF-βTrap在53kDa附近存在显著融合蛋白-HC降解后产物(TGFBR2-ECD缺失)，而Mu5分子的降解得到有效控制。
SEC-HPLC：以100mM PB 200mM Arg(pH 6.8)为流动相，1mL/min流速，采用Waters BEH SEC 200A 7.8x300mm 3.5μm色谱柱进行分析，每个样品进样50μg。
CE-SDS：取两份样品加入适量样品缓冲液，其中一份加入β-ME(β-巯基乙醇)进行还原，非还原样品70℃水浴5min，还原样品70℃水浴10min。使用Maurice进行CE-SDS分析，非还原样品(nrCE-SDS)分离40min，还原样品(rCE-SDS)分离35min。
通过SEC-HPLC分析野生型抗PD-L1/TGF-βTrap(WT)和Mu5的稳定性的图谱示于图2：WT中单体的比例为85.2％，降解物的比例为14％，而Mu5中单体比例为97％。
通过nrCE-SDS分析野生型抗PD-L1/TGF-βTrap(WT)和Mu5稳定性的电泳图谱示 于图3：WT中完整蛋白的比例为86.4％，蛋白片段的比例高达13.6％，而Mu5中完整蛋白比例高达94.7％，蛋白片段比例低至5.3％。
通过rCE-SDS分析野生型抗PD-L1/TGF-βTrap(WT)和Mu5稳定性的电泳图谱示于图4：WT中蛋白片段的比例高达8.3％，而Mu5中的蛋白片段比例低至1.8％。
野生型(WT)和突变型抗PD-L1/TGF-βTrap(Mu1-11)的SEC-HPLC和CE-SDS数据汇总如表2所示。
表2的SEC-HPLC结果显示，野生型抗PD-L1/TGF-βTrap中单体(Mono)比例为85.2％，降解物(LMW)的比例高达14％，本发明的突变型抗PD-L1/TGF-βTrap(Mu5-11)中单体比例可以达到95％以上，降解物比例可以低至3.5％以下，表明本发明的突变型抗PD-L1/TGF-βTrap的稳定性更高。
表2的nrCE-SDS结果显示，野生型抗PD-L1/TGF-βTrap中完整蛋白(Intact)比例为86.4％，蛋白片段(Fragment)的比例高达13.6％，本发明的突变型抗PD-L1/TGF-βTrap(Mu5-11)中完整蛋白比例高达94.7％或更高，蛋白片段比例低至5％左右。
表2的rCE-SDS结果显示，野生型抗PD-L1/TGF-βTrap的蛋白片段比例高达8.3％，本发明的突变型抗PD-L1/TGF-βTrap(Mu5-11)的蛋白片段比例低至2％以下。这些结果表明本发明的突变型抗PD-L1/TGF-βTrap的稳定性更高。
由该表可知，针对野生型抗PD-L1/TGF-βTrap的易断裂区域(第一区域QKS(第6-8位氨基酸)、第二区域NNDMI(第10-14位氨基酸)以及第三区域DNNG(第17-20位氨基酸))的随意突变不一定会有显著的质量提升效应。由Mu5-11与野生型抗PD-L1/TGF-βTrap比较可知，用亲水性氨基酸和/或N-X-S/T基序取代这三个区域中的氨基酸可以提高抗PD-L1/TGF-βTrap的稳定性。在针对三个区域同时进行有效突变的Mu5及在此基础上继续引入亲水且可发生N-糖基化修饰的N-X-S/T基序的Mu6-8具有较好的质量提升。另外，Mu10/11针对易断裂区域及其附近的氨基酸残基引入广泛的亲水性氨基酸，特别是广泛引入可发生潜在O-糖基化修饰的氨基酸T/S也同样显著促进了抗PD-L1/TGF-βTrap的稳定性。
除此之外，与在三个区域均包含氨基酸突变的Mu5-11相比，Mu1-4仅在三个区域中的一个或两个区域中包含氨基酸突变，这样的氨基酸突变对抗PD-L1/TGF-βTrap的稳定性改善不显著甚至可能会加重蛋白降解。由此可见，要提高抗PD-L1/TGF-βTrap的稳定性，氨基酸突变的区域也有一定的选择性。
表2野生型和突变型抗PD-L1/TGF-βTrap质量检测
Figure PCTCN2021119565-APPB-000003
实施例3抗PD-L1/TGF-βTrap的特异性识别活性分析
在本实施例中，用ELISA测定抗PD-L1/TGF-βTrap与靶点蛋白人PD-L1(hPD-L1)和人TGF-β1(hTGF-β1)的结合。
分别将人源PD-L1(R&D公司)或TGF-β1(Acro公司)用PBS稀释到1μg/ml并包被96孔板。在4℃下孵育过夜后，次日弃去包被液，并用PBST洗涤。然后每孔加入200μl BSA封闭液，在室温下孵育1h。用PBST洗涤三遍，将野生型抗PD-L1/TGF-βTrap、本发明的抗PD-L1/TGF-βTrap以及PD-L1抗体用1％BSA PBST稀释，最高浓度为14nM，进行4倍梯度稀释，做8个浓度梯度，以每孔100μl的量作为一抗分别加入96孔板，在室温下孵育2h。用PBST洗涤三遍，然后加入抗人IgG-Fab-HRP(二抗，Abcam)，在室温下孵育1h。最后每孔用PBST洗涤四次，加入TMB显色液(北京天根生化科技有限公司)，室温显色。终止显色后用酶标仪450nm测定OD值。实验结果如图5所示，野生型(WT)和突变型抗PD-L1/TGF-βTrap(Mu5-11)与PD-L1结合的EC50在0.1-0.2nM之间(图5A)，与TGF-β1结合的EC50在0.1-0.2nM之间(图5B)，表明WT和Mu5-11对两个靶点蛋白PD-L1和TGF-β1的体外结合能力相近。
实施例4抗PD-L1/TGF-βTrap的亲和力分析
在本实施例中，用Octet RED96检测系统测定融合蛋白对靶点蛋白TGF-β1的亲和力。
偶联配体：本方法采用FAB2G(Anti-Human Fab-CH1 2nd Generation)芯片，提前用SD缓冲液浸泡芯片10-15min，以50μg/ml浓度Loading配体(野生型或突变型抗PD-L1/TGF-βTrap)，预设时长1500s，配体Loading预设值2.5nm，用运行缓冲液(SD缓冲液)浸润芯片至基线平稳，去除游离配体。
动力学实验：将TGF-β1用SD缓冲液分别稀释至44.4nM、22.2nM、11.1nM、5.55 nM、2.775nM和1.39nM。以TGF-β1为分析物，野生型和突变型抗PD-L1/TGF-βTrap为配体，进行亲和力检测实验。配体与分析物结合时间(Association)240s，分析物解离时间(Dissociation)300s，以SD缓冲液作为空白对照进行背景扣除。
以FortéBio Data Analysis 9.0采用静态拟合模型进行分析，结果如图6所示，野生型抗PD-L1/TGF-βTrap(WT)与TGF-β1之间的K D为7.5×10 -9M，Mu5与TGF-β1之间的K D为3.6×10 -9M，表明WT和Mu5对TGF-β1的结合亲和力相近。
实施例5抗PD-L1/TGF-βTrap对EMT途径基因的表达调控
在6孔板中接种A549人非小细胞肺癌细胞(中国科学院细胞库，SCSP-503)，培养24-36h至60-70％融合度时，对照组加入含2ng/ml TGF-β1的F-12K完全培养基，实验组在含有TGF-β1的完全培养基中再分别加入5μg/ml野生型抗PD-L1/TGF-βTrap或Mu5。
共同培养48h后，回收细胞，提取细胞总RNA，并进行逆转录反应获得cDNA。配制实时荧光PCR反应体系，检测抗PD-L1/TGF-βTrap是否参与抑制TGF-β诱导的下游EMT(上皮-间充质转化)途径关键基因。相关途径关键基因主要有：CDH2、MMP-2、MMP-3、MMP-9、TWIST2和Vimentin等。结果如图7所示，野生型抗PD-L1/TGF-βTrap(WT)及本发明的抗PD-L1/TGF-βTrap(Mu5)均可有效抑制TGF-β1诱导的EMT途径基因表达。
实施例6 Mu5对MC38/hPD-L1小鼠结肠癌细胞皮下移植瘤的药效验证
本实施例以Mu5为本发明的抗PD-L1/TGF-βTrap融合蛋白的代表药物开展移植瘤药效验证。将1×10 6个结肠癌MC38/hPD-L1(人PD-L1稳转MC38细胞系；动物实验中心构建)细胞注射入小鼠腋下。待肿瘤生长至平均体积50mm 3左右，根据肿瘤体积将小鼠随机分为3组：溶剂对照组(PBS)、Mu5 1.22mg/kg组和Mu5 3.66mg/kg组。每组8只，各组按10ml/kg的给药容积腹腔注射给予相应浓度的受试物，给药频率为每周两次，每周称重和测量肿瘤体积2次。初次给药为第1天(D1)。分别于第1、4、7、11、15和18天(D18)称量小鼠体重并测量肿瘤体积(Tumor Volume，TV)。在第18天，将小鼠处死，剥离肿瘤并称取瘤重(Tumor Weight，TW)。根据肿瘤体积和瘤重计算相对肿瘤体积(Relative Tumor Volume，RTV)、相对肿瘤增殖率(T/C)以及瘤重抑制率(Inhibition Ratio，IR)。结果示于表3、表4和图8。
如表3和图8所示，在第18天，与溶剂对照组(PBS)的RTV值41.96±2.89相比，Mu5 1.22mg/kg组和Mu5 3.66mg/kg组的RTV值分别为17.45±2.81和12.27±3.42。
表3 Mu5的肿瘤抑制作用(肿瘤体积)
Figure PCTCN2021119565-APPB-000004
注：TV＝0.5×a×b 2，其中a、b分别表示肿瘤的长和宽。RTV＝Vt/V0，其中V0为分组给药时(即D1)所测得的肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。T/C＝(T RTV/C RTV)×100％，其中T RTV为治疗组的RTV，C RTV为溶剂对照组的RTV。与PBS组相比， ***：P<0.001。
Figure PCTCN2021119565-APPB-000005
平均值±标准误差。
如表4所示，在第18天，与溶剂对照组(PBS)的瘤重2.4269±0.3936g相比，Mu5 1.22mg/kg组和Mu5 3.66mg/kg组的瘤重分别为1.1161±0.0856g和0.6751±0.2231g。Mu51.22mg/kg组和Mu5 3.66mg/kg组的瘤重抑制率(IR)分别为54.01％和72.18％。
表4 Mu5的肿瘤抑制作用(瘤重)
Figure PCTCN2021119565-APPB-000006
注：IR＝(1-TW T/TW C)×100％，其中TW T为治疗组的瘤重，TW C为对照组的瘤重。与PBS组相比， **：P<0.01。
Figure PCTCN2021119565-APPB-000007
平均值±标准误差。
如表3、表4和图8所示，与溶剂对照组相比，肿瘤生长在Mu5治疗组中均被显著抑制，并呈现出良好的剂量依赖效应。
序列表
Figure PCTCN2021119565-APPB-000008
Figure PCTCN2021119565-APPB-000009
Figure PCTCN2021119565-APPB-000010
Figure PCTCN2021119565-APPB-000011
Figure PCTCN2021119565-APPB-000012
Figure PCTCN2021119565-APPB-000013
Figure PCTCN2021119565-APPB-000014
Figure PCTCN2021119565-APPB-000015

Claims (31)

  1. 一种TGF-βRⅡ胞外区的突变体，其能够结合TGF-β，并且在N端带有一个或多个氨基酸突变，从而与野生型TGF-βRⅡ胞外区相比，所述突变体包含在易断裂区域的氨基酸突变和/或亲水性的改进。
  2. 权利要求1的突变体，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且在其N端第1-24位氨基酸中带有一个或多个氨基酸突变；
    优选地，所述突变体在三个区域的每一个中均包含氨基酸突变，并且在所述三个区域的每一个中包含至少一个S或T，
    其中所述三个区域包括：第一区域QKS(第6-8位氨基酸)、第二区域NNDMI(第10-14位氨基酸)以及第三区域DNNG(第17-20位氨基酸)。
  3. 权利要求1或2的突变体，其中
    所述氨基酸突变包括用亲水性氨基酸、N-X-S/T基序或其组合在所述三个区域中的每一个中进行氨基酸取代，其中X为脯氨酸(P)以外的任何氨基酸；
    优选地，在所述三个区域中的每一个中至少取代一次；
    更优选地，在所述三个区域中的每一个中至少取代两次。
  4. 权利要求3的突变体，其中
    所述亲水性氨基酸选自G、T、S、N、E、Y或其组合；
    所述N-X-S/T基序为N-A-S。
  5. 权利要求1-4中任一项的突变体，其中所述氨基酸突变包括
    将第一区域QKS突变为GGS、TGS或NAS，
    将第二区域NNDMI突变为GGSGI、TGSGI或NASGI，以及
    将第三区域DNNG突变为GGSG、TGSG或GNAS；
    优选地，所述突变体具有选自SEQ ID NO:2-6的氨基酸序列。
  6. 权利要求1或2的突变体，其还包含在所述三个区域上下游区域中的氨基酸突变；
    优选地，所述氨基酸突变包括用G、S、E、T或其组合在所述三个区域的每一个中至少取代一个氨基酸，以及用T、Y或其组合在每个区域的上下游区域中至少取代一个氨基酸；
    更优选地，所述氨基酸突变包括将第一位氨基酸I突变为T，将第5-8位氨基酸(VQKS)突变为TQES或TQTS，将第9-15位氨基酸(VNNDMIV)突变为TSESMIT或TNNSMIT，以及将第17-24位氨基酸(DNNGAVKF)突变为GESGATKY或GTSGATKY；
    最优选地，所述突变体具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
  7. 一种靶向分子，其包含权利要求1-6中任一项的突变体和靶向部分，其中所述靶向部分与所述突变体的N末端共价连接；
    优选地，所述靶向部分所靶向的分子选自：生长因子及其受体、细胞因子及其受体、细胞表面抗原、免疫检查点分子、激素和其他体内生物活性成分。
  8. 权利要求7的靶向分子，其中所述靶向部分所靶向的分子选自：CD13、CD19、CD22、CD25、CD27、CD30/TNFRSF8、CD33、CD37、CD44v6、CD56、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD117/KIT、CD123、CD138、CD142、CD174、CD227/MUC1、CD352、CLDN18.2、DLL3、CN33、GPNMB、ENPP3、Nectin-4、HER2/ErbB2、EGFR、FGFR、VEGFR、HGFR、PDGFR、VEGF、HGF、FGF、FGF-2、PDGF、Galectin-3、EGFSLC44A4/AGS-5、CEACAM5、PSMA、TIM1、LY6E、LIV1、SLITRK6、SLAMF7/CS1、BCMA、AXL、NaPi2B、GCC、STEAP1、MUC16、Mesothelin、ETBR、EphA2、5T4、FOLR1、LAMP1、Cadherin 6、CA6、IntegrinαV、TDGF1、Ephrin A4、PTK7、NOTCH3、C4.4A、FLT3、PD1、CTLA4、LAG-3、BTLA、TIM-2、LAIR1、PD-L1、B7-DC、B7-H3、B7-H4、HVEM和TIM-4。
  9. 权利要求7或8的靶向分子，其中所述靶向部分为Fc片段、抗体或其抗原结合片段、拟抗体、配体、体内活性蛋白的配体结合结构域或功能活性结构域；
    优选地，所述配体为细胞表面抗原、细胞因子、生长因子或激素；所述体内活性蛋白为受体、激酶、离子通道或其他参与信号转导的蛋白；
    更优选地，所述配体结合结构域或功能性结构域为T细胞受体、细胞因子受体、生长因子受体或激素受体的配体结合结构域或功能性结构域；
    特别地，所述靶向部分为靶向肿瘤微环境的抗体或其抗原结合片段。
  10. 权利要求7-9中任一项的靶向分子，其中所述细胞因子选自：G-CSF、GM-CSF、eotaxin/CCL11、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL4、RANTES/CCL5、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、INFα、INFβ、INFγ和TNFα和TNFβ；所述生长因子选自：VEGF、HGF、FGF、FGF-2、PDGF、IGF、TGF、NGF、EPO和EGF；所述激素为肽类激素和甾体激素，优选为肽类激素。
  11. 权利要求7-10中任一项的靶向分子，其中所述靶向部分选自：合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、单域抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’) 2片段、Fv片段、dsFv片段、Fd片段、Fd’片段、scFv、scFab和双抗体。
  12. 权利要求7-11中任一项的靶向分子，其中所述靶向部分为抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
  13. 一种融合多肽，其包含权利要求1-6中任一项的突变体和第一多肽，并且所述第一多肽的C末端与所述突变体的N末端共价连接。
  14. 权利要求13的融合多肽，其中所述第一多肽包含抗体的至少一个重链可变区或抗体的至少一个轻链可变区。
  15. 权利要求14的融合多肽，其中所述抗体为抗PD-L1抗体。
  16. 权利要求13-15中任一项的融合多肽，其还包括所述第一多肽和所述突变体之间的接头，优选地，所述接头为(G 4S) nG，其中n为2-6的整数，优选为3-5的整数，更优选地为4。
  17. 一种融合蛋白，其包含权利要求13-16中任一项的融合多肽和第二多肽，其中所述第二多肽在与所述第一多肽组合时，形成靶向部分，所述靶向部分如权利要求7-12中任一项所定义。
  18. 权利要求17的融合蛋白，其中
    所述第一多肽包含抗体的至少一个重链可变区，所述第二多肽包含抗体的至少一个轻链可变区；
    或者
    所述第一多肽包含抗体的至少一个轻链可变区，所述第二多肽包含抗体的至少一个重链可变区。
  19. 权利要求18的融合蛋白，其中所述抗体为抗PD-L1抗体。
  20. 权利要求19的融合蛋白，其包含：
    (1-1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
    (ⅰ)第一多肽，其包含重链可变区，所述重链可变区包含
    HCDR1，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，
    HCDR2，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，
    HCDR3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和
    (ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
    (1-2)第二多肽，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含
    LCDR1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，
    LCDR2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和
    LCDR3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
    或者
    (2-1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
    (ⅰ)第一多肽，其包含重链可变区，其包含
    HCDR1，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，
    HCDR2，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，
    HCDR3，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
    (ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
    (2-2)第二多肽，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含
    LCDR1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，
    LCDR2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和
    LCDR3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
    或者
    (3-1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
    (ⅰ)第一多肽，其包含重链可变区，所述重链可变区包含
    HCDR1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，
    HCDR2，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，
    HCDR3，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和
    (ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
    (3-2)第二多肽，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含
    LCDR1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，
    LCDR2，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和
    LCDR3，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
  21. 权利要求19的融合蛋白，其包含：
    (1-1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
    (ⅰ)第一多肽，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和
    (ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
    (1-2)第二多肽，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
    或者
    (2-1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
    (ⅰ)第一多肽，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，和
    (ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
    (2-2)第二多肽，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
    或者
    (3-1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
    (ⅰ)第一多肽，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和
    (ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
    (3-2)第二多肽，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
  22. 权利要求19的融合蛋白，其包含：
    (1)融合多肽，从N末端到C末端，其包含：
    (ⅰ)第一多肽，其包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，和
    (ⅱ)突变体，其包含选自SEQ ID NO:2-8的氨基酸序列；以及
    (2)第二多肽，其包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
  23. 权利要求17-22中任一项的融合蛋白，其还包含：
    所述第一多肽和所述突变体之间的接头，优选地，所述接头为(G 4S) nG，其中n为2-6的整数，优选为3-5的整数，更优选地为4。
  24. 权利要求17-23中任一项的融合蛋白，其形成二聚体。
  25. 一种药物组合物，其包含权利要求7-12中任一项的靶向分子、权利要求13-16中任一项的融合多肽或者权利要求17-24中任一项的融合蛋白，以及药学上可接受的载剂。
  26. 权利要求7-12中任一项的靶向分子、权利要求13-16中任一项的融合多肽、权利要求17-24中任一项的融合蛋白或者权利要求25的药物组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤性疾病的药物中的用途；
    优选地，所述肿瘤性疾病选自肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤、骨肉瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合；
    更优选地，所述肿瘤性疾病为肺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤、结直肠癌和非小细胞肺癌，转移性癌，最优选地，所述肿瘤性疾病为表达PD-L1的转移性癌。
  27. 权利要求19-24中任一项的融合蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的用途；优选地，所述癌症为PD-L1阳性的癌症；更优选地，所述癌症选自肺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤、结直肠癌和非小细胞肺癌。
  28. 一种核酸分子，其编码权利要求1-6中任一项的突变体、权利要求7-12中任一项的靶向分子、权利要求13-16中任一项的融合多肽或者权利要求17-24中任一项的融合蛋白。
  29. 一种表达载体，其包含权利要求28的核酸分子。
  30. 一种宿主细胞，其包含权利要求28的核酸分子或权利要求29的表达载体。
  31. 一种方法，其用于产生权利要求1-6中任一项的突变体、权利要求7-12中任一项的靶向分子、权利要求13-16中任一项的融合多肽或者权利要求17-24中任一项的融合蛋白，所述方法包括：
    (i)在适合核酸分子或表达载体表达的情况下培养权利要求30的宿主细胞，和
    (ii)分离并纯化所述突变体、靶向分子、融合多肽或者融合蛋白。
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