CN116386718B - 检测拷贝数变异的方法、设备和介质 - Google Patents

检测拷贝数变异的方法、设备和介质 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测拷贝数变异的方法、设备和介质。该方法包括：将经由预处理的测序数据与参考基因组的测序数据进行比对，以便获得比对结果数据，所述测序数据经由扩增子测序技术获得；针对比对结果数据，过滤掉满足预定过滤条件的测序数据；基于经过滤而留下的比对结果数据，获取扩增子测序区域的整体均一性，以便确定稳定扩增的靶向分析区域；基于稳定扩增的靶向分析区域的测序深度，构建对照集基线；以及基于预测模型所确定的待测样本的拷贝数变异的断点位置、以及所构建的对照集基线，生成关于待测样本的拷贝数变异的检测结果。本发明能够显著提高拷贝数检测结果的稳定性。

Description

检测拷贝数变异的方法、设备和介质
技术领域
本发明总体上涉及生物信息处理，并且具体地，涉及用于基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法、计算设备和计算机存储介质。
背景技术
拷贝数变异（copy number variation，CNV）是指相比参考基因组长度不小于1kbp的DNA片段发生的缺失或者扩增。传统的基于高通量测序数据的用于检测拷贝数变异的方法主要包括：读段拆分法（split read，SR）、双末端比对法（paired-end mapping，PEM）、从头组装法（De novo assembly，DA）、读段深度法（read depth，RD）、以及以上四种检测方法的策略组合。
在上述传统的用于检测拷贝数变异的方法中，目前大部分的拷贝数变异检测方法是基于读段深度策略开发的，其原理是：根据异常区域的读段个数与正常区域的读段个数所具有的显著差别来判断。所采用的扩增子测序技术通常应用多重PCR方法。对于多重PCR技术的建库方法，产物的均一性会受模板质量、引物浓度及质量、反应体系与条件、酶等多因素影响，使得不同批次实验结果，样本间的读段深度差异显著，进而影响拷贝数检测的稳定性。
综上，传统的基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方案存在的不足之处在于：针对扩增子测序试剂盒的拷贝数变异检测结果的稳定性欠佳。
发明内容
本发明提供一种基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法、计算设备和计算机存储介质，能够显著提高拷贝数检测结果的稳定性。
根据本发明的第一方面，提供了一种基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法。该方法包括：将经由预处理的测序数据与参考基因组的测序数据进行比对，以便获得比对结果数据，所述测序数据经由扩增子测序技术获得；针对比对结果数据，过滤掉满足预定过滤条件的测序数据；基于经过滤而留下的比对结果数据，获取扩增子测序区域的整体均一性，以便确定稳定扩增的靶向分析区域；基于稳定扩增的靶向分析区域的测序深度，构建对照集基线；以及基于预测模型所确定的待测样本的拷贝数变异的断点位置、以及所构建的对照集基线，生成关于待测样本的拷贝数变异的检测结果。
根据本发明的第二方面，还提供了一种计算设备，该设备包括：存储器，被配置为存储一个或多个计算机程序；以及处理器，耦合至存储器并且被配置为执行一个或多个程序使装置执行本发明的第一方面的方法。
根据本发明的第三方面，还提供了一种非瞬态计算机可读存储介质。该非瞬态计算机可读存储介质上存储有机器可执行指令，该机器可执行指令在被执行时使机器执行本发明的第一方面的方法。
在一些实施例中，确定稳定扩增的靶向分析区域包括：基于所获取的整体均一性，针对经过滤而留下的比对结果数据进行过滤，以便获得经由均一性过滤的比对结果数据。
在一些实施例中，确定稳定扩增的靶向分析区域还包括：以序列比对到参考基因组的起始位置和终止位置作为一个bed区域，统计每个bed区域内的序列覆盖数；针对每个bed区域的序列覆盖数，使用待测样本的比对序列数量进行矫正，以便获得每个bed区域内的矫正后的序列覆盖数；以及基于经由均一性过滤的比对结果数据，提取阴性对照集中所有样本均有序列覆盖并且经由矫正的序列覆盖数差异小于预定矫正阈值的区域，以确定为稳定扩增的靶向分析区域。
在一些实施例中，生成关于待测样本的拷贝数变异的检测结果包括：经由预测模型，确定待测样本的拷贝数变异的断点位置；计算待测样本每个bed区域的测序深度与所构建的对照集基线bed区域的测序深度的均值的比值；将所计算的比值与预定比值阈值相比较，以便确定每个bed区域的倍性；统计断点区域内的各倍性bed区域的占比；确定所统计的各倍性的bed区域的占比是否大于或者等于预定占比阈值；以及响应于确定当前倍性的bed区域的占比大于或者等于预定占比阈值，确定所述稳定扩增的靶向分析区域的倍性为当前倍性。
在一些实施例中，获得经由均一性过滤的比对结果数据包括：统计待测样本的T20%X 覆盖率、Fold 80值，以便获取待测样本的扩增子测序区域的整体均一性；以及基于所获取的整体均一性与预定均一性阈值的比较结果，针对经过滤而留下的比对结果数据过滤，以获得经由均一性过滤的比对结果数据。
在一些实施例中，满足预定过滤条件的测序数据包括：多位置比对的序列数据和比对质量值低于预定质量阈值的序列数据。
在一些实施例中，基于稳定扩增的靶向分析区域的测序深度构建对照集基线包括：针对所确定的稳定扩增的靶向分析区域进行测序深度矫正；以及基于经由矫正的靶向区域的测序深度，计算对照集样本中每个bed区域的均值以及标准差，以便构建对照集基线。
在一些实施例中，针对所确定的稳定扩增的靶向分析区域进行测序深度矫正包括：使用经由均一性过滤的比对结果数据，统计待测样本以及对照集样本在稳定扩增的靶向分析区域的每个bed区域的序列覆盖深度；基于比对序列数、bed区域的数量、对待测样本以及对照集样本的平均测序深度进行矫正；以及使用局部多项回归方程矫正GC偏好、扩增子长度偏好，以获得矫正后的稳定扩增的靶向分析区域的标准化深度。
提供发明内容部分是为了以简化的形式来介绍对概念的选择，它们在下文的具体实施方式中将被进一步描述。发明内容部分无意标识本发明的关键特征或主要特征，也无意限制本发明的范围。
附图说明
图1示出了根据本发明的实施例的用于实施基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法的系统的示意图。
图2示出了根据本发明的实施例的用于基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法的流程图。
图3示出了根据本发明的实施例的用于确定稳定扩增的靶向分析区域的方法的流程图。
图4示出了根据本发明的实施例的用于针对所确定的稳定扩增的靶向分析区域进行测序深度矫正的方法的流程图。
图5示出了根据本发明的实施例的用于基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法的流程图。
图6示意性示出了适于用来实现本发明实施例的电子设备的框图。
在各个附图中，相同或对应的标号表示相同或对应的部分。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的优选实施例。虽然附图中显示了本发明的优选实施例，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
在本文中使用的术语“包括”及其变形表示开放性包括，即“包括但不限于”。除非特别申明，术语“或”表示“和/或”。术语“基于”表示“至少部分地基于”。术语“一个示例实施例”和“一个实施例”表示“至少一个示例实施例”。术语“另一实施例”表示“至少一个另外的实施例”。术语“第一”、“第二”等等可以指代不同的或相同的对象。
如前文所描述，基于扩增子测序数据检测单核苷酸位点变异(single nucleotidevariants，SNP)和插入/缺失(insertion-deletion, InDel)具有较高的准确性，但是在基于扩增子测序数据进行拷贝数变异检测的传统方法中，因为所采用的扩增子测序技术通常应用多重PCR方法。然而，对于多重PCR技术的建库方法，产物的均一性受模板质量、引物浓度及质量、反应体系与条件、酶等多因素影响，使得不同批次实验结果，样本间的读段深度差异显著，因而影响拷贝数变异检测的稳定性。
为了至少部分地解决上述问题以及其他潜在问题中的一个或者多个，本发明的示例实施例提出了一种基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法。该方法通过将经由扩增子测序技术获得的、经预处理的测序数据与参考基因组的测序数据之间的比对结果数据进行过滤，以便过滤掉满足预定过滤条件的测序数据；基于经过滤而留下的比对结果数据，统计扩增子测序区域的整体均一性，以便基于统计结果确定稳定扩增的靶向分析区域；基于稳定扩增的靶向分析区域的测序深度，构建对照集基线；以及基于预测模型所确定的待测样本的拷贝数变异的断点位置、以及所构建的对照集基线，生成关于待测样本的拷贝数变异的检测结果，本发明能够基于扩增子测序数据获得准确的拷贝数变异检测结果。
图1示出了根据本发明的实施例的用于实施基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法100的系统的示意图。如图1所示，系统100包括：计算设备110、测序设备130。在一些实施例中，计算设备110、测序设备130直接或者经由网络（未示出）进行数据交互。
关于测序设备130，其例如用于提供测序平台，生成关于待测样本的测序数据。测序平台例如而不仅限于是Illumina、Life、BGI等测序平台。测序读长例如可以为100bp、150bp等。测序设备130基于扩增子测序技术获得关于待测样本的测序数据。
关于计算设备110，其例如用于基于扩增子测序数据检测拷贝数变异。具体而言，计算设备110用于将经由预处理的测序数据与参考基因组的测序数据进行比对，以便获得比对结果数据；过滤掉满足预定过滤条件的测序数据；以及获取扩增子测序区域的整体均一性，以便确定稳定扩增的靶向分析区域。计算设备110还用于基于稳定扩增的靶向分析区域的测序深度，构建对照集基线；以及基于预测模型所确定的待测样本的拷贝数变异的断点位置、以及所构建的对照集基线，生成关于待测样本的拷贝数变异的检测结果。
在一些实施例中，计算设备110可以具有一个或多个处理单元，包括诸如GPU、FPGA和ASIC等的专用处理单元以及诸如CPU的通用处理单元。另外，在每个计算设备110上也可以运行着一个或多个虚拟机。计算设备110例如包括：比对结果数据获取单元112、测序数据过滤单元114、稳定扩增的靶向分析区域确定单元116、对照集基线构建单元118，拷贝数变异的检测结果生成单元120。上述比对结果数据获取单元112、测序数据过滤单元114、稳定扩增的靶向分析区域确定单元116、对照集基线构建单元118，拷贝数变异的检测结果生成单元120可以配置在一个或者多个计算设备110上。
关于比对结果数据获取单元112，其用于将经由预处理的测序数据与参考基因组的测序数据进行比对，以便获得比对结果数据。
关于测序数据过滤单元114，其用于针对比对结果数据，过滤掉满足预定过滤条件的测序数据。
关于稳定扩增的靶向分析区域确定单元116，其用于基于经过滤而留下的比对结果数据，获取扩增子测序区域的整体均一性，以便确定稳定扩增的靶向分析区域。
关于对照集基线构建单元118，其用于基于稳定扩增的靶向分析区域的测序深度，构建对照集基线。
关于拷贝数变异的检测结果生成单元120，其用于基于预测模型所确定的待测样本的拷贝数变异的断点位置、以及所构建的对照集基线，生成关于待测样本的拷贝数变异的检测结果。
图2示出了根据本发明的实施例的用于基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法200的流程图。应当理解，方法200例如可以在图6所描述的电子设备600处执行。也可以在图1所描述的计算设备110处执行。应当理解，方法200还可以包括未示出的附加动作和/或可以省略所示出的动作，本发明的范围在此方面不受限制。
在步骤202处，计算设备110将经由预处理的测序数据与参考基因组的测序数据进行比对，以便获得比对结果数据，所述测序数据经由扩增子测序技术获得。
关于测序数据，例如，计算设备110获得来自测序设备130所提供的测序平台（测序平台例如而不仅限于是Illumina、Life、BGI等）的、利用扩增子测序技术而获得的测序。测序读长例如可以为100bp、150bp等。
例如，计算设备110通过BWA软件的MEM算法，将步骤504处所生成的高质量可用数据与HG38标准参考基因组序列进行比对分析，获得每条序列在参考基因组序列上比对的位置信息，获得比对结果数据。
在步骤204处，计算设备110针对比对结果数据，过滤掉满足预定过滤条件的测序数据。
关于满足预定过滤条件的测序数据，其例如包括：多位置比对的序列数据和比对质量值低于预定质量阈值的序列数据。例如，在比对结果数据中过滤掉多位置比对的序列和比对质量值低于预定质量阈值（例如，20）的序列的测序数据。
在步骤206处，计算设备110基于经过滤而留下的比对结果数据，获取扩增子测序区域的整体均一性，以便确定稳定扩增的靶向分析区域。
关于确定稳定扩增的靶向分析区域的方法，其例如包括：计算设备110基于所获取的整体均一性，针对经过滤而留下的比对结果数据进行过滤，以便获得经由均一性过滤的比对结果数据；以序列比对到参考基因组的起始位置和终止位置作为一个bed区域，统计每个bed区域内的序列覆盖数；针对每个bed区域的序列覆盖数，使用待测样本的比对序列数量进行矫正，以便获得每个bed区域内的矫正后的序列覆盖数；以及基于经由均一性过滤的比对结果数据，提取阴性对照集中所有样本均有序列覆盖并且经由矫正的序列覆盖数差异小于预定矫正阈值的区域，以确定为稳定扩增的靶向分析区域。下文将结合图3具体说明确定稳定扩增的靶向分析区域的方法，在此，不再赘述。
关于获得经由均一性过滤的比对结果数据的方法，其例如包括：统计待测样本的T20%X 覆盖率、Fold 80值，以便获取待测样本的扩增子测序区域的整体均一性；以及基于所获取的整体均一性与预定均一性阈值的比较结果，针对经过滤而留下的比对结果数据过滤，以获得经由均一性过滤的比对结果数据。应当理解，T 20%X 覆盖率、Fold 80值可以作为用以衡量整体均一性的指标，整体均一性不合格的待测样本不进入后续靶向区域的分析。例如，待测样本的Fold 80值＞3.3，则过滤掉该待测样本。
例如，以下表一示意性示出了7个待测样本的基本数据。其中，样本编号为CN890的待测样本的Fold 80值为3.5，大于阈值3.3，则则需要过滤掉该待测样本CN890。
应当理解，通过采用上述手段，本发明可以获得待测样本的整体均一性，以及将整体均一性不好的样本不纳入后续分析。
以下结合公式（1）和（2）分别说明用于计算T 20%X 覆盖率（T 20%X coveragerate）、Fold 80值的算法。
T 20%X coverage rate(%)=(大于平均深度20%的扩增子靶向区域的碱基数)/扩增子靶向区域的总碱基数×100 （1）
Fold 80=扩增子测序区域的平均测序深度/80%以上扩增子测序区域覆盖的深度（2）
在上述公式（1）中，T 20%X coverage rate(%)代表大于平均深度20%的扩增子靶向区域的碱基数的覆盖比例。一般而言，T 20%X coverage rate(%)越低越好。
在上述公式（2）中，Fold 80值代表扩增子测序区域的平均测序深度的比例。一般而言，Fold 80值越高越好。
在步骤208处，计算设备110基于稳定扩增的靶向分析区域的测序深度，构建对照集基线。
关于构建对照集基线的方法，其例如包括：针对所确定的稳定扩增的靶向分析区域进行测序深度矫正；以及基于经由矫正的靶向区域的测序深度，计算对照集样本中每个bed区域的均值以及标准差，以便构建对照集基线。
关于针对所确定的稳定扩增的靶向分析区域进行测序深度矫正的方法，例如包括：使用经由均一性过滤的比对结果数据，统计待测样本以及对照集样本在稳定扩增的靶向分析区域的每个bed区域的序列覆盖深度；基于比对序列数、bed区域的数量、对待测样本以及对照集样本的平均测序深度进行矫正；以及使用局部多项回归方程矫正GC偏好、扩增子长度偏好，以获得矫正后的稳定扩增的靶向分析区域的标准化深度。下文将结合图4具体说明用于针对所确定的稳定扩增的靶向分析区域进行测序深度矫正的方法，在此，不再赘述。
在步骤210处，计算设备110基于预测模型所确定的待测样本的拷贝数变异的断点位置、以及所构建的对照集基线，生成关于待测样本的拷贝数变异的检测结果。
关于预测模型，其例如而不限于是隐马尔可夫模型或CBS模型。预测模型用于预测待测样本的拷贝数变异的断点位置。
关于生成关于待测样本的拷贝数变异的检测结果的方法，其例如包括：计算设备110经由预测模型，确定待测样本的拷贝数变异的断点位置；计算待测样本每个bed区域的测序深度与所构建的对照集基线bed区域的测序深度的均值的比值；将所计算的比值与预定比值阈值相比较，以便确定每个bed区域的倍性；统计断点区域内的各倍性bed区域的占比；确定所统计的各倍性的bed区域的占比是否大于或者等于预定占比阈值；以及响应于确定当前倍性的bed区域的占比大于或者等于预定占比阈值，确定所述稳定扩增的靶向分析区域的倍性为当前倍性。
应当理解，在传统的直接基于拷贝数均值判断倍性的方法中，鉴于存在拷贝数错误的问题，容易导致部分区域的倍性判断错误，例如将杂合判断为2倍体。而本发明的方法通过利用待测样本的每个bed区域与所构建的对照集基线bed区域的测序深度的均值的比值对bed区域的倍性进行矫正，进而使得整个区域的倍性数据更为准确，避免了局部拷贝数错误对区域检测结果的影响。例如，10个bed区域中，6个bed区域均是判断为2倍体，则传统的方法会将整个区域被判断为2倍体；而如果其实质上是杂合，属于1倍体，利用本发明可以矫正为准确的检测结果，例如“杂合”，而传统的方法会判断为假阴性的检测结果。因而本发明能够整体上提高关于拷贝数变异的检测结果的准确性。
具体而言，在本发明中，关于确定每个bed区域的倍性的方法，其例如包括：如果当前bed区域与所构建的对照集基线bed区域的测序深度的均值的比值为0.2至0.7之间（即，大于或者等于0.2，且小于0.7），则当前bed区域的倍性为杂合缺失；如果上述比值小于0.2，则当前bed区域的倍性为纯合缺失；如果上述比值位于7至1.3之间（即，大于或者等于0.7，且小于1.3），则当前bed区域的倍性为2倍体；以及如果上述比值在1.3至1.7之间（即，大于或者等于1.3，且小于1.7），则当前bed区域的倍性为3倍体。
关于预定占比阈值，其例如而不限于是断点区域bed数量的50%。例如，如果某一倍性的bed区域的占比高于断点区域bed数量的50%时，则该区域为该倍性。例如，3倍体的bed区域的占比高于高于断点区域bed数量50%的，则该靶向区域的倍性为3倍体。
以下表二示例性示出了利用传统的基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法的检测结果。以下表三示例性示出了利用本发明的基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法的检测结果。
在上述表二和表三中，表项“qPCR方法鉴定的地贫缺失类型”所指示的列信息指示各个样本编号所对应的样本实际鉴定的地贫缺失类型。表项“拷贝数”所对应的列信息指示“杂合/纯合的状态”。其中，“1”代表杂合。“0”代表纯合。以CN990编号的血液样本的“拷贝数变异类型”的检测结果为例，根据表二所指示的、依据传统方法所检测的“拷贝数变异类型”为“SEA杂合”，该检测结果与的实际鉴定的地贫缺失类型“SEA复合杂合4.2的缺失”不一致。表二中，实际鉴定的地贫缺失类型显示：样本编号CN990的血液样本的拷“拷贝数变异类型”属于复合类型，有纯合的，也有杂合的。传统的检测方法中，关于断点区域的检出数据是准确的，但是未检出纯合缺失区域。而根据表三指示的、依据本发明方法所检测的“拷贝数变异类型”为“α4.2 / SEA合”，该检测结果与的实际鉴定的地贫缺失类型“SEA复合杂合4.2的缺失”相一致，准确地检测出和纯合缺失区域、以及杂合缺失区域。
在上述方案中，通过使用过滤后的比对结果数据，统计各样本扩增子测序区域的整体均一性用以确定稳定扩增的靶向分析区域；基于稳定扩增的靶向分析区域的测序深度，构建对照集基线；以及基于预测模型所确定的待测样本的拷贝数变异的断点位置、以及所构建的对照集基线，生成关于待测样本的拷贝数变异的检测结果，本发明能够基于扩增子测序数据获得准确的拷贝数变异检测结果。实验数据表明，本发明相较于传统的方法（例如，直接使用CNVkit软件扩增子模式进行拷贝数变异检测）的检索结果，准确率提升50%。
图3示出了根据本发明的实施例的用于确定稳定扩增的靶向分析区域的方法300的流程图。应当理解，方法300例如可以在图6所描述的电子设备600处执行。也可以在图1所描述的计算设备110处执行。应当理解，方法300还可以包括未示出的附加动作和/或可以省略所示出的动作，本发明的范围在此方面不受限制。
在步骤302处，计算设备110以序列比对到参考基因组的起始位置和终止位置作为一个bed区域，统计每个bed区域内的序列覆盖数。例如， bed区域的序列覆盖数为N。
在步骤304处，计算设备110针对每个bed区域的序列覆盖数，使用待测样本的比对序列数量进行矫正，以便获得每个bed区域内的矫正后的序列覆盖数。例如，计算设备110对bed区域的序列覆盖数N使用各样本的比对序列数进行矫正，以便去除数据量差异对区间序列覆盖数的影响。
以下结合公式（3）示例性说明计算每个bed区域内的矫正后的序列覆盖数的算法。
Rn=N/M （3）
在上述公式（3）中，Rn代表每个bed区域内的经由矫正的序列覆盖数。N代表每个bed区域的序列覆盖数。M代表比对序列数。
在步骤306处，计算设备110基于经由均一性过滤的比对结果数据，提取阴性对照集中所有样本均有序列覆盖并且经由矫正的序列覆盖数差异小于预定矫正阈值的区域，以确定为稳定扩增的靶向分析区域。
关于预定矫正阈值，其例如而不限于是40%。
例如，计算设备110对阴性对照样本集（该阴性对照样本集例如是由多批次数据汇总形成，以便尽可能反映实验的多样性）的各样本分别统计，筛选均有reads覆盖且矫正后的Rn值的差异CV＜40%的bed区域，以便将所筛选的bed区域确定为稳定扩增的靶向分析区域。例如，将所筛选的bed区域标记为CNV target bed，以便基于CNV target bed进行后续的拷贝数变异分析。在一些实施例中，如果针对拷贝数变异的重要区域不满足上述要求，则建议优化扩增子试剂盒局部区域的稳定性。
应当理解，CNV的检测本身即是检测待测样本与对照集之间的拷贝数差异，在传统的检测方法中，扩增子本身的不稳定性容易导致待测样本与对照集之间的拷贝数差异的波动很大。上述波动来源于体系的原因，也来源于探针的设计原因。通过采用上述手段，使得本发明所筛选的区域在阴性样本中是稳定的。
以下表四示例性示出了本发明所提取的213例样本均有覆盖并且经由矫正的序列覆盖数差异小于40%的区域，以作为稳定扩增的靶向分析区域。
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在上述方案中，本发明可以通过确定稳定扩增的靶向分析区域，显著降低扩增子本身的不稳定性对拷贝数变异检测结果的影响，使得拷贝数变异检测结果更为准确。
图4示出了根据本发明的实施例的用于针对所确定的稳定扩增的靶向分析区域进行测序深度矫正的方法400的流程图。应当理解，方法400例如可以在图6所描述的电子设备600处执行。也可以在图1所描述的计算设备110处执行。应当理解，方法400还可以包括未示出的附加动作和/或可以省略所示出的动作，本发明的范围在此方面不受限制。
在步骤402处，计算设备110使用经由均一性过滤的比对结果数据，统计待测样本以及对照集样本在稳定扩增的靶向分析区域的每个bed区域的序列覆盖深度。
关于经由均一性过滤的比对结果数据，其例如是经由以下各步骤而获得的：计算设备110统计待测样本的T 20%X 覆盖率、Fold 80值，以便获取待测样本的扩增子测序区域的整体均一性；以及基于所获取的整体均一性与预定均一性阈值的比较结果，针对经过滤而留下的比对结果数据过滤，以获得经由均一性过滤的比对结果数据。
在步骤404处，计算设备110基于比对序列数、bed区域的数量、对待测样本以及对照集样本的平均测序深度进行矫正。
以下结合公式（4）和（5）示例性说明计算每个bed区域内的矫正后的平均测序深度的算法。
Ri=Ni/（Q/n）（4）
Mi=Ri/(median(Ri...Rn)) （5）
在上述公式（4）和（5）中，i代表bed区域的编号。Q代表待测样本的比对序列数。n代表bed区域的数量（即，bed区域总数）。Mi代表第i个bed区域矫正后的平均测序深度。Ri代表第i个bed区域的平均测序深度。Ni代表第i个bed区域的序列覆盖数。
在步骤406处，计算设备110使用局部多项回归方程矫正GC偏好、扩增子长度偏好，以获得矫正后的稳定扩增的靶向分析区域的标准化深度。在一些实施例中，多项回归方程例如是基于R语言的局部加权回归LOESS（locally weighted regression），即，R LOESS。
图5示出了根据本发明的实施例的用于基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法500的流程图应当理解，方法500例如可以在图6所描述的电子设备600处执行。也可以在图1所描述的计算设备110处执行。应当理解，方法500还可以包括未示出的附加动作和/或可以省略所示出的动作，本发明的范围在此方面不受限制。
在步骤502处，提取关于待测样本的不同样本类型的DNA，以使用扩增子测序试剂盒和测序平台进行测序文库的构建，以便生成关于待测样本的测序数据。
生成关于待测样本的测序数据的方法例如包括：提取样本DNA，并进行定量；使用多重PCR扩增引物，对目标区域进行扩增（即，第1轮PCR）；扩增结束后，使用0.9倍体积的磁珠，根据实验操作要求，对扩增产物进行纯化（即，磁珠纯化）；对上述获得的纯化后产物，根据illumina建库试剂盒的要求，对产物增加测序接头（即，第2轮PCR）；使用Qubit或者同类型仪器对文库浓度进行定量，使用Agilent DNA 1000 kit或者其它同功能试剂，对文库片段长度进行测定；以及使用Illumina Nextseq CN500二代测序平台进行高通量测序，以获得原始测序序列，即，基于扩增子测序数据。
在步骤504处，针对所生成的测序数据进行质量控制，以便生成经由预处理的测序数据。
关于针对所生成的测序数据进行质量控制的方法，其例如包括：过滤掉多位置比对的序列数据和比对质量值低于预定质量值的序列数据。例如，针对经由预处理的测序数据，使用数据质控软件进行初步质控（数据质控软例如而不限于包括：fastp、fastQC、trim-adpter等），其目的是将原始下机数据中，含有N的序列、低质量序列、含有接头的序列过滤掉，以获得高质量测序序列用于后续分析。例如，将原始测序数据使用fastp软件去除测序接头、低质量碱基（碱基质量<10），过滤长度小于40bp的序列，从而获得高质量可用数据。
在步骤506处，将经由预处理的测序数据与参考基因组的测序数据进行比对，以便获得比对结果数据。该比对结果数据至少指示每条序列在参考基因组上的位置信息。
例如，通过BWA软件的MEM算法，将步骤504处所生成的高质量可用数据与HG38标准参考基因组序列进行比对分析，获得每条序列在参考基因组序列上比对的位置信息，获得原始比对信息文件。
在步骤508处，针对比对结果数据，过滤掉满足预定过滤条件的测序数据。
例如，使用samtools软件过滤掉未比对上的序列、比对多个位置的序列以及比对质量值低于20的序列，以获得经过滤而留下的比对结果数据。
在步骤510处，基于经过滤而留下的比对结果数据，获取扩增子测序区域的整体均一性，以便基于所获取的整体均一性针对经过滤而留下的比对结果数据进行过滤，以得经由均一性过滤的比对结果数据。
例如，使用bamdst软件进行bam文件深度统计，根据上述获得的原始比对信息文件，统计样本的比对率、覆盖度以及T 20%X coverage rate(%)、以及统计每个样本的Fold80值，以便获取扩增子测序区域的整体均一性。然后，基于所获取的整体均一性与预定均一性阈值的比较结果，针对经过滤而留下的比对结果数据过滤，以获得经由均一性过滤的比对结果数据。例如，所统计的当前样本的Fold 80值＞3.3（例如3.3是多个预定均一性阈值中的与Fold 80值所对应的阈值），则过滤掉当前样本。
在步骤512处，确定稳定扩增的靶向分析区域。
应当理解，由于多重PCR在实际实验中，由于多因素影响，存在部分引物扩增不稳定，或引物间交叉扩增现象，为保证CNV检测的准确性，需要确定稳定扩增的区域。
关于确定稳定扩增的靶向区域的方法，其例如包括：以序列比对到参考基因组的起始位置和终止位置作为一个bed区域，统计每个bed区域内的序列覆盖数（相当于一个read的比对区域是一个bed区域），针对每个bed区域的序列覆盖数，使用待测样本的比对序列数量进行矫正，以便获得每个bed区域内的矫正后的序列覆盖数（相当于利用完全比对上的read数进行矫正）；基于经由均一性过滤的比对结果数据，提取阴性对照集中所有样本均有序列覆盖并且经由矫正的序列覆盖数差异小于预定矫正阈值的区域，以确定为稳定扩增的靶向分析区域。通过采用上述手段，可以使得去掉每个样本的数据量上的差异，使得整体的数据量一致。应当理解，本发明通过基于阴性对照样本的靶向区域筛选策略，为下游CNV的检测提供了稳定的基础。
在步骤514处，针对所确定的稳定扩增的靶向分析区域进行测序深度矫正。
例如，使用过滤后的比对信息文件，统计待测样本以及对照集样本在稳定扩增的靶向分析区域（CNV target bed 区域）内各bed区域的序列覆盖深度；然后，使用上文提及的方法400针对所有样本的平均深度进行矫正，以获得经由矫正的稳定扩增的靶向分析区域的测序深度。
在步骤516处，基于经由矫正的稳定扩增的靶向分析区域的测序深度，计算对照集样本中每个bed区域的均值以及标准差，以便构建对照集基线。
例如，基于步骤512获得的矫正后的靶向区域的深度，使用cnvkit 的reference模块，建立对照集样本训练集。在一些实施例中，针对性染色体，分性别单独建立对照集。
在步骤518处，基于用于预测待测样本的拷贝数变异的断点位置的预测模型、以及所构建得对照集基线，生成关于待测样本的拷贝数变异的检测结果。
例如，计算待测样本每个bed区域与对照集基线bed区域深度的均值比值（即，ratio值），如果ratio值为0.2~0.7之间的任一值，则对应bed区域为杂合缺失；如果ratio值＜0.2，则对应bed区域为纯合缺失；如果ratio值为0.7~1.3之间的任一值，则对应bed区域为2倍体；如果ratio值为1.3~1.7之间的任一值，则对应bed区域为3倍体。之后，统计断点区域内各倍性bed区域的比例，如果某一倍性的bed区域占比高于断点区域bed数量50%时，则该倍性作为整个区域的倍性。
在上述方案中，本发明能够在针对多重扩增子测序试剂盒的特点，系统的提供了一种基于靶向扩增子测序数据进行拷贝数变异检测分析方法，能够显著提高关于拷贝数变异的检测结果的准确性。
在一些实施例中，本发明还提供了一种基于靶向扩增子测序数据进行拷贝数变异检测分析的装置。该装置例如包括：下机数据质控模块、靶向区域筛选模块、靶向区域深度均一化模块、CNV检测模块。
在下机数据质控方面，本发明通过针对比对结果数据，过滤掉满足预定过滤条件的测序数据，以及基于经过滤而留下的比对结果数据，获取扩增子测序区域的整体均一性，以便基于所获取的整体均一性针对经过滤而留下的比对结果数据进行过滤，以获得经由均一性过滤的比对结果数据，由此，本发明在下机数据质控方面增加了覆盖均匀性的评估手段。
在靶向区域筛选模块方面，本发明以序列比对到参考基因组的起始位置和终止位置作为一个bed区域，针对每个bed区域的序列覆盖数，使用待测样本的比对序列数量进行矫正，以便获得每个bed区域内的矫正后的序列覆盖数；以及基于经由均一性过滤的比对结果数据，提取阴性对照集中所有样本均有序列覆盖并且经由矫正的序列覆盖数差异小于预定矫正阈值的区域，以确定为稳定扩增的靶向分析区域，因而，本发明在靶向区域筛选模块方面提出了基于阴性对照样本的靶向区域筛选策略，为下游CNV的检测提供了稳定的基础。
在靶向区域深度均一化模块方面，本发明使用经由均一性过滤的比对结果数据，统计待测样本以及对照集样本在稳定扩增的靶向分析区域的每个bed区域的序列覆盖深度；基于比对序列数、bed区域的数量、对待测样本以及对照集样本的平均测序深度进行矫正；以及使用局部多项回归方程矫正GC偏好、扩增子长度偏好，以获得矫正后的稳定扩增的靶向分析区域的标准化深度。
在CNV模块检测方面，本发明经由预测模型，预测模型用于预测待测样本的拷贝数变异的断点位置；计算待测样本每个bed区域与所构建得对照集基线bed区域的测序深度的均值的比值；将所计算的比值与预定比值阈值相比较，以便确定每个bed区域的倍性；以及统计断点区域内的各倍性bed区域的占比；以及基于所统计的各倍性的bed区域的占比与预定占比阈值的比较结果，确定靶向区域的倍性。因此，本发明提供了一种对拷贝数变异检测方法的矫正优化方法，显著提升了整体检出准确性。
图6示意性示出了适于用来实现本发明实施例的电子设备600的框图。电子设备600可以是用于实现执行图2至图5所示的方法200至500。如图6所示，电子设备600包括中央处理单元（即，CPU 601），其可以根据存储在只读存储器（即，ROM 602）中的计算机程序指令或者从存储单元608加载到随机访问存储器（即，RAM 603）中的计算机程序指令，来执行各种适当的动作和处理。在RAM 603中，还可存储电子设备600操作所需的各种程序和数据。CPU 601、ROM 602以及RAM 603通过总线604彼此相连。输入/输出接口（即，I/O接口605）也连接至总线604。
电子设备600中的多个部件连接至I/O接口605，包括：输入单元606、输出单元607、存储单元608，CPU 601执行上文所描述的各个方法和处理，例如执行方法200至500。例如，在一些实施例中，方法200至500可被实现为计算机软件程序，其被存储于机器可读介质，例如存储单元608。在一些实施例中，计算机程序的部分或者全部可以经由ROM 602和/或通信单元609而被载入和/或安装到电子设备600上。当计算机程序加载到RAM 603并由CPU 601执行时，可以执行上文描述的方法200至500的一个或多个操作。备选地，在其他实施例中，CPU 601可以通过其他任何适当的方式（例如，借助于固件）而被配置为执行方法200至500的一个或多个动作。
需要进一步说明的是，本发明可以是方法、装置、系统和/或计算机程序产品。计算机程序产品可以包括计算机可读存储介质，其上载有用于执行本发明的各个方面的计算机可读程序指令。
计算机可读存储介质可以是可以保持和存储由指令执行设备使用的指令的有形设备。计算机可读存储介质例如可以是但不限于电存储设备、磁存储设备、光存储设备、电磁存储设备、半导体存储设备或者上述的任意合适的组合。计算机可读存储介质的更具体的例子（非穷举的列表）包括：便携式计算机盘、硬盘、随机存取存储器（RAM）、只读存储器（ROM）、可擦式可编程只读存储器（EPROM或闪存）、静态随机存取存储器（SRAM）、便携式压缩盘只读存储器（CD-ROM）、数字多功能盘（DVD）、记忆棒、软盘、机械编码设备、例如其上存储有指令的打孔卡或凹槽内凸起结构、以及上述的任意合适的组合。这里所使用的计算机可读存储介质不被解释为瞬时信号本身，诸如无线电波或者其他自由传播的电磁波、通过波导或其他传输媒介传播的电磁波（例如，通过光纤电缆的光脉冲）、或者通过电线传输的电信号。
这里所描述的计算机可读程序指令可以从计算机可读存储介质下载到各个计算/处理设备，或者通过网络、例如因特网、局域网、广域网和/或无线网下载到外部计算机或外部存储设备。网络可以包括铜传输电缆、光纤传输、无线传输、路由器、防火墙、交换机、网关计算机和/或边缘服务器。每个计算/处理设备中的网络适配卡或者网络接口从网络接收计算机可读程序指令，并转发该计算机可读程序指令，以供存储在各个计算/处理设备中的计算机可读存储介质中。
用于执行本发明操作的计算机程序指令可以是汇编指令、指令集架构（ISA）指令、机器指令、机器相关指令、微代码、固件指令、状态设置数据、或者以一种或多种编程语言的任意组合编写的源代码或目标代码，该编程语言包括面向对象的编程语言—诸如Smalltalk、C++等，以及常规的过程式编程语言—诸如“C”语言或类似的编程语言。计算机可读程序指令可以完全地在用户计算机上执行、部分地在用户计算机上执行、作为一个独立的软件包执行、部分在用户计算机上部分在远程计算机上执行、或者完全在远程计算机或服务器上执行。在涉及远程计算机的情形中，远程计算机可以通过任意种类的网络—包括局域网(LAN)或广域网(WAN)—连接到用户计算机，或者，可以连接到外部计算机（例如利用因特网服务提供商来通过因特网连接）。在一些实施例中，通过利用计算机可读程序指令的状态信息来个性化定制电子电路，例如可编程逻辑电路、现场可编程门阵列（FPGA）或可编程逻辑阵列（PLA），该电子电路可以执行计算机可读程序指令，从而实现本发明的各个方面。
这里参照根据本发明实施例的方法、设备（系统）、和计算机程序产品的流程图和/或框图描述了本发明的各个方面。应当理解，流程图和/或框图的每个方框以及流程图和/或框图中各方框的组合，都可以由计算机可读程序指令实现。
这些计算机可读程序指令可以提供给语音交互装置中的处理器、通用计算机、专用计算机或其它可编程数据处理装置的处理单元，从而生产出一种机器，使得这些指令在通过计算机或其它可编程数据处理装置的处理单元执行时，产生了实现流程图和/或框图中的一个或多个方框中规定的功能/动作的装置。也可以把这些计算机可读程序指令存储在计算机可读存储介质中，这些指令使得计算机、可编程数据处理装置和/或其他设备以特定方式工作，从而，存储有指令的计算机可读介质则包括一个制造品，其包括实现流程图和/或框图中的一个或多个方框中规定的功能/动作的各个方面的指令。
也可以把计算机可读程序指令加载到计算机、其它可编程数据处理装置、或其它设备上，使得在计算机、其它可编程数据处理装置或其它设备上执行一系列操作步骤，以产生计算机实现的过程，从而使得在计算机、其它可编程数据处理装置、或其它设备上执行的指令实现流程图和/或框图中的一个或多个方框中规定的功能/动作。
附图中的流程图和框图显示了根据本发明的多个实施例的设备、方法和计算机程序产品的可能实现的体系架构、功能和操作。在这点上，流程图或框图中的每个方框可以代表一个模块、程序段或指令的一部分，该模块、程序段或指令的一部分包含一个或多个用于实现规定的逻辑功能的可执行指令。在有些作为替换的实现中，方框中所标注的功能也可以以不同于附图中所标注的顺序发生。例如，两个连续的方框实际上可以基本并行地执行，它们有时也可以按相反的顺序执行，这依所涉及的功能而定。也要注意的是，框图和/或流程图中的每个方框、以及框图和/或流程图中的方框的组合，可以用执行规定的功能或动作的专用的基于硬件的系统来实现，或者可以用专用硬件与计算机指令的组合来实现。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
以上仅为本发明的可选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等效替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于扩增子测序数据检测拷贝数变异的方法，其特征在于，包括：
将经由预处理的测序数据与参考基因组的测序数据进行比对，以便获得比对结果数据，所述测序数据经由扩增子测序技术获得；
针对比对结果数据，过滤掉满足预定过滤条件的测序数据；
基于经过滤而留下的比对结果数据，获取扩增子测序区域的整体均一性，以便确定稳定扩增的靶向分析区域；
基于稳定扩增的靶向分析区域的测序深度，构建对照集基线；以及
基于预测模型所确定的待测样本的拷贝数变异的断点位置、以及所构建的对照集基线，生成关于待测样本的拷贝数变异的检测结果，
其中确定稳定扩增的靶向分析区域包括：
以序列比对到参考基因组的起始位置和终止位置作为一个bed区域，统计每个bed区域内的序列覆盖数；
针对每个bed区域的序列覆盖数，使用待测样本的比对序列数量进行矫正，以便获得每个bed区域内的矫正后的序列覆盖数；
基于所获取的整体均一性，针对经过滤而留下的比对结果数据进行过滤，以便获得经由均一性过滤的比对结果数据；以及
基于经由均一性过滤的比对结果数据，提取阴性对照集中所有样本均有序列覆盖并且经由矫正的序列覆盖数差异小于预定矫正阈值的区域，以确定为稳定扩增的靶向分析区域。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生成关于待测样本的拷贝数变异的检测结果包括：
经由预测模型，确定待测样本的拷贝数变异的断点位置；
计算待测样本每个bed区域的测序深度与所构建的对照集基线bed区域的测序深度的均值的比值；
将所计算的比值与预定比值阈值相比较，以便确定每个bed区域的倍性；
统计断点区域内的各倍性bed区域的占比；
确定所统计的各倍性的bed区域的占比是否大于或者等于预定占比阈值；以及
响应于确定当前倍性的bed区域的占比大于或者等于预定占比阈值，确定所述稳定扩增的靶向分析区域的倍性为当前倍性。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，获得经由均一性过滤的比对结果数据包括：
统计待测样本的T 20%X 覆盖率、Fold 80值，以便获取待测样本的扩增子测序区域的整体均一性；以及
基于所获取的整体均一性与预定均一性阈值的比较结果，针对经过滤而留下的比对结果数据过滤，以获得经由均一性过滤的比对结果数据。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，满足预定过滤条件的测序数据包括：多位置比对的序列数据和比对质量值低于预定质量阈值的序列数据。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于稳定扩增的靶向分析区域的测序深度构建对照集基线包括：
针对所确定的稳定扩增的靶向分析区域进行测序深度矫正；以及
基于经由矫正的靶向区域的测序深度，计算对照集样本中每个bed区域的均值以及标准差，以便构建对照集基线。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，针对所确定的稳定扩增的靶向分析区域进行测序深度矫正包括：
使用经由均一性过滤的比对结果数据，统计待测样本以及对照集样本在稳定扩增的靶向分析区域的每个bed区域的序列覆盖深度；
基于比对序列数、bed区域的数量、对待测样本以及对照集样本的平均测序深度进行矫正；以及
使用局部多项回归方程矫正GC偏好、扩增子长度偏好，以获得矫正后的稳定扩增的靶向分析区域的标准化深度。
7.一种计算设备，其特征在于，包括：
至少一个处理单元；
至少一个存储器，所述至少一个存储器被耦合到所述至少一个处理单元并且存储用于由所述至少一个处理单元执行的指令，所述指令当由所述至少一个处理单元执行时，使得所述设备执行根据权利要求1至6任一项所述的方法的步骤。
8.一种计算机可读存储介质，其特征在于，计算机可读存储介质上存储有计算机程序，所述计算机程序被机器执行时实现根据权利要求1至6中任一项所述的方法。
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