CN116368231A - 增加小麦籽粒中的纤维的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及用于具有增加的膳食纤维的小麦的方法。公开了通过在小麦醇溶蛋白盒结合因子中提供突变来增加膳食纤维的方法。

Description

增加小麦籽粒中的纤维的方法

本申请要求2020年9月7日提交的美国临时专利申请序列号63/075,278的优先权，其全部内容通过引用在此并入。

这项发明是在美国国立卫生研究院授予的DK097976下在政府支持下完成的。政府对本发明具有一定权利。

技术领域

本文公开了用于提供具有增加的纤维含量的小麦的方法和组合物。

背景技术

小麦是一种重要的和战略性谷类作物，并且是大约20亿人(占世界人口的36％)的最重要的主食。在世界范围内，小麦提供了近55％的碳水化合物和20％的消耗食物卡路里。小麦在种植面积和产量上超过了所有其他籽粒作物(包括水稻、玉米等)并在广泛的气候条件下栽培。

小麦基因组是人类基因组的五倍，并且是水稻基因组的四十倍。此外，面包小麦(普通小麦(Triticum aestivum))是六倍体，在每个细胞核中有三个完整的基因组，称为A、B和D。硬粒小麦(硬粒小麦(Triticum durum)或圆锥小麦(Triticum turgidum)硬粒小麦亚种)是具有商业重要性的主要四倍体小麦品种，如今被广泛栽培。硬粒小麦有两个完整的基因组，A和B，并且广泛用于制作意大利面食。

当前世界上许多地区的问题是超重或肥胖的成人和儿童越来越普遍。根据FDA的数据，美国几乎40％的成年人肥胖，并且70％超重或肥胖。经常建议在饮食中增加纤维以帮助促进减肥，减少肥胖，降低冠心病和结肠癌的风险，并且改善整体健康。膳食纤维的一些生理作用包括降低血压、胆固醇和血糖水平。纤维也有助于促进饱腹感，并且通过增加排便和矿物质吸收来改善肠道健康。膳食纤维的来源包括籽粒，如小麦。

需要增加纤维的消耗以对抗肥胖症，降低其他类型疾病的发病率，并且提供纤维带来的通便和其他益处。因为其在许多消费者的饮食中很普遍，从而增加小麦的纤维含量将有助于增加总的纤维消耗。尽管很久以来就感觉到了这种需要，但是增加小麦纤维含量的方法的鉴定进展缓慢，因为除了其他可能的原因之外，在如今的商业小麦栽培品种中遗传多样性有限，小麦基因组复杂，并且已知增加小麦中的纤维的方法很少。

本申请旨在克服现有技术中的这些和其他缺陷。

附图说明

图1显示了小麦(WPBF_A(SEQ ID NO:3)、WPBF_D(SEQ ID NO:6)和WPBF_B(SEQ IDNO:9))和大麦(SEQ ID NO:12)的小麦醇溶蛋白盒结合因子(“Wheat Prolamin-boxBinding Factor；WPBF”)的蛋白质序列比对。结合单锌指的DNA(“DNAbinding with onefinger；DoF”)结构域用方框标出，并且高度保守的残基用粗体表示。

图2是来自WPBF高纤维突变体品系(WPBF20A和20B)的小麦籽粒与来自野生型对照(WPBF21)的籽粒以及来自常规北部平原或Express品种的籽粒相比较的摄影图像。

发明内容

本申请的一个方面涉及一种增加小麦籽粒中的纤维的方法。所述方法涉及提供包含小麦醇溶蛋白盒结合因子(WPBF)基因的小麦植株或植株部分，并且将人诱导的突变引入WPBF基因中，其中所述突变有效地产生如下小麦植株，所述小麦植株能够产生与来自没有突变的小麦植株的小麦籽粒相比具有增加的纤维的小麦籽粒。

本申请的另一方面涉及一种产生膳食纤维的方法。所述方法涉及提供包含在小麦醇溶蛋白盒结合因子(WPBF)基因中的人诱导的突变的小麦植株，其中所述突变使得小麦植株产生与没有突变的小麦植株相比具有增加的纤维的籽粒，并且从所述小麦植株的籽粒中获得纤维。

本申请的另一方面涉及一种能够产生具有提高的纤维含量的籽粒的小麦植株，所述小麦植株包含在小麦醇溶蛋白盒结合因子(WPBF)基因中的人诱导的突变，其中所述突变与来自没有所述突变的小麦植株的籽粒相比有效地提高了小麦植株的籽粒中的纤维。

本申请的另一方面涉及一种选择具有高纤维含量的小麦籽粒的方法。所述方法涉及将人诱导的突变引入小麦植株或植株部分中，从而产生具有突变的小麦植株，其中小麦植株产生籽粒。所述方法还涉及从所产生的小麦植株中鉴定出胚大于来自野生型小麦植株的小麦籽粒的胚的籽粒，并且选择具有较大胚的籽粒作为具有较高纤维含量的小麦籽粒。

本发明人发现了通过突变和修饰基因来增加小麦的膳食纤维组分的方法，这些基因以前从未被认为或知道参与产生具有增加的膳食纤维的籽粒。本文令人惊讶地显示，WPBF基因的突变增加了小麦籽粒和面粉中的纤维含量。出乎意料的是，在突变植株的小麦籽粒中增加的一种纤维组分被鉴定为抗性淀粉，这是一种不容易消化成葡萄糖而是保留到下消化道(在那里发酵)的淀粉形式。

具体实施方式

本申请的第一方面涉及一种增加小麦籽粒中的纤维的方法。所述方法涉及提供包含小麦醇溶蛋白盒结合因子(WPBF)基因的小麦植株或植株部分，并且将人诱导的突变引入WPBF基因中，其中所述突变有效地产生如下小麦植株，所述小麦植株能够产生与来自没有突变的小麦植株的小麦籽粒相比具有增加的纤维的小麦籽粒。

如本文所使用，“纤维”包括具有3个或更多个单体单元的不可消化的可溶性和不溶性碳水化合物。在小麦中，纤维在被称为麸皮的籽粒外层中含量丰富，并且包括阿拉伯木聚糖和纤维素。除麸皮外，在淀粉胚乳的细胞壁中也发现了阿拉伯木聚糖。果聚糖是小麦中的膳食纤维的另一种组分，占籽粒的约1％-2.5％。果聚糖是快速消化的含有果糖的短寡糖聚合物。β-葡聚糖是一种由D-葡萄糖单体通过β-糖苷键连接的多糖，占小麦纤维的<1％。传统品种中淀粉的次要组分(<1％)抗消化，被认为是一种称为抗性淀粉的理想的膳食纤维。

小麦醇溶蛋白盒结合因子(WPBF)(结合单锌指的DNA(DoF)转录因子)在种子发育期间作为醇溶蛋白基因表达的活化剂。WPBF是储存蛋白基因表达的活化剂。在中央胚乳发育期间，编码储存蛋白的基因的转录通过需要结合特定DNA基序(包括胚乳盒(“EB”)和ACAA基序)的转录因子的途径而在时间和空间上受到调节。EB具有两个不同的蛋白结合位点：GCN4样基序和醇溶蛋白盒。

Dof蛋白是具有高度保守的DNA结合结构域的植物转录因子。由约50-60个氨基酸残基构成的Dof结构域类似于GATA1和类固醇激素受体的Cys2/Cys2锌指DNA结合结构域，但与锌指结构域相比具有更长的推定环。

大麦醇溶蛋白盒结合因子中最近发现的突变被证明是突变体lys3a中高赖氨酸含量和低大麦醇溶蛋白(hordein)(种子储存蛋白)表型的原因(Moehs等人,“Development ofDecreased-Gluten Wheat Enabled by Determination of the Genetic Basis of lys3aBarley,”Plant Phys.179:1692-1703(2019)，其通过引用整体在此并入)。具有在LYS3中的突变的其他大麦品系最近被测序(Orman-Ligeza等人“LYS3 encodes aProlamin-Box-Binding Transcription Factor that controls Embryo Growth in Barley andWheat,”Journal of Cereal Science 93:102965(2020)，其通过引用整体在此并入)。大麦lys3突变体中的一种M1460(lys3d)最初是基于减少的β-葡聚糖表型进行选择的(Aastrup,“Selection and Characterization of Lowβ-Glucan Mutants from Barley,”CarlsbergRes.Commun.48:307-316(1983)，其通过引用整体在此并入)。

小麦WPBF基因编码类似于大麦LYS3(SEQ ID NO:12)的蛋白质，如图1的比对中所显示。在面包小麦中，已经报道了具有在所有三个WPBF基因(WPBF_A(SEQ ID NO:1)、WPBF_B(SEQ ID NO:4)和WPBF_D(SEQ ID NO:7))中的组合突变的籽粒具有减少的种子储存蛋白，如醇溶蛋白和低分子量谷蛋白，并且还具有大的胚(参见Moehs等人,“Development ofDecreased-Gluten Wheat Enabled by Determination of the Genetic Basis of lys3aBarley,”Plant Phys.179:1692-1703(2019)；Orman-Ligeza等人,“LYS3 encodes aProlami n-Box-Binding Transcription Factor that controls Embryo GrowthinBarley and Wheat,”Journal of Cereal Science 93:102965(2020)，其通过引用整体在此并入)。然而，这些报道中没有一个将突变WPBF作为增加小麦籽粒的膳食纤维含量的方法。

如本文所使用，术语“增加(increasing)”、“增加的(increased)”、“减少的”、“抑制”等被认为是相对术语，即与野生型或未改变的状态相比。蛋白质的“水平”是指特定蛋白质(例如WPBF)的量，其可以通过本领域已知的任何方法测量，如例如蛋白质印迹分析、其他免疫学方法或质谱法。如本文所使用，“转录因子(“TF”)活性”是指TF活化其靶基因转录的程度。

如本文所使用，“WPBF活性”可以通过下列特征中的一种或多种来度量：(1)WPBF活化转录的程度；(2)WPBF结合DNA的程度；(3)WPBF与共活化剂和/或其他转录调节复合物结合的程度；和(4)WPBF与DNA结合的稳定性。应理解，突变体中WPBF活性的水平或转录因子活性的水平可能会改变，但蛋白质本身的表达水平(量)不会改变。相反，如果产生或多或少的活性蛋白质，那么蛋白质的量可能改变，但活性保持不变。

蛋白质和蛋白质活性的水平的降低也是可能的，例如当编码酶的基因失活时。在某些实施方案中，与未修饰小麦的胚乳中的蛋白质或活性的水平相比，蛋白质或活性的水平降低至少10％或至少20％或至少30％或至少40％或至少50％，或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％或至少95％。在某些实施方案中，蛋白质或活性的水平降低100％。在一些实施方案中，蛋白质或蛋白质活性的水平是不可检测的。蛋白质或基因表达的水平或WPBF活性的水平或转录因子活性的水平的降低可发生在籽粒发育的任何阶段，特别是在籽粒灌浆阶段期间，或在籽粒发育至成熟的所有阶段。

如本文所使用，术语“等位基因”是基因的一种或多种替代形式中的任一种，其都与一种性状或特征相关。在二倍体细胞或有机体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的相应基因座。在四倍体或六倍体细胞或生物体(如小麦)中，一个基因组上的给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的相应基因座，并且占据另一基因组(如四倍体的A基因组或B基因组，或六倍体小麦的A基因组、B基因组或D基因组)上的相同基因座的同一基因的两个等位基因被认为与第一基因组的基因同源，并且存在于同源染色体上。

如本文所使用，氨基酸或核苷酸序列同一性和相似性由被比较的两个序列之间的最佳全局比对来确定。使用例如尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)可以实现最佳的全局比对(Needleman和Wunsch,“A General Method Applicable to the Searchfor Similarities in the Amino Acid Sequence of Two Proteins,”J.Mol.Biol.48:443-453(1970)，其通过引用整体在此并入)。序列也可以使用本领域已知的算法进行比对，包括但不限于CLUSTAL V算法或BLASTN或BLAST 2序列程序。

如本文所使用，“同一性”是指第一多肽或多核苷酸中特定位置处的氨基酸或核苷酸与第二多肽或多核苷酸中的相应氨基酸或核苷酸相同，所述第二多肽或多核苷酸与第一多肽或多核苷酸处于最佳的全局比对。与同一性形成对比，“相似性”包括保守取代的氨基酸。“保守”取代是在Blosum62取代矩阵中具有正分数的任何取代(Henikoff和Henikoff,“Amino Acid Substitution Matrices from Protein Blocks,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919(1992)，其通过引用整体在此并入)。

如本文所使用，术语“植株”是指未成熟或成熟的完整植株，包括已经去除种子或籽粒或花药的植株。将产生植株的种子或胚也被认为是植株。

如本文所使用，术语“植株部分”包括植株原生质体、可从中再生小麦植株的植株细胞组织培养物、植株愈伤组织、植株团块和植株或植株部分中完整的植株细胞，如胚、花粉、胚珠、果皮、种子、花、小花、头、穗、叶、根、根尖、花药等。

如本文所使用，术语“多肽”指包含通过肽键或经修饰的肽键相互接合的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。多肽既指通常称为肽、寡肽和寡聚体的短链，也指通常称为蛋白质的长链。多肽可能含有除20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。多肽包括通过自然过程(如加工和其他翻译后修饰)以及化学修饰技术修饰的多肽。这种修饰在基础教科书和更详细的专著以及大量的研究文献中有很好的描述，并且其是本领域技术人员所熟知的。应理解，相同类型的修饰可以相同或不同的程度存在于给定多肽的几个位点中。

如本文所使用，术语“多核苷酸”或“核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。此定义包括但不限于单链和双链DNA；单链和双链区域或单链、双链和三链区域的混合物的DNA；cDNA；单链和双链RNA；以及单链和双链区域的混合物的RNA；包含DNA和RNA的杂合分子，所述杂合分子可以是单链或更典型地是双链或三链区域，或是单链和双链区域的混合物。术语多核苷酸还包括短核苷酸或片段，通常称为寡核苷酸，其由于诱变而不是100％相同的，但编码相同的氨基酸序列。

术语“功能降低”是指编码与整个核酸序列的蛋白编码序列相比具有降低的生物活性的WPBF蛋白的核酸序列。换句话说，其是指基本上保留了编码本申请的WPBF多肽的能力，但是所编码的WPBF多肽具有降低的活性的核酸或其片段。

如本文所使用，术语“片段”是指多核苷酸序列(例如，PCR片段)，其是人工构建的(例如，通过化学合成)或通过使用限制性内切核酸酶或机械剪切将天然产物裂解成多个片段的主题核酸的分离部分，或是通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸的一部分。

如本文所使用，单核苷酸多态性(“SNP”)是根据作为转换(C/T或G/A)或颠换(C/G、A/T、C/A或T/G)的核苷酸取代，两个DNA之间的单核苷酸碱基差异。其他类型的突变包括插入、缺失、易位及其任意组合。插入和缺失的范围可以从1个以上到数千个碱基。

如本文所使用，“转基因”植物是指含有相同物种、品种或栽培品种的野生型植株中未发现的基因构建体(“转基因”)的植物。转基因在生物技术领域具有通常的含义，并且包括通过重组DNA或RNA技术产生或改变的遗传序列，并且已经被引入植物细胞中。转基因可以包括来自植物细胞的遗传序列。典型地，通过人工操作(如通过转化)将转基因引入植物中，但是如本领域技术人员所认识，可以使用任何方法。

如本文所使用，“非转基因”或“修饰的”植物是指具有非转基因突变的植物，或经历了基因组编辑的植物，或其组合。如本文所使用，“修饰的WPBF基因”包括通过非转基因突变或转基因或基因组编辑或其组合对WPBF基因的修饰。“人诱导的”突变是指通过化学诱变或基因组修饰引入的突变。

小麦植株在本文中定义为商业栽培的小麦(Triticum)的种的任何植物，包括例如普通小麦(Triticum aestivum L.ssp.aestivum)(普通小麦或面包小麦)、普通小麦的其他亚种、硬粒小麦(Triticum turgidum L.ssp.Durum)(硬粒小麦，也称为通心粉或意大利面食小麦)、单粒小麦(Triticum monococcum L.ssp.monococcum)(栽培的单粒小麦(einkorn)或小斯卑尔脱小麦(small spelt))、提莫菲维小麦(Triticum timopheevissp.Timopheevi)、四倍体二粒小麦(Triticum turgidum L.ssp.dicoccon)(栽培的二粒小麦(emmer))和硬粒小麦的其他亚种(Feldman)。小麦可以是具有AABBDD型基因组的六倍体小麦，或具有AABB型基因组的四倍体小麦。由于小麦中的遗传变异通过杂交转移到某些相关种，包括黑麦和大麦，因此本申请还包括由此形成的杂交种，包括黑小麦，其是面包小麦和黑麦的杂交种。在一个实施方案中，小麦植株属于普通小麦种，并且优选属于普通小麦亚种。在另一实施方案中，小麦植株是硬粒小麦种。此外，突变或转基因可以容易地从普通小麦转移到硬粒小麦。

如本文所使用，术语“大麦”是指大麦属(Hordeum)的任何种，包括其祖先以及通过与其他物种杂交产生的后代。大麦的优选形式是大麦(Hordeum vulgare)种。大麦LYS3氨基酸序列如下所示(GenBank登录号MN715387，其通过引用整体在此并入)SEQ ID NO:12：

本申请描述了与小麦植株基因组中不包含外源核酸的野生型小麦植株相比，表现出具有增加的纤维的籽粒的小麦植株。在一个实施方案中，本申请涉及一个或多个WPBF基因中的非转基因人诱导的突变。

在另一实施方案中，本申请涉及在一个或多个WPBF基因中引入一系列独立的人诱导的突变；具有在其至少一个WPBF基因中的一个或多个这些突变的小麦植株；以及在小麦的至少一个WPBF基因中产生和鉴定相似和/或额外突变以获得纤维量增加的小麦籽粒的方法。

在另一实施方案中，本申请涉及具有降低WPBF基因的表达和/或WPBF蛋白的活性的转基因的转基因小麦植株，其中所述转基因有助于产生与来自野生型植株的籽粒相比具有增加的纤维的籽粒。

在另一实施方案中，本申请涉及具有经修饰的WPBF基因的小麦植株，其中WPBF基因通过基因组编辑被修饰，并且进一步，其中所述修饰有助于产生与来自野生型植株的籽粒相比具有增加的纤维的籽粒。

在一个实施方案中，本申请涉及通过人诱导的突变、转基因或基因组编辑来修饰WPBF基因。

在一个实施方案中，本申请涉及WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变。在一个实施方案中，本申请涉及WPBF基因中的多个人诱导的突变，包括但不限于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个和多于10个突变。

在另一实施方案中，WPBF基因可以包含表1-3中列举的一个或多个人诱导的突变和同源物中的相应突变及其组合。

在另一实施方案中，本申请涉及在相应的同源物中的WPBF基因中的本文公开的一个或多个人诱导的突变的相应突变。例如，在A基因组的WPBF基因中鉴定的突变也可能是B基因组和/或D基因组的WPBF基因中的有益突变。本领域普通技术人员将理解，同源物中的突变可能不在完全相同的位置中。

在一些实施方案中，本申请涉及将突变引入A基因组、B基因组或D基因组的WPBF基因的方法。在一些实施方案中，本申请涉及将突变引入A基因组和B基因组的WPBF基因中的每一个中的方法。在一些实施方案中，本申请涉及将突变引入A基因组和D基因组的WPBF基因中的每一个中的方法。在一些实施方案中，本申请涉及将突变引入B基因组和D基因组的WPBF基因中的每一个中的方法。在一些实施方案中，本申请涉及将突变引入A基因组、B基因组和D基因组的WPBF基因中的每一个中的方法。

本领域普通技术人员理解，不同小麦品种中的WPBF基因的遗传序列可能存在天然变异。

本发明人已经确定，为了在来自植株的籽粒中实现增加的纤维，降低WPBF基因功能的突变是合乎需要的。在一些实施方案中，突变是功能缺失突变。短语“功能缺失突变”是指失活突变，其通常导致基因产物与野生型基因产物相比具有较少或没有功能。功能缺失突变包括过早截断来自信使RNA的一种或多种WPBF蛋白的翻译的突变，如在WPBF信使RNA的编码区内产生终止密码子的突变(无义突变)。功能缺失突变还包括将编码序列抛出阅读框的剪接连接点，以及改变阅读框的插入和缺失。不改变阅读框(如错义突变)但改变DoF结构域中高度保守的氨基酸的其他突变被认为是功能缺失突变。DoF结构域的最高度保守残基在图1中以粗体显示。

1.A基因组

在一个实施方案中，本申请涉及A基因组的WPBF基因中的人诱导的突变，包括但不限于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个和多于10个突变。在一个实施方案中，一个或多个人诱导的突变存在于A基因组中的WPBF基因的两个等位基因中。在另一实施方案中，人诱导的突变在A基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。在一个实施方案中，突变是纯合的。

表1-3中鉴定的下列突变是根据本文公开的各种实施方案产生和鉴定的突变的示例。其是作为说明而非限制来提供的。应理解，下面的突变仅仅是示例性的，并且也考虑了类似的突变。

SEQ ID NO.1：小麦醇溶蛋白盒结合因子(WPBF)A基因组(核苷酸序列在不同的小麦栽培品种-不同的等位基因中可能有非常微小的差异)：

SEQ ID NO:2小麦醇溶蛋白盒结合因子(WPBF)A基因组编码区：

SEQ ID NO.3：WPBF-A基因组氨基酸序列：

表1提供了A基因组中的WPBF基因的代表性突变的列表。一个示例性突变是G41A，导致在根据其在SEQ ID NO:2序列中的位置鉴定的核苷酸位置41处从鸟嘌呤变为腺嘌呤。这种突变导致在根据其在表达蛋白中的位置(SEQ ID NO:3)鉴定的氨基酸位置14处从甘氨酸变为天冬氨酸。

表1：A基因组中的WPBF基因的代表性突变

/>

/>

/>

在一个实施方案中，本申请涉及A基因组中的WPBF基因的多核苷酸，其具有表1中列出的一个或多个人诱导的突变，并且对应于SEQ ID NO:2。在另一实施方案中，表1中列出的具有一个或多个人诱导的突变的多核苷酸与SEQ ID NO:2具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性。

在另一实施方案中，具有表1中列出的一个或多个人诱导的突变的多核苷酸编码WPBF蛋白，其中WPBF蛋白包含一个或多个人诱导的突变，并且与SEQ ID NO:3具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性。

2.B基因组

在一个实施方案中，本申请涉及B基因组的WPBF基因中的人诱导的突变，包括但不限于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个和多于10个突变。在一个实施方案中，一个或多个人诱导的突变存在于B基因组中的WPBF基因的两个等位基因中。在另一实施方案中，人诱导的突变在B基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。在另一实施方案中，突变是纯合的。

SEQ ID NO:4WPBF-B基因组：

SEQ ID NO.5：WPBF-B基因组编码序列：

SEQ ID NO.6WPBF-B基因组氨基酸序列：

表2提供了小麦植株Kronos和Express的B基因组的WPBF基因中的突变的代表性列表。核苷酸和氨基酸变化分别根据其在SEQ ID NO:5和6中的位置来鉴定。“*”指示终止密码子。

表2.B基因组的WPBF基因中的代表性突变

/>

/>

/>

/>

/>

在一个实施方案中，本申请涉及B基因组中的WPBF基因的多核苷酸，其具有表2中列出的一个或多个人诱导的突变，并且对应于SEQ ID NO:5。在另一实施方案中，具有表2中列出的一个或多个人诱导突变的多核苷酸与SEQ ID NO:5具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性。

在另一实施方案中，具有表2中列出的一个或多个人诱导的突变的多核苷酸编码WPBF蛋白，其中WPBF蛋白包含一个或多个人诱导的突变，并且与SEQ ID NO:6具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性。

3.D基因组

在一个实施方案中，本申请涉及D基因组的WPBF基因中的人诱导的突变，包括但不限于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个和多于10个突变。在一个实施方案中，一个或多个人诱导的突变存在于D基因组中的WPBF基因的两个等位基因中。在另一实施方案中，人诱导的突变在D基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

SEQ ID NO:7WPBF-D基因组：

SEQ ID NO.8:WPBF-D编码序列：

SEQ ID NO.9:WPBF-D氨基酸序列

表3提供了在小麦植株Express的D基因组中的WPBF基因中产生和鉴定的突变的代表性实例。核苷酸和氨基酸变化分别根据其在SEQ ID NO:8和9中的位置来鉴定。

表3.D基因组的WPBF基因中的突变的代表性列表

/>

/>

/>

/>

在一个实施方案中，本申请涉及D基因组中的WPBF基因的多核苷酸，其具有表3中列出的一个或多个人诱导的突变，并且对应于SEQ ID NO:8。在另一实施方案中，多核苷酸具有表3中列出的一个或多个人诱导的突变，并且与SEQ ID NO:8具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性。

在另一实施方案中，具有表3中列出的一个或多个人诱导的突变的多核苷酸编码WPBF蛋白，其中WPBF蛋白包含一个或多个人诱导的突变，并且与SEQ ID NO:9具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性。

4.Dof区

在一个实施方案中，本申请涉及A基因组、B基因组或D基因组的WPBF基因的Dof区中的多个人诱导的突变。在一个实施方案中，本申请涉及A基因组和B基因组的WPBF基因的Dof区中的多个人诱导的突变。在一个实施方案中，本申请涉及A基因组和D基因组的WPBF基因的Dof区中的多个人诱导的突变。在一个实施方案中，本申请涉及B基因组和D基因组的WPBF基因的Dof区中的多个人诱导的突变。

在另一个实施方案中，本申请涉及如WPBF基因的SEQ ID NO.10中所示的Dof区中的一个或多个人诱导的突变。

在另一实施方案中，本申请涉及如WPBF蛋白的SEQ ID NO.11中所示的Dof区中的一个或多个人诱导的突变。SEQ ID NO.11中所示的63个氨基酸中的一个或多个可以被突变。

WPBF基因的SEQ ID NO:10Dof区

WPBF蛋白的SEQ ID NO:11Dof区

WPBF蛋白

本申请涉及WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变，其产生与野生型WPBF蛋白相比具有一个或多个突变的WPBF蛋白。在一个实施方案中，人诱导的突变包括但不限于表1-3中列举的突变、同源物中的相应突变及其组合。

在另一实施方案中，本申请涉及抑制WPBF蛋白产生的WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变。在一些实施方案中，WPBF基因中的突变降低了WPBF蛋白的表达。在其他实施方案中，WPBF基因中的突变产生不稳定的或功能降低的WPBF蛋白。

1.WPBF蛋白的表达水平

在另一实施方案中，具有本文公开的一个或多个突变的WPBF蛋白的表达水平被降低了野生型WPBF蛋白的表达水平的0-2％、2-5％、5-7％、7-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％或95-99％。

在又一实施方案中，与野生型WPBF蛋白的表达水平相比，具有本文公开的一个或多个突变的WPBF蛋白的表达水平被降低了10-20％、或20-30％、或30-40％、或40-50％、或50-60％、或60-70％、或70-80％、或80-90％、或90-99％。

2.WPBF蛋白的活性

在另一实施方案中，具有本文公开的一个或多个突变的WPBF蛋白的活性被降低至野生型WPBF蛋白的活性水平的0-1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％。在另一实施方案中，与野生型WPBF蛋白相比，本文公开的具有一个或多个突变的WPBF蛋白没有活性或活性为零。

在另一实施方案中，本文公开的具有一个或多个突变的WPBF蛋白的活性是野生型WPBF蛋白的活性水平的1-10％或10-30％或30-50％或50-70％或70-80％或80-90％或90-95％。

在一个实施方案中，本申请涉及包含编码多核苷酸的转基因的转基因植物，所述多核苷酸下调WPBF基因的表达和/或WPBF蛋白的活性。这种多核苷酸的实例包括但不限于反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、人工微小RNA或双链体RNA分子。在一个实施方案中，本申请涉及包含降低WPBF基因的表达和/或WPBF蛋白的活性的转基因的小麦植株，其中所述小麦植株与来自野生型植株的籽粒相比具有增加的纤维籽粒。

在一个实施方案中，本申请涉及具有降低的WPBF基因表达和/或降低的WPBF蛋白活性的植株，其中通过基因组编辑实现降低的WPBF基因表达和/或降低的WPBF蛋白活性。在一个实施方案中，本申请涉及具有基因组编辑的WPBF基因的小麦植株，其中所述小麦植株与野生型植株相比具有增加的纤维籽粒。在一个实施方案中，本申请涉及具有基因组编辑的WPBF基因的小麦籽粒，其中所述小麦籽粒与野生型籽粒相比具有增加的纤维。在一个实施方案中，将人诱导的突变引入WPBF基因的方法通过基因组编辑来进行。

基因组编辑是一种类型的遗传工程，其中使用人工工程化核酸酶或“分子剪刀”将DNA插入、替换或从基因组中去除。核酸酶在基因组中的所需位置处产生特异性双链断裂(“DSB”)，并且利用细胞的内源性机制通过同源重组(“HR”)和非同源末端接合(“NHEJ”)的自然过程修复诱导的断裂。目前使用的工程化核酸酶主要有四个家族：锌指核酸酶(“ZFN”)、转录活化因子样效应物核酸酶(“TALEN”)、CRISPR/Cas系统和具有重新工程化的归巢核酸内切酶的工程化大核酸酶。

成簇的规则间隔的短回文重复序列(“CRISPR”)II型系统是用于基因组工程化的RNA引导的核酸内切酶技术。此系统有两个不同的组分：(1)向导RNA和(2)基因组编辑核酸内切酶，在这种情况下是CRISPR相关(“Cas”)核酸酶。

当向导RNA和基因组编辑核酸内切酶在细胞中表达时，基因组靶序列可以被修饰或永久破坏。通过基因组DNA中向导RNA序列和靶序列的互补序列之间的碱基配对，向导RNA/基因组编辑核酸内切酶复合物被募集到靶序列上。如本文所使用，术语“基因组编辑核酸内切酶”、“基因组编辑蛋白”或“Cas核酸内切酶”是指蛋白质，如CRI SPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)相关核酸酶。CRISPR相关核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、Mad7、其同源物或修饰形式以及其核酸内切酶无活性形式。CRISPR/Cas系统可以是I型、II型或III型系统。已经广泛描述了使用这种系统进行基因编辑。例如，使用CRISPR向导RNA结合CRISPR-Cas9技术来靶向RNA描述于Wiedenheft等人,“RNA-Guided Genetic Silencing Sys tems in Bacteria and Archaea,”Nature 482:331-338(2012)；Zhang等人,“Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/CasSystems,”Science 339:819-23(2013)；和Gaj等人,“ZFN,TALEN,and CRISPR/Cas-basedMethods for Genome Engineering,”Cell 31:397-405(2013)中，其通过引用整体在此并入。

小麦栽培品种

在一个实施方案中，可以使用具有至少一个作为二倍体、多倍体、四倍体或六倍体的WPBF基因的小麦栽培品种。

在另一实施方案中，小麦是普通小麦。

在一个实施方案中，任何小麦栽培品种都可以用于在WPBF基因中产生突变。在一个实施方案中，任何小麦栽培品种都可用于在A基因组的WPBF基因中产生突变。在另一实施方案中，任何小麦栽培品种都可用于在B基因组的WPBF基因中产生突变。在另一实施方案中，任何小麦栽培品种都可用于在D基因组的WPBF基因中产生突变。

在一个实施方案中，任何小麦栽培品种都可以用作将WPBF突变杂交成不同栽培品种的品系。在另一实施方案中，可以使用具有至少一个WPBF基因的任何小麦栽培品种，包括但不限于硬红春小麦、硬白小麦、硬粒小麦、软白春小麦、软白冬小麦、硬红冬小麦、普通小麦、密穗小麦(club wheat)、斯卑尔脱小麦、二粒小麦、意大利面食小麦和圆锥小麦。小麦品种适应在不同地区生长。例如，在美国，不同的种植区域包括太平洋西北部、沙漠西南部、北部平原、中部平原以及中西部和东部。

在一个实施方案中，生长在北部平原的硬红春小麦包括但不限于Barlow、Bullseye、Cabernet、Cal Rojo、Hank、Joaquin、Kelse、Lariat、Lassik、Malbec、Mika、PR1404、Redwing、Summit 515、SY 314、Triple IV、Ultra、WB-Patron、WB-Rockland、YecoraRojo、Accord、Aim、Anza、Baker、Beth Hashita、Bonus、Borah、Brim、Brooks、Buck Pronto、Butte 86、Cavalier、Challenger、Chief、Ciano T79、Colusa、Companion、Copper、Cuyama、Dash 12、Eldon、Elgin-ND、Enano、Express、Expresso、Jefferson、Genero F81、Grandin、Glenn、Helena554、Hollis、Imuris T79、Inia 66R、Jerome、Kern、Len、Marshall、McKay、Nomad、Northwest 10、Oslo、Pavon F76、Pegasus、Pitic 62、Poco Red、Powell、Probrand711、Probrand 751、Probrand 771、Probrand775、Probred、Prointa Queguay、ProintaQuintal、Prosper、Rich、RSI 5、Sagittario、Scarlet、Serra、Shasta、Solano、Spillman、Sprite、Stander、Stellar、Steele、Stoa、Success、Summit、Sunstar 2、Sunstar King、Tadinia、Tammy、Tanori 71、Tara 2000、Tempo、Tesia T79、Topic、UI Winchester、Vance、Vandal、W444、Wampum、Wared、WB-Fuzion、Westbred 906R、Westbred 911、Westbred 926、Westbred 936、Westbred Discovery、Westbred Rambo、Yolo、Zeke、ND VitPro、Velva。

在另一实施方案中，硬白小麦包括但不限于Blanca Fuerte、Blanca Grande 515、Blanca Royale、Clear White、Patwin、Patwin 515、WB-Cristallo、WB-Paloma、WB-Perla、Alta Blanca、Blanca Grande、Delano、Golden Spike、ID377S、Klasic、Lochsa、Lolo、Macon、Otis、Phoenix、Pima 77、Plata、Pristine、Ramona 50、Siete Cerros 66、Vaiolet和Winsome。

在另一实施方案中，硬粒小麦包括但不限于Crown、Desert King、Desert KingHP、Duraking、Fortissimo、Havasu、Kronos、Maestrale、Normanno、Orita、Platinum、Q-Max、RSI 59、Saragolla、Tango、Tipai、Topper、Utopia、Volante、WB-Mead、Westmore、Aldente、Aldura、Altar 84、Aruba、Bittern、Bravadur、Candura、Cortez、Deluxe、Desert Titan、Durex、Durfort、Eddie、Germains 5003D、Imperial、Kofa、Levante、Matt、Mead、Mexicali75、Minos、Modoc、Mohawk、Nudura、Ocotillo、Produra、Reva、Ria、Septre、Sky、Tacna、Titan、Trump、Ward、Westbred 803、Westbred 881、Westbred 883、Westbred 1000D、Westbred Laker、Westbred Turbo和Yavaros 79。

在另一实施方案中，软白春小麦包括但不限于Alpowa、Alturas、Babe、Diva、JD、New Dirkwin、Nick、Twin,Whit、Blanca、Bliss、Calorwa、Centennial、Challis、Dirkwin、Eden、Edwall、Fielder、Fieldwin、Jubilee、Louise、Owens、Penawawa、Pomerelle、Sterling、Sunstar Promise、Super Dirkwin、Treasure、UI Cataldo、UI Pettit、Urquie、Vanna、Waduel、Waduel 94、Wakanz、Walladay、Wawawai、Whitebird和Zak。

在另一实施方案中，软白冬小麦包括但不限于AP Badger、AP Legacy、Brundage96、Bruneau、Cara、Goetze、Legion、Mary、Skiles、Stephens、SY Ovation、Tubbs、WB-Junction、WB-528、Xerpha、Yamhill、Barbee、Basin、Bitterroot、Bruehl、Castan、Chukar、Coda、Daws、Edwin、Eltan、Faro、Finch、Foote、Gene、Hill 81、Hiller、Hubbard、Hyak、Hyslop、Idaho 587、Kmor、Lambert、Lewjain、MacVicar、Madsen、Malcolm、Masami、McDermid、Moro、Nugaines、ORCF-101、ORCF-102、ORCF-103、Rod、Rohde、Rulo、Simon、Salute、Temple、Tres、Tubbs 06、UICF-Brundage、WB-523和Weatherford。

在另一个实施方案中，硬红冬小麦包括但不限于Andrews、Archer、Batum、Blizzard、Bonneville、Boundary、Declo、Deloris、Finley、Garland、Hatton、Hoff、Longhorn、Manning、Meridian、Promontory、Vona、Wanser、Winridge。

在另一实施方案中，普通小麦(六倍体，自由脱粒)(普通小麦(Triticum aestivumssp aestivum))包括但不限于Sonora、Wit Wolkoring、Chiddam Blanc De Mars、India-Jammu、Foisy。

在另一实施方案中，斯卑尔脱小麦(六倍体，非自由脱粒)(斯卑尔脱小麦(Triticum aestivum ssp spelta))包括但不限于Spanish Spelt、Swiss Spelt。

在另一实施方案中，二粒小麦(四倍体)(二粒小麦(Triticum turgidumssp.dicoccum))包括但不限于Ethiopian Blue Tinge。

在另一实施方案中，意大利面食小麦(四倍体，自由脱粒)(硬粒小麦(Triticumturgidum ssp durum))包括但不限于Blue Beard、Durum-Iraq。

在另一个实施方案中，圆锥小麦(四倍体，自由脱粒)(圆锥小麦(Triticumturgidum ssp turgidum))包括但不限于Akmolinka、Maparcha。

在一个实施方案中，具有至少一个与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8具有基本百分比同一性的WPBF基因的小麦栽培品种可与本文公开的方法和组合物一起使用。

如本文关于小麦栽培品种所使用，“基本百分比同一性”是指基因的DNA序列在核苷酸水平上与SEQ ID NO:1、2、4、5、7和8足够相似，以编码基本相似的蛋白质，从而允许栽培品种之间的等位基因差异(或可变mRNA剪接)。根据本申请的一个实施方案，当WPBF基因和SEQ ID NO:1、2、4、5、7和8之间的编码区中的百分比同一性低至约85％时，可能存在“基本百分比同一性”，条件是基因的保守区中的百分比同一性较高(例如，至少约90％)。优选地，编码区中的同一性百分比为85-90％，更优选为90-95％，最优选高于95％。因此，在不脱离本申请的范围和意图的情况下，本领域技术人员可能更喜欢利用具有商业普及性或具有特定期望特征的小麦栽培品种来产生WPBF突变的小麦植株。或者，本领域技术人员可能更喜欢利用具有很少多态性的小麦栽培品种，如近交系栽培品种，以便于根据本申请筛选一个或多个WPBF基因内的突变。

鉴定WPBF突变的代表性方法

本领域普通技术人员将理解，许多技术和方法可用于产生突变和/或人诱导的突变。下面描述了一种代表性方法。

为了产生和鉴定本文公开的WPBF突变和小麦植株，利用了称为耕种(TILLING)的方法。参见McCallum等人,“Targeted Screening forInduced Mutations,”NatureBiotechnology 18:455-457(2000)；McC allum等人,Plant Physiology,123:439-442(2000_；美国专利申请公开第2004/0053236号；和美国专利第5,994,075号，所有这些文献都通过引用整体并入本文。在基本的耕种方法中，植株材料(如种子)受到化学诱变，这在种子细胞的基因组内产生一系列突变。诱变的种子长成成年M1植株并自花授粉。汇集来自所得M2植株的DNA样品，然后对感兴趣的基因中的突变进行筛选。一旦在感兴趣的基因中鉴定出突变，将携带所述突变的M2植株的种子培育成成年M3植株，并且筛选与所述感兴趣的基因中的突变相关的表型特征。

在一个实施方案中，四倍体栽培品种是Kronos。在其他实施方案中，六倍体栽培品种是Express。

在一个实施方案中，小麦种子被诱变，然后长成M1植株。然后使M1植株自花授粉，并且使来自M1植株的种子长成M2植株，然后筛选其的WPBF基因座的突变。虽然根据本申请的替代实施方案可以筛选M1植株的突变，但筛选M2植株的一个优点是所有体细胞突变对应于种系突变。

本领域技术人员将理解，可以诱变多种小麦植株材料，包括但不限于种子、花粉、植株组织或植株细胞，以产生本文公开的WPBF突变的小麦植株。然而，被诱变的植物材料的类型可能影响何时对植物DNA的突变进行筛选。例如，当在未诱变植株授粉之前对花粉进行诱变时，由授粉产生的种子长成M1植株。M1植株的每个细胞都包含花粉中产生的突变，因此这些M1植株可以随后被筛选出WPBF突变，而不是等到M2代。

主要产生点突变、短缺失(约1至约200个核苷酸)、插入、颠换和/或转换的诱变剂(如化学诱变剂)或辐射(如紫外线、x射线和快中子)可用于产生突变。符合本申请方法的诱变剂包括但不限于甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)、三乙基三聚氰胺(TEM)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、甲基苄肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、美法仑、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(MNNG)、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7,12二甲基苯并蒽(DMBA)、环氧乙烷、六甲基磷酰胺、白消安(bisulfan)、二环氧烷烃(二环氧辛烷(DEO)、二环氧丁烷(DEB)等)、2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯-乙基)氨基丙基氨基]吖啶二盐酸盐(ICR-170)、叠氮化钠、甲醛或其组合。

在一些实施方案中，增加小麦籽粒中的纤维的方法进一步包括使用化学诱变将人诱导的突变引入WPBF基因中。在一些实施方案中，化学品是EMS。

现在已知的或以后设计的任何合适的植物DNA制备方法都可以用于制备小麦植株DNA以用于WPBF突变筛选。在一个实施方案中，汇集由单个小麦植株制备的DNA，以加速筛选来自诱变植株组织的整个植物群体的一个或多个WPBF基因中的突变。汇集组的大小可能取决于所用筛选方法的灵敏度。优选地，汇集两个或更多个单个小麦植株的组。

在另一实施方案中，在汇集DNA样品后，使汇集的样品进行WPBF序列特异性扩增技术，如聚合酶链式反应(PCR)。对WPBF基因座或与这些基因座中的一个直接相邻的序列具有特异性的任何引物可用于扩增汇集的DNA样品中的WPBF序列。在一个实施方案中，引物被设计用于扩增WPBF基因座中最有可能出现有用突变的区域。可以设计引物来检测一个或多个WPBF基因的外显子区域。此外，已知引物可以靶向已知的多态性位点来设计基因组特异性引物，以便于筛选特定基因组中的点突变。为了便于检测凝胶上的PCR产物，可以使用任何常规的或以后设计的标记方法来标记PCR引物。

在一个实施方案中，基于WPBF基因(SEQ ID NO:1、2、4、5、7和8)设计引物。

在另一实施方案中，可以使用鉴定野生型序列与突变序列之间的核苷酸差异的任何方法来筛选PCR扩增产物的WPBF突变。这些可以包括例如但不限于测序、变性高压液相色谱(dHPLC)、恒定变性剂毛细管电泳(CDCE)、温度梯度毛细管电泳(TGCE)，或通过使用酶促裂解的断裂，如在Colbert等人,“High-Throughput Screening for Induced Mutations,”Plant Physiology 126:480-484(2001)(其通过引用整体在此并入)中描述的高通量方法中使用的方法。优选地，使PCR扩增产物与核酸内切酶一起温育，所述核酸内切酶优先裂解野生型序列与突变型序列之间的异源双链体中的错配。

在另一实施方案中，人诱导的突变可以通过下一代测序来鉴定，如Krasileva等人,“Uncovering Hidden Variation in Polyploid Wheat,”Proc.Nat.Acad.Sci.114-E913-E921(2017)(其通过引用整体在此并入)中所描述。

在另一实施方案中，使用自动测序凝胶设备对裂解产物进行电泳，并且借助标准商业图像处理程序分析凝胶图像。

在另一实施方案中，一旦鉴定了具有突变的WPBF基因序列的M2植株，就分析这些突变以确定其对WPBF酶的表达、翻译和/或活性的影响。在一个实施方案中，使用标准测序技术对含有突变的PCR片段进行测序，以确定突变相对于整个WPBF序列的确切位置。使用生物信息学工具评估每个突变以预测其对蛋白质功能的影响(即，从完全耐受到导致功能丧失)，所述生物信息学工具例如SIFT(Ng和Henikoff,“SIFT:Predicting Amino AcidChanges that Affect Protein Function,”Nucleic Acids Research 31:3812-3814(2003)、PSSM(Henikoff和Henikoff,“Using Substitution Probabilities to ImprovePosition-Specific Scoring Matrices,”Computer Applications in the Biosciences12:135-143(1996))和PARSESNP(Taylor和Greene,“PARSESNP:A Tool for the Analysisof Nucleotide Polymorphisms,”Nucleic Acids Research 31:3808-3811(2003)，其通过引用整体在此并入)。例如，小于0.05的SIFT评分或PSSM评分的大变化(例如，10或以上)指示突变可能对蛋白质功能具有有害影响。这些突变在表1-3中指示为严重的错义突变。已知这些程序是预测性的，并且本领域技术人员理解预测的结果并不总是准确的。

在另一实施方案中，如果对M2植株中突变的初步评估表明其具有有用的性质并在WPBF基因内的有用位置中，那么可以对含有所述突变的小麦植株进行进一步的表型分析。在六倍体小麦中，在可以检测到表型之前，可能需要组合A基因组、B基因组和D基因组中的每一个中的突变。在四倍体小麦中，在可以检测到表型之前，可能需要组合A基因组和B基因组突变两者中的突变。在一个实施方案中，含有突变的植株可以回交或异交两次或更多次，以消除任何代的背景突变。然后，回交或异交植株可以自花授粉或杂交以产生WPBF突变纯合的植株。

评估这些纯合的WPBF突变植株的几个物理特征，以确定突变是否在小麦植株中产生有用的表型变化，而不产生不期望的负面影响，如显著降低的种子产量。

产生小麦植株的方法

在另一方面，本申请涉及用于产生具有增加的纤维籽粒的小麦植株的方法。在一个实施方案中，本申请涉及用于产生具有增加的抗性淀粉的小麦植株的方法。在另一实施方案中，本申请涉及用于产生具有增加的果聚糖的小麦植株的方法。在另一实施方案中，本申请涉及用于产生具有增加的不溶性纤维的植株的方法。在另一实施方案中，本申请涉及用于产生具有增加的可溶性纤维的植株的方法。

在另一实施方案中，本申请涉及将WPBF基因突变与野生型植株杂交的方法。

在另一实施方案中，本申请涉及用于产生与野生型小麦植株相比具有降低的一种或多种WPBF蛋白活性的植株的方法。

在一个实施方案中，所述方法包括在来自亲本植株的植株材料或植株部分中的WPBF基因的至少一个拷贝中诱导至少一个人诱导的突变；生长或使用诱变的植株材料以产生后代植株；分析诱变的植株材料和/或后代植株以检测WPBF基因的至少一个拷贝中的至少一个突变；和选择具有在WPBF基因的至少一个拷贝中的至少一个突变的后代植株。

在另一实施方案中，所述方法进一步包括将具有在WPBF基因的至少一个拷贝中的至少一个突变的后代植株与具有在WPBF基因的不同拷贝中的至少一个突变的其他后代植株杂交。鉴定具有突变的后代植株并使所述后代植株与具有突变的其他后代植株杂交的过程可以重复进行，以产生具有降低的WPBF/WPBF活性的后代小麦植株。

在一个实施方案中，小麦植株中WPBF蛋白的活性水平被降低至野生型植株中WPBF蛋白的活性水平的0-2％、2-5％、5-7％、7-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％或95-99％。

产生具有在多于一个基因组中的WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的植株的方法

本申请还涉及产生植株的其他方法，包括以下：在来自亲本植株的植株材料中的WPBF基因的至少一个拷贝中诱导至少一个人诱导的突变，所述亲本植株包含WPBF基因中的突变；生长或使用诱变的植株材料以产生后代植株；和选择具有在WPBF基因的至少两个拷贝中的至少一个突变的后代小麦植株。例如，亲本植株可能具有在A基因组的WPBF基因中的突变。所选择的后代植株可能具有在A基因组的WPBF基因中的一个突变，并且在B基因组的WPBF基因中的一个或多个突变。所选择的后代植株可能具有在A基因组的WPBF基因中的一个突变，并且在B基因组的WPBF基因中的一个或多个突变。所选择的后代植株可能具有在A基因组的WPBF基因中一个突变，并且在D基因组的WPBF基因中的一个或多个突变。提供这些实例仅仅是为了澄清，并且不应限制本文公开的方法。

在另一实施方案中，本申请涉及用于产生植株的方法，其包括在来自亲本植株的植株材料中的WPBF基因的至少一个拷贝中诱导至少一个人诱导的突变，所述亲本植株包含两个WPBF基因中的至少一个突变；生长或使用诱变的植株材料以产生后代植株；和选择具有在WPBF基因的三个拷贝中的至少一个突变的后代植株。在这个实施方案中，A基因组、B基因组和D基因组的WPBF基因中存在至少一个突变。

在另一实施方案中，本申请涉及用于产生小麦植株的方法，其包括使具有在第一WPBF基因中的至少一个人诱导的突变的第一植株与具有在第二WPBF基因中的至少一个人诱导的突变的第二植株杂交；和选择具有在WPBF基因的至少两个拷贝中的至少一个突变的后代植株。

在另一实施方案中，本申请涉及用于产生植株的方法，其包括使具有在第一和第二WPBF基因中的至少一个人诱导的突变的第一植株与具有在第三WPBF基因中的至少一个人诱导的突变的第二植株杂交；和选择具有在WPBF基因的所有三个拷贝中的至少一个突变的后代植株。在这个实施方案中，A基因组、B基因组和D基因组的WPBF基因中存在至少一个突变。

小麦植株、小麦种子和小麦植株的部分

在一个实施方案中，根据本文公开的方法产生具有增加的纤维籽粒的小麦植株。在一个实施方案中，根据本文公开的方法产生具有减少的低分子量谷蛋白的小麦植株。在一个实施方案中，根据本文公开的方法产生具有减少的醇溶蛋白的小麦植株。在另一实施方案中，根据本文公开的方法产生具有增加的或未改变的高分子量谷蛋白的小麦植株。

在另一实施方案中，小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分具有在WPBF基因或经修饰的WPBF基因中的一个或多个突变。在另一实施方案中，小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分具有在WPBF基因中的一个或多个突变。

在另一实施方案中，本申请涉及包含在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分。在另一实施方案中，本申请涉及包含在两个基因组中的每一个中的WPBF基因中的至少一个人诱导的突变的小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分。在另一实施方案中，本申请涉及包含在三个基因组中的每一个中的WPBF基因中的至少一个人诱导的突变的小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分。

在一个实施方案中，小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含在A基因组中的WPBF基因的两个等位基因中的一个或多个人诱导的突变。在另一实施方案中，人诱导的突变在A基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

在一个实施方案中，小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含在B基因组中的WPBF基因的两个等位基因中的一个或多个人诱导的突变。在另一实施方案中，人诱导的突变在B基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

在一个实施方案中，小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含在D基因组中的WPBF基因的两个等位基因中的一个或多个人诱导的突变。在另一实施方案中，人诱导的突变在D基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

在另一实施方案中，小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含具有表1中列出的一个或多个人诱导的突变的多核苷酸，并且与SEQ ID NO:2具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性或相似性。

在另一实施方案中，小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含具有表1中所列的一个或多个人诱导的突变的多核苷酸，其编码WPBF蛋白，其中WPBF蛋白包含一个或多个人诱导的突变，并且与SEQ ID NO:3具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性或相似性。

在另一实施方案中，小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含具有一个或多个人诱导的突变的多核苷酸，并且与SEQ ID NO:5具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性或相似性。

在又一实施方案中，小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含具有一个或多个人诱导的突变的多核苷酸，其编码WPBF蛋白，其中WPBF蛋白包含一个或多个人诱导的突变，并且与SEQ ID NO:6具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性或相似性。

在另一实施方案中，小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含具有一个或多个人诱导的突变的多核苷酸，并且与SEQ ID NO:8具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性或相似性。

在又一实施方案中，小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含具有一个或多个人诱导的突变的多核苷酸，其编码WPBF蛋白，其中WPBF蛋白包含一个或多个人诱导的突变，并且与SEQ ID NO:9具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性或相似性。

在另一实施方案中，小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分具有在WPBF基因中的一个或多个突变，包括但不限于表1-3中列举的一个或多个突变和同源物中的相应突变。可以产生具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或多于25个本文公开的突变的小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分，所述突变包括但不限于表1-3中公开的突变，以及相应同源物中的突变。

籽粒、面粉和淀粉

在另一实施方案中，本申请涉及包含在WPBF基因或经修饰的WPBF基因中的一个或多个人诱导的人诱导的突变的小麦籽粒、面粉或淀粉。在另一实施方案中，本申请涉及包含胚胎的小麦籽粒，其中所述胚胎包含在WPBF基因或经修饰的WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变。

在另一实施方案中，小麦籽粒、面粉或淀粉包含在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变，包括但不限于表1-3中列举的突变以及同系物和同源物中的相应突变。

在另一实施方案中，本申请涉包含在一个、两个或三个基因组中的WPBF基因中的至少一个人诱导的突变的小麦籽粒或面粉。

在另一实施方案中，本申请涉及包含在A基因组的WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦籽粒、面粉或淀粉。在另一实施方案中，人诱导的突变在A基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

在一个实施方案中，小麦籽粒、面粉或淀粉包含在B基因组中的WPBF基因的两个等位基因中的一个或多个人诱导的突变。在另一实施方案中，人诱导的突变在B基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

在一个实施方案中，小麦籽粒、面粉或淀粉包含在D基因组中的WPBF基因的两个等位基因中的一个或多个人诱导的突变。在另一实施方案中，人诱导的突变在D基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

在一个实施方案中，本申请涉及包含A基因组中的WPBF基因的多核苷酸的小麦籽粒、小麦面粉或淀粉，所述多核苷酸具有表1中列出的一个或多个人诱导的突变，并且对应于SEQ ID NO:2。在另一实施方案中，小麦籽粒或小麦面粉包含具有表1中列出的一个或多个人诱导的突变的多核苷酸，并且与SEQ ID NO:2具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性或相似性。

在另一实施方案中，小麦籽粒、小麦面粉或淀粉包含具有表1中列出的一个或多个人诱导的突变的多核苷酸，其编码WPBF蛋白，其中所述WPBF蛋白包含一个或多个人诱导的突变，并且与SEQ ID NO:3具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性或相似性。

在一个实施方案中，本申请涉及包含B基因组中的WPBF基因的多核苷酸的小麦籽粒、小麦面粉或淀粉，所述多核苷酸具有表2中列出的一个或多个人诱导的突变，并且对应于SEQ ID NO:5。在另一实施方案中，小麦籽粒或小麦面粉包含具有表2中列出的一个或多个人诱导的突变的多核苷酸，并且与SEQ ID NO:5具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性或相似性。

在另一实施方案中，小麦籽粒、小麦面粉或淀粉包含具有表2中列出的一个或多个人诱导的突变的多核苷酸，其编码WPBF蛋白，其中所述WPBF蛋白包含一个或多个人诱导的突变，并且与SEQ ID NO:6具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性或相似性。

在一个实施方案中，本申请涉及包含D基因组中的WPBF基因的多核苷酸的小麦籽粒、小麦面粉或淀粉，所述多核苷酸具有表3中列出的一个或多个人诱导的突变，并且对应于SEQ ID NO:8。在另一实施方案中，小麦籽粒或小麦面粉包含具有表3中列出的一个或多个人诱导的突变的多核苷酸，并且与SEQ ID NO:8具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性或相似性。

在另一实施方案中，小麦籽粒、小麦面粉或淀粉包含具有表3中列出的一个或多个人诱导的突变的多核苷酸，其编码WPBF蛋白，其中所述WPBF蛋白包含一个或多个人诱导的突变，并且与SEQ ID NO:9具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的同一性或相似性。

在另一实施方案中，本申请涉及小麦籽粒或面粉，其包含胚乳和与野生型小麦籽粒或面粉相比降低的基因表达水平、活性或WPBF基因的表达水平和活性。

在另一实施方案中，本申请涉及具有在WPBF基因或经修饰的WPBF基因中的一个或多个突变的小麦籽粒或面粉，其与野生型小麦籽粒或面粉相比表现出增加的纤维。在另一实施方案中，具有在WPBF基因或经修饰的WPBF基因中的一个或多个突变的小麦籽粒或面粉与野生型籽粒或面粉相比表现出1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％或大于95％的增加的纤维。

在一个实施方案中，本文公开的籽粒可以含有比野生型籽粒更大的胚胎。在一个实施方案中，本文公开的籽粒可以含有比野生型籽粒的胚胎大1-5％、或5-10％、或10-15％、或15-20％、或20-25％、或25-50％、或50-75％、或75-95％的胚胎。

在一个实施方案中，本文公开的籽粒可以含有尺寸比野生型籽粒的胚胎大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的胚胎。

食品

在一个实施方案中，本申请涉及由上述籽粒或面粉产生的面粉或其他产品。在另一实施方案中，面粉、粗粒部分或纯化淀粉可以是食品的组分。

食品包括但不限于百吉饼、饼干、面包、小圆面包、牛角面包、饺子、英式松饼(English muffin)、松饼、皮塔饼、快速面包、扁平面包、酸面团面包、冷藏/冷冻面团产品、面团、烘豆、墨西哥卷饼、辣椒、墨西哥玉米卷(taco)、玉米粉圆饼、馅饼、即食谷物食品、即食餐、填料、微波餐、核仁巧克力饼、蛋糕、奶酪蛋糕、咖啡蛋糕、曲奇、甜点、糕点、甜面包卷、糖果棒、馅饼皮、馅饼馅、婴儿食品、烘焙混合物、面糊、面包屑、肉汁混合物、肉增量剂、肉替代品、调料混合物、汤料混合物、肉汁、面糊、沙拉酱、汤、酸奶油、面条、意大利面、拉面、炒面、捞面、冰淇淋内含物、冰淇淋棒、冰淇淋蛋卷、冰淇淋三明治、薄脆饼干、油炸面包丁、油炸圈饼、蛋卷、挤压小吃、水果和谷物棒、可微波的小吃产品、营养棒、薄饼、部分烘焙的烘焙产品、椒盐卷饼、布丁、基于格兰诺拉麦片的产品、小吃片、小吃食品、小吃混合物、华夫饼、比萨饼皮、动物食品和宠物食品。

在一些实施方案中，面粉是干混合产品，例如但不限于用于松饼、华夫饼、曲奇、薄饼、饼干、蛋糕、比萨饼皮、百吉饼、面包和馅饼皮的混合物。

在一个实施方案中，面粉是全籽粒面粉(例如，超细研磨的全籽粒面粉，如超细研磨的全籽粒小麦面粉)。在一个实施方案中，全籽粒面粉包括精制面粉成分(例如，精制小麦面粉或精制面粉)和粗粒部分(例如，超细研磨的粗粒部分)。精制小麦面粉可以是例如通过研磨和过筛(筛分)干净的小麦制备的面粉。美国食品药品监督管理局(Food and DrugAdministration；FDA)要求面粉达到一定的颗粒尺寸标准，才能被纳入精制小麦面粉的范畴。精制小麦面粉的颗粒尺寸被描述为其中不少于98％的面粉通过具有不大于标为“212微米(美国线70)”的编织金属丝布的孔的布。

在另一个实施方案中，粗粒部分包括麸皮和胚芽中的至少一种。例如，胚芽是在小麦粒中发现的胚胎植株。胚芽包括脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和植物营养素，如类黄酮。麸皮可包括几个细胞层，并且含有大量的脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和植物营养素，如类黄酮。

例如，本申请的粗粒部分或全籽粒面粉或精制面粉可以各种量用于代替焙烤食品、零食产品和食品中的精制或全籽粒面粉。全籽粒面粉(即超细粉碎的全籽粒面粉)也可以直接销售给消费者以用于其自制的焙烤产品。在一示例性实施方案中，全籽粒面粉的颗粒分布是全籽粒面粉重量的98％的颗粒小于212微米。

在另一实施方案中，全籽粒面粉或粗粒部分或精制面粉可以是营养补充剂的组分。营养补充剂可以是添加到饮食中的含有一种或多种成分的产品，通常包括：维生素、矿物质、草药、氨基酸、酶、抗氧化剂、草药、香料、益生菌、提取物、益生元和纤维。

在另一实施方案中，营养补充剂可以包括任何已知的有助于个体整体健康的营养成分，实例包括但不限于维生素、矿物质、其他纤维组分、脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸、肽、蛋白质、叶黄素、核糖、ω-3脂肪酸和/或其他营养成分。因为本申请的胚乳的高营养含量，所以可以有许多用途，这些用途赋予个体许多益处，包括递送纤维和其他必需营养物、增强消化功能和健康、体重控制、血糖控制、心脏健康、降低糖尿病风险、降低潜在关节炎风险以及个体的整体健康和良好状态。

在另一实施方案中，全籽粒面粉或粗粒部分或精制面粉可以是膳食补充剂的组分。联邦法规将膳食补充剂定义为旨在补充膳食并含有一种或多种膳食成分的产品，所述膳食成分包括：维生素、矿物质、草药、植物药、氨基酸和其他物质或其成分；旨在以丸剂、胶囊、片剂或液体的形式口服；并且在前面板上标明是一种膳食补充剂。

在另一实施方案中，全籽粒面粉或粗粒部分或精制面粉可以是纤维补充剂或其组分。纤维补充剂可以但不限于以下形式递送：速溶饮料混合物、即饮饮料、营养棒、薄脆饼、曲奇、凝胶丸、胶囊、咀嚼物、咀嚼片和丸剂。一个实施方案以调味奶昔或麦芽型饮料的形式递送纤维补充剂。

在另一实施方案中，可包括全籽粒面粉或粗粒部分或精制面粉作为消化补充剂的组分。全籽粒面粉或粗粒部分或精制面粉可以单独作为消化补充剂的组分，或与一种或多种益生元化合物和/或益生菌组合。益生元化合物是不可消化的食物成分，其可以通过选择性刺激结肠中有限数量的微生物的生长和/或活性来有益地影响宿主。本申请范围内的益生元化合物的实例可以包括但不限于低聚糖和菊粉(inulin)。

益生菌是当以足够的量施用时赋予宿主健康益处的一种微生物。益生菌包括但不限于乳酸杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacteria)、埃希氏菌(Escherichia)、梭菌(Clostridium)、乳球菌(Lactococcus)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌(Enterococcus)、和酵母菌(Saccharomyces)。

在另一实施方案中，可包括全籽粒面粉或粗粒部分或精制面粉作为功能性食品的组分。食品技术专家协会将功能性食品定义为，在基本营养之外提供健康益处的食品和食品组分。这包括传统食品、强化食品、营养食品或加强食品和膳食补充剂。全籽粒面粉和粗粒部分或精制面粉包含多种维生素和矿物质，具有高氧自由基吸收能力，并且富含纤维，从而使其非常适合用作功能性食品。

在另一实施方案中，全籽粒面粉或粗粒部分或精制面粉可用于医疗食品。将医用食品定义为被配制以完全在医生监督下食用或施用的食品，并且其旨在用于疾病或病症的特定饮食管理，对于所述疾病或病症，基于公认的科学原理，通过医学评估建立了独特的营养需求。全籽粒面粉和粗粒部分或精制面粉的营养成分和抗氧化能力使其成为医用食品的理想选择。

在另一实施方案中，全籽粒面粉或粗粒部分或精制面粉也可用于药物中。全籽粒面粉和粗粒部分或精制面粉富含纤维，并且具有非常细的颗粒，从而使其适合用作药物的载体。

在另一实施方案中，全籽粒面粉或粗粒部分或精制面粉作为营养补充剂、膳食补充剂或消化补充剂的递送是通过如下递送机构进行的，在所述递送机构中全籽粒面粉或粗粒部分是单一成分或多种营养成分中的一种。递送机构的实例包括但不限于：速溶饮料混合物、即饮饮料、营养棒、薄脆饼、曲奇、薄脆饼干、凝胶丸、胶囊和咀嚼物。

在另一实施方案中，碾磨过程可用于制作多小麦面粉或多籽粒的粗粒部分。在一个实施方案中，可以将来自一种类型的小麦的麸皮和胚芽磨碎并与另一种类型的小麦的磨碎的胚乳或全籽粒小麦面粉共混。或者，可以将一种类型籽粒的麸皮和胚芽磨碎并与另一种类型的籽粒的磨碎的胚乳或全籽粒面粉共混。

在另一实施方案中，可以将来自第一种类型的小麦或籽粒的麸皮和胚芽与来自第二种类型的小麦或籽粒的麸皮和胚芽共混以产生多籽粒的粗粒部分。预期本申请包括混合一种或多种籽粒的麸皮、胚芽、胚乳和全籽粒面粉中的一种或多种的任意组合。这种多籽粒、多小麦的方法可以用于制作定制面粉，并且利用多种类型的籽粒或小麦的品质和营养成分来制作一种面粉。

本申请的全籽粒面粉可以通过多种碾磨工艺生产。一种示例性工艺涉及在单一物流中研磨籽粒，而不将籽粒的胚乳、麸皮和胚芽分离成单独的物流。将干净和回火的籽粒输送至第一通道研磨机，如锤磨机、辊磨机、针磨机、冲击式磨机、盘式磨机、气流粉碎磨机、间隙式磨机等。

研磨后，籽粒被排出并输送到筛子。可以使用本领域已知的用于筛分研磨颗粒的任何筛子。通过筛子的筛网的材料是本申请的全籽粒面粉，并且不需要进一步加工。留在筛网上的材料被称为第二部分。第二部分需要额外的颗粒减小。因此，此第二部分可以被输送至第二通道研磨机。

研磨后，第二部分可以被输送至第二筛子。通过第二个筛子的筛网的材料是全籽粒面粉。留在筛网上的材料被称为第四部分，并且需要进一步加工以减小颗粒尺寸。第二筛子的筛网上的第四部分通过反馈回路被输送回第一通道研磨机或第二通道研磨机以进行进一步加工。

预期本申请的全籽粒面粉、粗粒部分、纯化淀粉和/或籽粒产品可以通过本领域已知的多种碾磨方法生产。

植物育种

在另一实施方案中，本申请涉及使用具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦植株和植株部分进行植株育种的方法。

一个这样的实施方案是使具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种与另一种小麦品种杂交以形成F1植株的第一代群体的方法。通过此方法产生的第一代F1植株群体也是本申请的一个实施方案。F1植株的第一代群体将包含具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种的基本上完整的等位基因集。本领域普通技术人员可以利用育种书或分子方法来鉴定使用具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种产生的特定F1植株，并且任何这种个体植株也包括在本申请中。这些实施方案还包括使用具有在WPBF基因中的一个或多个突变的小麦品种的转基因或回交转换来产生第一代F1植株。

在另一实施方案中，本申请涉及培育后代小麦植株的方法。培育后代小麦植株的方法包括使具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种与第二种小麦植株杂交，并且实施育种方法。用于产生源自具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种的品系的具体方法如下。

本领域普通技术人员可以使具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种与另一种小麦品种(如优良品种)杂交。使由这种杂交产生的F1种子生长形成同质群体。F1种子将含有来自具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种的一个等位基因集和来自另一种小麦品种的一个等位基因集。

F1基因组将由50％的具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种和50％的其他优良品种组成。使F1种子生长形成F2种子。F1种子可以自交，或与另一种小麦品种杂交。

平均而言，F2种子的50％等位基因来自具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种，并且50％来自另一种小麦品种，但是来自群体的各种个体植株的更大百分比的等位基因来自具有在WPBF基因中的一个或多个人的诱导的突变的小麦品种(Wang和Bernardo,“Variance of Marker Estimates of Parental Contribution to F2and BC1-Derived Inbreds,”Crop Sci.40:659-665(2000)以及Bernardo和Kahler,“NorthAmerican Study on Essential Derivation in Maize:Inbreds Developed without andwith Selection from F2 Populations,”Theor.Appl.Genet.102:986-992(2001)，其通过引用整体在此并入)。

将使F2种子生长，并且基于目测和/或性状测量和/或标记辅助选择进行植株选择。将选择具有在WPBF基因来源的后代中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种，其表现出基因来源的性状，并且将单独收获每株植株。将使来自每株植株的F3种子在单独的行中生长并允许自交。然后，从这些行中选择的行或植株将被单独收获和脱粒。选择将再次基于对植株的期望性状的目测和/或测量，例如具有在WPBF基因来源的性状中的一个或多个突变的一个或多个期望的小麦品种。

生长和选择过程将重复任意次数，直到获得具有在WPBF基因来源的小麦植株中的一个或多个人的诱导的突变的纯合小麦品种。具有在WPBF基因来源的小麦植株中的一个或多个人诱导的突变的纯合小麦品种将含有来源于具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种的理想性状，其中一些可能没有被具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种与之杂交的其他原始小麦品种表达，并且其中一些可能已经被两个小麦品种表达，但是现在其表达水平等于或高于具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种中表达的水平。

可以重复杂交、自交和选择的育种过程，以产生具有在WPBF基因来源的小麦植株中的一个或多个人诱导的突变的另一个小麦品种群体，其平均25％的基因来源于具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种，但是来自所述群体的各种个体植株将具有更大百分比的来自具有在WPBF基因中的一个或多个人诱导的突变的小麦品种的等位基因。本申请的另一个实施方案是具有在WPBF基因来源的小麦植株中的一个或多个人诱导的突变的纯合小麦品种，其与具有在WPBF基因来源的性状中的一个或多个人诱导的突变的另一种小麦植株杂交。

作为标记的突变

遗传标记是由基因或基因座的等位形式决定的生物学特征，并且可以从一代传递到另一代，并且因此其可以用作实验探针或标签来跟踪个体、植株、组织、细胞、细胞核、染色体或基因。

SNP提供了最终/最简单形式的分子标记，因为单个核苷酸碱基是最小的遗传单位，并且因此其可以提供最大数量的标记。SNP在动物和植物中非常普遍。通常，植物中SNP频率在每100-300个碱基对一个SNP的范围内。SNP可能存在于基因的编码序列、基因的非编码区内或在不同的染色体区域以不同的频率存在的基因间区域中。

SNP是共显性标记，通常与基因连锁并以多态性的最简单/最终形式存在，并且因此其在遗传研究和育种中已成为非常有吸引力和潜在的遗传标记。此外，SNP可以非常容易地自动化和快速检测，对于多态性的检测具有高效率。

在一个实施方案中，WPBF中的突变是单核苷酸多态性。在一个实施方案中，本申请涉及WPBF基因中的突变，根据一个实施方案，这些突变是可在植物育种中用作标记的单核苷酸多态性。WPBF基因中的突变是致病的，并且可以使用例如KASP探针来跟踪其分离。

基于PCR的KASP^TM基因分型测定是一种同质的、基于荧光(FRET)的检测，其能够对已知SNP和InDel进行准确的双等位基因区分。基于PCR的KASP技术的一个关键特征是使用消除对昂贵的双标记探针的需要的通用的FRET盒报告系统。等位基因特异性正向引物各自具有专有的尾序列，其对应于两个FRET盒中的一个：一个用FAM染料标记，并且另一个用HEX染料标记。通过两个等位基因特异性正向引物的竞争性结合实现双等位基因鉴别。

本申请的另一方面涉及一种产生膳食纤维的方法。所述方法涉及提供包含在小麦醇溶蛋白盒结合因子(WPBF)基因中的人诱导的突变的小麦植株；并且将人诱导的突变引入WPBF基因中，其中所述突变使得小麦植株产生与没有突变的小麦植株相比具有增加的纤维的籽粒；并且从小麦植株的籽粒中获得纤维。

本申请的这个方面可以用本文描述的实施方案中的任何一个来实现。

本申请的另一个方面涉及能够产生具有提高的纤维含量的籽粒的小麦植株，所述小麦植株包含在小麦醇溶蛋白盒结合因子(WPBF)基因中的人诱导的突变，其中所述突变与来自没有突变的小麦植株的籽粒相比有效地提高了小麦植株籽粒中的纤维。

本申请的这个方面可以用本文描述的实施方案中的任何一个来实现。

本申请的另一方面涉及一种选择具有高纤维含量的小麦籽粒的方法。此方法涉及将人诱导的突变引入小麦植株或植株部分中，从而产生具有突变的小麦植株，其中小麦植株产生籽粒。所述方法还涉及从所产生的小麦植株中鉴定出胚大于来自野生型小麦植株的小麦籽粒的胚的籽粒，并且选择具有较大胚的籽粒作为具有较高纤维含量的小麦籽粒。

本申请的这个方面可以用本文描述的实施方案中的任何一个来实现。

实施例

实施例1-小麦种子的诱变

根据本申请的一个示例性实施方案，将六倍体栽培品种(普通小麦)Express或四倍体栽培品种Kronos的小麦种子在H₂O中真空渗透(大约1,000粒种子/100ml H₂O持续大约4分钟)。然后在室温下将种子放在通风橱中的振荡器(45rpm)上。将诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)添加至吸胀的种子中，达到范围为约0.75％至约1.2％(v/v)的最终浓度。在18小时的培养期后，用新鲜的H₂O替换EMS溶液4次。然后在流水下冲洗种子约4-8小时。最后，将诱变的种子种植在盆栽土壤中(96/盘)中，并且使其在室内发芽。将四至六周大的植株转移到田地中以生长成完全成熟的M1植株。让成熟的M1植株自花授粉，然后收集来自M1植株的种子并种植以产生M2植株。

提取并制备根据上述描述产生的M2植株的DNA，以鉴定哪些M2植株携带在其WPBF基因座中的一个或多个中的突变。使用

(Valencia,CA)/>

96植物试剂盒中包含的方法和试剂制备M2植株DNA。将大约50mg冷冻植株样品置于具有钨珠的样品管中，在液氮中冷冻，并且使用/>

Mixer Mill MM 300以20Hz研磨2次，每次1分钟。接下来，在80℃下向样品中添加400μl溶液AP1[缓冲液AP1、溶液DX和RNAse(100mg/ml)]。将试管密封并振荡15秒。添加130μl缓冲液AP2后，将试管振荡15秒。将样品放在-20℃的冰箱中持续至少1小时。然后将样品以5,600X g离心20分钟。将400μl等份上清液转移到另一个样品管中。添加600μl缓冲液AP3/E后，将此样品管加盖并振荡15秒。将滤板放在方形孔块上，并且将1ml样品溶施加到每个孔中并密封滤板。将板和块以5,600X g离心4分钟。接下来，将800μl缓冲液AW添加到滤板的每个孔中，密封并在方形孔块中以5,600X g旋转15分钟。然后将滤板放在一组新的样品管上，并且将80μl缓冲液AE施加至过滤器。加盖并在室温下温育1分钟，然后以5600X g旋转2分钟。用额外的80μl缓冲液AE重复此步骤。除去滤板，并且将含有合并滤液的试管加盖。然后以5至10ng/μl的DNA浓度对单个样品作归一化。

耕种

将M2小麦DNA汇集至两个个体植株的组中。集合中每个个体的DNA浓度约为2ng/ul，其中整个集合的最终浓度为4ng/μl。然后，将5μl汇集的DNA样品(或20ng小麦DNA)排列在微量滴定板上并进行基因特异性PCR。

在含有20ng汇集的DNA、0.75X ExTaq缓冲液(Clonetech,Mountain View,CA)、1.1mM额外的MgCl₂、0.3mM dNTP、0.3μM引物、0.009U Ex-Taq DNA聚合酶(Clonetech,Mountain View,CA)、0.02单位DyNAzyme II DNA聚合酶(Thermo Scientific)以及必要时0.33M聚合物辅助PCR增强剂(Sigma-

)的15μl体积中进行PCR扩增。使用MJ

热循环仪如下进行PCR扩增：95℃持续2分钟；8次“降落PCR”循环(94℃持续20秒，随后是以70-68℃持续30秒开始并且每个循环降低1℃的退火步骤，然后以每秒0.5℃的速度升温至72℃，随后是72℃持续1分钟)；94℃持续20秒，63或65℃持续30秒，0.5℃/秒升温至72℃，72℃持续1-2分钟的25-45个循环；72℃持续8分钟；98℃持续8分钟；80℃持续20秒；80℃持续7秒的60个循环-0.3度/个循环。

使PCR产物(2-4μl)在96孔板中消化。将3μl含有6mM HEPES[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸](pH 7.0)、6mM MgCl₂、6mM NaCl、0.012X

X-100、0.03mg/ml牛血清白蛋白、0.5X T-消化缓冲液[Advanced Analytical Technologies,Inc(AATI),Ames,IA]、各0.912U/>

核酸内切酶和增强剂(/>

Inc.)以及0.5X dsDNA裂解酶(AATI,Ames,IA)的溶液添加到PCR产物中。将消化反应在45℃下孵育45分钟。Surveyor酶的比活性为800单位/μl，其中一个单位由制造商定义为在37℃、pH 8.5、一分钟内从剪切的热变性小牛胸腺DNA产生1ng酸溶性物质所需的酶量。通过添加20μl稀释缓冲液E(AATI,Ames,IA)或1x TE来终止反应。将反应物储存在冰箱中，直到其在Fragment Analyzer^TM(AATI,Ames,IA)毛细管电泳系统上运行。根据制造商的方案，使用DNF-920-K1000T突变发现试剂盒(AATI,Ames,IA)在Fragment Analyzer^TM上运行样品。

电泳后，使用

2.0软件(AATI,Ames,IA)分析测定。凝胶图像显示了所有96个泳道共有的背景条带的序列特异性图。罕见的事件(如突变)产生新的条带，突出于背景图之上。通过与野生型DNA混合的库中的个体成员进行耕种，然后对个体PCR产物进行测序，来评估具有指示感兴趣突变的条带的植株。使携带通过测序证实的突变的植株如上所述生长(例如，M2植株可以回交或异交多次以消除背景突变，并且自花授粉以产生突变纯合的植株)，或与另一种在不同的同源物中含有WPBF突变的植株杂交。

实施例2-WPBF品系的基因分型和植株育种

使携带通过测序证实的突变的植株如上所述生长(例如，M2植株可以回交或异交多次以消除背景突变，并且自花授粉以产生突变纯合的植株)，或与另一种在不同的同源物中含有WPBF突变的植株杂交。在每一代中，通过提取DNA在植株材料中验证新的等位基因，并且通过测序或通过使用针对感兴趣的等位基因特异性开发的等位基因特异性KASP(竞争等位基因特异性PCR)分子标记(LGC Genomics,Beverly,MA)对感兴趣的等位基因进行基因分型。

如实施例1中所述，对自幼叶提取的DNA进行KASP基因分型。每个反应由5μl主混合物(KASP High-Rox Universal 2.times.主混合物，LGC Genomics)0.14μl KASP测定混合物，和40-60ng DNA组成，总反应体积为10.14μl。然后使用以下热循环条件在96孔格式中PCR扩增反应混合物：94℃持续15分钟；然后是在92℃下持续20秒，随后61℃持续60秒的10个循环，每个循环下降0.6℃直到达到55℃；然后是94℃持续20秒，随后55℃持续60秒的35-40个循环；并且最后保持在8℃直到测量。使用已知基因型的对照(Applied Biosystems,Inc,Foster City,Calif.,USA)，用7900HT快速实时PCR系统在室温下评估随后的反应。

使鉴定出在A基因组或B基因组或D基因组的WPBF中具有严重突变的选定植株(表1、2和3)与含有在其他基因组中的WPBF中的严重突变的其他植株杂交。严重突变也被认为是有害突变，包括那些通过其SIFT评分(<0.05)和PSSM评分(>20)预测对蛋白质功能具有有害影响的突变，以及那些导致终止密码子(无义突变)的引入或剪接点或翻译起始密码子突变的突变。对蛋白质功能的严重或有害影响意味着蛋白质的活性降低或消除。在一些情况下，这种蛋白质是不可检测的。在一些情况下，蛋白质存在，但无活性。改变氨基酸序列但预计不会影响蛋白质功能的突变称为错义突变。表4显示了具有在一个或多个WPBF基因组中的突变的示例性小麦植株和种子。具有纯合突变的植株和种子用Hom指示，并且具有野生型突变的植株和种子用Wt指示。

表4.具有在一个或多个基因组中的突变的小麦植株和种子

/>

/>

实施例3-WPBF突变品系的纤维含量的分析

在来自在田间生长的六倍体小麦植株的小麦籽粒中测量纤维含量。评估具有在WPBF-A、WPBF-B和WPBF-D中的人诱导的纯合突变，特别是预测为有害的突变(WPBF_A(C66Y):Hom、WPBF_B(W70*):Hom和WPBF_D(C63Y):Hom)的小麦籽粒。将这些突变品系WPBF01、WPBF02、WPBF03和WPBF09与来自同胞植株WPBF04和WPBF05的小麦籽粒进行比较，后者在三个基因组和亲本未突变品种Express中具有野生型等位基因。使两组植株都在相同的条件下生长。

使用由制造商(PerkinElmer,Inc.,Waltham,MA)提供的近红外光谱(“NIR”)和软件包分析来自每个品系的籽粒的重复样品的纤维和其他邻近组分。测量平均值以及标准偏差的显示于表5中。使用t-检验进行纯合品系与野生型品系之间的统计分析。

表5.Express品种的田间生长的WPBF籽粒的NIR分析

如表5中所示，用NIR分析进行的WBPF六倍体小麦突变品系和对照品系的分析显示灰分含量没有显著差异。然而，与野生型对照相比，WPBF突变品系中的纤维和中性洗涤剂纤维都显著增加(*表示P<0.01)。WPBF突变品系中的蛋白质和淀粉与其的野生型同胞和亲本品系相比减少。

将A基因组、B基因组和D基因组中的WPBF突变等位基因渗入到北部平原小麦品种背景中。与来自野生型同胞对照品系WPBF21的籽粒相比，所有三个突变(WPBF_A(C66Y):Hom、WPBF_B(W70*):Hom和WPBF_D(C63Y):Hom)均为纯合的BC1F4品系WPB F20A和WPBF20B产生了具有提高水平的纤维和中性洗涤剂纤维的籽粒(表6)。这个结果表明，人诱导的WPBF突变是纤维表型增加的原因。

表6.北部平原品种背景下WPBF籽粒的NIR分析

在0％、50％、100％和150％的额外氮肥施用下，种植来自氮投入试验的田间生长小麦籽粒的重复样品，收获并通过NIR评估。表7显示了在12％水分基础上的重复样品的平均值。与对照同胞品系WPBF14(3x Wt)和亲本品种Express(3x Wt)相比，在WPBF突变品系WPBF02(3x Hom)中，纤维和中性洗涤剂纤维随着氮施用量的增加而增加。

表7.氮试验中WPBF籽粒的NIR分析

由梅达莲实验室(Medallion Labs)(Minneapolis,MN,USA)在两种不同小麦背景中对WPBF突变品系及其对照的碾磨全籽粒面粉测试纤维组分。使用纤维快速综合试验(Fiber Rapid Integrated test)(ICC DS 185)测定总膳食纤维，包括不溶性和可溶性纤维组分。使用AOAC方法997.08测定果聚糖，并且使用AOAC方法2002.02测定抗性淀粉含量。与来自野生型对照品系的约17-21％的总膳食纤维含量相比，纯合的WPBF突变品系具有约31％的总膳食纤维含量，其中增加来自不溶性和可溶性纤维组分。绝对果聚糖水平在Express背景中增加了约0.5％，并且在北部平原背景中增加了0.23％。令人惊讶的是，来自两个小麦品种的WPBF突变品系中的抗性淀粉显著增加。

表8.全籽粒面粉的纤维组分分析

/>

WPBF突变品系中的β-葡聚糖纤维含量使用β-葡聚糖检测试剂盒(B-GLUC,Megazyme,Ireland)AOAC方法995.16根据制造商的说明书进行测量。来自两个不同实验的三个WPBF突变品系的平均β-葡聚糖含量与两个野生型对照品系的β-葡聚糖含量相似(表9)。

表9.WPBF突变品系和对照的β-葡聚糖含量

尽管本文已经详细描绘并描述了优选实施方案，但是对于相关领域的技术人员来说显而易见的是，可以在不脱离本申请的精神的情况下进行各种修改、添加、替换等，因此这些被认为是在本申请的范围内。

Claims (24)

1.一种增加小麦籽粒中的纤维的方法，所述方法包括：

提供包含小麦醇溶蛋白盒结合因子(WPBF)基因的小麦植株或植株部分，以及

将人诱导的突变引入所述WPBF基因中，其中所述突变有效地产生如下小麦植株，所述小麦植株能够产生与来自没有所述突变的小麦植株的小麦籽粒相比具有增加的纤维的小麦籽粒。

2.如权利要求1所述的方法，其中将所述突变引入A基因组、B基因组或D基因组的所述WPBF基因中。

3.如权利要求1所述的方法，其中将所述突变引入A基因组和B基因组的所述WPBF基因中的每一个中。

4.如权利要求1所述的方法，其中将所述突变引入A基因组和D基因组的所述WPBF基因中的每一个中。

5.如权利要求1所述的方法，其中将所述突变引入B基因组和D基因组的所述WPBF基因中的每一个中。

6.如权利要求1所述的方法，其中将所述突变引入A基因组、B基因组和D基因组的所述WPBF基因中的每一个中。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述突变是纯合的。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述增加的纤维包含抗性淀粉。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述增加的纤维包含果聚糖。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述增加的纤维包含可溶性纤维和不溶性纤维。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述引入通过化学诱变进行。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述化学品是EMS。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述引入通过基因组编辑进行。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述突变是单核苷酸多态性。

15.一种产生膳食纤维的方法，所述方法包括：

提供包含在小麦醇溶蛋白盒结合因子(WPBF)基因中的人诱导的突变的小麦植株，其中所述突变使得所述小麦植株产生与没有所述突变的小麦植株相比具有增加的纤维的籽粒，以及

从所述小麦植株的籽粒中获得纤维。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述突变在A基因组、B基因组或D基因组的所述WPBF基因中。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述突变在A基因组和B基因组的所述WPBF基因中的每一个中。

18.如权利要求15所述的方法，其中所述突变在A基因组和D基因组的所述WPBF基因中的每一个中。

19.如权利要求15所述的方法，其中所述突变在B基因组和D基因组的所述WPBF基因中的每一个中。

20.如权利要求15所述的方法，其中所述突变在A基因组、B基因组和D基因组的所述WPBF基因中的每一个中。

21.如权利要求15至20中任一项所述的方法，其中所述突变是纯合的。

22.如权利要求15所述的方法，其中所述获得包括将所述小麦籽粒碾磨成全籽粒面粉。

23.如权利要求15所述的方法，其中所述获得包括将所述小麦籽粒碾磨成精制面粉。

24.如权利要求15所述的方法，其还包括：

将所述膳食纤维掺入食品或饮料中。

Images