CN116322753A - 用于胰腺癌评价和治疗的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容的一些方面涉及用于治疗患有胰腺癌的对象的方法。某些方面涉及用癌症免疫治疗(包括免疫检查点阻断治疗)进行治疗。在一些情况下，对象已被确定为患有或患过炎性病症，例如胰腺炎。另一些方面涉及用于鉴定对象为免疫检查点阻断治疗的候选者的方法。

Description

用于胰腺癌评价和治疗的方法和组合物
背景
本申请要求于2020年8月7日提交的美国临时申请No.63/063,014的优先权权益，该申请在此通过引用整体并入。
I.技术领域
本发明的一些方面至少涉及癌症生物学、免疫学和医学领域。
II.背景技术
虽然免疫治疗(例如，检查点阻断治疗)有助于控制和治疗某些癌症类型，但在许多其他类型的癌症中未实现这样的益处。这包括例如，胰腺导管腺癌(pancreatic ductaladenocarcinoma，PDAC)、乳腺癌等。本领域需要用于使这样的癌症对免疫治疗敏感的方法和系统。还认识到需要用于对癌症患者进行分层和治疗的方法，所述癌症患者对免疫治疗具有提高的敏感性。
发明内容
本公开内容的一些方面通过提供用于选择和治疗对免疫治疗具有提高的敏感性的患有癌症(例如，胰腺癌)的对象的方法以及用于使患有癌症的对象对免疫治疗治疗敏感的方法而解决了某些需要。因此，在一些方面中，本文提供了用于治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括向所述对象提供免疫治疗，其中所述对象患有或先前患过胰腺炎症。在一些实施方案中，所公开的方法包括向患有或先前患过胰腺炎的对象提供免疫检查点阻断治疗。还公开了用于鉴定患有胰腺癌的对象对免疫治疗(例如，免疫检查点阻断治疗)敏感的方法，所述方法包括鉴定所述对象为患有或患过胰腺炎。还公开了用于治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括施用树突细胞疫苗和免疫检查点阻断治疗。
本公开内容的一些实施方案包括用于治疗患有癌症的对象的方法、用于诊断患有癌症的对象的方法、用于对患有癌症的对象进行预后的方法、用于鉴定患有癌症的对象对免疫治疗敏感的方法、用于使患有癌症的对象对免疫治疗敏感的方法、用于癌症治疗的方法、用于鉴定患有癌症的对象为免疫治疗候选者的方法、以及用于治疗患有胰腺癌的对象的方法。本公开内容的方法可包括以下步骤中的1、2、3、4、5、6个或更多个：向对象提供免疫治疗，向对象提供免疫检查点阻断治疗，向对象提供替代治疗，确定对象患有胰腺癌，向对象提供树突细胞疫苗，向对象提供两种或更多种类型的癌症治疗，将对象鉴定为患有胰腺炎，将对象鉴定为已患有胰腺炎，针对胰腺炎的症状对对象进行测试，测量对象中一种或更多种胰腺酶(pancreatic enzyme)的水平，在对象中诱导胰腺炎，以及将对象鉴定为免疫治疗的候选者。本公开内容的某些实施方案可不包括前述要素和/或步骤中的一个或更多个。
在一些方面中，本文公开了用于治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括向所述对象提供免疫治疗，其中所述对象已被确定为患有或患过胰腺炎。在一些方面中，本文还公开了用于治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括：(a)鉴定所述对象为患有胰腺炎或先前患过胰腺炎；以及(b)向所述对象提供免疫治疗。在一些实施方案中，(a)包括针对胰腺炎的一种或更多种症状对所述对象进行测试。在一些实施方案中，(a)包括检测所述对象中一种或更多种胰腺酶相对于对照或健康对象的提高的水平。在一些实施方案中，所述一种或更多种胰腺酶包括淀粉酶或脂肪酶。
在一些方面中，本文公开了用于治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括确定所述对象是否患有或先前患过胰腺炎，以及(a)如果所述对象被确定为患有或先前患过胰腺炎，则向所述对象提供免疫治疗；或者(b)如果所述对象被确定为从未患过胰腺炎，则向所述对象提供替代癌症治疗，其中所述替代癌症治疗不包含免疫治疗。在一些实施方案中，替代癌症治疗是化学治疗、激素治疗、放射治疗或手术。在一些实施方案中，确定所述对象是否患有或先前患过胰腺炎包括针对胰腺炎的一种或更多种症状对所述对象进行测试。在一些实施方案中，确定所述对象是否患有或先前患过胰腺炎包括检测所述对象中一种或更多种胰腺酶相对于对照或健康对象的提高的水平。在一些实施方案中，所述一种或更多种胰腺酶包含淀粉酶或脂肪酶。
在一些方面中，本文公开了用于治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括：(a)在所述对象中诱导胰腺炎；以及(b)在(a)之后，向所述对象提供免疫治疗。在一些实施方案中，(a)包括向所述对象提供感染原。在一些实施方案中，(a)包括胰腺手术。
在一些实施方案中，所述胰腺炎是慢性胰腺炎。在一些实施方案中，所述胰腺炎是急性胰腺炎。在一些实施方案中，所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。所述免疫治疗可以是任何免疫治疗，包括例如免疫检查点阻断治疗、CAR-T细胞治疗、过继性T细胞治疗、树突细胞疫苗等。在一些实施方案中，所述免疫治疗是免疫检查点阻断治疗。在一些实施方案中，所述免疫检查点阻断治疗包括向所述对象提供能够与免疫检查点蛋白结合的抗体或抗体样分子。在一些实施方案中，所述免疫检查点阻断治疗包括向所述对象提供包含能够与免疫检查点蛋白结合的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的细胞。在一些实施方案中，所述免疫检查点蛋白是CTLA-4、PD-1、PDL1、PD-2、IDO、LAG3或TIM-3。在一些实施方案中，所述免疫检查点蛋白是PD-1。在一些实施方案中，所述免疫检查点阻断治疗包含至少、至多或恰好1、2、3、4或5种免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点阻断治疗包含至少两种免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，两种或更多种免疫检查点抑制剂包含抗PD-1抗体、抗PDL1抗体和抗CTLA4抗体中的两种或更多种。
在一些实施方案中，来自所述对象的胰腺癌组织被确定为包含CD11c+树突细胞。在一些实施方案中，来自所述对象的胰腺组织被确定为包含三级淋巴结构。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述对象提供树突细胞疫苗。
在一些方面中，本文还公开了用于治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的树突细胞疫苗和免疫治疗(例如，免疫检查点阻断治疗)。在一些实施方案中，所述树突细胞疫苗和所述免疫治疗基本上同时施用。在一些实施方案中，所述树突细胞疫苗和所述免疫治疗依次施用。在一些实施方案中，所述树突细胞疫苗在所述免疫治疗之前施用。在一些实施方案中，所述免疫治疗在所述树突细胞疫苗之前施用。
在一些实施方案中，所述树突细胞疫苗是自体树突细胞疫苗。在一些实施方案中，所述树突细胞疫苗包含常规树突细胞(conventional dendritic cell，cDC)。在一些实施方案中，所述cDC是常规1型树突细胞(conventional type 1dendritic cell，cDC1)。在一些实施方案中，所述对象先前针对胰腺癌进行过治疗。在一些实施方案中，所述对象先前用免疫治疗进行过治疗。在一些实施方案中，所述对象被确定为对先前的治疗具有抗性。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述对象提供另外的癌症治疗。在一些实施方案中，所述另外的癌症治疗是化学治疗、放射治疗、激素治疗、手术或免疫治疗。
在一些方面中，本文公开了用于鉴定患有胰腺癌的对象为免疫检查点阻断治疗的候选者的方法，所述方法包括：(a)确定患有胰腺癌的对象组中的每个对象是否患有或先前患过胰腺炎；以及(b)将来自患有或先前患过胰腺炎的对象组的对象鉴定为免疫治疗的候选者。
在某些方面中，还公开了用于治疗胰腺癌对象的方法，所述方法包括向确定在来自对象的胰腺癌组织中具有三级淋巴结构的对象施用免疫治疗。在一些实施方案中，所述免疫治疗是免疫检查点阻断治疗。
在一些方面中，还公开了用于治疗胰腺癌对象的方法，所述方法包括：(a)检测所述对象的胰腺组织中的三级淋巴结构；以及(b)向所述对象施用免疫治疗。
在一些实施方案中，还公开了用于治疗胰腺癌对象的方法，所述方法包括：(a)在所述对象的胰腺组织中诱导三级淋巴结构的形成；以及(b)向所述对象施用免疫检查点阻断治疗。
在本申请通篇，术语“约”用于指示这样的值，其包括用于测量或定量方法的误差的固有变化。
当与术语“包含/包括”结合使用时，没有数目词修饰的名词的使用可意指“一个/种”，但是其也符合与“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义。
短语“和/或/或者”意指“和”或者“或/或者”。为了举例说明，A、B和/或C包括：单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合或者A、B和C的组合。换句话说，“和/或/或者”作为包含性的或来使用。
词语“包含”(及其任何变化形式)，“具有”(及其任何变化形式)，“包括”(及其任何变化形式)或“含有”(及其任何变化形式)是包含性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
所述组合物和方法根据其用途可“包含/包括”在本说明书通篇公开的任何成分或步骤、“基本上由其组成”或“由其组成”。“基本上由”任何公开的成分或步骤组成的组合物和方法将权利要求书的范围限制在不实质影响要求保护的发明的基本特征和新特征的特定材料或步骤。
“个体”、“对象”和“患者”可互换使用，并且可以是指人或非人。
在治疗性、诊断性或生理性目的或作用的背景下的任何方法也可以以“用途”权利要求语言描述，例如本文所讨论的任何化合物、组合物或药剂用于实现或实施所描述的治疗性、诊断性或生理性目的或作用的“用途”。
预期本说明书中讨论的任何实施方案可相对于本发明的任何方法或组合来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
通过以下详细描述，本发明的另一些目的、特征和优点将变得明显。然而，应当理解，尽管详细描述和具体实施例指示了本发明的一些具体实施方案，但是它们仅以示例的方式给出，因为根据该详细描述，本发明的精神和范围内的多种变化和修改对本领域技术人员将变得得显。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或更多个可以更好地理解本发明。
图1A至1E：胰腺炎增加了KC小鼠中的三级淋巴结构并加速肿瘤发生。(图1A)用于诱导急性和慢性胰腺炎的实验时间线的示意图。(图1B)患有AP和CP的KC小鼠中具有TLS的整个胰腺组织的代表性H&E染色切片。(图1C)患有AP和CP的KC小鼠的胰腺中TLS数目的定量。(图1D至1E)患有和未患有AP的KC小鼠中胰腺组织的代表性H&E和CK 19免疫染色以及定量。比例尺指示100μm。在C和E中，数据表示平均值±SD，使用双因素方差分析(针对肿瘤组织学)和未配对T检验(参数或非参数)进行统计学分析。P值：ns-不显著，*<0.05，**<0.01，***<0.001，****<0.0001。
图2A至2F：患有急性胰腺炎的KC小鼠中髓细胞和树突细胞浸润的分析。(图2A至2B)患有和未患有AP的KC小鼠中PanIN病变和TLS的代表性CD11c免疫染色和定量。(图2C至2D)患有和未患有AP的KC小鼠中PanIN病变和TLS的代表性CD11b免疫染色和定量。(图2E至2F)患有和未患有AP的KC小鼠中PanIN病变的代表性CD11c-MHC-II免疫染色和定量。比例尺指示100μm。在B、D和F中，数据表示平均值±SD，使用未配对T检验(参数或非参数)进行统计学分析。P值：ns-不显著，*<0.05，**<0.01，***<0.001，****<0.0001。
图3A至3B：患有和未患有AP的KC小鼠中的T细胞浸润的分析。(图3A)患有和未患有AP的KC小鼠中PanIN病变和TLS的代表性CD4和CD8免疫染色以及定量。(图3B)患有和未患有AP的KC小鼠中PanIN病变和TLS(仅CD4-Foxp3)的代表性CD4-Foxp3、CD4-GATA3、CD4-RORgt和CD-T-bet共染色以及定量。比例尺指示100μm。在A和B中，数据表示平均值±SD，使用未配对T检验(参数或非参数)进行统计学分析。P值：ns-不显著。
图4A至4D：针对T细胞的CD4-/-和CD8-/-小鼠的肿瘤和淋巴组织的免疫标记。(图4A至4B)KPC、KPC CD4-/-和KPC CD8-/-小鼠的胸腺和脾之CD4+或CD8+面积的％的CD4和CD8免疫染色(图4A)以及相应的定量(图4B)。每组n＝2至4只小鼠。(图4C)KPC、KPC CD4-/-和KPCCD8-/-小鼠肿瘤和三级淋巴结构(tertiary lymphoid structure，TLS)的CD4和CD8免疫染色以及相应的定量(图4D)。每组n＝3至7只小鼠。数据表示为平均值±SD。通过未配对T检验(参数或非参数)确定显著性。*P<0.05，****P<0.0001，ns：不显著。
图5A至5H：CD4+或CD8+T细胞不改变原发性肿瘤生长，但CD4+T细胞促进KPC小鼠中的转移。(图5A)基线KPC(n＝19)、KPC CD4-/-(n＝13)和KPC CD8-/-(n＝11)小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。(图5B至5D)终点KPC、KPC CD4-/-和KPC CD8-/-肿瘤的代表性H&E图像和Ki67免疫染色以及定量(每组中n＝4至8只小鼠)。(图5E)KPC(n＝19)、KPC CD4-/-(n＝11)和KPCCD8-/-(n＝11)小鼠的终点肿瘤重量。(图5F)KPC和KPC CD8-/-小鼠的肝转移的代表性H&E图像和CK 19免疫染色。(图5G至5H)KPC、KPC CD4-/-和KPC CD8-/-小鼠的肝转移(图5G)和肺转移(图5H)的定量。在(图5C、5D、5E、5G、5H)中，数据表示平均值±SD。通过对数秩检验(图5A)、双因素ANOVA(图5B)和未配对(参数或非参数)T检验(图5D、5E、5G、5H)确定显著性。*P<0.05，ns-不显著。比例尺，100μm。
图6A至6E：T细胞对肿瘤发生无影响，而CD4+T细胞促进患有胰腺炎的KC小鼠中的肿瘤发生。(图6A至6B)(自出生6m时年龄匹配的处死)KC(n＝5)、KC CD4-/-(n＝6)和KCCD8-/-(n＝6)小鼠的PanIN病变的代表性H&E和CK19免疫染色图像以及定量。(图6C)AP和CP诱导与实验处理时间点的示意图。(图6D至6E)患有AP和CP的小鼠的PanIN病变的代表性H&E和CK19免疫染色。AP-KC(n＝5)、AP-KC CD4-/-(n＝5)和AP-KC CD8-/-(n＝6)。在(图6B、6E)中数据表示为平均值±SD。通过未配对T检验(参数或非参数)和双因素方差分析(ANOVA)确定显著性。**P<0.01，***P<0.001，***P<0.0001，ns：不显著。比例尺指示100μm。
图7A至7I：CD4+T细胞通过抑制树突细胞促进患有胰腺炎的KC小鼠中的肿瘤发生。(图7A)KC CD4-/-小鼠中AP诱导以及αCD11c或同种型(isotype)抗体处理时间点的示意图。(图7B至7C)经αCD11c或同种型处理的KC CD4-/-小鼠的PanIN病变的代表性H&E和CK19免疫染色以及定量。AP-KC CD4-/-(n＝5)、AP-KC CD4-/-同种型(n＝4)和AP-KC CD4-/-αCD11c(n＝4)小鼠。(图7D至7I)患有和未患有CP的KC和KC CD4-/-小鼠中指定组和细胞类型的CD4、CD8和CD11c共染色的代表性图像以及定量(图7D)。以下的定量：KC和KC-CP小鼠中的CD11c+细胞(图7E)、KC和KC CD4-/-小鼠中的CD8+T细胞(图7F)、KC和KC-CP小鼠中接触中的CD11c+和CD4+细胞的数目(图7G)、KC和KC-CP小鼠中接触中的CD11c+和CD8+细胞的数目(图7H)、KCCD4-/-和AP-KC CD4-/-小鼠中的CD8+T细胞(图7H)。在(图7C、7E、7F、7G、7H、7I)中，数据表示平均值±SD。通过双因素ANOVA(图7C)和未配对(参数或非参数)T检验(图7C、7E、7F、7G、7H、7I)确定显著性。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001，ns-不显著。比例尺指示100μm。
图8A至8C：(图8A)来自图7D的单个通道图像。(图8B)KC和KC-CP小鼠的TLS中的CD11c+DC的定量。
图9A至9H：患有胰腺炎的野生型小鼠的胰腺免疫浸润物的表征。(图9A)针对流式细胞术和CyTOF的急性和慢性胰腺炎诱导(通过箭头指示，一天注射4次雨蛙素(caerulein))与实验时间点的示意图。(图9B)针对WT(n＝16只小鼠，来自合并的4只小鼠的胰腺/样品)和WT-AP小鼠胰腺(n＝8，来自合并的2只小鼠的胰腺/样品)的CD45+细胞的代表性viSNE图。(图9C)展示相对于整个元簇(metacluster)的最大平均值归一化的个体参数的表达值的WT胰腺浸润免疫细胞元簇的热图。(图9D至9G)用于指示细胞类型的元簇的相对频率。B细胞元簇(图9D)、T元簇(图9E)、DC元簇(图9F)和髓细胞元簇(图9G)。(图9H)通过流式细胞术的来自WT(n＝20只小鼠，来自合并的4只小鼠的胰腺/样品)和WT-CP小鼠(n＝10，来自合并的2只小鼠的胰腺/样品)的胰腺的免疫细胞群。(图9B至9G)中的分析是针对CyTOF数据进行的。在(D至G)中数据以箱线图表示。在(图9H)中数据表示为平均值±SD。通过未配对T检验(参数或非参数)确定显著性(图9D、9E、9F、9G和9H)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns：不显著。
图10A至10F：(图10A)开始注射雨蛙素之后1w，WT(n＝5)和WT-CP(n＝10)小鼠中的血清淀粉酶和脂肪酶水平。(图10B至10C)在WT、WT-AP(图10B)和iKPC*、iKPC-CP(图10C)小鼠中通过对CyTOF数据手动设门鉴定的免疫细胞群。CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞、CD11c+DC、CD11b+髓细胞和CD19+B细胞。(图10D至10F)通过流式细胞术的来自iKPC(n＝3只小鼠)和iKPC*-CP小鼠(n＝4只小鼠)的胰腺的免疫细胞群。cDC2(CD11c+B220-CD172a+CD64-Ly6c-CD11b+细胞)(图10D)、pDC(CD11c+B220+SIGLEC H+细胞)(图10E)、mDC(CD11c+B220-CD172a+CD64-Ly6c+细胞)以CD45+Lin(CD19，Ly6G，CD3，NK1.1)-细胞的百分比测量。在(图10A至10F)中，数据表示为平均值±SD。通过未配对T检验(参数或非参数)确定显著性(图10A至10F)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns：不显著。
图11A至11J：患有胰腺炎的iKPC*小鼠的胰腺免疫浸润物的表征。(图11A)针对流式细胞术和CyTOF的慢性胰腺炎诱导(通过箭头指示，一天注射4次雨蛙素)与实验时间点的示意图。(图11B)针对iKPC*(n＝4只小鼠)和iKPC*-CP小鼠胰腺(n＝6只小鼠)的CD45+细胞的代表性viSNE图。(图11C)展示相对于整个元簇的最大平均值归一化的个体参数的表达值的iKPC*胰腺浸润免疫细胞元簇的热图。(图11D至11F)用于指示细胞类型的元簇的相对频率。B和T细胞元簇(图11D)、DC元簇(图11E)和髓细胞元簇(图11F)。(图11G)通过流式细胞术的来自iKPC(n＝3只小鼠)和iKPC*-CP小鼠(n＝4只小鼠)的胰腺的免疫细胞群。(图11H)CD11c+CD86+DC和CD11c+CD40+DC以CD45+细胞的百分比测量。CD11c+MHC-II+F4/80+DC(图11I)、cDC1(CD11c+B220-CD172a-CD64-Ly6c-CD11b-MHC-II+XCR1+细胞)(图11J)以CD45+Lin(CD19，Ly6G，CD3，NK1.1)-细胞的百分比测量。(图11B至11F)中的分析是针对CyTOF数据进行的。在(图11D至11F)中数据以箱线图表示。在(图11G至11J)中数据表示为平均值±SD。通过未配对T检验(参数或非参数)确定显著性(图11D、11E、11F、11G、11H、11I和11J)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns：不显著。
图12A至12F：WT、WT-AP和WT、CP小鼠中T细胞群的分析。(图12A至12G)指定组的流式细胞术数据的免疫表型分析。CD8+Ki67+(图12A)、CD8+GrnzB+(图12B)、CD8+T-bet+(图12C)、CD4+T-bet+(图12D)、CD8+PD1+(图12E)、CD8+TIM3+(图12F)和CD4+Foxp3+细胞(图12G)以CD45+细胞的百分比测量。在(图12A至12G)中数据表示为平均值±SD。通过未配对T检验(参数或非参数)确定显著性(图12A至12G)。**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns：不显著。
图13A至13H：胰腺炎将活化的树突细胞募集至KPC小鼠的胰腺。(图13A)第10w时KPC小鼠(n＝5)和第10w时KPC-CP小鼠(n＝6)的胰腺炎诱导与实验时间点的示意图。(图13B)KPC-10w和KPC-CP小鼠的胰腺重量。(图13C)针对KPC-10w和KPC-CP小鼠胰腺的CD45+细胞的代表性viSNE图。(图13D)展示相对于整个元簇的最大平均值归一化的个体参数的表达值的WT胰腺浸润免疫细胞元簇的热图。(图13E至13G)用于指示细胞类型的元簇的相对频率。B和T细胞元簇(图13H)、DC元簇(图13I)和髓细胞元簇(图13J)。(图13E至13H)中的分析是针对CyTOF数据进行的。在(图13E至13G)中，数据以方框图和晶须图的形式给出。在(图13B、13H)中数据表示为平均值±SD。通过未配对T检验(参数或非参数)确定显著性(图13B、13E、13F、13G和13H)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns：不显著。比例尺指示100μm。
图14A至14L：DC疫苗和CP使iKPC*原位小鼠对检查点免疫治疗敏感。(图14A)B6小鼠中原位注射iKras细胞系、CP诱导以及DC疫苗与αCTLA4/PD1或同种型处理时间点的示意图。(图14B)用同种型，αCTLA4+αPD1，CP:同种型，CP:αCTLA4+αPD1，DC疫苗+αCTLA4+αPD1抗体处理的iKras小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。每组n＝5至6只小鼠。(图14C至14G)指定组的流式细胞术数据的免疫表型分型数据。(图14C)CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞、CD8+Ki67+和CD8+GrnzB+细胞以CD45+细胞的百分比测量。(图14D)CD4+T-bet+(Th1)和CD8+T-bet+细胞以及(图14E)CD4+Foxp3+细胞以CD45+细胞的百分比测量。CD8/Treg比率(图14F)和Th1/Treg比率(图14G)。(图14H)指定组的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞、CD8+Ki67+和CD8+GrnzB+细胞以CD45+细胞的百分比测量。(图14I)CD8+T-bet+细胞以CD45+细胞的百分比测量。(图14I)CD4+Foxp3+细胞和(图14J)CD4+T-bet+(Th1)和CD8+T-bet+细胞以CD45+细胞的百分比测量。在(图14C至14L)中，数据表示平均值±SD。通过对数秩检验(图14B)和未配对T检验(参数或非参数)确定显著性(图14C至14L)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，***P<0.0001，ns-不显著。
图15A至15F：(图15A至15F)来自图14B的原位iKPC*肿瘤小鼠的指定组的个体Kaplan Meier存活曲线。
图16A至16J：(图16A)在原位iKras注射之后第21天处死的经同种型和DC疫苗+αCTLA4+αPD1处理的小鼠的肿瘤重量。(图16B)iKPC*经同种型和DC疫苗+αCTLA4+αPD1处理的小鼠中的DC亚群(cDC1(CD11c+B220-CD172a-CD64-Ly6c-CD11b-MHC-II+XCR1+细胞)、cDC2(CD11c+B220-CD172a+CD64-Ly6c-CD11b+细胞)、mDC(CD11c+B220-CD172a+CD64-Ly6c+细胞)和pDC(CD11c+B220+SIGLEC H+细胞)的免疫表型分析以CD45+Lin(CD19，Ly6G，CD3，NK1.1)-细胞的百分比测量。(图16C、16D)指定组的T细胞上的耗竭标志物的免疫表型分析。CD4+PD1+、CD8+PD1+细胞(C)和CD4+TIM3+、CD8+TIM3+细胞(D)以CD45+细胞的百分比测量。(图16E)T细胞上的活化和记忆标志物CD69的免疫表型分析作为CD45+细胞的百分比。(图16F)在原位iKras注射之后第14天处死的经同种型、CP、αCTLA4+αPD1和CP:αCTLA4+αPD1处理的小鼠的肿瘤重量。(图16H至16I)指定组T细胞上的耗竭或活化标志物的免疫表型分析。CD8+PD1+和CD4+PD1+细胞(H)以及CD4+TIM3+、CD8+TIM3+细胞(图16I)以CD45+细胞的百分比测量。(图16J)T细胞上的活化和记忆标志物CD69的免疫表型分析作为CD45+细胞的百分比。在(图16A至16J)中数据表示平均值±SD并且通过未配对T检验(参数或非参数)确定显著性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns-不显著。
图17A至17F：胰腺炎使KC和KPC689原位小鼠对检查点阻断敏感。(图17A)KC小鼠中AP诱导和αCTLA4/PD1或同种型处理时间点的示意图。(图17B至17C)用αCTLA4/PD1、αPD1或同种型处理的小鼠的PanIN病变的代表性H&E和CK19免疫染色以及定量；AP-KC(n＝5)、AP-KC同种型(n＝5)、AP-KCαPD1(n＝4)和AP-KCαCTLA4+αPD1(n＝4)。(图17D)B6小鼠中原位注射KPC 689细胞、CP诱导以及DC疫苗和αCTLA4/PD1或同种型处理时间点的示意图。(图17E)在指定实验组中，d7的基线、d18的随访(follow up)、再攻击之前d85的成像和d95的IVIS成像的定量。(图17F)指定组的Kaplan-Meier存活曲线。每组n＝6至9只小鼠。在(图17C、17E)中数据表示平均值±SD。通过双因素ANOVA和未配对(参数或非参数)T检验(图17C、17E)以及对数秩检验(图17F)确定显著性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns-不显著。比例尺指示100μm。
图18A至18H：(图A至H)指定组的原位KPC689肿瘤小鼠的个体Kaplan Meier存活曲线。通过对数秩检验确定显著性。*P<0.05，****P<0.0001，ns-不显著。
图19A至19D：(图19A)指定实验组中d7的基线、d18的随访、再攻击之前d85的成像和d95的IVIS成像。(图19B至19E)包含GFP-Luc的KPC689和亲本肿瘤细胞裂解物表现出类似的CD8+T细胞活化水平。用Poly I:C和/或KPC GFP表达细胞或亲本KPC肿瘤的肿瘤细胞裂解物刺激骨髓来源的CD103+cDC1。细胞与CFSE标记的野生型CD8+T细胞以及DC共培养。OT-I脾CD8+T细胞与用卵清蛋白和/或Poly I:C刺激的CD103+cCD1共培养，作为阳性对照。(图19B)％CFSElo CD8+T细胞，(图19C)％CD25+CD8+T细胞，(图19D)T细胞上的CD25和(图19E)PD1(MFI)通过流式细胞术进行定量。(每组n＝5)。在原位注射之后45天，原位KPC 689肿瘤小鼠中的CD3+(T细胞)、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD11c+DC、CD11b+髓细胞(E)、CD4+Foxp3+(T reg)、CD8+GrnzB+、CD11c+CD40+、CD11c+CD86+细胞的免疫表型分析以CD45+细胞的百分比测量。在(图19B至19E)中，数据表示平均值±SD。通过未配对T检验(参数或非参数)确定显著性。*P<0.05，**P<0.01，ns-不显著。
图20A至20B：(图20A至20B)在终点时或在处死时的小鼠中的肿瘤组织学(H&E)分析和定量。在(图20B)中，数据表示平均值±SD。通过双因素ANOVA确定显著性。****P<0.0001，ns-不显著。
图21A至12F：在人PDAC中，肿瘤浸润树突细胞与CD8+T细胞浸润和更好的预后相关。(图21A)人PDAC TMA样品中CD4、CD8、Foxp3和CD11c+细胞的代表性免疫染色。(图21B)每个TMA中CD11c+DC与每个T细胞组(即CD4+T、CD8+T和CD4+Foxp3+T细胞)的线性回归分析；(n＝119)PDAC患者。(图21C至21D)针对CD11c高(n＝56)Vs.CD11c低(n＝63)肿瘤(图21C)、CD8高(n＝59)Vs.CD8低(n＝61)肿瘤(图21D)、CD4高(n＝58)Vs.CD4低(n＝62)肿瘤(图21E)以及Treg高(n＝55)Vs.Treg低(n＝65)肿瘤(图21F)的DSS的Kaplan Meier存活曲线。通过对数秩检验确定显著性(图21C、21D、21E和21F)。比例尺指示100μm。***P<0.001，ns-不显著。
图22：基于TMA组群中所有患者的中值，将PDAC患者分层为每种细胞类型的“高”和“低”。
图23A至23B：TCGA数据集的分析。(图23A至23B)基于中值表达BATF3高(n＝65)、BATF3低(n＝44)(图23A)以及CD11c：ITGAX高(n＝54)和低(n＝55)(图23B)表达，针对BATF3低和高表达的DSS的Kaplan meier存活曲线。ns-不显著。
具体实施方式
本公开内容至少部分基于以下出人意料的发现：由独立于癌症的炎症引起或与之相关的胰腺癌对癌症免疫治疗，包括免疫检查点阻断治疗有响应。如本文所公开的，当与胰腺癌相关时，急性和/或慢性胰腺炎缓解免疫抑制并实现免疫检查点阻断治疗的效力。因此，在一些实施方案中，公开了用于治疗胰腺癌的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有或患过癌症的对象提供免疫检查点阻断治疗，其中对象患有或先前患过胰腺炎症(例如，器官损伤、胰腺纤维化和/或胰腺炎)。另一些方面公开了用于基于炎症(包括胰腺炎)史对胰腺癌患者进行分层的方法。例如，一些实施方案涉及用于通过鉴定患者为患有或先前患过胰腺炎症(例如胰腺炎)来鉴定对象为免疫检查点阻断治疗的候选者的方法。还公开了用于治疗胰腺癌的方法，所述方法包括施用树突细胞疫苗和免疫检查点阻断治疗。
I.治疗方法
本公开内容的一些方面涉及用于治疗用途的组合物和方法。本公开内容的组合物可用于体内、体外或离体施用。组合物的施用途径可以是例如皮内、皮下、静脉内、局部、表面和腹膜内施用。
A.癌症治疗
在一些实施方案中，所公开的方法包括向对象或患者施用癌症治疗。在一些实施方案中，癌症治疗包括局部癌症治疗。在一些实施方案中，癌症治疗不包括全身性癌症治疗。在一些实施方案中，癌症治疗不包括局部治疗。在一些实施方案中，癌症治疗包括局部癌症治疗而不施用系统癌症治疗。在一些实施方案中，癌症治疗包括免疫治疗，其可以是免疫检查点治疗。这些癌症治疗中的任一种也可被排除在外。也可施用这些治疗的组合。
本文使用的术语“癌症”可用于描述实体瘤、转移性癌症或非转移性癌症。在某些实施方案中，癌症可起源于膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、肛门、牙龈(gum)、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。任何公开的方法或组合物均可用于治疗任何癌症类型。例如，本公开内容的一些方面包括用(a)树突细胞疫苗和(b)另外的免疫治疗(例如免疫检查点阻断治疗)治疗任何癌症。另外的一些方面包括诱导肿瘤组织处的炎症，随后用免疫治疗(例如，免疫检查点阻断治疗)进行治疗。另一些方面包括诱导肿瘤组织处的三级淋巴结构形成，随后用免疫治疗(例如，免疫检查点阻断治疗)进行治疗。
癌症可具体地是以下组织学类型，尽管其不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌肿瘤；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌(endometroid carcinoma)；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌(apocrine adenocarcinoma)；皮脂腺癌；耵聍腺癌；黏液表皮样癌；嚢腺癌；乳头状嚢腺癌；乳头状浆液性嚢腺癌；黏液性嚢腺癌；黏液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓细胞癌；小叶癌；炎性癌；乳房佩吉特病(paget’s disease)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌w/鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；sertoli细胞癌；恶性莱迪希细胞瘤(leydig cell tumor)；恶性脂质细胞瘤；恶性神经节细胞瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤(mullerianmixed tumor)；肾胚细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤(brennertumor)；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤(kaposi’ssarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤(ewing’s sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病(hodgkin’s disease)；霍奇金副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥散性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样霉菌病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸细胞性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓细胞肉瘤；和毛细胞白血病。
在一些实施方案中，公开了用于治疗源自胰腺的癌症的方法。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，癌症是胰腺导管腺癌(PDAC)。
在一些实施方案中，公开了用于治疗源自乳腺的癌症的方法。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。
B.癌症免疫治疗
在一些实施方案中，所述方法包括施用癌症免疫治疗。癌症免疫治疗(有时称为免疫肿瘤学(immuno-oncology)，缩写IO)是利用免疫系统来治疗癌症。可将免疫治疗分类为主动的、被动的或混合的(主动的和被动的)。这些方法运用了以下事实：癌细胞通常在其表面具有可被免疫系统检测到的分子，称为肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)；它们通常是蛋白质或其他大分子(例如碳水化合物)。主动免疫治疗通过靶向TAA引导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫治疗增强现有的抗肿瘤应答，并包括使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。多种免疫治疗是本领域已知的，并且以下描述了一些实例。
1.检查点抑制剂和组合治疗
本公开内容的一些实施方案可包括施用免疫检查点抑制剂，其实例在以下进一步描述。如本文所公开的，“免疫检查点阻断治疗”(也为“免疫检查点治疗”、“检查点阻断免疫治疗”或“CBI”)是指包括向患有或怀疑患有癌症的对象提供一种或更多种免疫检查点抑制剂的癌症治疗。在一些方面中，本公开内容的免疫检查点阻断治疗包括至少、至多或恰好1、2、3、4或5种免疫检查点抑制剂，或者更多。在一些方面中，免疫检查点阻断治疗包含两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1抑制剂和CTLA4抑制剂)。
a.PD-1、PDL1和PDL2抑制剂
PD-1可在其中T细胞遇到感染或肿瘤的肿瘤微环境中发挥作用。活化的T细胞上调PD-1并继续在外周组织中将其表达。细胞因子(例如IFN-γ)诱导上皮细胞和肿瘤细胞上PDL1的表达。PDL2在巨噬细胞和树突细胞上表达。PD-1的主要作用是在免疫应答期间限制外周中效应T细胞的活性并防止对组织的过度损伤。本公开内容的抑制剂可阻断PD-1和/或PDL1活性的一种或更多种功能。
“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PDL1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PDL2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些实施方案中，PD-1、PDL1和PDL2是人PD-1、PDL1和PDL2。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1抑制剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2抑制剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PDL2结合配偶体是PD-1。抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利No.8,735,553、8,354,509和8,008,449中，其全部通过引用并入本文。用于本文中提供的方法和组合物中的其他PD-1抑制剂是本领域已知的，例如描述于美国专利申请No.US2014/0294898、US2014/022021和US2011/0008369中，其全部通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自：纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和皮地利珠单抗(pidilizumab)。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是免疫黏附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的胞外部分或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中，PDL1抑制剂包含AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0004163800480000161
)是描述于WO2006/121168中的抗PD-1抗体。派姆单抗(也称为MK-3475、Merck 3475、兰罗利珠单抗(lambrolizumab)、/>
Figure BDA0004163800480000162
和SCH-900475)是描述于WO2009/114335中的抗PD-1抗体。皮地利珠单抗(也称为CT-011、hBAT或hBAT-1)是描述于WO2009/101611中的抗PD-1抗体。AMP-224(也称为B7-DCIg)是描述于WO2010/027827和WO2011/066342中的PDL2-Fc融合可溶性受体。另外的PD-1抑制剂包括MEDI0680，也称为AMP-514和REGN2810。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PDL1抑制剂，例如德瓦鲁单抗(Durvalumab)，也称为MEDI4736；阿特珠单抗(atezolizumab)，也称为MPDL3280A；阿维单抗(avelumab)，也称为MSB00010118C、MDX-1105、BMS-936559，或其组合。在某些方面中，免疫检查点抑制剂是PDL2抑制剂例如rHIgM12B7。
在一些实施方案中，抑制剂包含纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抑制剂包含纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体竞争与PD-1、PDL1或PDL2上相同表位的结合和/或与之结合。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中可推导出的任何范围)的可变区氨基酸序列同一性。
b.CTLA-4、B7-1和B7-2
在本文中提供的方法中可被靶向的另一免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞表面上，并且当与抗原呈递细胞表面上的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)结合时充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28类似，并且这两种分子均与抗原呈递细胞上的B7-1和B7-2结合。CTLA-4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。胞内CTLA-4也存在于调节性T细胞中并且对其功能可能是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)的表达提高。本公开内容的抑制剂可阻断CTLA-4、B7-1和/或B7-2活性的一种或更多种功能。在一些实施方案中，抑制剂阻断CTLA-4与B7-1相互作用。在一些实施方案中，抑制剂阻断CTLA-4与B7-2相互作用。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。
适用于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域公知的方法产生。或者，可使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，公开于以下中的抗CTLA-4抗体可用于本文公开的方法中：US 8,119,129，WO 01/14424，WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)，先前称为ticilimumab)，美国专利No.6,207,156；Hurwitz et al.,1998。每个前述出版物的教导均在此通过引用并入。也可使用与这些本领域公认的抗体中任一者竞争与CTLA-4结合的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请No.WO2001/014424、WO2000/037504和美国专利No.8,017,114中；所有均通过引用并入本文。
在本公开内容的方法和组合物中可用作检查点抑制剂的另外的抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和
Figure BDA0004163800480000171
)或者其抗原结合片段和变体(参见，例如WO 01/14424)。
在一些实施方案中，抑制剂包含曲美木单抗或伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抑制剂包含曲美木单抗或伊匹单抗的VH区域的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及曲美木单抗或伊匹单抗的VL区域的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体竞争与PD-1、B7-1或B7-2上相同表位的结合和/或与之结合。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中可推导出的任何范围)的可变区氨基酸序列同一性。
c.LAG3
在本文中提供的方法中可被靶向的另一种免疫检查点是淋巴细胞活化基因3(lymphocyte-activation gene 3，LAG3)，也称为CD223和淋巴细胞活化3。人LAG3的完整mRNA序列具有Genbank登录号NM_002286。LAG3是免疫球蛋白超家族的成员，其存在于活化的T细胞、自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突细胞的表面上。LAG3的主要配体是MHC II类，并且其以与CTLA-4和PD-1类似的方式负调节T细胞的细胞增殖、活化和内稳态，并且已被报道在Treg抑制功能中发挥作用。LAG3还有助于维持CD8+T细胞处于致耐受性状态并与PD-1共同作用，有助于在慢性病毒感染期间维持CD8耗竭。LAG3也被认为参与树突细胞的成熟和活化。本公开内容的抑制剂可阻断LAG3活性的一种或更多种功能。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗LAG3抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。
适用于本发明方法的抗人LAG3抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域公知的方法产生。或者，可使用本领域公认的抗LAG3抗体。例如，抗LAG3抗体可包括GSK2837781，IMP321，FS-118，Sym022，TSR-033，MGD013，B1754111，AVA-017，或GSK2831781。公开于以下中的抗LAG3抗体可用于本文所公开的方法中：US 9,505,839(BMS-986016，也称为relatlimab)；US 10,711,060(IMP-701，也称为LAG525)；US 9,244,059(IMP731，也称H5L7BW)；US 10,344,089(25F7，也称为LAG3.1)；WO 2016/028672(MK-4280，也称为28G-10)；WO 2017/019894(BAP050)；Burova E.，et al.，J.ImmunoTherapy Cancer,2016；4(增刊.1)：P195(REGN3767)；Yu，X.，et al.，mAbs，2019；11：6(LBL-007)。可用于所要求保护的公开内容的这些和其他抗LAG-3抗体可见于例如：WO 2016/028672，WO 2017/106129，WO2017062888，WO 2009/044273，WO 2018/069500，WO 2016/126858，WO 2014/179664，WO2016/200782，WO 2015/200119，WO 2017/019846，WO 2017/198741，WO 2017/220555，WO2017/220569，WO 2018/071500，WO 2017/015560；WO 2017/025498，WO 2017/087589，WO2017/087901，WO 2018/083087，WO 2017/149143，WO 2017/219995，US 2017/0260271，WO2017/086367，WO 2017/086419，WO 2018/034227和WO 2014/140180。每个前述出版物的教导在此通过引入并入。也可使用与这些本领域公认的抗体中的任一者竞争与LAG3结合的抗体。
在一些实施方案中，抑制剂包含抗LAG3抗体的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抑制剂包含抗LAG3抗体的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及抗LAG3抗体的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中可推导出的任何范围)的可变区氨基酸序列同一性。
d.TIM-3
在本文中提供的方法中可被靶向的另一种免疫检查点是含T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域-3(TIM-3)，也称为甲型肝炎病毒细胞受体2(hepatitis A virus cellularreceptor 2，HAVCR2)和CD366。人TIM-3的完整mRNA序列具有Genbank登录号NM_032782。TIM-3存在于产生IFNγ的CD4+Th1和CD8+Tc1细胞表面上。TIM-3的胞外区由膜远端的单个可变免疫球蛋白结构域(IgV)和位于靠近膜的可变长度的糖基化黏蛋白结构域组成。TIM-3是免疫检查点并且与其他抑制性受体(包括PD-1和LAG3)一起介导T细胞耗竭。TIM-3也显示为调节巨噬细胞活化的CD4+Th1特异性细胞表面蛋白质。本公开内容的抑制剂可以阻断TIM-3活性的一种或更多种功能。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗TIM-3抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。
适用于本发明方法的抗人TIM-3抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域公知的方法产生。或者，可使用本领域公认的抗TIM-3抗体。例如，在本文公开的方法中可以使用抗TIM-3抗体，包括：MBG453、TSR-022(也称为考伯利单抗(Cobolimab))和LY3321367。可用于所要求保护的公开内容的这些和其他抗TIM-3抗体可见于例如US 9,605,070、US 8,841,418、US2015/0218274和US 2016/0200815中。每个前述出版物的教导均在此通过引用并入。也可使用与这些本领域公认的抗体中任一者竞争与TIM-3结合的抗体。
在一些实施方案中，抑制剂包含抗TIM-3抗体的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抑制剂包含抗TIM-3抗体的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及抗TIM-3抗体的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中可推导出的任何范围)的可变区氨基酸序列同一性。
C.共刺激分子的激活
在一些实施方案中，免疫治疗包含共刺激分子的激动剂。在一些实施方案中，激动剂包含以下的激动剂：B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD28、ICOS、OX40(TNFSF4)、4-1BB(CD137；TNFRSF9)、CD40L(CD40LG)、GITR(TNFSF18)，及其组合。激动剂包括激动性抗体、多肽、化合物和核酸。
D.树突细胞治疗
在一些方面中，本公开内容的癌症治疗包括树突细胞治疗(也为“树突细胞疫苗”)。不希望受到理论的束缚，树突细胞治疗被理解为通过使树突细胞向淋巴细胞呈递肿瘤抗原从而激活淋巴细胞，引发淋巴细胞杀死呈递抗原的另一些细胞来引起抗肿瘤应答。树突细胞是哺乳动物免疫系统中的抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)。在癌症治疗中，它们有助于靶向癌症抗原。树突细胞治疗的一个实例是sibuleucel-T。
诱导树突细胞呈递肿瘤抗原的一种方法是通过用自体肿瘤裂解物或短肽(对应于癌细胞上的蛋白质抗原的小部分蛋白)进行疫苗接种。这些肽通常与佐剂(高免疫原性物质)组合来给予，以提高免疫和抗肿瘤应答。另一些佐剂包括吸引和/或活化树突细胞的蛋白质或其他化学物质，例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophagecolony-stimulating factor，GM-CSF)。
树突细胞也可通过使肿瘤细胞表达GM-CSF在体内被活化。这可以通过对肿瘤细胞进行遗传改造以产生GM-CSF来实现，或者通过用表达GM-CSF的溶瘤病毒感染肿瘤细胞来实现。
另一策略是从患者血液中去除树突细胞并在身体之外活化它们。树突细胞在存在肿瘤抗原的情况下被活化，肿瘤抗原可以是单肿瘤特异性肽/蛋白质或肿瘤细胞裂解物(分解的肿瘤细胞的溶液)。这些细胞(与任选的佐剂)被输注并引发免疫应答。
树突细胞治疗包括使用与树突细胞表面上的受体结合的抗体。可将抗原添加至抗体并且可诱导树突细胞成熟并提供对肿瘤的免疫。树突细胞受体例如TLR3、TLR7、TLR8或CD40已被用作抗体靶标。
树突细胞治疗可包含树突细胞群，所述树突细胞群包含一种或更多种类型的树突细胞。可用于本公开内容的树突细胞治疗的树突细胞的类型包括，例如，常规DC(例如，常规1型树突细胞(cDC1)、常规1型树突细胞(cDC2))、浆细胞样DC和单核细胞性DC。树突细胞治疗可以是自体或异体的。
多种类型的树突细胞治疗是本领域公认的，包括例如Santos PM，ButterfieldLH.Dendritic Cell-Based Cancer Vaccines.J Immunol.2018；200(2):443-449.(其全部内容通过引用并入本文)中描述的那些。
E.CAR-T细胞治疗
嵌合抗原受体(CAR，也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)是经改造受体，其将新的特异性与免疫细胞组合以靶向癌细胞。通常来说，这些受体将单克隆抗体的特异性接枝到T细胞、NK细胞或其他免疫细胞上。所述受体被称为嵌合的，因为其是由来自不同来源的部分融合的。CAR-T细胞治疗是指使用这样的经转化细胞以进行癌症治疗的治疗。
CAR-T细胞设计的基本原理涉及组合抗原结合和T细胞活化功能的重组受体。CAR-T细胞的一般前提是人工生成靶向癌细胞上存在的标志物的T细胞。科学家可从人中取出T细胞，对其进行遗传改变，并将其放回患者中，用于使其攻击癌细胞。一旦T细胞被改造变成CAR-T细胞，其就可充当“活的药物”。CAR-T细胞在胞外配体识别结构域和胞内信号传导分子之间建立联系，进而活化T细胞。胞外配体识别结构域通常是单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv)。CAR-T细胞治疗安全性的一个重要方面是如何确保仅靶向癌性肿瘤细胞，而不是正常细胞。CAR-T细胞的特异性由对所靶向的分子的选择决定。
示例性的CAR-T治疗包括Tisagenlecleucel(Kymriah)和Axicabtageneciloleucel(Yescarta)。
F.细胞因子治疗
细胞因子是由肿瘤内存在的许多类型的细胞产生的蛋白质。它们可调节免疫应答。肿瘤经常运用它们来使其生长并降低免疫应答。这些免疫调节作用使得它们被用作引发免疫应答的药物。两种常用的细胞因子是干扰素和白介素。
干扰素由免疫系统产生。它们通常参与抗病毒应答，但对于癌症也有用途。它们分为三组：I型(IFNα和IFNβ)、II型(IFNγ)和III型(IFNλ)。
白介素具有一系列的免疫系统作用。IL-2是示例性的白介素细胞因子治疗。
G.过继性T细胞治疗
过继性T细胞治疗是通过输注T细胞(过继性细胞转移)的被动免疫接种的一种形式。它们存在于血液和组织中，并且通常当它们发现外来病原体时会活化。具体地，当T细胞的表面受体遇到在其表面抗原上展示出部分外来蛋白质的细胞时，它们就会活化。这些可以是感染的细胞，或是抗原呈递细胞(APC)。它们存在于正常组织中和肿瘤组织中，在那里它们被称为肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)。它们在存在APC(例如呈递肿瘤抗原的树突细胞)的情况下被活化。尽管这些细胞可攻击肿瘤，但是肿瘤内的环境具有高度免疫抑制作用，这阻止免疫介导的肿瘤死亡。
已经开发了产生和获得靶向肿瘤的T细胞的多种方式。对肿瘤抗原具有特异性的T细胞可从肿瘤样品(TIL)中除去，或从血液过滤。随后的活化和培养离体进行，并将所得物进行再输注。活化可通过基因治疗或通过将T细胞暴露于肿瘤抗原来进行。
预期癌症治疗可排除本文所述的任何癌症治疗。此外，本公开内容的一些实施方案包括先前针对本文所述的治疗进行过治疗、目前正在针对本文所述的治疗进行治疗、或尚未针对本文所述的治疗进行治疗的患者。在一些实施方案中，患者是已经确定对本文所述的治疗具有抗性的患者。在一些实施方案中，患者是已经确定对本文所述的治疗敏感的患者。例如，患者可以是基于确定患有或先前患过胰腺炎的患者而被确定对免疫检查点抑制剂治疗敏感的患者。
II.胰腺癌治疗
本公开内容的一些方面涉及包括治疗患有或怀疑患有胰腺癌的对象的方法。在一些实施方案中，胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。在某些实施方案中，所公开的方法包括治疗目前患有或先前患过胰腺炎症的对象。胰腺炎症可包括但不限于急性胰腺炎、慢性胰腺炎、器官损伤(例如，由于细菌感染引起的器官损伤)和纤维化。例如，可通过检测来自对象的胰腺组织中CD11c+细胞的存在来确定对象患有或患过胰腺炎症。在一些实施方案中，治疗同时患有胰腺炎的对象。例如，在一些实施方案中，所述方法包括治疗患有(例如正在经历PDAC症状)PDAC的对象，其中所述对象目前患有慢性胰腺炎。可使用本领域已知的测试和诊断方法诊断对象患有胰腺炎。例如，可通过针对胰腺炎的一种或更多种症状对对象进行测试来确定对象患有胰腺炎。在另一个实例中，通过检测对象中一种或更多种胰腺酶(例如淀粉酶、脂肪酶)相对于对照或健康对象的提高的水平来确定对象患有胰腺炎。在一些实施方案中，对先前已患有胰腺炎的对象进行治疗。例如，在一些实施方案中，本公开内容的方法包括治疗患有PDAC的对象，其中所述对象先前患有急性胰腺炎并且从急性胰腺炎中恢复。
在一些实施方案中，所公开的方法包括用癌症免疫治疗治疗患有胰腺癌的对象。如本文所公开的，由胰腺炎症引起或与其相关的胰腺癌对癌症免疫治疗出乎意料且预料不到地敏感。因此，在一些实施方案中，公开了用于用癌症免疫治疗来治疗患有胰腺癌的对象的方法，其中所述对象先前已患有或目前患有胰腺炎症(包括胰腺炎)。在一些实施方案中，癌症免疫治疗是树突细胞治疗。在一些实施方案中，癌症免疫治疗是免疫检查点阻断治疗(例如，抗PD-1治疗、抗CTLA4治疗等)。在一些实施方案中，癌症免疫治疗包含树突细胞治疗和免疫检查点阻断治疗。
在一些实施方案中，所公开的方法包括基于目前或之前的胰腺炎将一个或更多个对象鉴定为癌症免疫治疗治疗的候选者。例如，在一些实施方案中，所公开的方法包括通过确定对象目前患有或先前患过胰腺炎来将患有胰腺癌的对象鉴定为癌症免疫治疗的候选者。在一些实施方案中，所公开的方法包括对患有胰腺癌的对象确定最佳癌症治疗。例如，如果对象患有或先前患过胰腺炎，则可给予对象癌症免疫治疗(例如，树突细胞治疗、免疫检查点阻断治疗、过继细胞治疗)，但是如果对象未患有或未曾患有胰腺炎，则给予替代治疗(例如，化学治疗、放射、激素治疗、手术)。在一些实施方案中，给予对象多种类型的癌症治疗，例如癌症免疫治疗和化学治疗。在一些实施方案中，所公开的方法包括基于来自对象的胰腺组织中CD11c+细胞的存在，将一个或更多个对象鉴定为癌症免疫治疗的候选者。在一些实施方案中，所公开的方法包括基于来自对象的胰腺组织中三级淋巴结构细胞的存在，将一个或更多个对象鉴定为癌症免疫治疗治疗的候选者。
本公开内容的另一些方面包括用于治疗胰腺癌的方法，所述方法包括向确定为在胰腺癌组织中具有三级淋巴结构的对象施用免疫治疗(例如，免疫检查点阻断治疗)。鉴定三级淋巴结构的多种方法是本领域已知的并在本文中预期。例如，在通过对来自对象的肿瘤组织进行病理学和/或形态学分析来鉴定三级淋巴结构之后，可以向对象施用免疫治疗。通过鉴定胰腺癌组织中的三级淋巴结构，可将对象鉴定为免疫治疗的候选者。还预期了治疗方法，其包括刺激患有胰腺癌的对象的胰腺组织中三级淋巴结构的形成，随后用免疫治疗(例如，免疫检查点阻断治疗)进行治疗。用于诱导三级淋巴结构形成的任何方法均可用于所公开的方法中。
III.治疗性组合物的施用
本文中提供的治疗可包括施用治疗剂(例如第一癌症治疗(例如，树突细胞治疗)和第二癌症治疗(例如，免疫检查点阻断治疗))的组合。治疗可以以本领域已知的任何合适的方式施用。例如，第一和第二癌症治疗可以顺序(在不同时间)或同时(在同一时间)施用。在一些实施方案中，第一和第二癌症治疗在单独的组合物中施用。在一些实施方案中，第一和第二癌症治疗在同一组合物中。
本公开内容的一些实施方案涉及包含治疗性组合物的组合物和方法。不同的治疗可以以一种组合物或多于一种组合物(例如2种组合物、3种组合物或4种组合物)施用。可采用药剂的多种组合。
本公开内容的治疗剂可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用。在一些实施方案中，癌症治疗静脉内、肌内、皮下、表面、经口、经皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在一些实施方案中，抗生素静脉内、肌内、皮下、表面、经口、经皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。合适的剂量可基于待治疗的疾病类型、疾病的严重程度和进程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的响应以及主治医师的判断来确定。
治疗可包括多种“单位剂量”。单位剂量被定义为包含预定量的治疗性组合物。待施用的量以及特定途径和制剂在临床领域技术人员的技能决定范围内。单位剂量不需要作为单次注射施用，但可包括在设定时间段内连续输注。在一些实施方案中，单位剂量包括单个可施用剂量。
根据治疗次数和单位剂量二者，待施用的量取决于所期望的治疗效果。有效剂量被理解为是指达到特定效果所需的量。在某些实施方案的实践中，预期在10mg/kg至200mg/kg范围内的剂量可影响这些药剂的保护能力。因此，预期剂量包括以下剂量：约0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、和200、300、400、500、1000μg/kg、mg/kg、μg/天、或mg/天、或其中可推导出的任何范围。此外，这样的剂量可在一天内、和/或在数天、数多周或数月内多次施用。
在某些实施方案中，药物组合物的有效剂量是可提供约1μM至150μM的血液水平的剂量。在另一个实施方案中，有效剂量提供以下的血液水平：约4μM至100μM；或约1μM至100μM；或约1μM至50μM；或约1μM至40μM；或约1μM至30μM；或约1μm至20μM；或约1μM至10μM；或约10μM至150μM；或约10μM至100μM；或约10μM至50μM；或约25μM至150μM；或约25μM至100μM；或约25μM至50μM；或约50μM至150μM；或约50μM至100μM(或其中可推导出的任何范围)。在另一些实施方案中，剂量可提供药剂的以下血液水平(其是由向对象施用的治疗剂产生的)：约、至少约或至多约
1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100μM
或其中可推导出的任何范围。在某些实施方案中，施用于对象的治疗剂在体内被代谢为经代谢的治疗剂，在这种情况下，血液水平可指该药剂的量。或者，到了治疗剂不被对象代谢的程度，本文中讨论的血液水平可指未经代谢的治疗剂。
治疗性组合物的确切量还取决于从业者的判断并且对每个个体是特有的。影响剂量的因素包括患者的身体和临床状态、施用途径、预期的治疗目标(症状的减轻与治愈)，以及对象可能正在接受的特定治疗性物质或其他治疗的效力、稳定性和毒性。
本领域技术人员将理解并意识到，可将μg/kg或mg/kg体重的剂量单位转换并以μg/ml或mM(血液水平)的相当浓度单位(例如4μM至100μM)来表示。还应理解，摄取依赖于物种和器官/组织。待进行的与摄取和浓度测量有关的适用的转换因素和生理假设是公知的，并且将允许本领域技术人员将一种浓度测量转换为另一种浓度测量，并且对本文中所述的剂量、效力和结果做出合理的比较和结论。
IV.试剂盒
本发明的某些方面还涉及包含本发明的组合物或实施本发明方法的组合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可用于评价一种或更多种生物标志物。在某些实施方案中，试剂盒包含、包含至少或包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1,000或更多个探针、引物或引物组、合成分子或抑制剂，或者其中可推导出的任何值或范围和组合。在一些实施方案中，存在用于评价细胞中生物标志物活性的试剂盒。
试剂盒可以包括组分，所述组分可以单独包装或放置在容器，例如管、瓶、小瓶、注射器或其他合适的容器装置中。
也可以在试剂盒中以浓缩量提供单独的组分；在一些实施方案，组分单独提供，其浓度与其在具有其他组分的溶液中的浓度相同。组分的浓度可以提供为1×、2×、5×、10×或20×或更高。
包括用于使用本公开内容的探针、合成核酸、非合成核酸和/或抑制剂用于预后或诊断应用的试剂盒作为本公开内容的一部分。特别考虑的是对应于本文所鉴定的任何生物标志物的任何这样的分子，所述生物标志物包括与生物标志物的全部或一部分相同或互补的核酸引物/引物组和探针，其可以包括生物标志物的非编码序列以及生物标志物的编码序列。
在某些方面中，在一些试剂盒实施方案中包括阴性和/或阳性对照核酸、探针和抑制剂。
实施例
包括以下实施例以表明本发明的一些实施方案。本领域技术人员应理解，在以下实施例中公开的技术代表本发明人发现在本发明的实践中发挥良好作用的技术。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可在所公开的一些具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相同或类似的结果。
实施例1-胰腺炎活化树突细胞并使胰腺导管腺癌对免疫治疗敏感
与胰腺炎相关的炎症提高了胰腺导管腺癌(PDAC)发生和进展的风险。关于T细胞在PDAC进展中的作用现有文献提出了矛盾的描述(15,18,19)。一项在PDAC小鼠中使CD4+和CD8+T细胞耗竭的研究得出T细胞在肿瘤进展中没有作用(15)的结论，而另一项分析胰腺炎诱导模型中肿瘤启动的研究得出CD4+T细胞(18,19)并且特别是Th17亚群(19)促进PDAC中的肿瘤发生的结论。此外，关于调节性T细胞(Treg)在PDAC中的作用存在矛盾的结论(20,21)。一项使用胰腺炎诱导模型的研究得出Treg抑制肿瘤启动的结论(21)，而另一项采用原位系统的研究得出Treg促进PDAC进展的结论(20)。
在本公开内容中，本发明人表明当与自发性胰腺癌小鼠相比时，急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)和慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)显著活化抗原呈递树突细胞(DC)。T细胞对自发性胰腺癌小鼠中的肿瘤发生和存活没有影响，而CD4+T细胞促进患有胰腺炎的小鼠的肿瘤发生。患有胰腺炎同时使CD4+T细胞耗竭导致胰腺癌减弱，这通过阻断CD11c+DC的功能而逆转。CD4+T细胞通过抑制活化的DC促进患有胰腺炎的小鼠中的肿瘤发生。通过慢性胰腺炎或施用常规树突细胞1(cDC1)疫苗募集活化的树突细胞，使免疫治疗抗性PDAC对检查点免疫治疗敏感，从而导致活化细胞毒性CD8+T细胞并显著提高整体存活和治愈。人PDAC的DC浸润与CD8+T细胞的浸润相关，并且预示着更长的疾病特异性存活(disease specific survival，DSS)。本发明人的发现揭示了患有和未患有潜在胰腺炎的PDAC的免疫调节的根本差异，并为组合cDC1疫苗和检查点免疫治疗提供了依据。本发明人的研究表明，具有较高DC浸润或具有慢性胰腺炎史的PDAC患者可受益于检查点免疫治疗。
结果
胰腺炎加速肿瘤启动并募集活化的树突细胞
为了分析胰腺炎对肿瘤启动的影响，本发明人在7w大的KC(Pdx1-Cre；LSL-KrasG12D/+)小鼠中诱导AP，并在AP诱导之后21天处死这些小鼠用于组织学分析(图1A)。使用年龄匹配KC小鼠(约10w)作为对照用于分析肿瘤启动胰腺上皮内瘤(pancreaticintraepithelial neoplasia，PanIN)病变。CP导致三级淋巴结构(TLS)显著提高，尽管在胰腺组织中在AP下观察到提高的趋势(图1B、C)。
如通过组织学表型和细胞角蛋白19(cytokeratin 19，CK19)染色所见到的，AP导致加速KC小鼠中的肿瘤启动(图1D、E)。由于10w的年龄匹配KC小鼠没有稳键的PanIN病变，因此本发明人随后在稍后的时间点(年龄为25w)处分析KC小鼠。6m的较年长KC小鼠与AP诱导的KC小鼠具有类似的PanIN病变百分比(图1D、E)，进一步支持了本发明人的发现：AP导致加速肿瘤启动。本发明人使用25w大的KC小鼠用于分析由胰腺炎诱导的免疫微环境的差异，因为它们与AP诱导的小鼠具有类似的肿瘤启动阶段。类似于早期在野生型小鼠中的研究发现(22)，KC小鼠中的AP提高了PanIN病变以及相关TLS二者中的CD11c+DC的数目(图2A、B)。TLS具有大多数CD11c+细胞的基线水平，PanIN病变对CD11c染色几乎不显示任何阳性。AP导致PanIN病变中CD11c+DC的显著提高，而在TLS中仅观察到适度提高(图2A、B)。以PanIN病变与TLS之间的CD11c+细胞的比率来看，患有AP的KC小鼠的PanIN病变表现出明显更高数目的DC(图2A、B)。髓细胞标志物CD11b免疫染色的进一步分析揭示了与未涉及的正常胰腺相比，PanIN病变中的CD11b+髓细胞显著增加(图2C、D)。在TLS中，当与年龄匹配小鼠相比时，在患有AP的情况下髓细胞浸润提高(图2C、D)，而较年长阶段的匹配KC小鼠显示出类似水平的CD11b浸润，表明髓细胞浸润在胰腺炎和肿瘤进展二者的情况下提高(图2C、D)。与正常胰腺相比，AP和较年长阶段的匹配KC小鼠二者具有较高数目的CD11b+髓细胞，并且胰腺炎本身的存在并未提高PanIN病变中的髓细胞(图2C、D)。用活化标志物MHC-II和CD11c共染色对CD11c+DC区室进行进一步分析揭示了在KC小鼠的PanIN中AP募集MHC-II+CD11c+DC(图2E、F)。
此外，通过免疫染色分析T细胞群表明，CD4+和CD8+T细胞在患有和未患有胰腺炎的KC小鼠的PanIN和TLS中没有显著差异(图3A)。本发明人的分析表明，PanIN病变具有大量CD4+T细胞，这使本发明人进一步表征其不同亚群。通过核转录因子(CD4+Foxp3+:Treg，CD4+GATA3+:Th2细胞，CD4+Roγt+:Th17细胞和CD4+T-bet+:Th1细胞)的表达分析不同CD4+T细胞亚群揭示了在患有和未患有AP的KC小鼠之间没有差异(图3B)。TLS中不同T细胞群的分析揭示了CD4+、CD8+和CD4+Foxp3+细胞在患有和未患有胰腺炎的KC小鼠之间没有差异(图3B)。
T细胞对PDAC中的肿瘤发生和存活没有影响，而CD4+T细胞促进患有胰腺炎的小鼠的肿瘤发生
本发明人接下来检查了通过胰腺炎募集的CD11c+DC对T细胞功能的影响，并探讨了DC与不同T细胞群之间的串流(cross talk)在PDAC中是否具有治疗相关性。为了了解T细胞在患有或未患有潜在胰腺炎的肿瘤中的不同功能，本发明人分析了CD4+或CD8+T细胞群遗传耗竭的小鼠中的肿瘤启动和进展。本发明人将CD4-/-或CD8-/-小鼠与Pdx1-Cre；LSL-KrasG12D/+；P53R172H/+(KPC)杂交并且产生CD4-/-；Pdx1-Cre；LSL-KrasG12D/+；P53R172H/+(KPCCD4-/-)和CD8-/-；Pdx1-Cre；LSL-KrasG12D/+；P53R172H/+(KPC CD8-/-)小鼠。通过免疫标记确认了KPC CD4-/-和KPC CD8-/-小鼠的胸腺、脾和肿瘤中CD4+和CD8+T细胞的耗竭(图4A至D)。KPCCD4-/-和KPC CD8-/-小鼠发生PDAC肿瘤，并表现出与对照KPC小鼠类似的中值存活(图5A)。肿瘤组织学、肿瘤重量和Ki67增殖指数分析未揭示CD4、CD8敲除小鼠与对照KPC小鼠之间的任何差异(图5B至E)。尽管CD4+或CD8+T细胞的耗竭不影响原发性肿瘤生长，但KPC CD4-/-小鼠与KPC小鼠相比肝转移减弱，而CD8+T细胞的耗竭不影响转移(图5F、H)。CD4+或CD8+T细胞的耗竭未改变KPC小鼠中的肺转移(图5G)。该发现与耗竭CD4+T细胞的使用乳腺癌转移模型的早期研究(23)一致。研究表明，CD4+T细胞通过调节肿瘤相关巨噬细胞间接地促进转移(23)。接下来，本发明人在KC、KC CD4-/-和KC CD8-/-小鼠中进行了肿瘤启动的年龄匹配分析(在25w时)。如通过组织学表型或CK19免疫染色所见到的，对这三个小鼠组群中PanIN病变的分析显示在肿瘤启动方面没有显著差异(图6A、B)。本发明人的组群中的KC小鼠均未表现出在本发明人的组群中具有侵袭性癌症的迹象。因此，CD4+或CD8+T细胞在未患有胰腺炎的PDAC小鼠中不影响肿瘤发生、原发性肿瘤生长和存活。
为了了解潜在胰腺炎对胰腺癌启动的影响，在7w大的KC、KC CD4-/-和KC CD8-/-小鼠中用雨蛙素注射诱导AP和CP，并且在3w(对于AP)和8w(对于CP)之后处死这些小鼠以评估肿瘤启动(图6C)(19)。与未患有胰腺炎的小鼠中的肿瘤启动相反，本发明人观察到患有胰腺炎的KC CD4-/-小鼠与KC和KC CD8-/-小鼠相比具有相对较少的PanIN病变(图6D、E)。为了评估这些发现的稳键性，本发明人探讨了在潜在慢性胰腺炎(CP)的背景下CD4+T细胞在肿瘤启动中的作用。在诱导胰腺炎之后8周处死这些小鼠以评估肿瘤组织学。与本发明人在患有AP的KC小鼠中的发现一致，CD4+T细胞促进了患有CP的KC小鼠的肿瘤发生。如通过肿瘤组织学和CK 19免疫染色所见到的，KC CD4-/-小鼠与KC和KC CD8-/-小鼠相比具有较少的PanIN病变(图6D、E)。在患有或未患有胰腺炎的KC小鼠中CD8+T细胞对肿瘤启动没有任何影响。
CD4+T细胞通过抑制树突细胞促进患有胰腺炎的KC小鼠的肿瘤发生
由于在胰腺炎诱导的小鼠中KC CD4-/-小鼠表现出抑制肿瘤启动，因此本发明人假设CD4+T细胞抑制活化的DC，并由此CD4+T细胞的耗竭导致肿瘤启动的抑制。在不存在DC的情况下，CD4+和CD8+T细胞均未在PDAC进展方面发挥任何肿瘤限制或促进作用。为了了解胰腺炎诱导的小鼠中CD4+T细胞与CD11c+DC之间的串流，本发明人用αCD11c抗体处理KC CD4-/-小鼠以确定树突细胞的耗竭是否能挽救肿瘤抑制(图7A)。AP诱导的KC CD4-/-小鼠中的CD11c+DC的耗竭挽救了肿瘤启动(图7B、C)，表明CD4+T细胞抑制DC以促进肿瘤启动。此外，本发明人分析了慢性胰腺炎诱导的KC和KC CD4-/-小鼠中的CD4+T细胞与DC之间的串流。由于AP诱导的KC CD4-/-小鼠具有非常少的PanIN病变，因此本发明人利用CP模型用于进一步分析T细胞-DC相互作用。与在AP诱导的KC小鼠中的本发明人的表型类似，CP提高了CD11c+DC的数目(图7D、E、8A)。尽管在KC与KC CD4-/-小鼠之间未观察到肿瘤启动方面的差异，但是在KCCD4-/-小鼠中CD8+T细胞的数目提高(图7F)。然而，由于在未患有胰腺炎的情况下发生的PanIN中缺乏抗原呈递DC，因此提高CD8+T细胞并未导致抑制KC CD4-/-小鼠中的肿瘤启动，如前所见到的(图6A、B)。尽管胰腺炎本身不会改变PanIN病变中的T细胞组成，但是患有CP的KC小鼠显示出CD11c+DC之间的接触提高并且CD4+T细胞对CD11c+DC产生抑制性影响(图7G)。CD4+T细胞的耗竭去除了其对DC的抑制作用，从而提高了CD11c:CD8+T细胞相互作用，导致在存在胰腺炎的情况下的肿瘤生长抑制(图7H、I)。在KC CD4-/-慢性胰腺炎小鼠中，本发明人观察到CD11c+DC与CD8+T细胞之间的相互作用提高，而患有CP的KC对应小鼠显示出CD11c+DC与抑制性CD4+T细胞之间的相互作用(图7D、G、H)。总体上，结果表明急性和慢性胰腺炎二者均可向KC小鼠的胰腺募集树突细胞。尽管抗原呈递提高，但是在存在胰腺炎的情况下，KC小鼠中抑制性CD4+T细胞的优势超过了DC的作用，导致肿瘤进展。胰腺炎诱导小鼠中CD4+T细胞的耗竭使得能够通过DC将抗原呈递至CD8+T细胞，导致抑制KC CD4-/-小鼠中的肿瘤启动。
野生型和患有胰腺炎的PDAC小鼠的胰腺免疫浸润物的表征
为了分析胰腺炎对正常胰腺免疫浸润物的影响，本发明人在野生型(wildtype，WT)小鼠中通过注射雨蛙素(与胰腺炎发病机制有关的胆囊收缩素的类似物)诱导急性和慢性胰腺炎，如前所述(18,19)(图9A)。与胰腺炎的诱导一致，在胰腺炎诱导之后7天，本发明人观察到与对照相比，雨蛙素注射WT小鼠中的血清淀粉酶和脂肪酶提高(图10A)。在开始雨蛙素注射之后第4天(对于急性胰腺炎-AP)和第14天(对于慢性胰腺炎-CP)，本发明人利用基于流式细胞术或质谱细胞术(mass cytometry)(CyTOF)的系统方法来鉴定免疫群。在患有AP的WT小鼠中，使用R软件用针对CD45+细胞(手动设门)的无监督层次聚类对CyTOF数据进行的FlowSOM分析鉴定了18种元簇(MC)，将所述元簇分组为B细胞(MC 1-2)、T细胞(MC 3-6)、DC(MC 7-10)和髓细胞(MC 11-17)群(图9B至G)。为了将CD11c+细胞分类为DC和髓细胞MC，将F4/80-Ly-6G-CD11c+细胞分类为DC MC，并将F4/80+或Ly-6G+CD11c+细胞分组为髓细胞MC。有关WT小鼠和WT-AP小鼠中这18种MC的viSNE图在图9B中示出。在T和B细胞群中，AP导致CD40+CD19+B细胞(MC1)(图9B至D)，以及CD4-和CD8-阴性(CD3+CD4-CD8-T-MC3、CD3+CD4-CD8-Ly-6C+-MC6)T细胞以及CD45+CD3+CD8+T(MC5)比例下降(图9B至E)。然而，AP未导致CD3+CD4+T(MC4)细胞的任何显著差异，尽管在AP下观察到下降趋势。在DC群中，AP导致CD11bint CD11c+(MC8)DC的比例提高(图9B至F)。此外，AP导致CD11b+Ly-6G+F4/80+CD11c+(MC11)、CD11b+Ly-6G+CD11c+(MC12)、CD11b+Ly-6Gint Ly-6C+(MC14)和CD11b+Ly6-G+F4/80+(MC16)髓细胞群的比例提高(图9B至G)。AP未导致B细胞MC(MC2)、DC MC(MC 7、9)和髓细胞MC(MC 13、15、17)的差异(图9D至G)。然而，在AP小鼠中看到一个次要DC群PD-L1+CD40+CD80+CD11bint CD11c+(MC10)的比例下降(图9F)。通过CyTOF数据的Boolean设门的免疫表型分析也确认了AP导致T细胞(CD3+)、CD8+T细胞(CD3+CD8+)、B细胞(CD19+CD3-)的频率降低，同时伴随髓细胞(CD11b+)和DC(CD11c+)的提高(图10B)。尽管患有AP的CD4+T细胞(CD3+CD4+)具有下降的趋势，但是这在统计学上不显著(图10B)。为了确认AP中的发现的稳键性，本发明人还在雨蛙素注射之后通过流式细胞术对患有慢性胰腺炎的WT小鼠中的胰腺免疫浸润物进行了免疫表型分析。与在AP小鼠中观察到的表型类似，CP还导致T细胞、CD4+和CD8+T细胞的比例降低，同时伴随髓细胞和DC群的提高(图9H)。
接下来，本发明人分析了患有CP的荷原位iKPC*(P48-Cre；tetO-LSL-KrasG12D/+；P53L/L)肿瘤小鼠的胰腺免疫浸润物(图11A)。通过在本发明人实验的整个过程中在饮用水中补料多西环素来维持四环素诱导型iKPC*小鼠中KrasG12D/+的胰腺特异性表达。对于CP诱导，本发明人如前所述一致地诱导胰腺炎持续3周(19)并随后分析所有发明人模型的肿瘤启动和存活。但是，为了分析免疫浸润物，本发明人选择了2周时间点，因为部分iKPC*小鼠早于3周达到终点。用无监督层次聚类对CyTOF数据进行的FlowSOM分析鉴定了16种元簇(MC)，将所述元簇分组为B细胞(MC 1)、T细胞(MC 2-6)、DC(MC 7、8、15)和髓细胞(MC 9-14)群(图11B至G)。有关这16种MC的viSNE图在图11B中示出。iKPC*小鼠中的CP导致CD45+CD11c+MC(MC7)的比例提高，而未看到B细胞、T细胞和髓细胞MC的显著差异(图11B至G)。对患有CP的iKPC*小鼠的CyTOF和流式细胞术数据的免疫表型分析也揭示了CD11c+DC的比例提高，而未看到T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞和髓细胞的变化(图11G、10C)。
目前，本发明人确定了胰腺炎募集WT和iKPC*原位小鼠中的CD11c+DC，本发明人还表征了WT和iKPC*小鼠中伴随CP的CD11c+群。本发明人研究了这些CD11c+DC是否表达活化标志物例如CD86和CD40。对流式细胞术数据的免疫表型分析揭示了CP提高了WT和iKPC*小鼠二者的CD86+CD11c+DC的比例，并且在iKPC*小鼠中显示出CD40+CD11c+DC的提高趋势(图11H)。尽管胰腺炎诱导CD11c+细胞百分比提高，但是鼠巨噬细胞也经常表达树突细胞标志物例如CD11c和MHC-II(24)。因此，本发明人确认了胰腺炎导致WT和iKPC*原位小鼠二者中的MHC-II+F4/80-CD11c+细胞(设门为％CD45+Lin(CD3，NK1.1，Ly-6G，CD19)-细胞)提高(图11I)。对DC的最新表征揭示了不同DC亚群的不同功能、表达谱和特性，并将其分为常规DC(cDC)、浆细胞样DC(plasmacytoid DC，pDC)和单核细胞性DC(monocytic DC，mDC)(24-26)。在常规DC中，cDC1在诱导抗原特异性T细胞应答以抑制肿瘤方面是重要的，而cDC2参与促进肿瘤生长的致耐受性免疫应答(25)。本发明人将cDC1表征为CD45+Lin-CD11c+B220-CD172a-CD64-Ly-6C-CD11b-MHC II+XCR1+细胞，并将cDC2表征为CD45+Lin-CD11c+B220-CD172a+CD64-Ly-6C-CD11b+细胞。pDC在I型干扰素应答中至关重要，并且可发展为抗原呈递细胞以活化T细胞，而mDC在炎症和自身免疫病理状况中生成(24)。本发明人将pDC表征为CD45+Lin-CD11c+B220+SIGLEC H+细胞，并将mDC表征为CD45+Lin-CD11c+B220-CD172a+CD64-Ly-6C+细胞(24)。对WT和iKPC*小鼠中cDC的分析表明CP导致WT和iKPC*小鼠二者中cDC1的比例提高(图11J)。尽管CP导致WT小鼠中cDC2的比例提高以及pDC降低，但是iKPC*小鼠未表现出cDC2的任何显著差异(图10D、E)。在患有CP的WT和iKPC*小鼠二者中均未看到mDC的差异(图11G)。
对胰腺免疫浸润物的表征表明胰腺炎募集WT和iKPC*原位小鼠二者中的CD11c+DC。尽管在患有胰腺炎的WT小鼠中看到骨髓增生和T细胞抑制，但是在这些群体中荷瘤小鼠未表现出任何差异。对WT小鼠中T细胞的进一步分析揭示了在患有AP和CP小鼠中增殖的CD8+T细胞比例降低(图12A)。CD8+GrnzB+细胞的比例在患有AP的小鼠中未发生变化，但显示出在患有CP的小鼠中显著降低(图12B)。此外，AP和CP二者均导致表达CD8+(细胞毒性效应T细胞)和CD4+细胞(Th1细胞)的T-bet比例降低(图12C、D)。然而，与对照相比，在AP和CP小鼠的CD8+T细胞上未观察到耗竭标志物PD1和TIM3的差异(图12E、F)。出乎意料的是，本发明人还观察到患有AP和CP二者的WT小鼠中调节性T细胞(CD4+Foxp3+细胞)降低(图12G)。
总之，这些结果表明胰腺炎提高了iKPC*原位和WT小鼠二者胰腺中CD11c+DC的比例。此外，本发明人表明活化的DC和抗原呈递cDC1提高。另外，WT型小鼠中的AP和CP产生骨髓增生和T细胞抑制应答，降低增殖的和产生颗粒酶B的CD8+T细胞。此外，AP和CP诱导表达T-bet的效应物CTL和Th1细胞的频率降低，表明T细胞抑制代表了防止对患有胰腺炎之小鼠的胰腺的自身免疫细胞毒性损伤的宿主反应。在抑制细胞介导的细胞毒性的环境中，在AP和CP下T reg的进一步降低表明在该情况下的外周耐受机制和总T细胞群的克隆耗竭。
胰腺炎将活化的树突细胞募集至KPC小鼠的免疫微环境
本发明人接下来探讨了患有胰腺炎的WT与iKPC*原位小鼠之间胰腺免疫浸润物的差异是否可归因于由于胰腺注射iKPC*癌细胞而引起的基线炎症。为了排除由于原位肿瘤注射而引起的基线胰腺炎的影响，本发明人分析了患有CP的胰腺浸润的KPC(Pdx1-Cre；LSL-KrasG12D/+；P53R172H/+)。本发明人在8w大的KPC小鼠中诱导CP，并进行CyTOF分析(类似于iKPC*小鼠)以鉴定通过胰腺炎募集的免疫浸润物(图13A)。本发明人使用年龄匹配KPC小鼠(约10w)作为对照以用于分析免疫浸润物。CP加速了KPC小鼠中的肿瘤生长(图13B)。用无监督层次聚类对CyTOF数据进行的FlowSOM分析鉴定了15种元簇(MC)，将所述元簇分组为B细胞(MC 1)、T细胞(MC 2-4)、DC(MC 5、6)和髓细胞(MC 7-15)群(图13C至G)。有关这15种MC的viSNE图在图13C中示出。10w的KPC对照比其经CP处理的对应物具有更少的CD45+淋巴细胞。因此，在viSNE图中示出了来自KPC-10w和KPC-CP小鼠胰腺的相等数目的代表性淋巴细胞群(图13C)。与在iKPC*小鼠中观察到的表型类似，CP未导致B和T细胞(MC 1-4)百分比的任何变化(图13C至E、H)。在DC MC中，观察到CD11c+PDL1+DC(MC 5)百分比显著提高(图13C、D、F)。在髓细胞MC中，CD11c+CD11b+F4/80+CD40+CD80+(MC7)和CD11c+CD11b+F4/80+(MC8)，CD11b+PDL1+CD80+(MC12)，CD11b+PDL1+CD80+F4/80+(MC14)和CD11b+Ly-6G高/+Ly-6C低/-(MC15)的百分比显著提高(图13C至G)。KPC Vs.iKPC*小鼠中髓细胞群的比较表明，iKPC*小鼠中的F4/80+CD11c+MC(MC9、10)(图11C、E)是与原位胰腺注射相关的炎症的结果。在由于雨蛙素注射而存在CP的情况下，这些F4/80+CD11c+群没有进一步提高(图11C、E)。而在自体KPC小鼠中，F4/80+CD11c+MC(MC7、8)在对照小鼠中几乎不存在(图13G)，并且在存在CP的情况下显著提高。在患有CP的iKPC*和KPC小鼠二者中，iKPC*中的CD11c+CD11b-F4/80-DC MC即MC-7(图11C、E)和KPC中的MC-5(图13G)可能代表参与抗原呈递的DC。另外，CP还在KPC小鼠中募集CD11b+F4/80+巨噬细胞(MC-11、14)(图13G)。因此，雨蛙素诱导的CP和原位注射导致还表达CD11c的炎性F4/80+巨噬细胞的募集。此外，在iKPC*和KPC小鼠模型二者中，雨蛙素诱导的CP募集了对F4/80呈阴性的抗原呈递DC。
胰腺炎和DC疫苗使荷原位iKPC*肿瘤小鼠对检查点免疫治疗敏感
本发明人接下来确定了DC疫苗和iKPC*肿瘤中的CP是否使PDAC对检查点免疫治疗敏感。用iKPC*细胞对6至8周龄的B6小鼠进行原位注射，并用雨蛙素处理两个小鼠组群以诱导慢性胰腺炎。用组合检查点免疫治疗处理患有和未患有CP的荷iKPC*原位肿瘤小鼠(图14A)。另一小鼠组群用指定的DC疫苗和组合检查点免疫治疗进行处理(图14A)。未患有CP的iKPC*原位小鼠对组合检查点免疫治疗无应答，而CP使这些小鼠对免疫治疗敏感(图14B、15A、B)。CP未显著缩短荷原位肿瘤iKPC*小鼠的存活(图14B、15C)。此外，用DC疫苗和组合检查点免疫治疗进行处理导致这些小鼠中的肿瘤生长抑制和增强的存活(图14B、15D)。在DC疫苗和CP下，经组合免疫治疗处理的小鼠中的相当一部分(5只小鼠中的2只)表现出原位iKPC*肿瘤清除。本发明人接下来分析了在来自原位注射之后第21天在2剂DC疫苗治疗之后的经DC疫苗和组合检查点免疫治疗处理的小鼠的免疫浸润物(图14A)。经DC疫苗+αCTLA4+αPD1处理的小鼠与经同种型处理iKPC*小鼠相比具有更低的肿瘤重量(图16A)，并且与同种型小鼠相比，cDC1的频率提高并伴随cDC2(以CD45+Lin-细胞的百分比设门)的降低(图16B)。经DC疫苗+αCTLA4+αPD1处理的小鼠表现出较高比例的CD8+T细胞(图14C)。对这些小鼠中T细胞的进一步分析揭示了在经DC疫苗+αCTLA4+αPD1处理的小鼠中，增殖的、表达颗粒酶B和T-bet的CD8+T细胞提高，伴随CD4+Foxp3+(Treg)细胞的降低(图14C至E)。尽管没有观察到Th1群的差异，但是经DC疫苗+αCTLA4+αPD1处理的小鼠显示出CD8/Treg比率提高和Th1/Treg比率的提高趋势，尽管这不如CD8/Treg比率一样稳键(图14F、G)。对耗竭标志物的分析揭示了在CD4+和CD8+T细胞中PD1表达降低，而在经DC疫苗+αCTLA4+αPD1处理的小鼠中没有观察到TIM3表达的差异(图16C、D)。对与T细胞记忆和对T细胞的活化相关的CD69标志物的分析揭示了可防止肿瘤复发的CD3+CD69+和CD8+CD69+T细胞的频率提高(图16E)。
接下来，本发明人分析了具有CP和组合检查点免疫治疗的iKPC*肿瘤(在iKPC*原位注射之后2周)中的免疫浸润物。与经同种型处理的iKPC*小鼠相比，患有CP的iKPC*小鼠具有更高的肿瘤重量(图16F)。此外，与经同种型和检查点处理的iKPC*小鼠相比，用组合检查点免疫治疗处理的患有CP的iKPC*小鼠具有更小的肿瘤(图16F)。免疫浸润物分析揭示了在用组合检查点免疫治疗处理的具有CP的iKPC*小鼠的肿瘤微环境中，CD3+和CD8+T细胞的比例提高(图14H)。对这些小鼠中T细胞的进一步分析揭示了在用αCTLA4+αPD1处理的CP小鼠中，增殖的、表达颗粒酶B和T-bet的CD8+T细胞提高，伴随CD4+Foxp3+(Treg)细胞的降低(图14H至J)。此外，在患有和未患有CP的检查点免疫治疗组二者中，CD8+T细胞均表现出PD1活性降低，而在组之间没有观察到表达TIM3的CD4+和CD8+T细胞的差异(图16G、H)。在任何组之间均未观察到Th1细胞群的差异(图14J)。然而，在用αCTLA4+αPD1处理的CP小鼠中观察到CD8/Treg比率提高和Th1/Treg比率提高(图14K、L)。用组合检查点免疫治疗处理的CP小鼠也表现出表达CD69的CD3+和CD8+T细胞提高(图16I)。总之，本发明人的结果表明，由于TME中缺乏抗原呈递DC，因此PDAC肿瘤对检查点免疫治疗具有抗性。DC疫苗治疗和慢性胰腺炎募集抗原呈递DC，使PDAC可接受组合检查点免疫治疗。
胰腺炎使PanIN病变对检查点阻断敏感
接下来，本发明人探讨了潜在胰腺炎的存在是否使PanIN病变对检查点阻断敏感。在患者和临床前模型中进行的多项研究已确定，检查点免疫治疗未能在PDAC中产生持久的存活应答(11-13)。本发明人研究了在AP期间在存在募集的抗原呈递树突细胞的情况下，αCTLA4+αPD1或αPD1单一治疗的组合是否会抑制肿瘤启动(图17A)。当第3周之后处死KC小鼠以分析检查点阻断应答时，本发明人观察到与患有AP的同种型和未经处理的KC小鼠相比，患有胰腺炎的经αCTLA4+αPD1和αPD1处理的KC小鼠中的PanIN降低(图17B、C)。因此，本发明人的结果表明潜在胰腺炎的存在使KC小鼠对检查点阻断敏感。
胰腺炎和DC疫苗治疗使原位KPC肿瘤对检查点阻断敏感
接下来，本发明人在第二原位肿瘤模型中验证了来自iKPC*模型的本发明人的发现。本发明人利用原位KPC 689肿瘤模型来确定与DC疫苗组合的检查点免疫治疗的影响及其在限制已确定患有潜在胰腺炎的PDAC中的作用(图17D)。用5×105个生物发光KPC689GFP-Luc细胞(用GFP-Luc转染的Pdx1-Cre；LSL-KrasG12D/+；P53R172H/+细胞)对6至8周龄B6小鼠进行原位注射。如前所述同时用雨蛙素处理一个小鼠组群以诱导CP，持续3周，而另一小鼠组群允许在不存在CP的情况下发生肿瘤。在一周之后在进行基线IVIS成像之后，用DC疫苗和检查点免疫治疗处理荷瘤小鼠(图17D)。在不存在CP的情况下，与经同种型处理的小鼠相比，组合检查点免疫治疗(αCTLA4+αPD1)未导致肿瘤生长抑制或显著的存活改善(图17D至F，18A)。尽管CP的存在加速了KC小鼠中的肿瘤启动，但是慢性胰腺炎并未导致荷KPC689肿瘤小鼠存活的统计学显著缩短(图17G、18B)。在存在慢性胰腺炎的情况下，组合检查点免疫治疗导致KPC689肿瘤的清除(图17E、F，18C)。施用DC疫苗也提高了患有和未患有CP的小鼠的存活(图17E、F，18D、E)。在经DC疫苗处理的小鼠中施用组合检查点免疫治疗增强了患有和未患有CP的小鼠中的KPC 689肿瘤的清除(图17E、F，18F、G)。总之，这些结果表明，通过DC疫苗治疗或慢性胰腺炎募集到胰腺TME的活化的树突细胞使肿瘤对检查点免疫治疗敏感。此外，为确定清除肿瘤的3个小鼠组群(即DC疫苗+αCTLA4+αPD1、CP+DC疫苗+αCTLA4+αPD1、CP+αCTLA4+αPD1)中的T细胞记忆，本发明人在第85天用KPC 689细胞的原位注射再攻击这些小鼠(图17E)。在再攻击之后10天，IVIS成像揭示了在任何组中均不存在肿瘤(图17E)。所有处理组群的代表性IVIS图像在图19A中示出。
接下来，本发明人探讨了由KPC689细胞表达的GFP是否增强了对胰腺癌细胞的免疫原性，从而导致响应于DC疫苗和检查点免疫治疗的肿瘤清除。在鼠模型中利用表达GFP的肿瘤细胞系的研究已经表明，与其亲本肿瘤细胞系相比，抗肿瘤免疫应答增强(27,28)。为了评估GFP在本发明人的模型中引发抗肿瘤免疫应答的影响，本发明人比较了荷有亲本与表达GFP-Luc的KPC 689肿瘤的小鼠的基线存活。在荷有亲本与表达GFP-Luc的肿瘤的小鼠之间未观察到显著的存活差异(图17E)，表明GFP-Luc的表达未导致免疫编辑应答。此外，当在具有或不具有GFP的肿瘤裂解物中与受刺激的CD103+cDC1细胞共培养时，本发明人评价了CD8+T细胞体外活化。本发明人使用卵清蛋白特异性CD8+T细胞(OT-1细胞)作为CD8活化的阳性对照。在cDC1和CD8+T细胞与亲本或表达GFP-Luc的KPC689肿瘤细胞裂解物共培养4天之后，本发明人分析了CD8+T细胞活性和耗竭，包括CD8+T细胞上的％CFSElo、CD25、CD44和PD1表达。本发明人在具有和不具有TLR激动剂poly(I:C)的组之间观察到轻微差异，但是与OT-1条件相比，变化是微不足道的(图19B至D)。因此，具有和不具有GFP Luc的两种KPC689肿瘤细胞裂解物均表现出类似的CD8+T细胞活化水平，表明GFP不可能有助于增强肿瘤清除。本发明人接下来分析了终点处的经DC疫苗、慢性胰腺炎和检查点免疫治疗处理的小鼠的肿瘤组织学。本发明人的数据表明，具有αCTLA4+αPD1、DC疫苗+αCTLA4+αPD1的CP小鼠和具有DC疫苗+αCTLA4+αPD1处理的CP小鼠清除了肿瘤，并且即使在这些小鼠的亚群中在肿瘤再攻击之后也显示出完全正常的胰腺组织学(图20A、B)。
在人PDAC中，肿瘤浸润树突细胞与CD8+T细胞浸润和更好的预后相关
基于DC在调节鼠PDAC中T细胞应答和存活方面的影响，本发明人接下来评估了DC在人PDAC背景中的贡献。本发明人对治疗原初人PDAC肿瘤微阵列(tumor microarray，TMA)样品中的CD4、CD8、Foxp3和CD11c标志物进行了免疫染色。对这些PDAC TMA中CD4+、CD8+、Treg和CD11c+细胞的分析表明，肿瘤浸润的CD8+T细胞与CD11c+树突细胞之间具有良好的相关性(R2＝0.66)(图21A、B)。在人PDAC中，DC浸润与CD4+T细胞的相关性较弱(R2＝0.51)，并且与Treg浸润的相关性较差(R2＝0.2)(图21A、B)。本发明人接下来基于肿瘤浸润细胞的中值数将每种细胞类型的肿瘤划分为“高”和“低”，以分析这些患者中的疾病特异性存活(图22)。与CD11c低的PDAC患者相比，CD11c高的患者具有显著更长的疾病特异性存活(DSS)(图21C)。尽管肿瘤浸润的CD11c+DC与CD8+T细胞之间具有良好的相关性，但是CD8+T细胞并不能预测PDAC患者的存活(图21D)。此外，CD4+T细胞和Treg浸润不能预测人PDAC肿瘤中的存活(图21E、F)。接下来，本发明人分析了来自TCGA-Pancan数据集的173名未经治疗的患者中的DC浸润，所述数据集对人PDAC肿瘤进行了大量RNA测序。尽管TCGA数据集中的ITGAX RNA表达(CD11c+细胞的标志物)在TCGA数据集中没有对存活进行分层(图23A至B)，但是本发明人鉴定了更高的BATF3表达，所述BATF3是对人中的cDC1具有特异性的标志物，预测PDAC患者的更好预后(图22A)。人PDAC分析揭示了DC在改变PDAC病程中发挥重要作用，并且肿瘤浸润性DC的缺乏可导致PDAC对T细胞靶向治疗的难治性。
总之，这些研究提供了T细胞功能及其与PDAC TME中的DC的相互作用的全面的背景依赖性分析。通过胰腺炎或通过外源性施用CD103+cDC1疫苗募集的抗原呈递DC的存在，使PDAC TME对检查点免疫治疗敏感。这些研究表明，具有慢性胰腺炎病史的患者可受益于免疫治疗，并且为PDAC中组合DC疫苗与检查点免疫治疗或CD4+T细胞靶向治疗提供了依据。
材料和方法
动物研究：先前已描述了Pdx1-cre；LSL-KrasG12D/+；P53R172h/+(KPC)和Pdx1-cre；LSL-KrasG12D/+(KC)小鼠的基因分型和肿瘤进展(31)。本发明人将KPC与CD4-/-(Cd4tm1Mak)(32)或CD8-/-(Cd8tm1Mak)(33)小鼠(二者均由Dr.Tak Mak,University Health Network-University of Toronto友情提供)杂交，以获得KC、KC CD4-/-和KC CD8-/-、KPC、KPC CD4-/-和KPC CD8-/-小鼠。对于原位实验，在6至8w大的B6小鼠的胰腺中注射5×105个原代PDAC细胞系，即KPC689 GFP Luc细胞系(34)和iKPC*细胞系(35)(由Dr.Haoqiang Ying友情提供)。iKPC*细胞系具有四环素诱导型tetO-LSL KrasG12D/+等位基因，并且在整个实验中与原位注射同时开始维持在多西环素(doxycycline，Dox)水(Dox 2g/L，蔗糖20g/L)中。对于肿瘤再攻击研究，在首次注射之后第85天将5×105个KPC689 GFP Luc细胞注射至胰腺中。在所有实验组的统一条件下，使用IVIS成像(Xenogen谱)监测KPC 689GFP Luc细胞系注射的肿瘤辐射率(光子s-1cm-2sr-1)。用萤光素(100mg/kg，浓度为10mg/ml)腹膜内注射小鼠，并在注射之后10分钟在异氟醚麻醉下进行成像。对于胰腺炎诱导，以100μL(剂量-50μg/kg/只小鼠)的最终体积注射雨蛙素，一天四次(六小时制注射，对于急性胰腺炎隔日注射并且一周三次，持续3周，以诱导慢性胰腺炎，如前所述(19)。对于中和CD11c+DC的实验，在第0、5、10和15天对每只小鼠腹膜内注射500μg抗小鼠CD11c(ThermoFisher scientific，N418)(1mg/mL)。对于检查点免疫治疗，如下指示腹膜内注射抗小鼠CTLA4(BioXcell，9H10，BE0131)和/或抗小鼠PD-1(BioXcell，29F.1A12，BE0273)三次：开始剂量为200μg，随后是100μg的2次剂量，其各自分别在200μL和100μL PBS的最终体积中。以与制造商推荐的中和抗体的相同途径、时间和给药用各自的同种型抗体处理对照小鼠。对于DC疫苗，每周腹膜内注射1.5至2×106cCD1，在KPC 689GFP Luc小鼠中持续4周并且在荷iKPC*原位肿瘤小鼠中持续2周。
DC疫苗：已描述了CD103+cDC1疫苗的制备(30,36)。简言之，在RBC裂解之后产生B6小鼠(6至10w大的)骨髓培养物，浓度为在补充有50ng/mL hFIt3-L(PeproTech，10773-618)和2ng/mL GM-CSF(PeproTech，315-03)的cRPMI(10％热灭活胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)(Atlanta Biologicals，Atlanta，Georgia，USA)、1％青霉素-链霉素、1mM丙酮酸钠和50μMβ-巯基乙醇)中为1.5×105个细胞/mL。在第5天用5mL cRPMI补充培养物，并随后在第9天以3×105个细胞/mL的浓度补充相同量的hFIt3-L和GM-CSF来重新平板接种非贴壁细胞(non-adherent cell)。在第15至17天收集具有非贴壁细胞的上清液以用于与肿瘤裂解物共刺激。针对以下标志物对细胞沉淀物进行染色：CD11c、B220、CD24、CD172a和CD103。在FACS aria融合分选仪上分选cDC1(L/D-CD11c+CD24+CD172-CD103+B220-)，并在cRPMI中以2至4×106个细胞/mL平板接种，与从KPC 689GFP Luc或IKPC*细胞制备的肿瘤裂解物(裂解物:cDC1比率＝2:1)共刺激。用20μg/mL Poly I:C(Sigma-Aldrich，P4929)和2ng/mL GM-CSF补充培养物持续4小时。随后，将1.5至2×106cDC1重悬于100μL PBS中，并按指示进行腹膜内注射。
对于比较KPC689 GFP Luc肿瘤裂解物vs.KPC亲本肿瘤裂解物的体外CD8+T细胞刺激实验，本发明人用poly I:C、各自的肿瘤裂解物(cDC1:肿瘤细胞裂解物的比率＝2:1)或用二者刺激cDC1。本发明人以1×105个细胞/mL浓度平板接种T细胞和cDC1，在96孔板中各100μL。在孵育之后，将细胞离心(spun down)并在FACS缓冲液中洗涤。然后，在冰上用CD3、CD8、PD1、CD25和CFSE的抗体的混合物对细胞染色30分钟。在1.6％甲醛中固定细胞并通过流式细胞术分析。所有抗体均以1:200的浓度使用以用于cDC1分选和CD8+T细胞刺激实验。
免疫染色：对于单染色免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)，将5μm厚的福尔马林固定的石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded，FFPE)载片进行脱蜡，并在指定的缓冲液中于95℃下进行抗原提取，持续20分钟。对于CK19、CD11b、CD68和CD11c染色使用柠檬酸盐缓冲液(pH＝6)，而对于CD4、CD8和Ki67染色使用Tris-EDTA缓冲液(pH＝9)进行抗原提取。随后，将载片在PBST(0.1％吐温20)中的1.5％牛血清白蛋白中封闭30分钟。然后将载片在PBS中的3％ H2O2中孵育15分钟。将第一抗体CK19(Abcam，Ab52625，1:250)，CD11b(Abcam，Ab133571；1:500)、抗小鼠CD11c(Cell signaling technology，CST 97585S，1:350)、抗人CD11c(Abcam，Ab52632，1:100)、CD4(Abcam，Ab183685，1:400)、CD8(Cellsignaling technology，98941s，1:250)和Ki67(ThermoScientific，RM-9106-S，1:100)在PBST中的1.5％ BSA中稀释，并在4℃下孵育过夜。对于所有IHC，将切片与生物素化的二抗孵育30分钟，随后用ABC试剂盒(VECTASTATIN，ABC kit，Standard，PK-6100)孵育30分钟。接下来，进行DAB和苏木精复染色，并通过检查多个随机视野量化DAB阳性。对于CD68(M0814，Dako，1:200)免疫染色，遵按照造商的说明使用小鼠-小鼠(Mouse-on-Mouse，MOM)试剂盒(Vector Laboratories)。对于KPC、KPC CD4-/-和KPC CD8-/-小鼠的胸腺和脾，将5μm厚的低温恒温器OCT切片在4℃下在丙酮中固定持续5分钟，在PBS中的1.5％ BSA中封闭30分钟，用在PBS中的1.5％ BSA中的第一抗体-CD4(Abcam，Ab183685，1:400)或CD8(Abdserotec，MCA1767T，1:100)(RT下1小时)，以及二抗(山羊抗兔(H+L)，Alexa Fluor Plus 488，ThermoFischer，A32731，针对CD4第一为1:250或者山羊抗大鼠IgG(H+L)，Alex Fluor 400，针对CD8第一为1:250)(RT下30分钟)进行染色。
其他地方已经描述了使用酪胺信号传导扩增(Tyramide signalingamplification，TSA)进行的免疫荧光染色(37)。
流式细胞术：将肿瘤或胰腺切碎，并在5mL胶原酶P、1.5mg/mL(Sigma-Aldrich)HBSS中于37℃下消化20分钟。随后，在cRPMI中进行多次洗涤，并使用70μm过滤器(Corning352350)过滤并离心。洗涤细胞并重悬于FACS缓冲液中。随后，在RBC裂解缓冲液(Thermofisher，00-4300)中孵育5分钟。将细胞在冰上用以下避光染色30分钟：稀释于FACS缓冲液中的100μL表面抗体混合物、20％brilliant染色缓冲液(BD Bioscience，566349)、活/死染色液(eBioscience，65-0865-14)和50μg/mL抗小鼠CD16/32(TONBO biosciences，40-0161)。对于细胞内染色，将细胞固定并在Foxp3/转录因子染色缓冲液组(eBioscience，00-5523-00)中透化，并与在固定/透化稀释液(eBioscience，00-5223)中稀释的细胞内抗体孵育30分钟。随后，将细胞用固定缓冲液(BD Bioscience 554655)固定，并使用Fortessa-X20获得数据并用FlowJo v10进行分析。
质谱细胞术：如前在流式细胞术部分中所述，切碎并消化肿瘤或胰腺。在RBC裂解之后，流式分选CD45+淋巴细胞，并将1×106个细胞用于在室温下以在maxpar细胞染色缓冲液(Fluidigm，201068)中100μL的最终体积用具有抗小鼠CD16/32(TONBO biosciences，40-0161)的抗体混合物(表4)染色30分钟。在maxpar PBS(Fluidigm，201058)中以5μM的最终浓度添加顺铂(Fluidigm，201064)生存力染色。在室温下将细胞在从maxpar PBS中的16％甲醛贮备安瓿(Thermofisher，28906)稀释的1.6％甲醛溶液中固定10分钟。然后，在MaxparFix和Perm缓冲液中制备的最终浓度为125nM的Cell-ID Intercalator Ir(Fluidigm，201192A)中在4℃下过夜孵育细胞。将细胞重悬于maxpar水(fluid GM，201069)中，并在Fluidigm Helios质谱血细胞仪中进行分析。在Flowjo(10.7.1版)中对质谱细胞术数据进行初步处理和手动设门。导出具有相同百分比的每个样品中的活CD45+细胞，并用于下游聚类分析。本发明人使用R(4.0.2版)包CyTOF workflow(1.7.2版)中描述的方法进行下游分析。具体地，采用R包FlowSOM(1.20.0版)使用以下参数来计算性定义初始细胞簇：CD45、PD-L1、CD40、CD80、CD19、CD11b、Ly-6G、F4/80、Ly-6C、CD3e、PD-1、CD8a、CD4和CD11c，随后基于热图鉴定细胞元簇。采用t-随机邻域嵌入(t-stochastic neighbor embedding，t-SNE)和R包分散(1.16.2版)进行降维分析。
统计学分析：使用GraphPad Prism 8和R-studio进行统计测试。为评估分布的正态性，使用Shapiro-Wilk检验来评估分布的正态性。对于具有连续变量的组的比较，正态分布采用参数未配对T检验，并且非正态分布采用Mann-Whitney检验。通过双因素ANOVA评估组织学表型的相对百分比的比较。采用对数秩检验比较Kaplan-Meier存活曲线。通篇的P值：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns：不显著。
PDAC-TMA和TCGA数据集分析：对于PDAC-TMA数据集，从存档的PDAC试样的FFPE肿瘤块中选择2至3个核心，并产生核心面积为1mm2的TMA。使用连续切片进行CD4-CD8-Foxp3和CD11c染色。对129个处理原初样品进行染色以分析这些肿瘤中的免疫浸润。使用处理172个原初样品的胰腺腺癌(Pancreatic adenocarcinoma，PAAD)基因表达数据和从UCSC Xena(DOI：10.1038/s41587-020-0546-8)下载的临床数据进行TCGA存活分析。在UCSC Xena中通过对数2对基因表达进行归一化。本发明人基于中值基因表达将肿瘤样品划分为两组，并在prism中绘制疾病特异性存活(DSS)以生成Kaplan-Meier存活图。
***
根据本公开内容，本文中公开和要求保护的所有方法均无需过度实验即可进行和实施。尽管已经以某些实施方案的方式描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说将明显的是可在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，将改变应用于本文中所述的方法以及所述方法的步骤或步骤顺序。更具体地，明显的是，可用某些在化学和生理学两个方面均相关的试剂来替代本文中所述的试剂，同时实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这样的类似替代和改变被视为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。
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以下参考文献就其提供补充本文中阐述的那些的示例性操作或其他细节而言特别地通过引用并入本文。
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Claims (115)

1.用于治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括向所述对象提供免疫治疗，其中所述对象已被确定为患有或患过胰腺炎。
2.权利要求1所述的方法，其中所述胰腺炎是慢性胰腺炎。
3.权利要求1所述的方法，其中所述胰腺炎是急性胰腺炎。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点阻断治疗。
6.权利要求5所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括向所述对象提供能够与免疫检查点蛋白结合的抗体或抗体样分子。
7.权利要求5所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括向所述对象提供包含能够与免疫检查点蛋白结合的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。
8.权利要求6或7所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是CTLA-4、PD-1、PDL1、IDO、LAG3或TIM-3。
9.权利要求8所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是PD-1。
10.权利要求5所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包含两种或更多种免疫检查点抑制剂。
11.权利要求10所述的方法，其中所述两种或更多种免疫检查点抑制剂包含抗PD-1抗体、抗PDL1抗体和抗CTLA4抗体中的两种或更多种。
12.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中来自所述对象的胰腺组织被确定为包含CD11c+树突细胞。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中来自所述对象的胰腺组织被确定为包含三级淋巴结构。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其还包括向所述对象提供树突细胞疫苗。
15.权利要求14所述的方法，其中所述树突细胞疫苗是自体树突细胞疫苗。
16.权利要求14或15所述的方法，其中所述树突细胞疫苗包含常规树突细胞(cDC)。
17.权利要求16所述的方法，其中所述cDC是常规1型树突细胞(cDC1)。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述对象先前针对胰腺癌进行过治疗。
19.权利要求18所述的方法，其中所述对象先前用免疫治疗进行过治疗。
20.权利要求18或19所述的方法，其中所述对象被确定为对先前的治疗具有抗性。
21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其还包括向所述对象提供另外的癌症治疗。
22.权利要求21所述的方法，其中所述另外的癌症治疗是化学治疗、激素治疗、放射治疗、手术或免疫治疗。
23.用于治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括：
(a)确定所述对象患有胰腺炎或先前患过胰腺炎；以及
(b)向所述对象提供免疫治疗。
24.权利要求23所述的方法，其中所述胰腺炎是慢性胰腺炎。
25.权利要求23所述的方法，其中所述胰腺炎是急性胰腺炎。
26.权利要求23至25中任一项所述的方法，其中(a)包括针对胰腺炎的一种或更多种症状对所述对象进行测试。
27.权利要求23至25中任一项所述的方法，其中(a)包括检测所述对象中一种或更多种胰腺酶相对于对照或健康对象的提高的水平。
28.权利要求27所述的方法，其中所述一种或更多种胰腺酶包含淀粉酶或脂肪酶。
29.权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。
30.权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点阻断治疗。
31.权利要求30所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括向所述对象提供能够与免疫检查点蛋白结合的抗体或抗体样分子。
32.权利要求30所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括向所述对象提供包含能够与免疫检查点蛋白结合的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。
33.权利要求31或32所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是CTLA-4、PD-1、PDL1、IDO、LAG3或TIM-3。
34.权利要求33所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是PD-1。
35.权利要求30所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包含两种或更多种免疫检查点抑制剂。
36.权利要求35所述的方法，其中所述两种或更多种免疫检查点抑制剂包含抗PD-1抗体、抗PDL1抗体和抗CTLA4抗体中的两种或更多种。
37.权利要求23至36中任一项所述的方法，其还包括检测来自所述对象的胰腺组织中的CD11c+树突细胞。
38.权利要求23至37中任一项所述的方法，其还包括检测来自所述对象的胰腺组织中的三级淋巴结构。
39.权利要求23至38中任一项所述的方法，其还包括向所述对象提供树突细胞疫苗。
40.权利要求39所述的方法，其中所述树突细胞疫苗是自体树突细胞疫苗。
41.权利要求39或40所述的方法，其中所述树突细胞疫苗包含常规树突细胞(cDC)。
42.权利要求41所述的方法，其中所述cDC是常规1型树突细胞(cDC1)。
43.权利要求23至40中任一项所述的方法，其中所述对象先前针对胰腺癌进行过治疗。
44.权利要求43所述的方法，其中所述对象先前用免疫治疗进行过治疗。
45.权利要求43或44所述的方法，其中所述对象被确定为对先前的治疗具有抗性。
46.权利要求23至45中任一项所述的方法，其还包括向所述对象提供另外的癌症治疗。
47.权利要求46所述的方法，其中所述另外的癌症治疗是化学治疗、放射治疗、激素治疗、手术或免疫治疗。
48.用于治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括确定所述对象是否患有或先前患过胰腺炎，以及：
(a)如果所述对象被确定为患有或先前患过胰腺炎，则向所述对象提供免疫治疗；或者
(b)如果所述对象被确定为从未患过胰腺炎，则向所述对象提供替代癌症治疗，其中所述替代癌症治疗不包含免疫治疗。
49.权利要求48所述的方法，其中所述替代癌症治疗是化学治疗、激素治疗、放射治疗或手术。
50.权利要求48或49所述的方法，其中所述胰腺炎是慢性胰腺炎。
51.权利要求48或49所述的方法，其中所述胰腺炎是急性胰腺炎。
52.权利要求48至51中任一项所述的方法，其中确定所述对象是否患有或先前患过胰腺炎包括针对胰腺炎的一种或更多种症状对所述对象进行测试。
53.权利要求48至51中任一项所述的方法，其中确定所述对象是否患有或先前患过胰腺炎包括检测所述对象中一种或更多种胰腺酶相对于对照或健康对象的提高的水平。
54.权利要求53所述的方法，其中所述一种或更多种胰腺酶包含淀粉酶或脂肪酶。
55.权利要求48至54中任一项所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。
56.权利要求48至55中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点阻断治疗。
57.权利要求56所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括向所述对象提供能够与免疫检查点蛋白结合的抗体或抗体样分子。
58.权利要求56所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括向所述对象提供包含能够与免疫检查点蛋白结合的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。
59.权利要求57或58所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是CTLA-4、PD-1、PDL1、IDO、LAG3或TIM-3。
60.权利要求59所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是PD-1。
61.权利要求56所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包含两种或更多种免疫检查点抑制剂。
62.权利要求61所述的方法，其中所述两种或更多种免疫检查点抑制剂包含抗PD-1抗体、抗PDL1抗体和抗CTLA4抗体中的两种或更多种。
63.权利要求48至62中任一项所述的方法，其还包括检测来自所述对象的胰腺组织中的CD11c+树突细胞。
64.权利要求48至63中任一项所述的方法，其还包括检测来自所述对象的胰腺组织中的三级淋巴结构。
65.权利要求48至64中任一项所述的方法，其还包括向所述对象提供树突细胞疫苗。
66.权利要求65所述的方法，其中所述树突细胞疫苗是自体树突细胞疫苗。
67.权利要求65或66所述的方法，其中所述树突细胞疫苗包含常规树突细胞(cDC)。
68.权利要求67所述的方法，其中所述cDC是常规1型树突细胞(cDC1)。
69.权利要求48至66中任一项所述的方法，其中所述对象先前针对胰腺癌进行过治疗。
70.权利要求48至69中任一项所述的方法，其中所述对象先前用免疫治疗进行过治疗。
71.权利要求70所述的方法，其中所述对象被确定为对先前的治疗具有抗性。
72.用于治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括：
(a)在所述对象中诱导胰腺炎；以及
(b)在(a)之后，向所述对象提供免疫治疗。
73.权利要求72所述的方法，其中(a)包括向所述对象提供感染原。
74.权利要求72或73所述的方法，其中(a)包括胰腺手术。
75.权利要求72至74中任一项所述的方法，其中所述胰腺炎是慢性胰腺炎。
76.权利要求72至74中任一项所述的方法，其中所述胰腺炎是急性胰腺炎。
77.权利要求72至76中任一项所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。
78.权利要求72至77中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点阻断治疗。
79.权利要求78所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括向所述对象提供能够与免疫检查点蛋白结合的抗体或抗体样分子。
80.权利要求78所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括向所述对象提供包含能够与免疫检查点蛋白结合的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。
81.权利要求79或80所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是CTLA-4、PD-1、IDO、LAG3或TIM-3。
82.权利要求81所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是PD-1。
83.权利要求72至82中任一项所述的方法，其还包括向所述对象提供树突细胞疫苗。
84.权利要求83所述的方法，其中所述树突细胞疫苗是自体树突细胞疫苗。
85.权利要求72至84中任一项所述的方法，其中所述对象先前针对胰腺癌进行过治疗。
86.权利要求85所述的方法，其中所述对象先前用免疫治疗进行过治疗。
87.权利要求85或86所述的方法，其中所述对象被确定为对先前的治疗具有抗性。
88.权利要求72至87中任一项所述的方法，其还包括向所述对象提供另外的癌症治疗。
89.权利要求88所述的方法，其中所述另外的癌症治疗是化学治疗、放射治疗、激素治疗、手术或免疫治疗。
90.用于治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的树突细胞疫苗和免疫治疗。
91.权利要求90所述的方法，其中所述树突细胞疫苗和所述免疫治疗基本上同时施用。
92.权利要求90所述的方法，其中所述树突细胞疫苗和所述免疫治疗依次施用。
93.权利要求92所述的方法，其中所述树突细胞疫苗在所述免疫治疗之前施用。
94.权利要求92所述的方法，其中所述免疫治疗在所述树突细胞疫苗之前施用。
95.权利要求90至94中任一项所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。
96.权利要求90至95中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点阻断治疗。
97.权利要求96所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括向所述对象提供能够与免疫检查点蛋白结合的抗体或抗体样分子。
98.权利要求96所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包括向所述对象提供包含能够与免疫检查点蛋白结合的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。
99.权利要求97或98所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是CTLA-4、PD-1、PDL1、IDO、LAG3或TIM-3。
100.权利要求99所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是PD-1。
101.权利要求96所述的方法，其中所述免疫检查点阻断治疗包含两种或更多种免疫检查点抑制剂。
102.权利要求101所述的方法，其中所述两种或更多种免疫检查点抑制剂包含抗PD-1抗体、抗PDL1抗体和抗CTLA4抗体中的两种或更多种。
103.权利要求90至102中任一项所述的方法，其中所述树突细胞疫苗是自体树突细胞疫苗。
104.权利要求90至103中任一项所述的方法，其中所述树突细胞疫苗包含常规树突细胞(cDC)。
105.权利要求104所述的方法，其中所述cDC是常规1型树突细胞(cDC1)。
106.权利要求90至105中任一项所述的方法，其中所述对象先前针对胰腺癌进行过治疗。
107.权利要求106所述的方法，其中所述对象先前用免疫治疗进行过治疗。
108.权利要求106或107所述的方法，其中所述对象被确定为对先前的治疗具有抗性。
109.权利要求90至108中任一项所述的方法，其还包括向所述对象提供另外的癌症治疗。
110.权利要求109所述的方法，其中所述另外的癌症治疗是化学治疗、激素治疗、放射治疗、手术或免疫治疗。
111.用于治疗胰腺癌对象的方法，所述方法包括向确定在来自对象的胰腺癌组织中具有三级淋巴结构的对象施用免疫治疗。
112.权利要求111所述的方法，其中所述免疫治疗是免疫检查点阻断治疗。
113.用于治疗胰腺癌对象的方法，所述方法包括：
(a)检测所述对象的胰腺组织中的三级淋巴结构；以及
(b)向所述对象施用免疫治疗。
114.用于治疗胰腺癌对象的方法，所述方法包括：
(a)在所述对象的胰腺组织中诱导三级淋巴结构的形成；以及
(b)向所述对象施用免疫治疗。
115.用于鉴定患有胰腺癌的对象为免疫检查点阻断治疗的候选者的方法，所述方法包括：
(a)确定患有胰腺癌的对象组中的每个对象是否患有或先前患过胰腺炎；以及
(b)将来自患有或先前患过胰腺炎的对象组的对象鉴定为免疫检查点阻断治疗的候选者。
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