CN116322647A - 用于治疗急性呼吸窘迫综合征的微乳剂药物递送体系 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗或抑制病毒性急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的药物或抗病毒化合物的聚合物‑脂质微乳剂递送体系、一种用于生产微乳剂递送体系的方法以及用于治疗ARDS的微乳剂递送体系的应用方法。

Description

用于治疗急性呼吸窘迫综合征的微乳剂药物递送体系
技术领域
本发明涉及一种用于治疗或抑制病毒性急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的药物或抗病毒化合物的聚合物-脂质微乳剂递送体系、一种用于生产微乳剂递送体系的方法以及用于治疗ARDS的微乳剂递送体系的应用方法。
背景技术
2019新型冠状病毒(COVID-19)已使整个全球共同体瘫痪，并威胁到所有人的健康和全球的经济稳定。它是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的可致死的传染性疾病。
然而，SARS-CoV-2只是导致呼吸道疾病的一系列病原体中最新的一种，所述导致呼吸道疾病的一系列病原体包括其他严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)例如中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和流感病毒。
全球许多机构都在对SARS-CoV-2疫苗的研发过程中，但研发疫苗是一个漫长的过程，成本高昂。
然而，有一些药物目前正在用于治疗其他综合征和感染，并已被证明在体外和体内对SARS-CoV-2有效或部分有效。这些药物包括瑞德西韦、洛匹那韦和恩曲他滨。然而，瑞德西韦和洛匹那韦具有高度疏水性，在极性介质中的溶解度非常差(分别为0.339mg/mL和0.00192mg/mL)。另一方面，恩曲他滨是一种酸性亲水性分子，这使得与这些药物的任何可能的共同递送方式复杂化。此外，脂肪似乎会干扰恩曲他滨的溶解，并且当在进食后服用时，在胃pH值降低的情况下，这可能进一步延迟口服配置药物的溶解，导致恩曲他宾的生物利用度降低。这些药物的半衰期很短，很快被代谢并被从体内迅速排泄出去，导致需要高剂量和高频率的给药(每日)。经认可的药物瑞德西韦也是价格昂贵且供应短缺，需要由经过培训的人员通过静脉内注射(IV注射)进行递送。
已知有一小部分用于肺部递送药物的体系。例如，WO 2016/030524描述了一种藻酸盐低聚物的可吸入粉末制剂，用于形成用于针对呼吸道病症的抗病毒药物的喷雾干燥可吸入制剂；CN111202722A公开了一种用于吸入的洛匹那韦干粉药物组合物；US2020/0179287A1描述了将含有抗菌药物或抗病毒药物(例如洛匹那韦)的阴离子溶液电喷雾到阳离子溶液中，然后冷冻干燥以产生可吸入剂量；US7,629,331公开了一种称为CAPTISOL的聚结β环糊精磺丁基醚钠盐产品，用于递送包含瑞德西韦的活性药物成分。
然而，这些体系使用粉末制剂，并且只能将一种药物掺入递送体系中。基于粉末的体系需要时间溶解成液体形式以用于液体施用，并降解包封基质以释放药物。可替代的，在将干粉递送体系引入呼吸道中的情况下，这些体系到达深肺(包括肺泡)的机会很低，因为它们类似于灰尘，因此会因呼吸道刺激而通过免疫反应被迅速清除。此外，这些递送体系在用所选药物制备和配制时也是复杂的，并且需要使用昂贵的设备。
一种不需要侵入式递送、易于使用且价格低廉的将可有效地治疗和抑制SARS-CoV-2的抗病毒药物递送至感染部位的安全、有效、靶向性的方法是非常有益的(例如通过吸入进行肺部递送)。特别地当要联合施用的药物是疏水性药物和亲水性药物的混合物时，如果此类递送体系能够同时共同递送多种药物，则将是有用的。此类递送体系还可能用于治疗其他呼吸道综合征和疾病的药物，其他呼吸道综合征和疾病包括由诸如流感病毒和其他SARS-CoV的病毒感染(包括MERS)引起的那些呼吸道综合征和疾病。
氯喹和大麻二酚是已被认为可用于治疗或抑制ARDS的免疫调节药物。氯喹是一种抗疟疾的免疫调节化合物，已知用于破坏细胞内进程，例如限制膜结合细胞器的酸化，然后使环境碱化，这导致跨膜受体的功能和敏感性降低。大麻二酚用作竞争性结合受体和/或负变构调节剂，通过改变受体对某些配体或刺激物的亲和力来限制病毒与宿主细胞膜的融合。
抗病毒凝集素已被证明通过与病毒的表面蛋白上的富含甘露糖的聚糖结合从而抑制病毒与宿主细胞膜的融合来抑制多种包膜病毒，包括慢病毒，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒和SARS-CoV。这些抗病毒凝集素包括格瑞弗森(GRFT)、蓝藻抗病毒蛋白-N(CV-N)和scytovirin(SVN)，更优选地GRFT和CV-N。尽管有包括静脉内、动脉内、鞘内、脑池内、经颊、经直肠、经鼻、经肺、经皮、经阴道、经眼等的其他途径，但这些凝集素通常已开发用于通过以凝胶剂、乳膏剂、润滑剂或栓剂的制剂进行粘膜递送。
在病毒性ARDS的情况下，如果此类免疫调节化合物和融合抑制剂能够通过肺部施用被特异性地递送到感染的主要部位，则将是有用的。特别地，一种易于使用且价格低廉的将可有效地治疗和抑制SARS-CoV-2的此类免疫调节化合物递送至感染部位的安全、有效、靶向性的方法是非常有益的(例如通过吸入进行肺部递送)。特别地当要共同施用的药物是疏水性药物和亲水性药物的混合物时，如果此类递送体系能够同时共同递送一种或多种免疫调节化合物、融合抑制剂和/或抗病毒药物，则将是有用的。此类递送体系还可能用于治疗和抑制由诸如流感病毒和其他SARS-CoV的病毒感染(包括MERS)引起的其他呼吸道综合征和疾病。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种用于治疗或抑制病毒性急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的聚合物-脂质微乳剂药物递送体系，所述体系包含以下或由以下组成：
i.内部微乳剂基质，包含表面活性剂与溶解在极性非质子溶剂中的至少一种脂肪酸，或由表面活性剂与溶解在极性非质子溶剂中的至少一种脂肪酸组成；
ii.外壳，包含一种或多种亲水性聚合物或由一种或多种亲水性聚合物组成；和
iii.一种或多种药物，选自由以下药物组成的组：
a.抗病毒药物；
b.免疫调节化合物；和
c.抗病毒凝集素，
其中所述一种或多种药物中是疏水性药物的，该疏水性药物被包含在所述内部微乳剂基质中，而所述药物中是亲水性药物的，这些抗病毒药物被包含在所述外壳中。
所述一种或多种抗病毒药物可以选自疏水性抗病毒药物瑞德西韦和洛匹那韦，以及亲水性抗病毒药物恩曲他滨。
所述一种或多种疏水性免疫调节化合物可以是大麻二酚(CBD)，并且亲水性免疫调节化合物可以是氯喹或二磷酸氯喹。
所述一种或多种抗病毒凝集素可以选自亲水性抗病毒凝集素格瑞弗森(GRFT)、蓝藻抗病毒蛋白-N(CV-N)和scytovirin(SVN)。优选地，所述抗病毒凝集素可以是GRFT和CV-N。
所述外壳特别地可以包含诸如聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(PEG)(例如PEG 4000)的亲水性聚合物的水性混合物的水溶液，或特别地可以由诸如聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(PEG)(例如PEG 4000)的亲水性聚合物的水性混合物的水溶液组成。
所述内部微乳剂基质还可以包含至少一种有机羧酸。所述至少一种有机羧酸可以是弱酸，包括批准用于人类消费的包括乙酸、乳酸、柠檬酸或磷酸的那些有机羧酸，优选地是乙酸。
此外，所述内部微乳剂基质可以包含至少一种共聚物、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA，或可替代地，任意适用于活性化合物或药物递送的生物相容的且可生物降解的聚合物，包括聚乳酸、聚乙醇酸或聚ε-己内酯。
优选地，所述至少一种脂肪酸包括硬脂酸、棕榈酸和月桂酸中的任意一种或多种，或由硬脂酸、棕榈酸和月桂酸中的任意一种或多种组成，优选硬脂酸。
所述极性非质子溶剂可以包括乙醇或丙酮，或者可以是乙醇和丙酮的混合物。优选地，所述极性非质子溶剂是丙酮。
所述表面活性剂可以包括亲水-亲脂平衡(HLB)值大于10的任意表面活性剂。优选地，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80，也被称为吐温
Figure BDA0004113382020000041
微乳剂被定义为由表面活性剂与助表面活性剂的混合物稳定的、热力学稳定的油包水或水包油乳剂，所述微乳剂输入最小的机械能自发地形成。这与其他类型的乳剂(所谓的动态稳定乳剂，对于它们来说需要高剪切输入才会形成)形成对比。
由于分散相的液滴尺寸小低于约150nm，所以本发明的微乳剂通常是各向同性且半透明的。
所述病毒性ARDS可以是SARS-CoV(包括SARS-CoV-2)，MERS-CoV或流感。优选地，所述病毒性ARDS是SARS-CoV-2。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于生产聚合物-脂质微乳剂药物递送体系的方法，所述聚合物-脂质微乳剂药物递送体系包含选自由抗病毒药物；免疫调节化合物；和抗病毒凝集素组成的组中的一种或多种药物；所述方法包括以下步骤或基本上由以下步骤组成：
A.I.将至少一种疏水性药物、溶解在极性非质子溶剂中的脂肪酸与表面活性剂混合以形成有机相；
A.II.任选地加热所述有机相；
A.III.将所述有机相分配到包含至少一种亲水性聚合物的水性混合物中以形成微乳剂；和
A.IV.在约0℃下、在磷酸盐缓冲液中稳定所述微乳剂以形成聚合物-脂质微乳剂，或
B.I.将溶解在极性非质子溶剂中的脂肪酸与表面活性剂混合以形成有机相；
B.II.任选地加热所述有机相；
B.III.将所述有机相分配到包含至少一种亲水性聚合物和至少一种疏水性药物的水性混合物中以形成微乳剂；和
B.IV.在约0℃下、在磷酸盐缓冲液中稳定所述微乳剂以形成所述聚合物-脂质微乳剂，或
C.I.将至少一种疏水性药物、溶解在极性非质子溶剂中的脂肪酸与表面活性剂混合以形成有机相；
C.II.任选地加热所述有机相；
C.III.将所述有机相分配到包含至少一种亲水性聚合物和至少一种疏水性药物的水性混合物中以形成微乳剂；和
C.IV.在约0℃至约10℃下、在磷酸盐缓冲液中稳定所述微乳剂形成所述聚合物-脂质微乳剂。
所述一种或多种抗病毒药物可以选自疏水性抗病毒药物瑞德西韦和洛匹那韦以及亲水性抗病毒药物恩曲他滨。
所述一种或多种疏水性免疫调节化合物可以是大麻二酚(CBD)，并且亲水性免疫调节化合物可以是氯喹或二磷酸氯喹。
所述一种或多种抗病毒凝集素可以选自亲水性抗病毒凝集素格瑞弗森(GRFT)、蓝藻抗病毒蛋白-N(CV-N)和scytovirin(SVN)。优选地，所述抗病毒凝集素可以是GRFT和CV-N。
所述聚合物-脂质微乳剂递送体系可以是液体，并且可以被雾化用于通过吸入递送，包括用于肺部递送。
所述方法可以任选地还包括通过冷冻干燥或通过喷雾干燥来干燥所述经稳定的聚合物-脂质微乳剂以产生自由流动的聚合物-脂质微乳剂粉末的最后步骤。所述自由流动的聚合物-脂质微乳剂递送体系可以被配制用于口服或静脉内递送。
所述方法还可以包括将有机羧酸与所述有机相混合。
所述方法可以还包括将至少一种适用于活性化合物递送的生物相容的且可生物降解的聚合物或共聚物(聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、或聚乳酸、聚乙醇酸或聚ε-己内酯)与所述脂肪酸一起溶解在极性非质子溶剂中以形成有机相。
所述至少一种脂肪酸可以包括硬脂酸、棕榈酸和月桂酸中的任意一种或多种，或由硬脂酸、棕榈酸和月桂酸中的任意一种或多种组成，优选地是硬脂酸。
所述极性非质子溶剂可以包括乙醇或丙酮，或者可以是乙醇和丙酮的混合物。优选地，所述极性非质子溶剂是丙酮。
所述有机羧酸可以包括至少一种弱酸。例如，所述弱酸可以包括被批准用于人类消费的包括乙酸、乳酸、柠檬酸或磷酸的那些弱酸中任意一种或多种。优选地，所述弱酸是乙酸。
所述表面活性剂可以包括亲水-亲脂平衡(HLB)值大于10的任意表面活性剂。优选地，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80，也被称为吐温
Figure BDA0004113382020000051
特别地，所述方法可以包括以下步骤或由以下步骤组成：
A.a)将至少一种脂肪酸溶解在极性非质子溶剂中以形成脂肪酸溶液；
A.b)将一种或多种疏水性药物溶解在所述脂肪酸溶液中；
A.c)滴加表面活性剂以形成有机相；
A.d)任选地加热所述有机相；
A.e)在搅拌的同时将所述有机相分配到包含至少一种亲水性聚合物和任选的一种或多种亲水性药物的水性混合物中，以形成微乳剂；和
A.f)在0℃下、在搅拌的同时通过加入磷酸盐缓冲液来稳定聚合物-脂质微乳剂，或
B.a)将至少一种脂肪酸溶解在极性非质子溶剂中以形成脂肪酸溶液；
B.b)任选地将一种或多种疏水性药物溶解在所述脂肪酸溶液中；
B.c)滴加表面活性剂以形成有机相；
B.d)任选地加热所述有机相；
B.e)在搅拌的同时将所述有机相分配到包含至少一种亲水性聚合物和一种或多种亲水性药物的水性混合物中，以形成微乳剂；和
B.f)在0℃下、在搅拌的同时通过加入磷酸盐缓冲液来稳定所述聚合物-脂质微乳剂，或
C.a)将至少一种脂肪酸溶解在极性非质子溶剂中以形成脂肪酸溶液；
C.b)将一种或多种疏水性药物溶解在所述脂肪酸溶液中；
C.c)滴加表面活性剂以形成有机相；
C.d)任选地加热所述有机相；
C.e)在搅拌的同时将所述有机相分配到包含至少一种亲水性聚合物和一种或多种亲水性药物的水性混合物中，以形成微乳剂；和
C.f)在0℃下、在搅拌的同时通过加入磷酸盐缓冲液来稳定所述聚合物-脂质微乳剂。
所述方法还可以包括通过冷冻干燥或通过喷雾干燥来干燥经稳定的聚合物-脂质微乳剂以产生自由流动的聚合物-脂质纳米复合物粉末的附加步骤。
所述方法还可以包括，在步骤a)中，将PLGA，或可替代地，将适用于活性化合物递送的任意生物相容的且可生物降解的聚合物与脂肪酸一起溶解在所述极性非质子溶剂中，所述生物相容的且可生物降解的聚合物包括聚乳酸、聚乙醇酸或聚乳酸ε-己内酯。
所述方法还可以包括在步骤c)中，滴加有机羧酸与表面活性剂。
所述方法还可以包括在步骤e)中，在搅拌的同时加热以形成所述微乳剂。所述加热步骤可以在约40℃至50℃下，优选地40℃进行。
所述磷酸盐缓冲液在0℃的pH可以为约7.2至约7.6，更优选地为约7.4。
可以通过以约1:1的比例将所述微乳剂添加到所述磷酸盐缓冲溶液中来进行对所述微乳剂的稳定。应当理解，包括药物负载、制剂的稳定性(包括在干燥过程期间)等的多种因素影响微乳剂与缓冲液的最佳比例，。
可以在液氮中在初始快速冷冻步骤之后进行所述冷冻干燥。
喷雾干燥可使用喷雾干燥器例如Top bench Buchi-B290进行。特别地，此类喷雾干燥可以在以下一组参数下进行：
·入口温度：约90至110℃
·出口温度：约60℃
·进料速率：2％(mL/min)
·雾化压力：6-7bar
·吸入真空度设置为100％。
应当理解，入口温度应当足够高，以在不降解制剂中的任何化合物的情况下蒸发极性(水)和非极性(有机)溶剂，并且应当理解，所提供的范围是本发明的一个实施方式，可以由本领域技术人员修改。
还应当理解，出口温度受装置所在实验室的室温影响，并且除了要求出口温度高于60℃从而获得干燥、自由流动的粉末以外，具体温度可以变化。出口温度同样受液体进料速率、入口温度和液滴与干燥热空气之间的热交换效率的控制。
根据本发明的另一方面，提供了一种用本发明的聚合物-脂质微乳剂递送体系治疗或抑制病毒性ARDS的方法，所述聚合物-脂质微乳剂递送体系包含选自由抗病毒药物；免疫调节化合物；和抗病毒凝集素组成的组中的一种或多种药物。
所述病毒性ARDS可以是SARS-CoV(包括SARS-CoV-2)和MERS-CoV或流感。优选地，所述病毒ARDS是SARS-CoV-2。
所述方法可以包括经由肺部施加本发明的聚合物-脂质微乳剂递送体系的液体制剂来进行递送。
所述方法可以包括通过口服或静脉内施加本发明的聚合物-脂质微乳剂递送体系的粉末制剂来进行递送。
所述方法可以包括经由肺部施加本发明的聚合物-脂质微乳剂递送体系的液体制剂和通过口服或静脉内施加本发明的聚合物-脂质微乳剂递送体系的粉末制剂来进行同步递送。
所述方法可以包括雾化所述液体聚合物-脂质微乳剂递送体系以通过吸入递送的步骤，所述递送包括肺部递送。
附图说明
将参考以下例示图描述本发明，这些例示图决不应被解释为限制本发明的范围：图1示出了在微乳剂递送体系中包含的恩曲他滨的尺寸和尺寸分布；
图2示出了在微乳剂递送体系中包含的瑞德西韦的尺寸和尺寸分布；
图3示出了在微乳剂递送体系中包含的洛匹那韦的尺寸和尺寸分布；
图4示出了在同一微乳剂递送体系中包含的恩曲他滨和瑞德西韦的尺寸和尺寸分布；
图5示出了在混合聚合物-脂质纳米复合物递送体系中包含的瑞德西韦的尺寸和尺寸分布；
图6示出了在混合聚合物-脂质纳米复合物递送体系中包含的洛匹那韦的尺寸和尺寸分布；
图7示出了恩曲他滨、瑞德西韦和洛匹那韦的校准曲线；
图8示出了在递送体系中包含的药物保留峰的分析检测；
图9示出了包含药物的递送体系的物理化学结果；
图10示出了微乳剂递送体系的图示例示图；
图11示出了CBD的流体动力学尺寸和尺寸分布；
图12示出了CQ的流体动力学尺寸和尺寸分布；
图13示出了CBD和CQ的流体动力学尺寸和尺寸分布；
图14示出了CBD和CQ的校准曲线；
图15示出了CBD和CQ的药物负载；
图16示出了CBD抑制HIV-1假病毒对细胞的感染；
图17示出了CQ抑制HIV-1假病毒对细胞的感染；
图18示出了CBD和CQ的组合抑制HIV-1假病毒对细胞的感染；
图19示出了通过动态光散射Malvern NanoZS设备获得的无活性化合物的微乳剂递送体系的尺寸；
图20示出了负载了凝集素的微乳剂递送体系的尺寸；
图21示出了通过HPLC进行的定性表征，描绘了配制后的活性抗病毒凝集素(未被配制过程改变)；
图23示出了CVN的抗病毒活性；和
图24示出了GRFT的抗病毒活性。
具体实施方式
本发明涉及一种用于治疗或抑制病毒性急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的一种或多种药物或活性化合物的聚合物-脂质微乳剂递送体系、一种用于生产微乳剂递送体系的方法以及用于治疗ARDS的微乳剂递送体系应用方法。
瑞德西韦、洛匹那韦和恩曲他滨目前用于其他综合征和感染，已被证明在体外和体内对SARS-CoV-2有效或部分有效。然而，瑞德西韦和洛匹那韦是高疏水性的，而恩曲他滨是一种酸性亲水性分子，这使得与这些药物的任何可能的共同递送方式复杂化。
氯喹和大麻二酚是已被认为用于治疗或抑制ARDS的免疫调节药物。
包括GRFT、CV-N和SVN的抗病毒凝集素已被用于通过与病毒的表面蛋白上富含甘露糖的聚糖结合来抑制病毒与宿主细胞的结合，从而抑制病毒与寄主细胞膜的融合。尽管根据目标病毒提出了包括静脉内、动脉内、鞘内、池内、口腔、直肠、鼻、肺、经皮、阴道、眼部等的其他途径，但这些凝集素通常通过以凝胶剂、乳膏剂、润滑剂或用于抑制HIV的栓剂的制剂进行粘膜递送。
在病毒性ARDS的情况下，如果上述药物或活性化合物能够通过肺部施加而特异性地递送到感染的主要部位，则将是有用的。在严重感染的情况下，如果使用安全、有效、简单且生产成本低廉的相同递送媒介物既能够通过肺部施加又通过静脉和/或口服施加来递送免疫调节化合物，则将也是有用的。
此外，具有提供疏水性和亲水性药物化合物(诸如上文所述的那些)两者的共同递送的递送体系将是非常有用的。
因此，申请人开发了一种聚合物-脂质微乳剂递送体系，使用于治疗或抑制病毒性ARDS的一种或多种药物或活性化合物靶向肺部施加，所述病毒性ARDS包括由SARS-CoV(例如SARS-CoV-2)和MERS-CoV以及流感引起的ARDS。聚合物-脂质微乳剂递送体系是多用途的，因为它可以被配制成用于雾化和肺部施加的液体，或者可以被配制成用于口服和/或静脉施加的自由流动的粉末。
本申请人开发的聚合物-脂质微乳剂体系的另一个优点是，它可用于一种或多种药物或活性化合物的同时共同递送，包括其中是疏水性和亲水性药物或活性化合物的混合物的情况。递送体系可以在一个体系中包含多达三种具有不同疏水性或亲水性的药物或活性化合物。
用于治疗或抑制病毒性ARDS的药物和其他活性分子有许多不足之处，包括在内腔中的吸收低、肝脏代谢高以及由于高剂量和高频率而产生的严重不良反应。本发明的聚合物-脂质微乳剂体系提供的递送机制解决了这些问题。
所述递送体系是无创、安全的且其99％是水基的。当与疏水性活性化合物结合使用时，聚合物-脂质微乳剂体系提高了疏水性药物的溶解度，这进而又提高了吸收并避开了肝脏酶的首过代谢，使得更多的活性化合物可用于治疗病毒性ARDS。
由于聚合物-脂质微乳剂体系的靶向肺递送，所以封装在其中的抗病毒药物和化合物在感染的主要部位具有较高的沉积。这提供了较低活性化合物剂量和给药频率的使用、加快了抗病毒活性的释放和缩短了治疗的持续时间。
已经成功开发了聚合物-脂质微乳剂体系，并且使用HIV假病毒在体外进行的生物抑制试验中观察到抑制活性。
下面的示例性实施例用于说明目的，并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例1
包含重新调整用途用于治疗COVID-19的抗病毒药物(恩曲他滨、瑞德西韦和洛匹那韦)的递送体系的开发
1.背景
病毒无处不在，是已知会感染所有类型的生命形式并在各种范围的多细胞生物中引起疾病最小的非生命生物体。它们缺乏关键的细胞特征，例如细胞膜，并且只能在活的宿主细胞内复制。它们生存所需的关键过程完全取决于感染宿主细胞并利用其复制过程的能力。简而言之，病毒附着在细胞跨膜蛋白(即受体)上，然后将它们的病毒基因组插入宿主内(即内吞作用)，并复制以产生大量的新的病毒粒子去感染其他细胞。目前，尽管对于COVID-19尚无治疗方法或疫苗，但在体外生物测定中，一些抗病毒药物通过抑制它们的病毒基因组复制而显示出有效性。这些抗病毒药物包括转录抑制剂和蛋白酶抑制剂，例如恩曲他滨、瑞德西韦和洛匹那韦。
恩曲他滨是一种合成的胞嘧啶核苷酸类似物，通过细胞酶在细胞内磷酸化为其活性代谢产物恩曲他滨5'-三磷酸盐。它作为宿主胞嘧啶底物的竞争者，并通过它的掺入导致早期链序列终止。恩曲他滨也已被证明会促进免疫细胞例如CD4+T细胞的增加。瑞德西韦的作用机制与恩曲他滨相同；它最初是为治疗埃博拉病毒而开发的。瑞德西韦抗SARS-CoV-2的最近研究显示，在严重病例中的恢复期缩短，并被批准进一步用作实验药物。洛匹那韦是一种被认可的用于HIV治疗的抗病毒分子；它是一种可抑制HIV-1蛋白酶的作用的合成蛋白酶抑制剂。它通过阻断冠状病毒的3C样蛋白酶而显示出疗效，并正作为一种用于抗COVID-19的潜在药物被进行进一步研究。
2.方法和材料
2.1材料和设备
恩曲他滨(ETB)、瑞德西韦(RDV)和洛匹那韦(LPV)由Abdi Ibrahim
Figure BDA0004113382020000101
(土耳其伊斯坦布尔)慷慨供应。溶剂均购自Sigma，包括乙醇、丙酮、乙腈、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯、二氯甲烷(DCM)和油酸。聚乙烯醇(PVA)(87-89醇解度/Mw＝13000-23000)、聚乙二醇(PEG)(Mw-4000)、硬脂酸和磷酸盐缓冲盐(PBS-pH 7.4)试剂均得自Sigma Aldrich(南非)。磷酸和三甲胺(TEA)购自Sigma-Aldrich。所有其他化学品和试剂均为分析级。
Malvern Zetasizer Nano系列ZS(DLS)用于确定微乳剂的流体动力学尺寸、尺寸分布和稳定性，岛津SIL-20AXR/20ACRXR高效高压液相色谱(HPLC)用于定性分析。在由配备有SIL-20AXR/20ACXR自动取样器的LC-20AT溶剂递送模块、SPD-M20A UV/VIS光电二极管阵列检测器组和SN4000 LabSolutions系统软件组成的岛津(Shimadzu)SIL-20AXR/20ACRXR高效液相色谱(HPLC)上进行分析。使用飞诺美公司(phenomenex)的LUNA C18柱(150×4.6mmid；5微米粒径)进行HPLC分离。
2.2方法
2.2.1微乳剂的制备-亲水性药物
内部/有机相
简而言之，含恩曲他滨的微乳剂体系的制备如下：通过将PLGA(5至20mg)和硬脂酸(1至5mg)溶解在丙酮/乙醇的共溶液中，然后加入10至20μl HLB值高于10的表面活性剂(Tween
Figure BDA0004113382020000111
)，来制备内部有机相。
连续/极性相
通过将等份量的磷酸盐缓冲盐水(PBS pH 7.4)的一种缓冲溶液与两种亲水性聚合物(聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(即PEG 4000))混合来制备连续极性相。向连续相中加入恩曲他滨(10-100mg)并使其溶解。
乳剂形成
为了形成微乳剂，在室温(23-25℃)在适度搅拌的同时将有机相加入连续相中。PLGA/SA的自发沉淀通过成核导致了热力学稳定微乳剂的自组装。然后在通风橱下搅拌所述体系2小时以蒸发溶剂。微乳剂是透明的，稳定超过2个月，并具有淡蓝色的明显外观，这种现象被称为廷德尔效应。
2.2.2微乳剂的制备-疏水性药物
内部/有机相
为了用瑞德西韦或洛匹那韦制备微乳剂，通过将PLGA和硬脂酸溶解在丙酮/乙醇的共溶液中来制备内部相。随后加入10至20μl HLB值高于10的表面活性剂(Tween
Figure BDA0004113382020000121
)(在表面活性剂中加入了50至100μl有机羧酸(乙酸))。将药物RDV或LPV(5-20mg)加入有机溶液中并溶解在有机溶液中，使得其进入乳剂的油相中(内部)。可以任选地将油相中溶解的药物加热至约40℃，然后加入到亲水性聚合物的水性混合物中，并且可以在磁性热板上在约40℃进行适度搅拌。
连续/极性相
通过将等份量的磷酸盐缓冲盐水(PBS pH 7.4)的一种缓冲溶液与两种亲水性聚合物(聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(即PEG 4000))混合来制备连续极性相。
乳剂形成
为了形成微乳剂，在室温(23-25℃)在适度搅拌的同时将有机相加入连续相中。PLGA/SA的自发沉淀通过成核导致了热力学稳定微乳剂的自组装。然后在通风橱下搅拌所述体系2小时以蒸发溶剂。微乳剂是透明的，稳定超过2个月，并具有淡蓝色的明显外观，这种现象被称为廷德尔效应。
2.2.3微乳剂的制备-疏水性药物和亲水性药物
内部/有机相
为了用瑞德西韦和恩曲他滨制备微乳剂，通过将PLGA和硬脂酸溶解在丙酮/乙醇的共溶液中，然后加入10-20μl HLB值高于10的表面活性剂(Tween
Figure BDA0004113382020000122
)(向表面活性剂中加入了50-100μl的有机羧酸(乙酸))，来制备内部有机相。将药物RDV(5-20mg)加入有机溶液中并溶解在有机溶液中，使得其进入乳剂的油相中(内部)。也可以在硬脂酸和丙酮/乙醇共溶液中任选地溶解任意适用于药物递送的生物相容的且可生物降解的聚合物(包括聚乳酸、聚乙醇酸或聚ε-己内酯)，以进一步提高在微乳剂的内部基质中的疏水活性物质的稳定性。可以任选地首先将有机相加热至约40℃，然后，当将有机相分配到亲水性聚合物的水性混合物中时，可以在约40℃使用磁性热板进行适度搅拌。
连续/极性相
通过将等份量的磷酸盐缓冲盐水(PBS pH 7.4)的一种缓冲溶液与两种亲水性聚合物(聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(即PEG 4000))混合来制备连续极性相。向连续相中加入恩曲他滨(10-100mg)并使其溶解。
乳剂形成
为了形成液体微乳剂，在室温(23-25℃)适度搅拌的同时，将有机相快速分配到连续相中。自发沉淀通过成核导致热力学稳定微乳剂的自组装。然后在通风橱下搅拌所述体系2小时以蒸发溶剂。微乳剂是透明的，稳定超过2个月，并具有淡蓝色的明显外观(被称为廷德尔效应的现象)。
2.2.4纳米颗粒的制备-疏水性药物
内部/有机相
为了用瑞德西韦或洛匹那韦制备纳米颗粒，通过将PLGA和硬脂酸溶解在丙酮/乙醇的共溶液中，然后加入10-20μl HLB值高于10的表面活性剂(Tween
Figure BDA0004113382020000131
)(向表面活性剂中加入了50-100μl的有机羧酸(乙酸))，来制备内部有机相。在PLGA和硬脂酸完全溶解后，将疏水性药物(100-300mg)加入有机溶液中并溶解在有机溶液中，继续适度搅拌3-5分钟，使得其进入乳剂的油相中(内部)。也可以在硬脂酸和丙酮/乙醇共溶液中任选地溶解任意适用于药物递送的生物相容的且可生物降解的聚合物(包括聚乳酸、聚乙醇酸或聚ε-己内酯)，以进一步提高在微乳剂的内部基质中的疏水活性物质的稳定性。
连续/极性相
通过将等份量的磷酸盐缓冲盐水(PBS pH 7.4)的一种缓冲溶液与两种亲水性聚合物(聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(即PEG 4000))混合来制备连续极性相。
乳剂形成
为了形成液体微乳剂，在室温(23-25℃)适度搅拌的同时，将有机相快速分配到连续相中。自发沉淀通过成核导致热力学稳定微乳剂的自组装。可以任选地首先将有机相加热至约40℃，然后，当将有机相分配到亲水性聚合物的水性混合物中时，可以在约40℃使用磁性热板进行适度搅拌，产生具有可再现的液滴尺寸和尺寸分布的稳定微乳剂。然后将所得O/W乳剂添加到磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)的冷溶液中，以进一步稳定乳剂。然后在雾化压力为5至8bar的情况下在95-110℃对乳剂进行喷雾干燥。所有制剂在喷雾干燥过程后产生自由流动的粉末，并容易地在水溶液中重新分散，产生半透明的纳米悬浮剂。
2.2.6物理化学表征
2.2.6.1流体动力学尺寸、尺寸分布和稳定性
使用Malvern Zetasizer Nano系列ZS通过动态光散射(DLS)技术确定递送体系的流体动力学尺寸、尺寸分布和稳定性。DLS仪器测量布朗(Brownion)运动(溶液中亚微米颗粒的随机运动(波动))，以确定流体动力学尺寸。简而言之，使用激光束照射样品溶液，入射激光束沿所有方向散射，并通过检测器测量强度。为了详细说明，溶液中颗粒扩散的速度与计数率(以千次/秒(Kcps)计)的连续数据相关性是用于尺寸确定的关键参数。溶液中较小的颗粒比较大的颗粒扩散得更快。亚微米颗粒的稳定性也可以通过连续样品分析通过随时间变化的DLS来确定。在去离子水中制备用于微乳剂和纳米颗粒两者的分析的样品，稀释300至400倍，并且使用一次性激光粒度仪(zetasizer)比色杯进行分析。
2.2.6.2定性分析和定量分析
所用的分析方法是根据美国食品药品监督管理局卫生与公共服务部关于药物和生物制剂的分析程序和方法验证的指南、2015年出版的行业指南和欧洲药典(EP10.0)而开发的。使用飞诺美公司(phenomenex)的LUNA C18柱(150×4.6mm id；5微米粒径)和由甲醇(A)和0.1％三乙胺水溶液组成的流动相(用磷酸(B)调节pH至3.2)以0.4mL/min的流速进行HPLC分离。梯度洗脱程序为10％ A(0-1.9分钟)、10-40％ A(1.9-2.0分钟)和40％ A(2.0-3.3分钟)。对于柱的再平衡，将10％ A保持3.3-5.00分钟。在220-260nm进行UV检测，进样体积为20μl。
开发了一种简单、快速且选择性的反相高效液相色谱(HPLC-UV)方法，用于确定两种递送体系的恩曲他滨、瑞德西韦和洛匹那韦的含量。通过分析加标有不同浓度的药物工作溶液的空白递送体系样品来制作校准曲线。然后将样品进行诸如上述的超声处理、色谱法分离和UV检测的过程。通过对峰面积与浓度的线性最小二乘回归分析绘制获得校准曲线。校准曲线方程为y＝ax+b，其中y表示峰面积，x表示药物浓度。检测限(LOD)被确定为最低浓度，对于所有药物产生的信噪比(S/N)为3。作为能够以可接受的精度和准确度进行定量的最低分析物量的定量限(LOQ)被确定为S/N为10。
在甲醇/水(50:50)中制备药物的储备溶液。测量前，用甲醇-水(50:50，v/v)稀释储备溶液，从而制备100μg/mL和1μg/mL的工作标准溶液 。进行各种稀释以制备工作溶液。用不同浓度的工作溶液的20μL等分试样进行HPLC分析。
3.结果
3.1递送体系
通过快速纳米沉淀技术和纳米颗粒制剂，使用水包油(O/W)单乳剂，成功研制了包含ETB、RDV和LPV药物的微乳剂体系(>95％水)。通过DLS确认了两种递送体系的流体动力学尺寸(纳米，nm)和分布的测量结果。封装抗病毒药物的两种递送体系的流体动力学尺寸和尺寸分布是可观的。微乳剂体系的结果可见于图1(ETB)、图2(RDV)、图3(LPV)和图4(ETB+RDV)。纳米颗粒的尺寸分布不如微乳剂好，但粉末在极性介质(水)中可再分散，并观察到关键因素。具有药物的纳米颗粒在水中的扩散速度较慢，并且需要几分钟才能解离。图5(RDV)和图6(LPV)示出了包封抗病毒药物的纳米颗粒的结果。
通过连续DLS分析确定了微乳剂和纳米颗粒制剂的稳定性，结果表明对于制备方法达到了最佳参数。2个月的时间段后发现尺寸和尺寸分布不变，表明稳定性良好，而稳定性研究仍在进行中。
3.2表征
通过HPLC对药物进行定性分析和定量分析。下图7示出了纯药物的校准曲线，图8示出了制剂中药物的保留峰。图9示出了微乳剂和纳米颗粒制剂所达到的药物负载量。
实施例2
大麻二酚(Log P 6)-植物化学镇痛药物
1.背景
目前推荐的用于预防2019冠状病毒(COVID-19)感染和传播的策略已证明收效甚微。SARS-CoV-2刺突蛋白是介导感染并对人血管紧张素转换酶2(hACE2)具有高结合亲和力的1类病毒融合蛋白。由于hACE2受体的高表达，肺部细胞极易受感染，并且先天免疫反应由于其有毒化学物质(细胞因子风暴)的分泌加大了疾病的严重性。为了缓解这两个问题，我们使用了我们的包含两种免疫调节药物(大麻二酚和氯喹)的多功能微乳剂药物递送体系。氯喹及其衍生物羟化氯喹是碱性分子，自20世纪40年代以来因其抗疟疾活性而广为人知。它们主要在胃肠道中被吸收，在不到1小时(±30分钟)内达到血浆最大浓度(Cmax)，并且通常经口服施用。在细胞组织中的分布迅速，随后被膜包围的细胞器(如内体和溶酶体)截留。它们被广泛提议和接受的传染的作用方式是它们的溶酶体分泌(lysosomotrophic)特性。溶酶体的截留导致细胞器的碱化，这抵消了最佳细胞器功能所需的正常酸化过程。此外，它还被证明对于对正常的变构调节产生负面影响、导致对膜结合受体/蛋白质活性的破坏的变构位点具有亲和力。在抗SARS-CoV-2的体外生物模型中研究了CQ的潜在用途，并显示出潜在用途。
大麻二酚(CBD)是在大麻植物中发现的一种天然存在的化学物质或植物化学物质。它是来自大麻植物的113种大麻素化合物提取物中的一种，是主要的植物性大麻素化合物，占总植物提取物的40％。它属于大麻素药物类，通过吸入施用的生物利用度范围为11-45％，且口服施用的生物利用度仅为13-19％。提取物可以溶液形式经口服施用或作为食品制备中的添加剂施用。它对人类主要的药用益处包括减轻疼痛和炎症、控制焦虑、控制癫痫发作，并且还具有抗氧化特性。提取物为非水溶性(0.0126mg/mL)无色结晶粉末，可溶于各种有机溶剂中。CBD极其不溶于水，从而阻碍吸收，并且还受到显著的首过代谢。这两种特性都是对治疗效果的主要限制，也造成口服施用时CBD生物利用度低。
2.方法和材料
2.1材料
溶剂均购自Sigma，并包括乙醇、丙酮、乙腈、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯、二氯甲烷(DCM)和油酸。聚乙烯醇(PVA)(87-89醇解度/Mw＝13000-23000)、聚乙二醇(PEG)(Mw-4000)、硬脂酸和磷酸盐缓冲盐水(PBS-pH 7.4)试剂均从Sigma Aldrich获得，SouthMalvern Zetasizer Nano系列ZS(DLS)用于微乳剂的尺寸和尺寸分布。
人类上皮样宫颈癌症细胞系HeLa得自美国模式培养物集存库(ATCC，美国弗吉尼亚州阿灵顿)。Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FCS)、抗生素(青霉素/链霉素(pen/strep)和胰蛋白酶-EDTA购自Gibco和Pierce(Thermo Fischer Scientific，南非约翰内斯堡)。FuGENE转染试剂和Bright-Glo荧光素酶测定试剂盒购自美国Promega。
2.2方法
2.2.1微乳剂制剂
大麻二酚(CBD)
将CBD(10至20mg)溶解在硬脂酸和丙酮/乙醇的共溶液中，然后加入10至20μl HLB值高于10的表面活性剂(Tween
Figure BDA0004113382020000161
)，以帮助形成油相液滴。也可以在硬脂酸和丙酮/乙醇共溶液中任选地溶解PLGA，或者可替代地，溶解任意适用于药物递送的生物相容的且可生物降解的聚合物(包括聚乳酸、聚乙醇酸或聚ε-己内酯)，以进一步提高疏水活性物在微乳剂的内部基质中的稳定性。通过将等份量的磷酸盐缓冲盐水(PBS pH 7.4)的一种缓冲溶液与两种亲水性聚合物(聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(即PEG 4000))混合来制备连续极性相。
为了形成液体微乳剂，将有机相快速分配到连续极性相的水溶液混合物中。可以任选地首先将有机相加热至约40℃，然后，当将有机相分配到亲水性聚合物的水性混合物中时，可以在约40℃使用磁性热板进行适度搅拌，产生具有可再现的液滴尺寸和尺寸分布的稳定微乳剂。然后在通风橱下搅拌所述体系2小时以蒸发溶剂。也按照上述精确的合成方法制备不添加免疫调节药物的递送体系。微乳剂是透明的，稳定超过3个月，并具有淡蓝色的明显外观，这种现象被称为廷德尔效应。
氯喹(CQ)
通过将硬脂酸溶解在丙酮/乙醇的共溶液中制备内部相(有机相)，然后加入10-20μl HLB值高于10的表面活性剂(Tween
Figure BDA0004113382020000171
)，以帮助形成油相液滴。也可以在硬脂酸和丙酮/乙醇共溶液中任选地溶解PLGA，或者可替代地，溶解任意适用于药物递送的生物相容的且可生物降解的聚合物(包括聚乳酸、聚乙醇酸或聚ε-己内酯)，以进一步提高疏水活性物(如果存在)在微乳剂的内部基质中的稳定性。通过将等份量的磷酸盐缓冲盐水(PBS pH 7.4)的一种缓冲溶液与两种亲水性聚合物(聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(即PEG 4000))混合来制备连续极性相。向连续极性相中加入氯喹(10-100mg)并使其溶解。
为了形成微乳剂，在室温(23-25℃)在适度搅拌的同时将有机相加入连续相中。自发沉淀通过成核导致热力学稳定微乳剂的自组装。然后在通风橱下搅拌所述体系2小时以蒸发溶剂。微乳剂是透明的，稳定超过3个月，并具有淡蓝色的明显外观，这种现象被称为廷德尔效应。
大麻二酚和氯喹(CBD/CQ)
将CBD(10至20mg)溶解在硬脂酸和丙酮/乙醇的共溶液中，然后加入10至20μl HLB值高于10的表面活性剂(Tween
Figure BDA0004113382020000172
)，以帮助形成油相液滴。也可以在硬脂酸和丙酮/乙醇共溶液中任选地溶解PLGA，或者可替代地，溶解任意适用于药物递送的生物相容的且可生物降解的聚合物(包括聚乳酸、聚乙醇酸或聚ε-己内酯)，以进一步提高疏水活性物在微乳剂的内部基质中的稳定性。通过将等份量的磷酸盐缓冲盐水(PBS pH 7.4)的一种缓冲溶液与两种亲水性聚合物(聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(即PEG 4000))混合来制备连续极性相。向连续极性相中加入氯喹(10-100mg)并使其溶解。
为了形成同时具有CBD和CQ的微乳剂，在室温(23-25℃)在适度搅拌的同时将有机相加入连续相中。自发沉淀通过成核导致热力学稳定微乳剂的自组装。然后在通风橱下搅拌所述体系2小时以蒸发溶剂。可以任选地首先将有机相加热至约40℃，然后，当将有机相分配到亲水性聚合物的水性混合物中时，可以在约40℃使用磁性热板进行适度搅拌，产生具有可再现的液滴尺寸和尺寸分布的稳定微乳剂。微乳剂是透明的，稳定超过4个月，并具有淡蓝色的明显外观，这种现象被称为廷德尔效应。
2.2.2物理化学表征
2.2.2.1流体动力学尺寸、尺寸分布和稳定性
使用Malvern Zetasizer Nano系列ZS通过动态光散射(DLS)技术确定递送体系的流体动力学尺寸、尺寸分布和稳定性。DLS仪器测量布朗运动(溶液中亚微米颗粒的随机运动(波动))，以确定流体动力学尺寸。简而言之，使用激光束照射样品溶液，入射激光束沿所有方向散射，并通过检测器测量强度。为了详细说明，溶液中颗粒扩散的速度与计数率(以千次/秒(Kcps)计)的连续数据相关性是用于尺寸确定的关键参数。溶液中较小的颗粒比较大的颗粒扩散得更快。亚微米颗粒的稳定性也可以通过连续样品分析通过随时间变化的DLS来确定。在去离子水中制备用于分析的样品，稀释300至400倍，并且使用一次性激光粒度仪(zetasizer)比色杯进行分析。
2.2.2.2定性分析和定量分析
所用的分析方法是根据美国食品药品监督管理局卫生与公共服务部关于药物和生物制剂的分析程序和方法验证的指南、2015年出版的行业指南和欧洲药典(EP10.0)而开发的。使用飞诺美公司(phenomenex)的LUNA C18柱(150×4.6mm id；5微米粒径)和由甲醇(A)和0.1％三乙胺水溶液组成的流动相(用磷酸(B)调节pH至3.2)以0.4mL/min的流速进行HPLC分离。梯度洗脱程序为10％ A(0-1.9分钟)、10-40％A(1.9-2.0分钟)和40％ A(2.0-3.3分钟)。对于柱的再平衡，将10％A保持3.3-5.00分钟。在220-260nm进行UV检测，进样体积为20μl。
开发了一种简单、快速且选择性的反相高效液相色谱(HPLC-UV)方法，用于确定微乳剂制剂中的大麻二酚和氯喹。通过分析加标有不同浓度的药物工作溶液的空白递送体系样品来制作校准曲线。然后将样品进行诸如上述的超声处理、色谱法分离和UV检测的过程。通过对峰面积与浓度的线性最小二乘回归分析绘制获得校准曲线。校准曲线方程为y＝ax+b，其中y表示峰面积，x表示药物浓度。检测限(LOD)被确定为最低浓度，对于所有药物产生的信噪比(S/N)为3。作为能够以可接受的精度和准确度进行定量的最低分析物量的定量限(LOQ)被确定为S/N为10。
在甲醇/水(50:50)中制备药物的储备溶液。测量前，用甲醇-水(50:50，v/v)稀释储备溶液，从而制备100μg/mL和1μg/mL的工作标准溶液。进行各种稀释以制备工作溶液。用不同浓度的工作溶液的20μL等分试样进行HPLC分析。
2.2.2.3生物测试
假病毒中和测定
在TZM-bl中和测定中测试了同时包含CBD和CQ的微乳剂递送体系的抑制活性。TZM-bl中和测定模拟了对细胞的自由病毒颗粒感染的抑制。简而言之，TZM-bl中和测定是通过一式两份地在96孔板中在100μL生长培养基(DMEM)(具有10％胎牛血清(FBS))中制备的抑制剂的稀释系列物进行的。随后在50μL生长培养基中加入100TCID50假病毒，并在37℃温育1小时。然后将100μL浓度为1×105细胞/mL的TZM-bl细胞(含37.5μg/mL的DEAE葡聚糖)加入到每个孔中，并在37℃培养48小时。将通过测量萤火虫荧光素酶的活性来评价感染。
在减去背景(不含病毒和抑制剂两者的孔)后，与病毒对照(不含抑制剂的孔)相比，滴定度计算为导致相对光单位(RLU)减少50％(ID50)的抑制稀释度。根据制造商的说明，使用Bright Glo荧光素酶测定试剂盒(Promega，美国)进行荧光素酶测定，并且荧光素素酶活性以相对荧光素素酶单位(RLU)表示。上述测定将适用于使用293-T细胞代替TZM-bl细胞来测试对SARS-CoV-2假病毒感染的抑制。
3.结果
3.1递送体系
通过快速纳米沉淀技术使用水包油(O/W)单乳剂成功地研制了包含CBD、CQ以及两种药物组合的微乳剂体系(>95％水)。通过DLS确认了微乳剂的流体动力学尺寸(纳米，nm)和分布的测量结果，下图10显示了在整个连续相中均质分散的纳米液滴(内部相)的图形表示。具有免疫调节药物的微乳剂体系的流体动力学尺寸和尺寸分布是可观的，结果可见于图11(CBD)、图12(CQ)和图13(CBD+CQ)中。
通过连续DLS分析确定微乳剂的稳定性，结果表明对于制备方法实现了最佳参数。4个月的时段后发现尺寸和尺寸分布不变，表明稳定性良好。
3.2表征
通过HPLC对药物进行定性分析和定量分析。下图14示出了纯药物的校准曲线，图15示出了微乳剂制剂的药物负载量。
3.3假病毒中和测定
使用TZM bl中和测定证明了CBD(图16)、CQ(图17)和组合(图18)的抗病毒活性，并观察到成功抑制了假病毒对细胞的感染。
实施例3
用于预防COVID-19的抗病毒蓝藻抗病毒蛋白-N和格瑞弗森功能化的新型微乳剂递送体系的制备方法
4.背景
SARS-CoV-2进入细胞是由受体结合域(RBD)、刺突(S)糖蛋白与人血管紧张素转换酶2(hACE2)的融合介导的两步机制。所述受体结合域对hACE2具有高结合亲和力，并且蛋白酶切割对于由细胞表面蛋白酶例如TMPRSS2和溶酶体蛋白酶组织蛋白酶的激活是必需的。RBD有两个亚基，负责附着的S1受体结合亚基，通过内吞作用进入细胞的S2膜融合亚基。病毒附着后，S1亚基解离，产生S2亚基的主要结构构型，导致造成感染的内吞摄入。SARS-CoV-2刺突蛋白是介导病毒附着和进入细胞的1类病毒融合蛋白。
蓝藻抗病毒蛋白-N和格瑞弗森是抑制1类融合蛋白的功能的广普抗病毒蛋白。对多种病毒(包括HPV、HIV和少数肠病毒)已显示出杀病毒效果。这些病毒使用其表面血球凝集素(HE)蛋白(一种1类融合蛋白)，附着到靶细胞，然后提供内吞摄入，导致感染。蓝藻抗病毒蛋白-N和格瑞弗森对病毒的这些表面糖蛋白具有高度的结合亲和力，并且通过结合这些蛋白包封病毒HE，从而抑制它们与靶细胞的融合。SARS-CoV-2在其表面上也有这种1类融合蛋白，是用于抑制感染的主要靶标。
5.方法和材料
a.材料
蓝藻抗病毒蛋白-N和格瑞弗森由CSIR的NextGen Health cluster供应。溶剂均购自Sigma，包括乙醇、丙酮、乙腈、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯、二氯甲烷(DCM)和油酸。聚乙烯醇(PVA)(87-89醇解度/Mw＝13000-23000)、聚乙二醇(PEG)(Mw-4000)、硬脂酸和磷酸盐缓冲盐水(PBS-pH 7.4)试剂均得自南非Sigma Aldrich。使用Malvern Zetasizer Nano系列ZS(DLS)确定微乳剂的流体动力学尺寸、尺寸分布和稳定性，并使用Shimadzu SIL-20AXR/20ACRXR高效(prominence)高压液相色谱(HPLC)进行定性分析。
人类上皮样宫颈癌症细胞系HeLa得自美国模式培养物集存库(ATCC，美国弗吉尼亚州阿灵顿)。Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FCS)、抗生素(青霉素/链霉素(pen/strep)和胰蛋白酶-EDTA购自Gibco和Pierce(Thermo Fischer Scientific，南非约翰内斯堡)。FuGENE转染试剂和Bright-Glo荧光素酶测定试剂盒购自美国Promega。
2.2方法
递送体系的设计和开发考虑了各种适合应用的脂质、聚合物、溶剂和表面活性剂，以实现所需的物理化学性质。此外，原材料的选择考虑了施用途径、靶位点，最关键的考虑是选择对人类食用安全且经诸如南非卫生产品监管局(SAHPRA)和食品药品监督管理局(FDA)的国际监管机构批准的材料。所使用的聚合物和脂质是可生物降解的且生物相容的，所使用的溶剂和体积在推荐和允许的限度内，并研究了诸如浓度和比例的关键因素，从而实现最佳的递送体系。
2.2.1递送体系的合成
简而言之，用蓝藻抗病毒蛋白-N/格瑞弗森功能化的微乳剂体系制备如下：通过将硬脂酸和PLGA(1:5的比例)溶解在丙酮/乙醇的共溶液中，然后加入10-20μl HLB值高于10的表面活性剂(Tween
Figure BDA0004113382020000211
)来制备有机相(内部相)。通过将等份量的磷酸盐缓冲盐水(PBSpH7.4)一种缓冲溶液与两种亲水性聚合物(聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(即PEG 4000))混合来制备连续极性相。通过在PBS(pH 7.4)溶液中溶解0.1-1mg抗病毒凝集素来制备抗病毒凝集素的储备溶液，并向连续相中加入10-100μL储备溶液。
为了形成含抗病毒凝集素的微乳剂，在室温(23-25℃)在适度搅拌的同时，将有机相加入连续相中。SA/PLGA的自发沉淀通过成核导致了热力学稳定微乳剂的自组装。然后在通风橱下搅拌所述体系2小时以蒸发溶剂。也按照上述精确的合成方法制备不添加凝集素的递送体系。微乳剂是透明的，稳定超过3个月，并具有淡蓝色的明显外观，这种现象被称为廷德尔效应。
2.2.2物理化学表征
a)流体动力学尺寸、尺寸分布和稳定性
使用Malvern Zetasizer Nano系列ZS通过动态光散射(DLS)技术确定递送体系的流体动力学尺寸、尺寸分布和稳定性。DLS仪器测量布朗运动(溶液中亚微米颗粒的随机运动(波动))，以确定流体动力学尺寸。简而言之，使用激光束照射样品溶液，入射激光束沿所有方向散射，并通过检测器测量强度。为了详细说明，溶液中颗粒扩散的速度与计数率(以千次/秒(Kcps)计)的连续数据相关性是用于尺寸确定的关键参数。溶液中较小的颗粒比较大的颗粒扩散得更快。亚微米颗粒的稳定性也可以通过连续样品分析通过随时间变化的DLS来确定。在去离子水中制备用于分析的样品，稀释300至400倍，并且使用一次性激光粒度仪(zetasizer)比色杯进行分析。
b)定性分析和定量分析
所用的分析方法是根据美国食品药品监督管理局卫生与公共服务部关于药物和生物制剂的分析程序和方法验证的指南、2015年出版的行业指南和欧洲药典(EP10.0)而开发的。使用飞诺美公司(phenomenex)的LUNAC18柱(150×4.6mm id；5微米粒径)和由甲醇(A)和0.1％三乙胺水溶液组成的流动相(用磷酸(B)调节pH至3.2)以0.4mL/min的流速进行HPLC分离。梯度洗脱程序为10％ A(0-1.9分钟)、10-40％A(1.9-2.0分钟)和40％ A(2.0-3.3分钟)。对于柱的再平衡，将10％A保持3.3-5.00分钟。在220-260nm进行UV检测，进样体积为20μl。
开发了一种简单、快速且选择性的反相高效液相色谱(HPLC-UV)方法，用于确定微乳剂制剂中的蓝藻抗病毒蛋白-N和格瑞弗森。通过分析加标有不同浓度的药物工作溶液的空白递送体系样品来制作校准曲线。然后将样品进行诸如上述的超声处理、色谱法分离和UV检测的过程。通过对峰面积与浓度的线性最小二乘回归分析绘制获得校准曲线。校准曲线方程为y＝ax+b，其中y表示峰面积，x表示药物浓度。检测限(LOD)被确定为最低浓度，对于所有药物产生的信噪比(S/N)为3。作为能够以可接受的精度和准确度进行定量的最低分析物量的定量限(LOQ)被确定为S/N为10。
在甲醇/水(50:50)中制备抗病毒凝集素的储备溶液。测量前，用甲醇-水(50:50，v/v)稀释储备溶液，从而制备100μg/mL和1μg/mL的工作标准溶液 。进行各种稀释以制备工作溶液。用不同浓度的工作溶液的20μL等分试样进行HPLC分析。
2.2.3生物测试
c)假病毒中和测定
在TZM-bl中和测定中测试了同时包含蓝藻抗病毒蛋白-N和格瑞弗森的微乳剂递送体系的抑制活性。TZM-bl中和测定模拟了对细胞的自由病毒颗粒感染的抑制。简而言之，TZM-bl中和测定是通过一式两份地在96孔板中在100μL生长培养基(DMEM)(具有10％胎牛血清(FBS))中制备的抑制剂的稀释系列进行的。随后在50μL生长培养基中加入100TCID50假病毒，并在37℃温育1小时。然后将100μL浓度为1×105细胞/mL的TZM-bl细胞(含37.5μg/mL的DEAE葡聚糖)加入到每个孔中，并在37℃培养48小时。将通过测量萤火虫荧光素酶的活性来评价感染。
在减去背景(不含病毒和抑制剂两者的孔)后，与病毒对照(不含抑制剂的孔)相比，滴定度计算为导致相对光单位(RLU)减少50％(ID50)的抑制稀释度。根据制造商的说明，使用Bright Glo荧光素酶测定试剂盒(Promega，美国)进行荧光素酶测定，并且荧光素素酶活性以相对荧光素素酶单位(RLU)表示。上述测定将适用于使用293-T细胞代替TZM-bl细胞来测试对SARS-CoV-2假病毒感染的抑制。
6.结果
a.递送体系
通过快速纳米沉淀技术使用水包油(O/W)单乳剂成功地研制了用CVN或GFTS功能化的微乳剂体系(>95％水)。没有添加抗病毒凝集素的微乳剂体系具有窄的尺寸分布，其平均直径为83.19nm(图19)。如图20(CVN)和图21(GFTS)中所示，包含凝集素的微乳剂体系在尺寸上相对于CVN增加了至少22.51nm，并且相对于GTS增加了至少50.61nm。
通过连续分析确定微乳剂的稳定性，并且应当理解，在形成微乳剂的成核过程中观察到纳米液滴的计数率增加。这表明制备方法实现了最佳参数。3个月的时段后发现尺寸和尺寸分布不变，表明稳定性良好。
b.表征
为了确认体系中凝集素的完整性，通过HPLC进行了定性分析，下图22示出了配置后完整的抗病毒凝集素的完全保留峰。
c.假病毒中和测定
使用TZM-bl中和测定证明了凝集素的抗病毒活性，图23(CVN)和图24(GFTS)显示成功抑制了假病毒对细胞的感染。

Claims (51)

1.一种用于治疗或抑制病毒性急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的聚合物-脂质微乳剂药物递送体系，包含以下或由以下组成：
i.内部微乳剂基质，包含表面活性剂与溶解在极性非质子溶剂中的至少一种脂肪酸，或由表面活性剂与溶解在极性非质子溶剂中的至少一种脂肪酸组成；
ii.外壳，包含一种或多种亲水性聚合物或由一种或多种亲水性聚合物组成；和
iii.一种或多种药物，选自由以下药物组成的组：
a.抗病毒药物；
b.免疫调节化合物；和
c.抗病毒凝集素，
其中所述一种或多种药物中是疏水性药物的，该疏水性药物被包含在所述内部微乳剂基质中，而所述药物中是亲水性药物的所述抗病毒药物被包含在所述外壳中。
2.根据权利要求1所述的药物递送体系，其中所述一种或多种抗病毒药物选自由疏水性抗病毒药物瑞德西韦和洛匹那韦，以及亲水性抗病毒药物恩曲他滨组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的药物递送体系，其中所述一种或多种免疫调节化合物选自疏水性大麻二酚(CBD)和亲水性氯喹或二磷酸氯喹。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物递送体系，其中所述一种或多种抗病毒凝集素选自亲水性抗病毒凝集素格瑞弗森(GRFT)、蓝藻抗病毒蛋白-N(CV-N)和scytovirin(SVN)。
5.根据权利要求4所述的药物递送体系，其中所述抗病毒凝集素是GRFT和CV-N。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物递送体系，其中所述外壳包含亲水性聚合物的水性混合物的水溶液，所述亲水性聚合物包含聚乙烯醇(PVA)和聚乙二醇(PEG)，所述聚乙二醇(PEG)包括PEG 4000。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的药物递送体系，其中所述内部微乳剂基质还包含至少一种有机羧酸，所述至少一种有机羧酸包括乙酸、乳酸、柠檬酸或磷酸中的任意一种或多种。
8.根据权利要求7所述的药物递送体系，其中所述有机羧酸是乙酸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物递送体系，其中所述内部微乳剂基质包含至少一种共聚物、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA，或可替代地，任意适用于活性化合物或药物递送的生物相容的且可生物降解的聚合物，包括聚乳酸、聚乙醇酸或聚ε-己内酯。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物递送体系，其中所述至少一种脂肪酸包括硬脂酸、棕榈酸和月桂酸中的任意一种或多种，或由硬脂酸、棕榈酸和月桂酸中的任意一种或多种组成。
11.根据权利要求10所述的药物递送体系，其中所述脂肪酸是硬脂酸。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的药物递送体系，其中所述极性非质子溶剂包括乙醇或丙酮，或者是乙醇和丙酮的混合物。
13.根据权利要求10所述的药物递送体系，其中所述极性非质子溶剂是丙酮。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的药物递送体系，其中所述表面活性剂包括亲水-亲脂平衡(HLB)值大于10的任意表面活性剂。
15.根据权利要求14所述的药物递送体系，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的药物递送体系，所述药物递送体系是各向同性且半透明的，分散相的液滴尺寸小于约150nm。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的药物递送体系，其中所述病毒性ARDS选自流感或SARS-CoV，SARS-CoV包括SARS-CoV-2和MERS-CoV。
18.根据权利要求17所述的药物递送体系，其中所述病毒性ARDS是SARS-CoV-2。
19.一种用于生产聚合物-脂质微乳剂药物递送体系的方法，所述聚合物-脂质微乳剂药物递送体系包含选自由抗病毒药物；免疫调节化合物；和抗病毒凝集素组成的组中的一种或多种药物；所述方法包括以下步骤或基本上由以下步骤组成：
A.I.将至少一种疏水性药物、溶解在极性非质子溶剂中的脂肪酸与表面活性剂混合以形成有机相；
A.II.任选地加热所述有机相；
A.III.将所述有机相分配到包含至少一种亲水性聚合物的水性混合物中以形成微乳剂；和
A.IV.在约0℃下、在磷酸盐缓冲液中稳定所述微乳剂以形成聚合物-脂质微乳剂，或
B.I.将溶解在极性非质子溶剂中的脂肪酸与表面活性剂混合以形成有机相；
B.II.任选地加热所述有机相；
B.III.将所述有机相分配到包含至少一种亲水性聚合物和至少一种疏水性药物的水性混合物中以形成微乳剂；和
B.IV.在约0℃下、在磷酸盐缓冲液中稳定所述微乳剂以形成所述聚合物-脂质微乳剂，或
C.I.将至少一种疏水性药物、溶解在极性非质子溶剂中的脂肪酸与表面活性剂混合以形成有机相；
C.II.任选地加热所述有机相；
C.III.将所述有机相分配到包含至少一种亲水性聚合物和至少一种疏水性药物的水性混合物中以形成微乳剂；和
C.IV.在约0℃至约10℃下、在磷酸盐缓冲液中稳定所述微乳剂形成所述聚合物-脂质微乳剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述一种或多种抗病毒药物选自由疏水性抗病毒药物瑞德西韦和洛匹那韦以及亲水性抗病毒药物恩曲他滨组成的组。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中疏水性免疫调节化合物是大麻二酚(CBD)，并且亲水性免疫调节化合物选自由氯喹和二磷酸氯喹组成的组。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗病毒凝集素选自由亲水性抗病毒凝集素格瑞弗森(GRFT)、蓝藻抗病毒蛋白-N(CV-N)和scytovirin(SVN)组成的组。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗病毒凝集素是GRFT和CV-N。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述聚合物-脂质微乳剂递送体系是液体，并且被雾化用于通过吸入递送，包括用于肺部递送。
25.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述方法任选地还包括通过冷冻干燥或通过喷雾干燥来干燥经稳定的聚合物-脂质微乳剂以产生自由流动的聚合物-脂质微乳剂粉末的最后步骤。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述自由流动的聚合物-脂质微乳剂递送体系被配制用于口服或静脉内递送。
27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，还包括将有机羧酸与所述有机相混合。
28.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，还包括将至少一种适用于活性化合物递送的生物相容的且可生物降解的聚合物或共聚物与所述脂肪酸一起溶解在极性非质子溶剂中以形成有机相，所述生物相容的且可生物降解的聚合物或共聚物包括聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、或聚乳酸、聚乙醇酸或聚ε-己内酯。
29.根据权利要求19至28中任一项所述的方法，其中所述至少一种脂肪酸包括硬脂酸、棕榈酸和月桂酸中的任意一种或多种或由硬脂酸、棕榈酸和月桂酸中的任意一种或多种组成。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述脂肪酸是硬脂酸。
31.根据权利要求19至30中任一项所述的方法，其中所述极性非质子溶剂包括乙醇或丙酮，或者是乙醇和丙酮的混合物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述极性非质子溶剂是丙酮。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述有机羧酸包括被批准用于人类消费的包括乙酸、乳酸、柠檬酸或磷酸的那些有机羧酸中任意一种或多种。
34.根据权利要求27或33所述的方法，其中所述有机羧酸是乙酸。
35.根据权利要求19至34中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂包括亲水-亲脂平衡(HLB)值大于10的任意表面活性剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。
37.根据权利要求19至36中任一项所述的方法，包括以下步骤或由以下步骤组成：
A.a)将至少一种脂肪酸溶解在极性非质子溶剂中以形成脂肪酸溶液；
A.b)将一种或多种疏水性药物溶解在所述脂肪酸溶液中；
A.c)滴加表面活性剂以形成有机相；
A.d)任选地加热所述有机相；
A.e)在搅拌的同时将所述有机相分配到包含至少一种亲水性聚合物和任选的一种或多种亲水性药物的水性混合物中，以形成微乳剂；和
A.f)在0℃下、在搅拌的同时通过加入磷酸盐缓冲液来稳定聚合物-脂质微乳剂，或
B.a)将至少一种脂肪酸溶解在极性非质子溶剂中以形成脂肪酸溶液；
B.b)任选地将一种或多种疏水性药物溶解在所述脂肪酸溶液中；
B.c)滴加表面活性剂以形成有机相；
B.d)任选地加热所述有机相；
B.e)在搅拌的同时将所述有机相分配到包含至少一种亲水性聚合物和一种或多种亲水性药物的水性混合物中，以形成微乳剂；和
B.f)在0℃下、在搅拌的同时通过加入磷酸盐缓冲液来稳定所述聚合物-脂质微乳剂，或
C.a)将至少一种脂肪酸溶解在极性非质子溶剂中以形成脂肪酸溶液；
C.b)将一种或多种疏水性药物溶解在所述脂肪酸溶液中；
C.c)滴加表面活性剂以形成有机相；
C.d)任选地加热所述有机相；
C.e)在搅拌的同时将所述有机相分配到包含至少一种亲水性聚合物和一种或多种亲水性药物的水性混合物中，以形成微乳剂；和
C.f)在0℃下、在搅拌的同时通过加入磷酸盐缓冲液来稳定所述聚合物-脂质微乳剂。
38.根据权利要求37所述的方法，还包括在步骤a)中将PLGA，或可替代地，将适用于活性化合物递送的任意生物相容的且可生物降解的聚合物与脂肪酸一起溶解在所述极性非质子溶剂中，所述生物相容的且可生物降解的聚合物包括聚乳酸、聚乙醇酸或聚乳酸ε-己内酯。
39.根据权利要求37或38所述的方法，还包括在步骤c)中滴加有机羧酸与表面活性剂。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，还包括在步骤e)中在搅拌的同时在约40℃至50℃下加热，以形成所述微乳剂。
41.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其中所述磷酸盐缓冲液在0℃的pH为约7.2至约7.6。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述磷酸盐缓冲液在0℃的pH为约7.4。
43.根据权利要求37至42中任一项所述的方法，其中通过以约1:1的比例将所述微乳剂添加到所述磷酸盐缓冲溶液中来进行对所述微乳剂的稳定。
44.根据权利要求25所述的方法，其中在液氮中初始快速冷冻步骤之后进行所述冷冻干燥。
45.一种用根据权利要求1至18中任一项所述的聚合物-脂质微乳剂递送体系治疗或抑制病毒性ARDS的方法，所述聚合物-脂质微乳剂递送体系包含选自由抗病毒药物；免疫调节化合物；和抗病毒凝集素组成的组中的一种或多种药物。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述病毒性ARDS是流感或SARS-CoV，SARS-CoV包括SARS-CoV-2和MERS-CoV。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述病毒性ARDS是SARS-CoV-2。
48.根据权利要求45至47中任一项的方法，包括经由肺部施加根据权利要求1至18中任一项所述的聚合物-脂质微乳剂递送体系的液体制剂来进行递送。
49.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，包括通过口服或静脉内施加根据权利要求1至18中任一项中所述的聚合物-脂质微乳剂递送体系的粉末制剂来进行递送。
50.根据权利要求45至49中任一项所述的方法，包括经由肺部施加根据权利要求1至18中任一项所述的聚合物-脂质微乳剂递送体系的液体制剂和通过口服或静脉内施加根据权利要求1至18中任一项中所述的聚合物-脂质微乳剂递送体系的粉末制剂来进行同步递送。
51.根据权利要求45至50中任一项所述的方法，包括雾化所述液体聚合物-脂质微乳剂递送体系以通过吸入递送的步骤，所述递送包括肺部递送。
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