CN116265945A - 抗凝血药物的生物学活性检测方法 - Google Patents

抗凝血药物的生物学活性检测方法 Download PDF

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CN116265945A CN202310012445.0A CN202310012445A CN116265945A CN 116265945 A CN116265945 A CN 116265945A CN 202310012445 A CN202310012445 A CN 202310012445A CN 116265945 A CN116265945 A CN 116265945A
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Abstract

本公开涉及抗凝血药物的生物学活性检测方法。具体而言，本公开涉及一种抗FXI/FXIa抗体生物学活性检测方法，该方法用酶标仪替代传统方法的凝血仪对抗FXI/FXIa抗体生物学活性进行分析，并且简化了实验操作，缩短了实验周期，提高了检测效率。

Description

抗凝血药物的生物学活性检测方法
技术领域
本公开涉及到抗体药物的生物学活性检测领域，更具体地说涉及抗凝血因子XI(Factor XI，FXI)或其活化形式XIa(Factor XIa，FXIa)的抗体及其抗原结合片段的体外生物学活性检测方法。
背景技术
血栓性疾病不仅发病率高，而且致死率和致残率也很高。抗凝血药物是有效防治血栓性疾病的药物。凝血级联反应是系列凝血因子相继被激活，最终形成纤维蛋白的过程。凝血级联反应由内源途径(又称为接触激活途径)和外源途径(又称组织因子途径)启动，再经共同途径生成纤维蛋白。FXI是维持内源途径所必需的，并且在凝血级联反应放大过程中发挥关键作用。因此针对FXI靶点的药物，可阻断内源途径，抑制凝血级联反应的放大，从而起到抗血栓形成的作用。
体内高水平的凝血因子XI与血栓形成事件相关，抗FXI/FXIa抗体是一种有效预防或治疗血栓形成的药物，其通过结合血液中的凝血因子XI或其活化形式XIa阻止内源性凝血途径，从而达到抗凝血的目的。作为对抗体药物有效性的质量评价或质量控制的方法之一，对抗FXI/FXIa单克隆抗体的体外生物学活性进行测定具有重要意义。
抗FXI/FXIa抗体生物学活性测定通常采用活化部分凝血活酶时间(aPTT)法。aPTT法通常使用凝血仪测定系列浓度抗体的凝血时间，绘制抗体浓度与凝血时间的曲线，进而计算供试品的生物学活性。用凝血仪测定抗体生物活性需要对系列浓度的样品及对照品分批测定，往往测定一个样品用时较长，对于8通道凝血仪大需要2小时，而且大多数生物药分析实验室不具备凝血仪，而酶标仪是实验室常用仪器。本公开中，我们使用酶标仪代替凝血仪，根据系列浓度抗体在相同作用时间凝血的不同程度，测定透射光OD值。当血浆没有凝固时，透射光OD值最小；当血浆完全凝固时，透射光OD值达到最大；当血浆在凝固过程中时，在一定范围内透射光OD值与凝血时间成线性相关(R2>0.99，参见附图1、2)。因此凝血过程的OD值可以反映血浆凝固的程度。通过测定在一定反应时间下抗体系列浓度的凝血OD值，绘制抗体系列浓度与OD值的量效反应曲线，该曲线反映了抗FXI/FXIa抗体的抗凝血作用，通过与标准品(或对照品)的比较，从而可计算抗FXI/FXIa抗体供试品的生物学活性。酶标仪法测定一个样品(含对照品)大只需要20分钟，较凝血仪法大大缩短了时间，对于样品数量较多时，前者优势更加显著。
本公开的目的在于提供一种抗FXI/FXIa抗体生物学活性检测方法，该方法用酶标仪替代传统方法的凝血仪对抗FXI/FXIa抗体生物学活性进行分析，并且简化了实验操作，缩短了实验周期，提高了检测效率。
发明内容
本公开涉及一种操作时间短、准确性高、重复性好的抗FXI/FXIa抗体的活性检测方法。
本公开提供一种抗凝血药物的活性检测方法，该方法包括以下的步骤：
(a)将供试品和对照品用缓冲液按比例稀释成系列浓度；
(b)加入血浆，孵育；
(c)加入aPTT试剂，孵育；
(d)加入CaCl2；和
(e)于酶标仪上读取OD值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性。
一些实施方案中，上述抗凝血药物为抗体，例如为抗FXI/FXIa抗体、抗FXII/FXIIa抗体、抗FIX抗体、抗FX抗体、抗FVII抗体、抗FVIII抗体、抗血小板糖蛋白IIb/IIIa受体抗体。
一些实施方案中，上述供试品和对照品为抗凝血药物，例如为抗FXI/FXIa抗体、抗FXII/FXIIa抗体、抗FIX抗体、抗FX抗体、抗FVII抗体、抗FVIII抗体、抗血小板糖蛋白IIb/IIIa受体抗体、肝素、阿斯匹林、水蛭素、秋水仙碱、替罗非班、西洛他唑、噻氯吡啶。
在一些实施方案中，所述供试品和对照品为相同的抗凝血药物，例如相同的抗FXI/FXIa抗体。
在一些实施方案中，所述活性检测方法还进一步包含步骤(f)加入EDTA溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间。
在一些实施方案中，进一步地，所述步骤(f)中的EDTA溶液的浓度为约15mM至约50mM，例如约15mM至约45mM、约15mM至约40mM、约15mM至约35mM、约15mM至约30mM、约15mM至约25mM、约20mM至约50mM、约20mM至约45mM、约20mM至约35mM、约20mM至约30mM、约17mM至约27mM、约25mM至约30mM、约25mM至约35mM。在一些非限制性实施方案中，所述步骤(f)中的EDTA溶液的浓度为约15mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约40mM或约50mM。在一些实施方案中，进一步地，所述步骤(f)中的EDTA溶液的浓度为约25mM。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的缓冲液浓度为约20mM至约100mM，例如约20mM至约90mM、约30mM至约80mM、约40mM至约70mM、约45mM至约60mM、约50mM至约55mM、约25mM至约95mM、约35mM至约85mM、约45mM至约75mM、约55mM至约65mM、约20mM至约70mM、约20mM至约50mM、约30mM至约60mM、约40mM至约60mM、约45mM至约55mM。在一些非限制性实施方案中，其中所述步骤(a)中的缓冲液浓度为20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM或约100mM。在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的缓冲液浓度为约50mM。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的缓冲液的pH值为约6.0至约8.5，例如约6.0至约8.0、约6.0至约7.5、约6.5至约8.5、约6.5至约8.0、约6.5至约7.5、约7.0至约8.0、约7.0至约7.5、约7.0至约7.4、约7.2至约7.4(7.3±0.1)。在一些非限制性实施方案中，所述步骤(a)中的缓冲液的pH值为约6.0、约6.5、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.5。在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的缓冲液的pH值为7.3±0.1。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的缓冲液可以含有有色物质，其包括但不限于台盼蓝、亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝、甲苯胺蓝、碱性蓝、伊红、结晶紫、中性红、詹纳斯绿B、番红，并且所述有色物质不影响抗体与抗原的反应以及凝血过程。在一些实施方案中，进一步地，所述有色物质包括但不限于台盼蓝。
进一步地，所述步骤(a)中的缓冲液中的有色物质含量为约0.001％至约0.005％，例如0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％、约0.005％。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的供试品和对照品用缓冲液按比例稀释，该稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的稀释成系列浓度，所述系列浓度可以包括但不限于约200μg/mL、约100μg/mL、约50μg/mL、约25μg/mL、约12.5μg/mL、约6.25μg/mL、约3.13μg/mL、约1.56μg/mL、约0.781μg/mL、约0.391μg/mL、约0.195μg/mL、约0.0977μg/mL。一些实施方案中，可以增减一些浓度，比如，可以去掉最高和/或最低浓度点：200μg/mL、0.0977μg/mL，注意增减浓度不会影响最终曲线拟合的完整性。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(b)中的血浆可以是但不限于人血浆。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(c)中需加入等体积的aPTT试剂。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(b)和(c)中的孵育条件为约20℃至约37℃，例如约20℃、约23℃、约25℃、约27℃、约30℃、约32℃、约35℃、约37℃；约500rpm至约2000rpm转速，例如约500rpm、800rpm、900rpm、1000rpm、1100rpm、1200rpm、1500rpm、2000rpm；孵育1min至30min，例如1min至30min、1min至20min、1min至10min、3min至10min。
在一些具体实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(b)中的孵育条件为约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育10min。
在一些具体实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(c)中的孵育条件为约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育3min。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(d)中的CaCl2溶液的浓度为约1mM至约30mM，例如约1.0mM、约5.0mM、约10.0mM、约11.0mM、约12.0mM、约12.1mM、约12.2mM、约12.3mM、约12.4mM、约12.5mM、约12.6mM、约12.7mM、约12.8mM、约12.9mM、约13.0mM、约15.0mM、约20.0mM、约30.0mM。在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(d)中的CaCl2溶液的浓度为约12.5mM。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(e)中的OD值是在340±20nm处60秒至180秒读取获得，例如340nm处60秒、340nm处90秒、340nm处120秒、340nm处150秒、340nm处180秒、320nm处60秒、320nm处90秒、320nm处120秒、320nm处150秒、320nm处180秒、360nm处60秒、360nm处90秒、360nm处120秒、360nm处150秒、360nm处180秒，但不限于此。在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(e)中的OD值是在340nm处90秒读取获得。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中，所述步骤(e)中的供试品的相对生物学活性是通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的EC50值，再根据对照品EC50值与供试品EC50值的比值计算出供试品的相对生物学活性。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aPTT试剂、CaCl2溶液和EDTA溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μL/孔，例如约25至约50μL/孔、约30至约50μL/孔、约35至约50μL/孔、约40至约50μL/孔、约20至约45μL/孔、约25至约40μL/孔、约30至约35μL/孔、约20至约30μL/孔。在一些非限制性实施方案中，所述加入体积为约20μL/孔、约25μL/孔、约30μL/孔、约35μL/孔、约40μL/孔、约45μL/孔、约50μL/孔。在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aPTT试剂、CaCl2溶液和EDTA溶液的加入体积为约25μL/孔。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述抗FXI/FXIa抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：7、8、9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：10、11、12所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
在一些实施方案中，其中所述抗FXI/FXIa抗体或其抗原结合片段可选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，例如人源化抗体。
在可选实施方案中，其中所述的人源化抗FXI/FXIa抗体轻链和重链可变区上的轻链和重链FR序列分别来源于人种系轻链和重链的FR或其突变序列。
在一些实施方案中，其中所述抗FXI/FXIa抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：
重链可变区序列如SEQ ID NO：5或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如SEQ ID NO：6或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列；
重链可变区序列如SEQ ID NO：13或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如SEQ ID NO：14或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列；
重链可变区序列如SEQ ID NO：15或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如SEQ ID NO：16或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列；
重链可变区序列如SEQ ID NO：17或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如SEQ ID NO：16或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列；
在一些具体实施方案中，其中所述抗FXI/FXIa抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区序列如SEQ ID NO：17所示，和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：16所示。
在一些实施方案中，所述抗FXI/FXIa抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。在可选的实施方案中，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG4P(即IgG4的S241P突变体)恒定区，所述轻链恒定区选自人κ和λ链恒定区。所述IgG4PFc(即包含S241P的IgG4 Fc)的序列例如SEQ ID NO：19所示。在一些实施方案中，所述重链CH1的序列如SEQ ID NO：18所示或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，和/或所述轻链恒定区的序列如SEQ ID NO：20所示或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述抗FXI/FXIa抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中：所述重链具有SEQ ID NO：21所示的序列或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，和所述轻链具有SEQ ID NO：22所示的序列或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列。
本公开中，所述“至少90％同一性”涵盖至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。
在一些具体实施方案中，其中所述抗FXI/FXIa抗体包含抗体重链和轻链，其中：所述重链序列如SEQ ID NO：21所示，和所述轻链序列如SEQ ID NO：22所示。
在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述抗FXI/FXIa抗体的抗原结合片段为Fab、Fv、sFv、Fab’、F(ab’)2、线性抗体、单链抗体、scFv、sdAb、sdFv、纳米抗体、肽抗体peptibody、结构域抗体和多特异性抗体(双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody、串联二-scFv、串联三-scFv)，例如具体为scFv、Fv、Fab或Fab’片段。
本公开提供一种抗FXI/FXIa抗体的活性检测方法，该方法包括以下的步骤：
(a)将供试品和对照品用缓冲液按比例稀释成系列浓度；
(b)加入血浆，孵育；
(c)加入aPTT试剂，孵育；
(d)加入CaCl2；和
(e)于酶标仪上读取OD值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性；
其中，所述供试品和对照品为抗FXI/FXIa抗体；
可选地，可进一步包含步骤(f)加入EDTA溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间。
具体实施方案一，该方法包括以下的步骤：
(a)将供试品和对照品用pH值为约6.0至约8.5的约20mM至约100mM Tris-HCl缓冲液按比例稀释成系列浓度，优选pH值为约7.3±0.1的约50mM Tris-HCl缓冲液；
(b)加入血浆，孵育；
(c)加入aPTT试剂，孵育；
(d)加入约12.5mM CaCl2；和
(e)于酶标仪上340nm处90秒读取OD值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性。
其中，所述供试品和对照品为抗FXI/FXIa抗体；
可选地，可进一步包含步骤(f)加入EDTA溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间，其中EDTA溶液的浓度为约15mM至约50mM，优选为约25mM；
可选地，步骤(a)中缓冲液可以含有约0.001％至约0.005％台盼蓝作为有色物质，优选约0.002％；
可选地，步骤(a)中稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个；
可选地，步骤(b)和(c)中的孵育条件为约20℃至约37℃，约500rpm至约2000rpm转速下孵育1min至30min；
可选地，步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aPTT试剂、CaCl2溶液和EDTA溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μL/孔，优选约25μL/孔。
可选地，步骤(e)中的供试品的相对生物学活性是通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的EC50值，再根据对照品EC50值与供试品EC50值的比值计算出供试品的相对生物学活性。
可选地，抗FXI/FXIa抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：7、8、9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和所述轻链可变区包含分别如SEQID NO：10、11、12所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
具体实施方案二，该方法包括以下的步骤：
(a)将供试品和对照品用pH值为约7.3±0.1的约50mM Tris-HCl缓冲液按比例稀释成系列浓度；
(b)加入血浆，约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育10min；
(c)加入aPTT试剂，约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育3min；
(d)加入约1mM至约30mM CaCl2溶液，优选约12.5mM；和
(e)于酶标仪上340nm处90秒读取OD值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性。
其中，所述供试品和对照品为抗FXI/FXIa抗体；
可选地，可进一步包含步骤(f)加入EDTA溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间，其中EDTA溶液的浓度为约15mM至约50mM，优选为约25mM；
可选地，步骤(a)中缓冲液可以含有约0.001％至约0.005％台盼蓝作为有色物质，优选约0.002％；
可选地，步骤(a)中稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个；
可选地，步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aPTT试剂、CaCl2溶液和EDTA溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μL/孔，优选约25μL/孔。
可选地，步骤(e)中的供试品的相对生物学活性是通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的EC50值，再根据对照品EC50值与供试品EC50值的比值计算出供试品的相对生物学活性。
可选地，抗FXI/FXIa抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：7、8、9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和所述轻链可变区包含分别如SEQID NO：10、11、12所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
具体实施方案三，该方法包括以下的步骤：
(a)将供试品和对照品用pH值为约7.3±0.1的约50mM Tris-HCl缓冲液按比例稀释成系列浓度；
(b)加入血浆，约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育10min；
(c)加入aPTT试剂，约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育3min；
(d)加入约12.5mM CaCl2溶液；和
(e)于酶标仪上340±20nm处60秒至180秒读取OD值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性；
其中，所述供试品和对照品为抗FXI/FXIa抗体；
可选地，可进一步包含步骤(f)加入EDTA溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间，其中EDTA溶液的浓度为约15mM至约50mM，优选为约25mM；
可选地，步骤(a)中缓冲液可以含有约0.001％至约0.005％台盼蓝作为有色物质，优选约0.002％；
可选地，步骤(a)中稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个；
可选地，步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aPTT试剂、CaCl2溶液和EDTA溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μL/孔，优选约25μL/孔。
可选地，步骤(e)中的供试品的相对生物学活性是通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的EC50值，再根据对照品EC50值与供试品EC50值的比值计算出供试品的相对生物学活性。
可选地，抗FXI/FXIa抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：7、8、9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和所述轻链可变区包含分别如SEQID NO：10、11、12所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
具体实施方案四，该方法包括以下的步骤：
(a)将供试品和对照品用pH值为约7.3±0.1的约50mM Tris-HCl缓冲液按比例稀释成系列浓度，所述稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个；
(b)加入血浆，约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育10min；
(c)加入aPTT试剂，约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育3min；
(d)加入约12.5mM CaCl2溶液；和
(e)于酶标仪上340nm处90秒读取OD值，通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的EC50值，再根据对照品EC50值与供试品EC50值的比值计算出供试品的相对生物学活性；
其中，所述供试品和对照品为抗FXI/FXIa抗体；
可选地，可进一步包含步骤(f)加入EDTA溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间，其中EDTA溶液的浓度为约15mM至约50mM，优选为约25mM；
可选地，步骤(a)中缓冲液可以含有约0.001％至约0.005％台盼蓝作为有色物质，优选约0.002％；
可选地，步骤(a)中稀释后的系列浓度选自约200μg/mL、约100μg/mL、约50μg/mL、约25μg/mL、约12.5μg/mL、约6.25μg/mL、约3.13μg/mL、约1.56μg/mL、约0.781μg/mL、约0.391μg/mL、约0.195μg/mL、约0.0977μg/mL中任意一个或多个；
可选地，步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aPTT试剂、CaCl2溶液和EDTA溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μL/孔，优选约25μL/孔。
可选地，抗FXI/FXIa抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：7、8、9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和所述轻链可变区包含分别如SEQID NO：10、11、12所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
具体实施方案五，该方法包括以下的步骤：
(a)将供试品和对照品用pH值为约6.0至约8.5的约20mM至约100mM Tris-HCl缓冲液按比例稀释成系列浓度；
(b)加入血浆，约20℃至约37℃，约1000rpm转速下孵育1min至30min；
(c)加入aPTT试剂，约20℃至约37℃，约1000rpm转速下孵育1min至30min；
(d)加入约1mM至约30mM CaCl2溶液；和
(e)于酶标仪上340±20nm处60秒至180秒读取OD值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性；
其中，所述供试品和对照品为抗FXI/FXIa抗体；
可选地，可进一步包含步骤(f)加入EDTA溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间，其中EDTA溶液的浓度为约15mM至约50mM，优选为约25mM。
可选地，步骤(a)中缓冲液可以含有约0.001％至约0.005％台盼蓝作为有色物质，优选约0.002％；
可选地，步骤(a)中稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个；
可选地，步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aPTT试剂、CaCl2溶液和EDTA溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μL/孔，优选约25μL/孔。
可选地，步骤(e)中的供试品的相对生物学活性是通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的EC50值，再根据对照品EC50值与供试品EC50值的比值计算出供试品的相对生物学活性。
可选地，抗FXI/FXIa抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：7、8、9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和所述轻链可变区包含分别如SEQID NO：10、11、12所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
本公开中所使用的抗FXI/FXIa抗体包括但不局限于上述具体实施方案中的抗FXI/FXIa抗体。
本公开数据处理采用四参数方程进行拟合，回归方程为：Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D。其中A为曲线上渐近线估值；B为曲线的斜率；C为EC50值(μg/mL)；D：曲线下渐近线估值。待检样品生物活性按下面公式计算：待检样品生物活性(％)＝对照品EC50(μg/mL)/待检样品EC50(μg/mL)×100。
本公开同时提供了抗FXI/FXIa抗体的生物学活性测定方法及其在FXI/FXIa单克隆抗体质控中的应用。
本公开采用竞争抑制的体外酶联免疫吸附法测定抗FXI/FXIa抗体的生物学活性具有操作简便、准确度高、质量更可控等优点。
本公开提供的检测方法满足专属性、精密度、线性和范围、准确度及耐用性等验证方面的要求，能够有效地应用于抗FXI/FXIa抗体生物学活性的检测。
本公开还提供一种试剂盒或产品，所述试剂盒包含前述任一项检测方法中的血浆、aPTT试剂、CaCl2溶液和酶标仪。
本公开还提供了前述任一项抗凝血药物的活性检测方法、试剂盒或产品在质量放行中的应用。
附图说明
图1：抗FXI/FXIa抗体的体外FXIIa介导的FXI活化酶活抑制试验。
图2：人血的aPTT/PT抗凝血活性检测，其中，图2A、2B分别为抗FXI/FXIa抗体在人血上的aPTT和PT试验结果。
图3：猴血的aPTT/PT抗凝血活性检测，其中，图3A、3B分别为抗FXI/FXIa抗体在猴血上的aPTT和PT试验结果。
图4：抗FXI/FXIa抗体在食蟹猴上的动物实验检测，其中，图4A为抗体3882在食蟹猴体内的aPTT、血浆药物浓度、FXI:C％和游离FXI的变化曲线，图4B为抗体3882在食蟹猴体内的血栓生成抑制作用，图4C和图4D为抗体3882在食蟹猴体内的安全性测试，分别出血时间测定和PT检测结果。
图5：抗FXI/FXIa抗体在食蟹猴上体内药效学(PD)试验结果，其中，图5A为APTT(s)检测结果，图5B为FXI：C(％)检测结果，3882(1mg/kg)为静脉给药和皮下给药两种方式，对照BAY1213790(1mg/kg)为静脉给药方式。
图6：aPTT活化凝血动力学曲线。
图7：凝血过程中透射光OD值与反应时间线性回归分析。
图8：不同浓度抗FXI/FXIa抗体的凝血曲线。
图9：抗FXI/FXIa抗体生物活性测定。
图10：抗FXI/FXIa抗体生物活性测定(专属性评价)。
图11：实测抗FXI/FXIa抗体生物活性与理论生物活性线性回归分析(准确度评价)。
具体实施方式
术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
“因子XI”在本文中也称为“凝血因子XI”、“FXI”或“fXI”，其是分子量为约160千道尔顿(kD)的双链糖蛋白。两条链可为相同的经二硫键连接的分子量为约80,000道尔顿的多肽。FXI含有4个“苹果结构域(apple domains)”(来自N-末端的A1-A4，重链)和C-末端催化结构域(轻链)。不希望受限于特定理论，认为四个苹果结构域包含对其它蛋白的FXI结合位点，诸如A1对凝血酶；A2对HK，A3对因子IX(FIX)、GPIb和肝素，A4对FXIIa。FXI可通过因子XIIa(FXIIa)转化为其活性形式，凝血因子XIa(FXIa)。丝氨酸蛋白酶FXIa转化凝血因子IX为IXa，后者随后激活凝血因子X(Xa)。Xa随后可介导凝血因子II/凝血酶激活。
本公开所述的“抗体”以最广义使用，涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体；单特异性抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，全长抗体和抗体片段(或抗原结合片段，或抗原结合部分)，只要它们展现出期望的抗原结合活性。抗体可以指免疫球蛋白，天然完整抗体是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公开所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。
本公开“抗体”除包括全长抗体外，还包括能结合抗原的抗原结合片段。
术语“抗原结合片段”或“功能片段”是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或更多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)dsFv，由VH和VL经链间二硫键形成的稳定的抗原结合片段；(vi)包含scFv、dsFv、Fab等片段的双抗体、双特异性抗体和多特异性抗体。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。此类单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
本公开的术语“与FXI/FXIa结合”，指能与FXI/FXIa或其表位相互作用，所述FXI/FXIa或其表位可以是人源的。本公开的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本公开抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
术语“特异性结合”指如通过本领域可用的技术，例如竞争ELISA、
Figure BDA0004038163270000121
测定或/>
Figure BDA0004038163270000122
测定所测定的。该术语还适用于当例如本公开抗体的抗原结合结构域对许多抗原携带的特定表位特异的情况，在该情况下携带抗原结合结构域的抗体能够特异性结合携带该表位的多种抗原。/>
术语“供试品”是指待测定、待鉴别的供测试样品。在本公开中，供试品包括在工业生产中被生产出来的待检测生物学活性的抗体样本，具体包括抗FXI/FXIa抗体原液或成品。
术语“样品缓冲液”是指用于稀释样品或其他试剂的缓冲液。
术语“放行”是指根据工艺数据，评估中间品和/或成品达到可接受质量的能力。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。下述实施例中的所用的材料与试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。文中所述实施方法与材料试剂仅作示范之用。
在以上说明书中提出了本公开一种或多种实施方式的细节。虽然可使用与本文所述类似或相同的任何方法和材料来实施或测试本公开，但是以下描述的方法和材料。通过说明书和权利要求书，本公开的其他特点、目的和优点将是显而易见的。在说明书和权利要求书中，除非上下文中有清楚的另外指明，单数形式包括复数指代物的情况。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本公开所属领域普通技术人员所理解的一般含义。说明书中引用的所有专利和出版物都通过引用纳入。提出以下实施例是为了更全面地说明本公开的可选实施方式。这些实施例不应以任何方式理解为限制本公开的范围，本公开的范围由权利要求书限定。
实施例
以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
材料与一般方法
试剂与材料
抗FXI/FXIa抗体(对照品或供试品)的制备、纯化等参照下述实施例1至3；活化部分凝血活酶时间测定试剂盒、标准人血浆、25mM CaCl2溶液均购自Dade Behring；Trisbase购自Sigma-Aldrich；EDTA购自国药集团化学试剂有限公司；96孔板购自Greiner Bio-One。
设备
多功能酶标仪(型号SpectraMax M5e)购自Molecular Devices；微孔板恒温混匀器(型号PHMP-4)购自Grant-bio
样品
样品稀释液[50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.3，含0.002％台盼蓝)]：Tris 0.60g，0.4％台盼蓝0.5mL，纯化水加至100mL，用5M HCl调pH至7.3±0.1。
12.5mM CaCl2溶液：25mM CaCl2溶液与等体积超纯水混合即得。
标准人血浆：按产品说明书进行操作，于实验当天复溶。每瓶标准人血浆冻干品加1mL超纯水，轻轻摇动使充分溶解。
25mM EDTA溶液：EDTA二钠0.465g，纯化水加至500mL，用5M HCl调pH值至7.3±0.1。
实施例1、抗FXI/FXIa的杂交瘤单克隆抗体的筛选和制备
1.1、人FXI/FXIa抗原及检测蛋白的制备
人FXI/FXIa蛋白(Uniprot Acc No.P03951)作为本公开涉及的抗原及检测用蛋白，购自Enzyme research laboratories(FXI:Cat.HFXI1111；FXIa:HFXIa 1111a)。以下FXI/FXIa抗原未特殊说明的均指人FXI/FXIa。
>人FXI/FXIa的氨基酸序列：
ECVTQLLKDTCFEGGDITTVFTPSAKYCQVVCTYHPRCLLFTFTAESPSEDPTRWFTCVLKDSVTETLPRVNRTAAISGYSFKQCSHQISACNKDIYVDLDMKGINYNSSVAKSAQECQERCTDDVHCHFFTYATRQFPSLEHRNICLLKHTQTGTPTRITKLDKVVSGFSLKSCALSNLACIRDIFPNTVFADSNIDSVMAPDAFVCGRICTHHPGCLFFTFFSQEWPKESQRNLCLLKTSESGLPSTRIKKSKALSGFSLQSCRHSIPVFCHSSFYHDTDFLGEELDIVAAKSHEACQKLCTNAVRCQFFTYTPAQASCNEGKGKCYLKLSSNGSPTKILHGRGGISGYTLRLCKMDNECTTKIKPRIVGGTASVRGEWPWQVTLHTTSPTQRHLCGGSIIGNQWILTAAHCFYGVESPKILRVYSGILNQSEIKEDTSFFGVQEIIIHDQYKMAESGYDIALLKLETTVNYTDSQRPICLPSKGDRNVIYTDCWVTGWGYRKLRDKIQNTLQKAKIPLVTNEECQKRYRGHKITHKMICAGYREGGKDACKGDSGGPLSCKHNEVWHLVGITSWGEGCAQRERPGVYTNVVEYVDWILEKTQAV
(SEQ ID NO：1)
同时将FXIa特异性多肽与KLH偶联，用于小鼠免疫。FXIa特异性多肽序列如下：
CFYGVESPKILRVYSGIL (SEQ ID NO：2)
CGYRKLRDKIQNTLQKAKIPL (SEQ ID NO：3)
CGVQEIIIHDQYKMAESGYDI (SEQ ID NO：4)
1.2、FXI/FXIa相关重组蛋白的纯化，以及杂交瘤抗体、重组抗体的纯化
首先利用ProteinG亲和层析分离纯化鼠杂交瘤上清，其次利用Protein A亲和层析提取带人Fc标签的融合蛋白或者抗体，再进一步利用阴离子层析精纯抗体。
1.3、抗体筛选
取5只SJL白小鼠，5只Balb/c白小鼠，分别用25μg的FXIa抗原和3个KLH偶联的多肽与佐剂混合免疫。时间为第0、14、35天。第0天腹膜内(IP)注射25μg/只的乳化后抗原。第14、35天注射12.5ug/只。于第21、42天取血，用ELISA方法确定小鼠血清中的抗体滴度。在第4-5次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。
采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14细胞进行融合得到杂交瘤细胞。根据杂交瘤细胞生长密度，用结合ELISA方法对杂交瘤培养上清进行纯化、细胞结合实验和细胞阻断实验，阳性的孔细胞及时进行扩增冻存保种和测序。ELISA方法对杂交瘤细胞进一步筛选后获得杂交瘤克隆，然后制备并纯化抗体。
获得阳性克隆3807，对应的抗体可变区氨基酸序列如下：
>3807-VH：
EVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCIASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYASKFQGKATITADTSANTAYLQFSSLTSEDTAVYYCLYGNFYYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：5
>3807-VL：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSINYMHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSFSPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：6
表1.抗体3807的重链及轻链CDR区序列
Figure BDA0004038163270000141
Figure BDA0004038163270000151
实施例2、抗FXI/FXIa杂交瘤抗体的人源化和免疫原性的改造
2.1、人源化
通过对抗体分子3807进行三维同源建模，结合V-base人种系序列数据库，IMGT人类抗体重链可变区种系基因数据库进行比对的结果，挑选与筛选出来的抗体同源性高的重链可变区种系基因作为模板，将小鼠来源单克隆抗体的CDR移植到相应的人源模块中。对移植后的抗体再次进行三维结构模拟并分析，将FR区中影响CDR区结构形态的特定位点进行恢复突变。其中氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
杂交瘤克隆3807人源化架构的轻链模板为IGKV3-11*01，重链模板为IGHV1-69-2*01，人源化可变区序列如下(下划线为CDR)：
>3807VH-CDR graft
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDDYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYASKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNFYYFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：13
>3807VL-CDR graft
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQRSFSPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：14
杂交瘤克隆3807的回复突变位点和突变方式设计如表2。
表2.各重链可变区及轻链可变区序列
Figure BDA0004038163270000152
其中3807-VH1和3807-VL3具体序列如下。
>3807-VH1：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDDYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYASKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLYGNFYYFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：15
>3807-VL3：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYMHWYQQKPGQAPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQRSFSPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：16
抗体3871的VH为3807-VH1，VL为3807-VL3。
2.2、免疫原性改造
对3871进行基因改造，使抗体具有更高的稳定性，更低的免疫原性。仅对重链可变区FR区进行了改造，轻链可变区未变动。
人源化抗体3871基因改造的重链可变区序列如下(轻链不变)：
>3807-VH1(GTFS)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDDYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYASKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLYGNFYYFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：17
抗体3882的VH为3807-VH1(GTFS)，VL为3807-VL3。
将以上各重链可变区与对应的人源抗体重链CH1(SEQ ID NO：18)和人抗体IgG4的Fc(含S241P突变)(SEQ ID NO：19)融合，轻链可变区与人源kappa(SEQ ID NO：20)融合，组成重组嵌合抗体进行后续检测。
>人抗体重链CH1：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV
SEQ ID NO：18
>人抗体IgG4PFc(即含S241P突变)：
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：19
>人抗体轻链Cκ：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：20
以3882示例抗体全长序列。
>3882-HC：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDDYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYASKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLYGNFYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：21
>3882-LC：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYMHWYQQKPGQAPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQRSFSPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：22
经常规方法制备抗体的表达载体，转染CHO细胞，分离，纯化，检测，获得目的抗体。
实施例3、抗FXI/FXIa抗体功能验证
3.1、亲和力测定
采用Biacore方法。用Protein A生物传感芯片(Cat.#29127556，GE)亲和捕获一定量的待测抗体，然后于芯片表面流经一系列浓度梯度下的人FXI/FXIa，利用Biacore仪器(Biacore T200，GE)实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，用人抗捕获试剂盒里配置的再生溶液或pH1.5的甘氨酸-盐酸再生溶液(Cat.#BR-1003-54，GE)将生物芯片洗净再生。实验中用到的缓冲剂为HBS-EP+10×缓冲溶液(Cat.#BR-1006-69，GE)用D.I.Water稀释至1×(pH 7.4)
实验得到的数据用BIAevaluation version 4.1，GE软件以(1:1)Langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值，测试结果见表3。
表3.抗FXI/FXIa抗体的亲和力测定
抗体 抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
3871 FXI 1.32E+06 2.66E-05 2.00E-11
3882 FXI 1.973E+6 5.846E-5 2.963E-11
3807 FXIa 1.59E+06 2.35E-04 1.48E-10
3871 FXIa 1.24E+06 7.08E-04 5.70E-10
3882 FXIa 1.06E+06 3.87E-04 3.64E-10
3.2、体外FXIIa介导的FXI活化酶活抑制试验
检测抗FXI/FXIa抗体与胰蛋白酶原FXI结合阻断FXIIa对FXI酶切的能力。
预先设置SpectraMax M5酶标仪到37℃，冰上预冷384孔板后，加入分别用缓冲剂(20mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl和0.1％ BSA)稀释的10ul FXI(12ug/mL)、10ul FXIIa(7.8ug/mL)、10ul的FXI/FXIa待测抗体(300ug/mL)、10ul的Dextran(100ug/mL)，在37℃孵育60min，然后放冰上孵育5min，加入10ul S-2366(8mM)(Chromogenix，S821090)后，酶标仪检测。结果见图1，其中，使用人IgG同种型作为阴性对照(NC)。
3.3、人血/猴血的aPTT/PT抗凝血活性检测
用枸橼酸钠管新鲜采集人血/猴血，3000rpm离心15min，取上层血浆。
用Sysmex试剂盒测定在不同浓度的候选抗体(PBS稀释)的存在下的活化部分凝血活酶时间(aPTT)，将所要测试的候选抗体用血浆在37℃下孵育3分钟，然后通过加入25mM氯化钙试剂启动凝血，测定发生凝血时的时间。测定使aPTT延长50％的候选抗体的浓度(aPTT1.5)和半数有效浓度(EC50)，部分抗体测试结果见图2A、图3A和表4。其中，1209为本申请筛选获得的另一个抗FXI/FXIa抗体。
用Sysmex试剂盒测定在不同浓度的候选抗体(PBS稀释)存在下的凝血酶原时间(PT)，将所要测试的候选抗体用血浆在37℃下孵育3分钟，然后通过加入促凝血酶原激酶启动凝血，测定发生凝血时的时间。部分抗体测试结果见图2B和图3B。
表4.抗FXI/FXIa抗体的aPTT/PT测定
抗体 血浆 aPTT1.5(ug/mL) EC50(ug/mL)
3882 人血 0.91 1.24
3882 猴血 0.98 1.25
3.4、食蟹猴体内药代动力学(PK)/药效学(PD)试验
正常成年雄性食蟹猴(体重在4.0-4.7kg范围)，按照体重分配入组(体重第1、4、5入一组，体重第2、3、6入另一组)，每组3只，观察14天。
给药前一天以枸橼酸钠采血管采集血样，作为给药前样本，测定aPTT、PT、血浆药物浓度、血浆活性XI因子(Factor XI,FXI)比例(FXI:C％，即有凝血活性的FXI的比例)和血浆游离FXI浓度；同时测定每只动物的出血时间。两组动物中，其中一组空白不给药；另一组给药3882，5毫克/千克体重(mg/kg,mpk)。药物按照5毫克/毫升(mg/mL)浓度溶于磷酸盐缓冲剂(PBS)，静脉推注给药。
空白对照组于给药后15分钟(min)、3小时(h)分别观测出血时间；于给药后15min、3h、6h和1天(d)分别按照上述方法采集血浆并观测aPTT和PT。给药组于给药后15min、3h、2d、4d、1周(w)、2w和3w分别观测出血时间；于给药后15min、3h、6h、1d、2d、4d、1w、2w、3w、4w、5w和6w分别按照上述方法采集血浆并观测aPTT、PT、血浆药物浓度、血浆FXI:C％和血浆游离FXI浓度。两组动物均于给药1d后进行AV-shunt造栓，造栓时间10min，造栓后称取栓净重。
其中aPTT、PT和血浆FXI:C％以凝血仪和相应试剂盒测定，血浆游离FXI浓度和血浆药物浓度以ELISA方法测定。血栓重量以给药组与对照组进行对比，以t检验进行统计分析。
抗体测试结果参见图4A-图4D，其中，阴性对照(NC)为未给药。结果显示，3882良好的抑制了血栓生成，同时，延长了内源性凝血时间，但对动物出血时间和外源性凝血时间没有显著影响，PK结果显示半衰期为20天左右。
3.5、食蟹猴体内药效学(PD)试验
正常成年雄性食蟹猴(体重在7-9kg范围)6只，随机分为3组，分别为：BAY1213790静脉给药1毫克/千克体重(mg/kg)组；3882静脉给药1毫克/千克体重(mg/kg)组；3882皮下给药1毫克/千克体重(mg/kg)组。静脉给药组动物在给药前及给药后5min,1h、1d、2d、3d、5d、1w、2w、3w、4w，皮下给药组在给药前及给药后1h、1d、2d、3d、5d、1w、2w、3w、4w，以枸橼酸钠采血管采集血样，以凝血仪和相应试剂盒测定aPTT和血浆FXI:C％。
测试结果参见图5A，5B。结果显示，3882皮下给药和静脉给药均能显著延长内源性凝血时间，抑制FXI的活性。在等剂量给药条件下，3882和BAY1213790相比，3882对内源性凝血时间的延长维持时间更长，对FXI的抑制作用更强。
>BAY1213790的重链：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSQYGMDWVRQAPGKGLEWVSGIGPSGGSTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGGPYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：23)
>BAY1213790的轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADSFPVTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：24)
以下实施例中的对照品或供试品为相同的抗FXI/FXIa抗体，即均为3882抗体。
实施例4、不同抗FXI/FXIa抗体浓度的凝血曲线
将抗FXI/FXIa抗体(3882抗体)用50mM TB(pH 7.3,0.002％台盼蓝)缓冲液稀释成一系列浓度：6.25μg/mL、1.56μg/mL、0.391μg/mL、0.0977μg/mL、0.0488μg/mL以及0μg/mL(TB)，分别取25μL加至96孔板中，加入等体积标准人血浆，于25℃、1000rpm孵育10min。然后加入aPTT试剂25μL/孔，25℃、1000rpm孵育3min；加入25μL/孔12.5mM CaCl2溶液，以启动凝血过程；立即于酶标仪上扫描340nm处的动力学曲线。
图6、图7和图8结果显示，TB缓冲液和各个浓度抗体的凝血曲线呈“S”形，曲线基线的OD值和完全凝固的终点OD值分别达到相同水平；随着抗体浓度的增加，凝血起始时间及达到凝固中间点的时间延长，与抗体的抗凝血作用相一致。
实施例5、抗FXI/FXIa抗体生物活性测定
将供试品和对照品用50mM TB(pH 7.3,0.002％台盼蓝)缓冲液预稀释至200μg/mL，然后在稀释板中连续进行8-10次2倍梯度稀释，共得9-11个浓度的样品溶液，每个浓度均设置复孔，分别取25μL加至96孔半孔板中，加入等体积标准人血浆25℃、1000rpm孵育10min，同时设置只加缓冲液的对照空白孔。然后加入aPTT试剂25μL/孔，25℃、1000rpm孵育3min；每孔加入25μL 12.5mM CaCl2溶液，启动凝血过程；25℃孵育60秒，每孔加入25μL25mM EDTA溶液；于酶标仪上以对照空白孔校零，读取340nm处的OD值。以浓度的对数为横坐标，OD值为纵坐标，选用四参数方程进行拟合，绘制曲线，计算样品EC50值。
图9结果显示，对照品、供试品四参数曲线R2值分别为：0.991、0.992，表明曲线拟合良好；对照品EC50值为：1.969μg/mL，供试品EC50值为：1.827μg/mL，供试品的相对生物活性为：108％。
实施例6、抗FXI/FXIa抗体生物活性测定(专属性评价)
通过对供试品(抗FXI/FXIa抗体)、供试品缓冲液和无关抗体(与供试品同为IgG4亚型的靶向非FXI/FXIa抗原的抗体)进行测定。供试品缓冲液按照与供试品相同的方法稀释，无关抗体按照其蛋白含量稀释，与供试品在同一块96孔板上测定。
图10结果显示，供试品呈现明显的量效曲线，供试品缓冲液及无关抗体无明显量效曲线,表明本方法对抗FXI/FXIa抗体生物学活性测定的专属性良好。
实施例7、抗FXI/FXIa抗体生物活性测定(精密度评价)
两名实验员不同日对同一份样品(抗FXI/FXIa抗体)分别进行3次独立检测，计算6次生物活性值的RSD(％)。
表5精密度试验结果
Figure BDA0004038163270000201
表5结果显示，两名实验员测定供试品抗FXI/FXIa抗体6次生物活性的RSD为14.7％，表明本方法的精密度良好。
实施例8、抗FXI/FXIa抗体生物活性测定(准确度评价)
将抗FXI/FXIa抗体样品分别稀释至400μg/mL、300μg/mL、200μg/mL、140μg/mL、100μg/mL，即制备成理论生物活性分别为200％、150％、100％、70％、50％的样品，再以1:2进行连续梯度稀释后检测，分别计算这5组样品的回收率(回收率＝实测生物活性/理论生物活性×100％)。
表6准确度试验结果
样品名称 理论生物活性(％) 实测生物活性(％) 相对误差(％) 回收率
200％抗FXI/FXIa抗体 200 177 -11.5 88.5％
150％抗FXI/FXIa抗体 150 155 3.3 103.3％
100％抗FXI/FXIa抗体 100 110 10.0 110.0％
70％抗FXI/FXIa抗体 70 70 0.0 100.0％
50％抗FXI/FXIa抗体 50 mL51 2.0 102.0％
注：对照品与100％抗FXI/FXIa抗体样品相同。
结果显示，理论生物活性为200％、150％、100％、70％和50％的5个浓度点的回收率均在80％-120％之间，表明准确度良好。将实测生物活性值与理论生物活性值进行线性回归分析，R2为0.967，表明拟合线性良好，参见图11。
实施例9、酶标仪法与凝血仪法测定抗FXI/FXIa抗体生物活性的比较
本实施例使用的对照品浓度为43.8mg/mL，4个供试品浓度分别为43.8mg/mL、62.6mg/mL、6.1mg/mL、12.1mg/mL，均于2-8℃保存。
酶标仪法：将供试品及对照品用50mM TB(pH 7.3,0.002％台盼蓝)以2倍梯度稀释，共得11个浓度的样品溶液，浓度分别为：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL、0.781μg/mL、0.391μg/mL、0.195μg/mL。取稀释好的样品25μL/孔加到96孔板中，NC孔及空白对照孔加25μL/孔稀释液，每个浓度均设复孔。将标准人血浆加入到样品及NC孔中(空白对照孔不加)，25μL/孔，微孔板置于微孔板恒温混匀器上，1000rpm、25℃±2℃孵育10min。将aPTT试剂加入到样品及NC孔中(空白对照孔不加)，25μL/孔，微孔板置于微孔板恒温混匀器上，1000rpm、25℃±2℃孵育3min。将12.5mM CaCl2溶液加入到样品及NC孔中(空白对照孔不加)，25μL/孔。加完12.5mM CaCl2溶液后各孔样品终浓度依次为：50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL、0.781μg/mL、0.391μg/mL、0.195μg/mL、0.0977μg/mL、0.0488μg/mL。将微孔板置于酶标仪托架上，计时，以空白对照孔校零，90秒读340nm处OD值。拟合OD值与抗体浓度的四参数曲线，计算抗体EC50值及相对生物活性。
凝血仪法：将供试品及对照品用50mM TB(pH 7.3,0.002％台盼蓝)作梯度稀释，共得10个浓度的样品溶液，浓度范围为：200μg/mL–390.625ng/mL。取稀释好的样品与等体积的标准人血浆混合，37℃孵育3分钟。将凝血试管置于凝血仪中，按照常规方法进行aPTT凝血分析，测定各浓度抗体的凝血时间，绘制凝血时间与抗体浓度曲线图，计算抗体EC50值及相对生物活性。
表7酶标仪法与凝血仪法测定抗FXI/FXIa抗体生物活性的结果比较
Figure BDA0004038163270000221
结果显示，酶标仪法测定的生物活性结果与凝血仪法的结果较为一致，二者的回收率分别为90.0％-100.0％、82.0％-114.3％，都能达到较好的水平(均在80％-120％之间)。酶标仪法测定抗FXI/FXIa抗体生物活性能够达到与凝血仪法测定的相同准确度，可以作为抗FXI/FXIa抗体样品质量控制的方法。

Claims (11)

1.一种抗凝血药物的生物学活性检测方法，包括以下的步骤：
(a)将供试品和对照品用缓冲液按比例稀释成系列浓度；
(b)加入血浆，孵育；
(c)加入aPTT试剂，孵育；
(d)加入CaCl2溶液；和
(e)于酶标仪上读取OD值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性；
其中，所述供试品和对照品为同一种抗凝血药物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性检测方法还进一步包含步骤(f)加入EDTA溶液，终止反应，所述步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间；
优选地，所述EDTA溶液的浓度为约15mM至约50mM，
更优选地，所述EDTA溶液的浓度为约25mM。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中的缓冲液的pH值为6.0至8.5，优选7.3±0.1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述步骤(a)中的缓冲液为Tris-HCl缓冲液；优选地，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为约20mM至约100mM；更优选地，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为约50mM；
和/或，所述步骤(a)中的缓冲液可以含有有色物质，并且所述有色物质不影响抗体与抗原的反应以及凝血过程；优选地，所述有色物质为台盼蓝；优选地，所述有色物质含量为约0.001％至约0.005％，更优选约0.002％；
和/或，所述步骤(a)中的稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)和(c)中的孵育条件为约20℃至约37℃，约500rpm至约1000rpm转速，孵育1min至30min；
优选地，所述步骤(b)中的孵育条件为约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育10min；
优选地，所述步骤(c)中的孵育条件为约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育3min；
和/或，所述步骤(d)中的CaCl2为溶液，浓度为约1mM至约30mM，优选为约12.5mM；
和/或，所述步骤(e)中的OD值是在340±20nm处60秒至180秒读取获得，优选为340nm处60-90秒。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(e)中的供试品的相对生物学活性是通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的EC50值，再根据对照品EC50值与供试品EC50值的比值计算出供试品的相对生物学活性。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗凝血药物为抗体；
优选地，所述抗体选自抗FXI/FXIa抗体、抗FXII/FXIIa抗体、抗FIX抗体、抗FX抗体、抗FVII抗体、抗FVIII抗体、抗血小板糖蛋白IIb/IIIa受体抗体。
更优选地，所述抗体为抗FXI/FXIa抗体；
更优选地，所述抗FXI/FXIa抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：7、8、9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：10、11、12所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗FXI/FXIa抗体包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区和轻链可变区选自：
重链可变区序列如SEQ ID NO：5或与之具有至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如SEQ ID NO：6或与之具有至少90％同一性的序列；
重链可变区序列如SEQ ID NO：13或与之具有至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如SEQ ID NO：14或与之具有至少90％同一性的序列；
重链可变区序列如SEQ ID NO：15或与之具有至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如SEQ ID NO：16或与之具有至少90％同一性的序列；或，
重链可变区序列如SEQ ID NO：17或与之具有至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如SEQ ID NO：16或与之具有至少90％同一性的序列；
优选地，所述重链可变区序列如SEQ ID NO：17所示，所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：16所示；
优选地，所述抗FXI/FXIa抗体包含重链和轻链，其中：所述重链序列包含SEQ IDNO：21或与之具有至少90％同一性的序列，和所述轻链序列包含SEQ ID NO：22或与之具有至少90％同一性的序列。
9.一种抗FXI/FXIa抗体的活性检测方法，所述方法包括以下的步骤：
(a)将供试品和对照品用pH值为约6.0至约8.5的约20mM至约100mM Tris-HCl缓冲液按比例稀释成系列浓度；
(b)加入血浆，约25℃至37℃，约500rpm至约2000rpm转速下孵育1min至30min；
(c)加入aPTT试剂，约25℃至37℃，约500rpm至约2000rpm转速下孵育1min至30min；
(d)加入约1mM至约30mM CaCl2溶液；和
(e)于酶标仪上340±20nm处60秒至180秒读取OD值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性；
其中，所述供试品和对照品为抗FXI/FXIa抗体；
可选地，可进一步包含步骤(f)加入EDTA溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间，其中EDTA溶液的浓度为约15mM至约50mM，优选为约25mM。
可选地，步骤(a)中缓冲液可以含有约0.001％至约0.005％台盼蓝作为有色物质，优选0.002％；
可选地，步骤(a)中稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个；
可选地，步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aPTT试剂、CaCl2溶液和EDTA溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μL/孔，优选约25μL/孔；
可选地，步骤(e)中的供试品的相对生物学活性是通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的EC50值，再根据对照品EC50值与供试品EC50值的比值计算出供试品的相对生物学活性；
可选地，抗FXI/FXIa抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：7、8、9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和所述轻链可变区包含分别如SEQ IDNO：10、11、12所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
优选地，所述重链可变区和轻链可变区选自：
重链可变区序列如SEQ ID NO：5或与之具有至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如SEQ ID NO：6或与之具有至少90％同一性的序列；
重链可变区序列如SEQ ID NO：13或与之具有至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如SEQ ID NO：14或与之具有至少90％同一性的序列；
重链可变区序列如SEQ ID NO：15或与之具有至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如SEQ ID NO：16或与之具有至少90％同一性的序列；
重链可变区序列如SEQ ID NO：17或与之具有至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如SEQ ID NO：16或与之具有至少90％同一性的序列；
更优选地，所述重链可变区序列如SEQ ID NO：17所示，所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：16所示；
最优选地，所述抗FXI/FXIa抗体包含重链和轻链，其中：所述重链序列包含SEQ IDNO：21或与之具有至少90％同一性的序列，和所述轻链序列包含SEQ ID NO：22或与之具有至少90％同一性的序列。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-9任一项所述的检测方法中的血浆、aPTT试剂、CaCl2溶液和酶标仪。
11.根据权利要求1-9任一项所述的测定方法或权利要求10所述的试剂盒在质量放行中的应用。
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