CN116262139A - 通过蓝斑核及其周边区域调控血管内皮细胞异质性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过蓝斑核及其周边区域调控血管内皮细胞异质性的方法，该方法包括，在蓝斑核或蓝斑核上部及其周边区域表达由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体，然后通过所述设计药物激活所述人工设计的蛋白受体，从而激活或抑制神经元活动，实现对骨血管内皮细胞异质性的调控；或者将光感基因转入蓝斑核或蓝斑核上部及其周边区域表达离子通道蛋白，然后通过不同波长的光照刺激离子通道蛋白，离子通道对离子产生选择性，从而激活或抑制神经元活动，实现对血管内皮细胞异质性的调控。本发明利用光遗传学或药理遗传学调控中枢神经特定脑区活动度，调控骨血管内皮细胞的亚型，可实现对骨血管内皮细胞亚型的双向调控，同时影响与其偶联的骨密度。

Description

通过蓝斑核及其周边区域调控血管内皮细胞异质性的方法
技术领域
本发明涉及骨和血管，具体涉及利用神经调控技术控制骨骼内血管内皮细胞的特异性，更具体地涉及通过蓝斑核及其周边区域调控血管内皮细胞异质性的方法。
背景技术
血管内皮细胞是分布在血管内壁的单层细胞，具有丰富的异质性与器官特异性。通过密集的毛细血管分支，血管内皮在各个器官内与几乎所有的细胞建立联系。在不同的器官中，血管内皮有着显著的形态特异性，同时，不同器官的血管内皮细胞有着不同的转录因子簇，对应不同的器官和需求表达分泌不同的血管分泌因子以支持器官的生理功能。骨内的血管内皮被发现存在丰富的异质性，其中一类亚型血管内皮，H亚型骨血管内皮，能够促进骨质生成，骨血管H亚型内皮主要成拱柱状分布在骨生长板及骨内膜附近，是一类生长代谢高度活跃的内皮细胞亚型，它通过Notch信号通路将自身和骨代谢偶联在一起，促进骨质生成。随着年龄的增长，H亚型内皮细胞中CD31与EMCN的表达降低，转变为L亚型内皮，不再保留活跃代谢生长和促进骨生成的性质。通过药物甲磺酸去铁胺促进L亚型血管内皮逆向转变成H亚型，能够增加老年C57BL/6J雄鼠的骨密度。此外，缺氧诱导因子、Notch信号通路、血流、由破骨细胞前体分泌的血小板衍生生长因子以及由成骨细胞分泌的衔接蛋白Schnurri311，都与H亚型内皮细胞的体内水平相关。目前现有的技术一是进行基因改造，二是服用药物从而改变骨血管内皮细胞亚型，同时升高骨密度。
光遗传学是一种操控神经元活动的方法，能够精准的控制特定细胞在空间和时间上的活动。上个世纪70年代，微生物学家发现细菌视紫质和盐细菌视紫红质照光之后会成为离子转运蛋白。到了2005年，科学家第一次将光敏感通道表现在神经元里，其主要原理是首先采用基因操作技术将光感基因(如ChR2和NaHR3.0)转入到神经系统中特定类型的神经元细胞中表达特殊的离子通道。光感离子通道在不同波长的光照刺激下会分别对阳离子或者阴离子的通过产生选择性，造成细胞膜两边的膜电位发生变化，达到对神经元细胞选择性地兴奋或抑制的目的。这些光感离子通道蛋白的表达对神经元不产生毒害，是神经科学领域不可或缺的工具。药理遗传学则将光遗传学中的光感基因替换成了能够激活的离子通道的特定药物，通过注射不参与机体正常生理活动的特定药物，较光遗传学更长时间的激活或抑制神经元活动。
目前没有利用光遗传学或药理遗传学调控中枢神经特定脑区活动度来控制血管内皮异质性的方法。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供通过蓝斑核及其周边区域调控血管内皮细胞异质性的方法。
本发明第一方面提供一种通过蓝斑核及其周边区域调控血管内皮细胞异质性的方法，包括，
在蓝斑核或蓝斑核上部及其周边区域表达由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体，然后通过所述设计药物激活所述人工设计的蛋白受体，从而激活或抑制神经元活动，实现对血管内皮细胞异质性的调控；
所述人工设计的蛋白受体为在所述设计药物的激活作用下能够激活或抑制神经元活动的蛋白受体；或，
将光感基因转入蓝斑核或蓝斑核上部及其周边区域表达离子通道蛋白，然后通过不同波长的光照刺激离子通道蛋白，离子通道对离子产生选择性，从而激活或抑制神经元活动，实现对血管内皮细胞异质性的调控。
进一步地，所述人工设计的蛋白受体为hM4Di或hM3Dq；
所述设计药物为氯氮平一氧化氮或去氯氯氮平；
优选地，所述设计药物为氯氮平一氧化氮；
所述光感基因为ChR2、eBR、NaHR3.0、Arch或OptoXR；
所述蓝斑核为哺乳动物的蓝斑核；
优选地，所述哺乳动物为幼龄哺乳动物；
优选地，所述哺乳动物为3～14周龄的小鼠。
进一步地，所述血管内皮细胞为骨血管内皮细胞。
进一步地，所述人工设计的蛋白受体为hM4Di时，通过所述设计药物激活hM4Di，抑制神经元活动，减少H亚型骨血管内皮细胞数量。
进一步地，所述人工设计的蛋白受体为hM3Dq时，通过所述设计药物激活hM3Dq，激活神经元活动，增加H亚型骨血管内皮细胞数量。
本发明第二方面提供一种改变骨密度或骨量的方法，包括，在蓝斑核或蓝斑核上部及其周边区域表达由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体，然后通过所述设计药物激活所述人工设计的蛋白受体，激活或抑制神经元活动，调控H亚型骨血管内皮细胞数量，从而改变骨密度或骨量；
所述人工设计的蛋白受体为在所述设计药物的激活作用下能够激活或抑制神经元活动的蛋白受体；或，
将光感基因转入蓝斑核或蓝斑核上部及其周边区域表达离子通道蛋白，然后通过不同波长的光照刺激离子通道蛋白，离子通道对离子产生选择性，从而激活或抑制神经元活动，实现对血管内皮细胞异质性的调控。
进一步地，所述人工设计的蛋白受体为hM4Di或hM3Dq；
所述设计药物为氯氮平一氧化氮或去氯氯氮平；
优选地，所述设计药物为氯氮平一氧化氮；
所述光感基因为ChR2、eBR、NaHR3.0、Arch或OptoXR；
所述蓝斑核为哺乳动物的蓝斑核；
优选地，所述哺乳动物为幼龄哺乳动物；
更优选地，所述哺乳动物为3～14周龄的小鼠。
进一步地，所述人工设计的蛋白受体为hM4Di时，通过所述设计药物激活hM4Di，抑制神经元活动，减少H亚型骨血管内皮细胞数量，从而降低骨密度或骨量。
进一步地，所述人工设计的蛋白受体为hM3Dq时，通过所述设计药物激活hM3Dq，激活神经元活动，增加H亚型骨血管内皮细胞数量，从而提高骨密度或骨量。
本发明第三方面提供一种治疗或预防骨质疏松的方法，包括，在蓝斑核或蓝斑核上部及其周边区域表达由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体，然后通过所述设计药物激活所述人工设计的蛋白受体，激活神经元活动，增加H亚型骨血管内皮细胞数量，实现治疗或预防骨质疏松；
所述人工设计的蛋白受体为在所述设计药物的激活作用下能够激活神经元活动的蛋白受体。
进一步地，所述人工设计的蛋白受体为hM3Dq；
所述设计药物为氯氮平一氧化氮或去氯氯氮平；
优选地，所述设计药物为氯氮平一氧化氮；
所述蓝斑核为哺乳动物的蓝斑核；
优选地，所述哺乳动物为幼龄哺乳动物；
更优选地，所述哺乳动物为3～14周龄的小鼠。
本发明第四方面提供一种改变骨量或骨密度的药物组合物，所述药物组合物包括由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体和设计药物；或，所述药物组合物包括携带化学遗传基因的病毒和激活化学遗传基因的设计药物；或所述药物组合物包括携带光感基因的病毒；
所述化学遗传基因为编码由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体的基因；
所述人工设计的蛋白受体为在所述设计药物的激活作用下能够激活或抑制神经元活动的蛋白受体。
进一步地，所述病毒为腺相关病毒或慢病毒；
所述人工设计的蛋白受体为hM4Di或hM3Dq；
所述设计药物为氯氮平一氧化氮或去氯氯氮平；
优选地，所述设计药物为氯氮平一氧化氮；
所述光感基因为ChR2、eBR、NaHR3.0、Arch或OptoXR；
优选地，所述药物组合物的作用对象为哺乳动物；
更优选地，所述哺乳动物为幼龄哺乳动物；
更优选地，所述哺乳动物为3～14周龄的小鼠。
进一步地，所述人工设计的蛋白受体为hM4Di时，通过所述设计药物激活hM4Di，抑制神经元活动，减少H亚型骨血管内皮细胞数量，从而降低骨密度或骨量。
进一步地，所述人工设计的蛋白受体为hM3Dq时，通过所述设计药物激活hM3Dq，激活神经元活动，增加H亚型骨血管内皮细胞数量，从而提高骨密度或骨量。
本发明第五方面提供一种治疗或预防骨质疏松的药物组合物，所述药物组合物包括由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体和设计药物；或，所述药物组合物包括携带化学遗传基因的病毒和激活化学遗传基因的设计药物；
所述化学遗传基因为编码由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体的基因；
所述人工设计的蛋白受体为在所述设计药物的激活作用下能够激活神经元活动的蛋白受体。
进一步地，所述病毒为腺相关病毒或慢病毒；
所述人工设计的蛋白受体为hM3Dq；
所述设计药物为氯氮平一氧化氮或去氯氯氮平；
优选地，所述设计药物为氯氮平一氧化氮；
优选地，所述药物组合物的作用对象为哺乳动物；
更优选地，所述哺乳动物为幼龄哺乳动物；
更优选地，所述哺乳动物为3～14周龄的小鼠。
进一步地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
本发明第七方面提供所述通过蓝斑核调控骨血管内皮细胞异质性的方法、所述改变骨密度或骨量的方法或治疗或预防骨质疏松的方法获得的动物模型。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供的通过蓝斑核及其周边区域调控骨血管内皮细胞异质性的方法利用光遗传学或药理遗传学调控中枢神经特定脑区活动度，调控骨血管内皮细胞的亚型，可实现对骨血管内皮细胞亚型的双向调控，同时影响与其偶联的骨密度。
2、本发明提供的改变骨密度或骨量的方法，利用光遗传学或药理遗传学原理，通过蓝斑核及其周边区域来控制骨血管内皮细胞异质性，控制骨血管内皮细胞的亚型，从而影响与其偶联的骨密度，在治疗或预防骨质疏松领域具有重要的临床意义。
3、本发明提供的增加骨密度的方法，通过在中枢神经LC脑区表达hM3Dq，然后通过设计药物激活hM3Dq，从而激活LC脑区的神经细胞，增加H亚型骨血管内皮细胞数量，，从而影响与其偶联的骨密度，促进骨形成，在治疗或预防骨质疏松方面具有重要应用前景。
附图说明
图1a：骨血管内皮细胞荧光显微镜成像图，图1b：LC及周边脑区病毒表达示意图，图1c：骨量变化microCT成像图，图1d：骨量变化统计图。EGFP为对照组，hM3Dq为实验组。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1
1、构建腺病毒
将hM3Dq基因、绿色荧光蛋白基因EGFP和神经元特异性启动子构建在pAAV质粒上，得到pAAV-hSyn-hM3D(Gq)-EGFP。将构建得到的质粒转染至293T细胞，转染完成后，富集病毒颗粒，得到携带pAAV-hSyn-hM3D(Gq)-EGFP的腺病毒。同时以携带pAAV-hSyn-EGFP的腺病毒作为对照组。
本实施例中腺病毒载体的构建采用本领域的常规方法和常规条件。
2、表达hM3Dq蛋白
选取3周龄C57小鼠麻醉后剪开头皮，通过脑区定位仪找到LC脑区(locuscoeruleus)。利用小型颅钻在颅骨上LC脑区上方打孔。利用微量注射器，通过小孔，配合定位仪，在针头到达LC脑区之后，缓慢注射1ul病毒滴度在1012～1013vg/ML左右的pAAV-hSyn-hM3D(Gq)-EGFP至小鼠LC脑区。注射结束后仍留针一段时间，使脑组织充分吸收混有病毒的注射液。缓慢小心抽出注射器。缝合头皮。在伤口涂抹消炎镇痛药物。待小鼠恢复和病毒所携带药理遗传学基因表达2周。
3、注射设计药物
待小鼠恢复和病毒所携带药理遗传学基因表达2周后，每48小时注射一次氯氮平一氧化氮(clozapine N-oxide，CNO)，小鼠体内浓度为1mg/kg。连续注射十天，大约在小鼠7周龄时收取股骨获取数据。
结果如图1。图1a：骨血管内皮细胞荧光显微镜成像图，图1b：LC及周边脑区病毒表达示意图，图1c：骨量变化microCT成像图，图1d：骨量变化统计图。CD31与EMCN两者均为H亚型骨血管内皮的标记物，荧光强度越强，血管形态越完整，表明CD31和EMCN的表达越多，也就是H亚型骨血管内皮细胞越多，相比左侧的对照组，右侧通过药理遗传学激活LC及周边脑区后，长骨内H亚型内皮细胞数量上升。同时对比注射不携带hM3Dq基因腺病毒的对照组，注射携带基因hM3Dq基因腺病毒激活小鼠LC脑区内的神经细胞后，骨密度和骨量上升。表明在小鼠LC脑区操纵神经活动度，能够调控骨血管内皮细胞异质性，同时影响骨密度。
实施例2
本实施例提供一种改变骨量或骨密度的药物组合物，包括携带化学遗传基因的病毒和激活化学遗传基因的设计药物；所述化学遗传基因为编码由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体的基因；所述人工设计的蛋白受体在所述设计药物的作用下能够激活或抑制神经元活动。
在另一个实施方案中，改变骨量或骨密度的药物组合物也可以为携带光感基因的病毒，所述光感基因可以选自ChR2，eBR，NaHR3.0，Arch或OptoXR。
在本实施例中，所述病毒为腺相关病毒；
优选的一个实施方式中，所述人工设计的蛋白受体为hM4Di时，通过所述设计药物氯氮平一氧化氮激活hM4Di，抑制神经元活动，减少H亚型骨血管内皮细胞数量，从而降低骨密度或骨量。
优选的另一个实施方式中，所述人工设计的蛋白受体为hM3Dq时，通过所述设计药物氯氮平一氧化氮激活hM3Dq，激活神经元活动，增加H亚型骨血管内皮细胞数量，从而提高骨密度或骨量。
本实施例中的上述优选实施方式的药物组合物的优选作用对象为3～14周龄的小鼠。
实施例3
本实施例提供一种治疗或预防骨质疏松的药物组合物，包括携带化学遗传基因的病毒和/或激活化学遗传基因的设计药物；所述化学遗传基因为编码由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体的基因；所述人工设计的蛋白受体在所述设计药物的作用下能够激活神经元活动。在本实施例中，所述病毒为腺相关病毒。
优选的一个实施方式中，所述人工设计的蛋白受体为hM3Dq；所述设计药物为氯氮平一氧化氮。
本实施例中的上述优选实施方式的药物组合物的优选作用对象为3～14周龄的小鼠。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种通过蓝斑核及其周边区域调控血管内皮细胞异质性的方法，其特征在于，包括，
在蓝斑核或蓝斑核上部及其周边区域表达由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体，然后通过所述设计药物激活所述人工设计的蛋白受体，从而激活或抑制神经元活动，实现对血管内皮细胞异质性的调控；
所述人工设计的蛋白受体为在所述设计药物的激活作用下能够激活或抑制神经元活动的蛋白受体；或，
将光感基因转入蓝斑核或蓝斑核上部及其周边区域表达离子通道蛋白，然后通过不同波长的光照刺激离子通道蛋白，离子通道对离子产生选择性，从而激活或抑制神经元活动，实现对血管内皮细胞异质性的调控。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工设计的蛋白受体为hM4Di或hM3Dq；
所述设计药物为氯氮平一氧化氮或去氯氯氮平；
优选地，所述设计药物为氯氮平一氧化氮；
所述光感基因为ChR2、eBR、NaHR3.0、Arch或OptoXR；
所述蓝斑核为哺乳动物的蓝斑核；
优选地，所述哺乳动物为幼龄哺乳动物；
优选地，所述哺乳动物为3～14周龄的小鼠；
优选地，所述血管内皮细胞为骨血管内皮细胞；
优选地，所述人工设计的蛋白受体为hM4Di时，通过所述设计药物激活hM4Di，抑制神经元活动，减少H亚型骨血管内皮细胞数量；
优选地，所述人工设计的蛋白受体为hM3Dq时，通过所述设计药物激活hM3Dq，激活神经元活动，增加H亚型骨血管内皮细胞数量。
3.一种改变骨密度或骨量的方法，其特征在于，包括，在蓝斑核或蓝斑核上部及其周边区域表达由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体，然后通过所述设计药物激活所述人工设计的蛋白受体，激活或抑制神经元活动，调控H亚型骨血管内皮细胞数量，从而改变骨密度或骨量；
所述人工设计的蛋白受体为在所述设计药物的激活作用下能够激活或抑制神经元活动的蛋白受体；或，
将光感基因转入蓝斑核或蓝斑核上部及其周边区域表达离子通道蛋白，然后通过不同波长的光照刺激离子通道蛋白，离子通道对离子产生选择性，从而激活或抑制神经元活动，实现对血管内皮细胞异质性的调控。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述人工设计的蛋白受体为hM4Di或hM3Dq；
所述设计药物为氯氮平一氧化氮或去氯氯氮平；
优选地，所述设计药物为氯氮平一氧化氮；
所述光感基因为ChR2、eBR、NaHR3.0、Arch或OptoXR；
所述蓝斑核为哺乳动物的蓝斑核；
优选地，所述哺乳动物为幼龄哺乳动物；
更优选地，所述哺乳动物为3～14周龄的小鼠；
优选地，所述人工设计的蛋白受体为hM4Di时，通过所述设计药物激活hM4Di，抑制神经元活动，减少H亚型骨血管内皮细胞数量，从而降低骨密度或骨量；
优选地，所述人工设计的蛋白受体为hM3Dq时，通过所述设计药物激活hM3Dq，激活神经元活动，增加H亚型骨血管内皮细胞数量，从而提高骨密度或骨量。
5.一种治疗或预防骨质疏松的方法，其特征在于，包括，在蓝斑核或蓝斑核上部及其周边区域表达由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体，然后通过所述设计药物激活所述人工设计的蛋白受体，激活神经元活动，增加H亚型骨血管内皮细胞数量，实现治疗或预防骨质疏松；
所述人工设计的蛋白受体为在所述设计药物的激活作用下能够激活神经元活动的蛋白受体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述人工设计的蛋白受体为hM3Dq；
所述设计药物为氯氮平一氧化氮或去氯氯氮平；
优选地，所述设计药物为氯氮平一氧化氮；
所述蓝斑核为哺乳动物的蓝斑核；
优选地，所述哺乳动物为幼龄哺乳动物；
更优选地，所述哺乳动物为3～14周龄的小鼠。
7.一种改变骨量或骨密度的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体和设计药物；或，所述药物组合物包括携带化学遗传基因的病毒和激活化学遗传基因的设计药物；或所述药物组合物包括携带光感基因的病毒；
所述化学遗传基因为编码由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体的基因；
所述人工设计的蛋白受体为在所述设计药物的激活作用下能够激活或抑制神经元活动的蛋白受体。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述病毒为腺相关病毒或慢病毒；
所述人工设计的蛋白受体为hM4Di或hM3Dq；
所述设计药物为氯氮平一氧化氮或去氯氯氮平；
优选地，所述设计药物为氯氮平一氧化氮；
所述光感基因为ChR2、eBR、NaHR3.0、Arch或OptoXR；
优选地，所述药物组合物的作用对象为哺乳动物；
更优选地，所述哺乳动物为幼龄哺乳动物；
更优选地，所述哺乳动物为3～14周龄的小鼠；
优选地，所述人工设计的蛋白受体为hM4Di时，通过所述设计药物激活hM4Di，抑制神经元活动，减少H亚型骨血管内皮细胞数量，从而降低骨密度或骨量；
优选地，所述人工设计的蛋白受体为hM3Dq时，通过所述设计药物激活hM3Dq，激活神经元活动，增加H亚型骨血管内皮细胞数量，从而提高骨密度或骨量。
9.一种治疗或预防骨质疏松的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体和设计药物；或，所述药物组合物包括携带化学遗传基因的病毒和激活化学遗传基因的设计药物；
所述化学遗传基因为编码由设计药物专门激活的人工设计的蛋白受体的基因；
所述人工设计的蛋白受体为在所述设计药物的激活作用下能够激活神经元活动的蛋白受体；
优选地，所述病毒为腺相关病毒或慢病毒；
所述人工设计的蛋白受体为hM3Dq；
所述设计药物为氯氮平一氧化氮或去氯氯氮平；
优选地，所述设计药物为氯氮平一氧化氮；
优选地，所述药物组合物的作用对象为哺乳动物；
更优选地，所述哺乳动物为幼龄哺乳动物；
更优选地，所述哺乳动物为3～14周龄的小鼠。
10.一种由权利要求1或3或5所述方法获得的动物模型。
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