CN116251104A - Kd025在制备用于治疗骨关节炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了KD025在制备用于治疗骨关节炎药物中的应用，涉及药物新用途的技术领域。本发明发现KD025能够通过促进线粒体自噬，抑制基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5基因的表达、提高蛋白聚糖基因的表达，发挥治疗骨关节炎的作用；将KD025应用于骨关节炎的治疗，不仅为制备治疗骨关节炎的药物提供了一种新来源，同时也发掘出了KD025新的药用价值。

Description

KD025在制备用于治疗骨关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物新用途的技术领域，具体涉及KD025在制备用于治疗骨关节炎药物中的应用。

背景技术

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是最常见的慢性关节疾病，其特征是关节软骨的渐进性破坏和慢性疼痛的发展，导致患者生活质量降低。据调查我国目前约有1.4亿骨关节炎患者，65岁以上人群超过80％患有不同程度的骨关节炎，且骨关节炎在老年人致残疾病中高居第二位，仅次于脑血管疾病，其产生的治疗费用依据发达国家情况将逐年增加至达到GDP的1％-2.5％。目前对于骨关节炎的治疗主要是：早期予以药物镇痛消炎和康复治疗，晚期通过关节置换术缓解疼痛和恢复功能。而近年来行髋和膝关节置换术的骨关节炎晚期患者不断增加，研究预测关节置换术从2005到2030将增加174％(髋关节)和673％(膝关节)。因此，阐明骨关节炎病因及其生物学分子机制一直是关节外科的研究热点，寻求早期延缓OA发生发展的治疗手段是诊治OA的关键问题。

随着科学研究和手术技术的发展，关节软骨退变与促进软骨修复方面相关研究取得了巨大成果，然而随着研究的深入发现，无论是正常软骨还是组织工程软骨都会逐渐出现软骨的退变，纤维软骨产生等缺点，所以关键问题还是回到了如何解决阻遏软骨退变和维持软骨稳态这一根本问题。

目前，尚无有效药物可以从根本上有效阻止早期骨关节炎软骨退变。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供KD025在制备用于治疗骨关节炎药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：KD025在制备用于治疗骨关节炎药物中的应用。

骨关节炎引发的关节软骨退变不可逆转，且缺乏有效药物可通过靶向抑制软骨退变从而延缓OA进展。所以治疗OA的关键问题在于如何找到解决阻遏软骨退变以及维持软骨稳态的有效机制并在此基础上开发相关有效药物。关节软骨稳态维持的核心问题在于软骨细胞的调控。本申请发明人经过大量的研究发现，线粒体动态平衡的维持对软骨细胞的稳态调控尤为重要，线粒体自噬水平的下降可能是OA软骨细胞退变的关键因素之一。进一步研究发现，FUNDC1介导的线粒体自噬在骨关节炎软骨退变中起关键调控作用，FUNDC1的磷酸化水平改变在其中起重要作用，并受PFKP蛋白的调节。在充分研究骨关节炎软骨退变中线粒体自噬中所起调节作用及机制的基础上，本申请发明人认为诱导线粒体自噬的小分子可能是延缓软骨退变的有效药物。因此，本申请发明人经过大量的实验研究和筛选，最终确定了KD025能明显减轻软骨细胞的退变表型，并通过体外细胞实验与体内动物实验证实了其在治疗骨关节炎中的作用。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述骨关节炎包括软骨退变和软骨稳态失衡。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物通过抑制基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5基因的表达治疗骨关节炎。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物通过提高蛋白聚糖基因的表达治疗骨关节炎。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物通过诱导线粒体自噬治疗骨关节炎。本申请发明人研究发现，人OA软骨细胞中线粒体自噬水平下降。而KD025能明显抑制OA相关标志物MMP3、MMP13、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(ADAMTS5)，并使ACAN表达升高，促进线粒体自噬标志物LC3B的表达提高，诱导线粒体自噬。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物中KD025的浓度为2.5μM。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物的用量为100mg/kg体重。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物通过口服给药。

本发明还提供一种用于治疗骨关节炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括KD025和药学上可接受的载体。

作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述药物中KD025的浓度为2.5μM。

本发明的有益效果：本发明提供了KD025在制备用于治疗骨关节炎药物中的应用，KD025能够通过抑制基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5基因的表达、提高蛋白聚糖基因的表达，促进线粒体自噬发挥治疗骨关节炎的作用；将KD025应用于骨关节炎的治疗，不仅为制备治疗骨关节炎的药物提供了一种新来源，同时也发掘出了KD025新的药用价值。

附图说明

图1：A为人OA软骨细胞与与NA软骨细胞中自噬标志物LC3B表达水平；B为透射电镜观察下IL-1β刺激诱导的OA软骨细胞线粒体形态图；C为共聚焦显微镜观察下IL-1β刺激诱导的OA软骨细胞代表健康线粒体的JC-1聚合物和代表线粒体低膜电位的JC-1单体的含量；D为流式细胞术显示IL-1β刺激诱导的OA软骨细胞膜电位。

图2：A为ELISA检测对照组与各实验组细胞上清中OA标志物MMP3的浓度，其中红色虚线为阴性对照与阳性对照组细胞培养上清中MMP3浓度水平；B为实时荧光定量PCR分别检测复筛药物与KD025各梯度浓度处理后细胞MMP3、MMP13、ACAN的mRNA表达水平；C为实时荧光定量PCR检测2.5μM的KD025处理后细胞MMP3、MMP13、ACAN与ADAMTS5的mRNA表达水平；D为Western Blot检测2.5μM的KD025处理后细胞MMP3、MMP13、LC3B的蛋白表达水平。

图3：A为4组小鼠左膝关节micro-CT扫描后的3D成像与软骨下骨截面图；B为步态分析中小鼠左后肢与右后肢摇摆期比值的分析比较；C为骨赘体积定量分析；D为关节间隙测量；E为软骨下骨的骨体积分数BV/TV的分析比较；F为软骨下骨的骨小梁平均厚度的分析比较；G为软骨下骨的骨小梁间隙的分析比较；H为左膝关节组织切片的HE染色、番红O-固绿染色与MMP3、MMP13、ACAN的免疫荧光染色。

图4：A为对照组与实验组小鼠的(从上到下)心脏、肺、肝脏、肾脏与脾脏的大体形态；B为对照组与实验组小鼠灌胃4周后的体重增长幅度比较；C为对照组与实验组小鼠灌胃4周后外周血血清中肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的浓度比较；D为对照组与实验组小鼠灌胃4周后外周血血清中肾功能指标尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)的浓度比较；E为对照组与实验组小鼠的心脏、肺、肝脏、肾脏与脾脏的组织切片HE染色图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1OA软骨细胞中线粒体自噬水平的研究

本实施例检测OA软骨细胞与正常关节(NA)软骨细胞中自噬标志物LC3B的表达水平和线粒体膜电位。

结果如图1所示。由图1A可以看出，OA软骨细胞与正常关节(NA)软骨细胞相比，自噬标志物LC3B表达水平下降；在体外实验中，IL-1β刺激诱导的OA软骨细胞线粒体明显肿胀、畸形(如图1B所示)，线粒体膜电位下降明显(如图1C，图1D所示)。

实施例2缓解OA进展的药物的筛选

1、初步筛选：委托Selleck生物科技有限公司定制了一个包含129种分子(已经被证实或潜在可能诱导线粒体自噬激活)的药物库。以IL-1β刺激SW1353细胞系48小时构建体外OA模型作为阳性对照，以不施加任何处理的细胞作为阴性对照，同时在各组中以10μM的浓度加入各种药物，48小时后收集阴性对照、阳性对照与各药物处理组的细胞上清，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞上清中OA标志物基质金属蛋白酶(MMP)3的浓度，以MMP3浓度介于阴性对照与阳性对照之间的范围内最低的10组作为复筛范围(如图2A所示)。

2、复筛：同样以IL-1β刺激SW1353细胞系48小时构建体外OA模型作为阳性对照，以不施加任何处理的细胞作为阴性对照，同时在各组中以10μM的浓度加入初筛确定的10种药物，48小时后收集阴性对照、阳性对照与各药物处理组细胞的RNA，通过实时荧光定量PCR检测各组细胞的MMP3、MMP13、蛋白聚糖(ACAN)的表达水平。结果如图2B所示，Belumosudil(KD025，目录号：S7936)为10种药物中唯一能同时有效降低MMP3、MMP13，提高ACAN表达水平的药物。

3、确定体外实验中最佳浓度：以0.625、1.25、2.5、5、10、20、30、40μM的梯度浓度稀释KD025，并分别处理细胞，同样以IL-1β刺激SW1353细胞系48小时构建体外OA模型作为阳性对照，以不施加任何处理的细胞作为阴性对照，48小时后收集阴性对照、阳性对照与各浓度KD025处理组细胞的RNA，通过实时荧光定量PCR检测各组细胞的MMP3、MMP13、蛋白聚糖(ACAN)的表达水平，确定2.5μM的KD025处理SW1353细胞能有效降低MMP3、MMP13表达水平，同时提高ACAN表达水平(如图2B所示)。如图2C、图2D所示，通过实时荧光定量PCR与WesternBlot证实，2.5μM的KD025能明显抑制OA相关标志物MMP3、MMP13、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(ADAMTS5),并使ACAN表达升高，促进线粒体自噬标志物LC3B的表达提高，诱导线粒体自噬。

实施例3动物实验验证口服饲喂KD025缓解小鼠OA进展的作用

1、实验分组：①假手术组：Sham；②单纯手术组：DMM；③DMM手术后灌胃溶剂羧甲基纤维素钠(CMC-Na)组：CMC-Na；④DMM手术后灌胃KD025(100mg/kg溶于CMC-Na)组：KD025。首先通过内侧半月板失稳术(DMM)构建8周龄小鼠左膝OA模型(4组，n＝5)，同时Sham组除离断内侧半月板胫骨韧带之外同样行切开皮肤与关节囊后缝合等操作。

2、术后4周开始分别对实验组(KD025)与对照组(CMC-Na)小鼠灌胃KD025(100mg/kg)，4周后对4组小鼠行步态分析；处死所有小鼠并分别解剖、收集4组小鼠的左侧膝关节，进行micro-CT分析及石蜡包埋、切片并进行HE、番红O-固绿染色与免疫荧光染色。

结果如图3所示。DMM术导致小鼠左后肢摇摆期相对提高，而灌胃KD025能明显缓解这个变化，且灌胃CMC-Na并没有此效应(如图3F所示)；DMM手术使小鼠膝关节骨赘明显增加(如图3A、B所示)，关节间隙变窄(如图3C所示)，骨体积分数BV/TV与骨小梁厚度升高，骨小梁间隙变小(如图3A、D、E、G所示)，意味着软骨下骨成骨增强，且组织切片染色也显示软骨退变加剧；软骨中MMP3、MMP13表达升高而ACAN明显下降(如图3H所示)；而KD025灌胃相比CMC-Na能明显缓解DMM导致的以上OA表现。由上述可知，口服KD025(100mg/kg)能明显缓解DMM诱导的小鼠膝关节软骨退变与OA进展。

实施例4KD025的动物毒性检测

实验分组：DMM手术后灌胃溶剂羧甲基纤维素钠(CMC-Na)组：CMC-Na；DMM手术后灌胃KD025(100mg/kg溶于CMC-Na)组：KD025。首先通过内侧半月板失稳术(DMM)构建8周龄小鼠左膝OA模型(4组，n＝5)。

2、术后4周开始分别对实验组(KD025)与对照组(CMC-Na)小鼠灌胃KD025(100mg/kg)，记录实验组(KD025)与对照组(CMC-Na)小鼠分别灌胃4周后的体重变化；通过眼球取血收集小鼠血液标本，取上层血清进行肝肾功能检测；处死小鼠后，解剖、收集两组小鼠的心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏器官，观察两组小鼠器官的大体形态。

实验结果如图4所示。如图4B所示，两组小鼠之间的体重变化没有显著性差异；如图4C、D所示，实验组与对照组小鼠的肝肾功能指标之间没有显著性差异；如图4A所示，两组小鼠器官的大体形态无显著性差异，各器官组织包埋、切片后进行HE染色，观察两组小鼠各器官组织、细胞病理学特征没有明显差异。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.KD025在制备用于治疗骨关节炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨关节炎包括软骨退变和软骨稳态失衡。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过抑制基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5基因的表达治疗骨关节炎。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过提高蛋白聚糖基因的表达治疗骨关节炎。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过诱导线粒体自噬治疗骨关节炎。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中KD025的体外实验使用浓度为2.5μM。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的动物实验用量为100mg/kg体重。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过口服给药。

9.一种用于治疗骨关节炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括KD025和药学上可接受的载体。

10.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物中KD025的浓度为2.5μM。

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