CN116234570A - 人类巨细胞病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本公开的方面涉及通过施用mRNA疫苗在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hCMV)的抗原特异性免疫反应的方法。

Description

人类巨细胞病毒疫苗
相关申请
本申请根据35U.S.C§119(e)要求2020年8月25日提交的名称为“HumanCytomegalovirus Vaccine”的美国临时申请第63/070,134号、2020年9月16日提交的名称为“Human Cytomegalovirus Vaccine”的美国临时申请第63/079,421号和2021年1月11日提交的名称为“Human Cytomegalovirus Vaccine”的美国临时申请第63/136,117号的权益，所述临时申请各自通过引用整体并入本文。
背景技术
巨细胞病毒(CMV)是疱疹病毒科病毒的成员。CMV主要通过接触感染性粘膜分泌物或在子宫内获得，并且在初次感染后建立潜伏期。总体而言，美国CMV血清盛行率为50.4％，但在资源贫乏地区据报告比率为60％至100％。
CMV是最常见的先天性病毒感染，因为其每年影响美国30,000至40,000名婴儿(活产婴儿的0.6％至2％)。尽管妊娠早期的先天性CMV感染与最不利的妊娠结果相关，但症状性先天性CMV可能由妊娠期间任何时间的感染引起。妊娠期间患有原发性CMV感染的母亲中的约30％至35％将所述病毒传递至胎儿；这些新生儿中的12％将患有症状性疾病，并且约4％将在生命第一年死亡。另外，出生时有症状的CMV感染婴儿中约一半将产生晚期并发症，例如智力障碍、感觉神经性听力损失和发育迟缓。由于先天性CMV感染对儿童健康的显著影响，2017年美国国家医学研究院报告(Institute of Medicine Report)将开发用于预防先天性CMV感染的CMV疫苗列为其最高优先类别。
在实体器官或造血干细胞移植后长期服用免疫抑制药物的个体中，引起移植排斥或终末器官疾病的CMV感染与高死亡率相关。在美国，每年约有30,000名成人接受实体器官移植并且有22,000名接受造血细胞移植。总体而言，接受抗病毒防治的实体器官移植患者中的8％至40％和接受抗病毒防治的造血细胞移植患者中的3％至6％将因CMV而产生移植后并发症。移植接受者中CMV感染的主要并发症包括移植组织的急性或慢性排斥和侵袭性疾病，例如结肠炎、肝炎和脑炎。
发明内容
一个重要的未满足的医疗需求是用于预防先天性CMV感染的安全且有效的方法。另一个未满足的医疗需求是预防在实体器官或造血干细胞移植后长期服用免疫抑制药物的个体的CMV感染。
基于信使核糖核酸(mRNA)的疫苗平台已根据以下原理和观察结果开发：靶标病毒蛋白或抗原可通过递送和细胞摄取相应合成病毒mRNA而在体内产生，所述相应合成病毒mRNA来自配制于脂质纳米粒子中的免疫原性组合物的递送。所述mRNA然后进行细胞内核糖体翻译以内源性表达由包含合成病毒mRNA的疫苗免疫原性组合物编码的病毒蛋白抗原。这些基于mRNA的疫苗不进入细胞核或与人类基因组相互作用，是非复制性的，并且短暂表达。因此，mRNA疫苗和免疫原性组合物提供如下机制，其以精确模拟野生型病毒感染并且能够诱导针对感染性病原体如CMV的高度靶向免疫反应的方式刺激结构完整、正确折叠并且经人类糖基化的病毒糖蛋白和蛋白抗原的内源性产生。
本公开的方面涉及hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物包含(a)包含编码hCMV gH多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；(b)包含编码hCMV gL多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(c)包含编码hCMV UL128多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(d)包含编码hCMV UL130多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(e)包含编码hCMVUL131A多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；和(f)包含编码hCMV gB多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸，其中：
所述免疫原性组合物中(a):(f)的摩尔比为约1:1；所述免疫原性组合物中(b):(c):(d):(e)的摩尔比为约1:1:1:1；并且所述免疫原性组合物中(a)和(f)中每一者与(b)、(c)、(d)或(e)中任一者的摩尔比为约1.5:1至2:1。
在一些实施方案中，(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2。
在一些实施方案中，所述hCMV免疫原性组合物维持液体制剂形式直至用于向患者施用。在一些实施方案中，所述hCMV免疫原性组合物维持冻干制剂形式直至用于向患者施用。
在一些实施方案中，当储存在大于0℃且小于或等于10℃的温度下时，所述hCMV免疫原性组合物稳定至少三个月。在一些实施方案中，当储存在大于0℃且小于或等于10℃的温度下时，所述hCMV免疫原性组合物稳定至少十二至十八个月。在一些实施方案中，当储存在大于0℃且小于或等于10℃的温度下时，所述hCMV免疫原性组合物稳定至少二十四个月。在一些实施方案中，当储存在约5℃的温度下时，所述hCMV免疫原性组合物稳定至少三个月。在一些实施方案中，当储存在约5℃的温度下时，所述hCMV免疫原性组合物稳定至少十二至十八个月。在一些实施方案中，当储存在约5℃的温度下时，所述hCMV免疫原性组合物稳定至少二十四个月。
在一些实施方案中，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物具有增加的稳定性。在一些实施方案中，当在大于0℃且小于或等于10℃的温度下储存至少三个月时，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物具有增加的稳定性。在一些实施方案中，当在大于0℃且小于或等于10℃的温度下储存至少二十四个月时，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物具有增加的稳定性。
在一些实施方案中，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物具有增加的五聚体表达。在一些实施方案中，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物诱导增加的五聚体抗体水平。在一些实施方案中，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物具有增加的gB表达。在一些实施方案中，相对于(a)-(f)以大致等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物诱导增加的gB抗体水平。
在一些实施方案中，将(a)-(f)的mRNA多核苷酸以足以在受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应的量配制于至少一种脂质纳米粒子中。在一些实施方案中，将(a)-(f)的mRNA多核苷酸以足以在受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应的量配制于至少一种脂质纳米粒子中并冻干。
在一些实施方案中，(a)-(f)的mRNA多核苷酸中的至少一者包含化学修饰。在一些实施方案中，mRNA多核苷酸(a)-(f)的开放阅读框中尿嘧啶的至少80％具有选自N1-甲基-假尿苷或N1-乙基-假尿苷的化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰在尿嘧啶的碳5位置处。在一些实施方案中，(a)-(f)的mRNA多核苷酸中的至少一者还包含至少一个5'末端帽，即7mG(5')ppp(5')N1mpNp。
在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含：可离子化氨基脂质；胆固醇；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)。在一些实施方案中，所述可离子化氨基脂质包含化合物I：
Figure BDA0004094056490000051
在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含20-60mol％可离子化氨基脂质、25-55mol％胆固醇、5-25mol％DSPC和0.5-15mol％DMG-PEG。在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含45-55mol％可离子化氨基脂质、35-40mol％胆固醇、5-15mol％DSPC和1-2mol％DMG-PEG。在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含50mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、10mol％DSPC和1.5mol％DMG-PEG。在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含49mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、10mol％DSPC和2.5mol％DMG-PEG。在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含48mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、11mol％DSPC和2.5mol％DMG-PEG。在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含47mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、11.5mol％DSPC和3mol％DMG-PEG。
在一些实施方案中，mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2，并且使施用于患者的脂质比施用相等质量mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)时少10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施方案中，mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2，并且使施用于患者的脂质比施用相等质量mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)时少30％。在一些实施方案中，mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2，并且使施用于患者的脂质比施用相等质量mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)时少40％。在一些实施方案中，mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2，并且使施用于患者的脂质比施用相等质量mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)时少50％。
在一些实施方案中，编码hCMV gH蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO:5序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，编码hCMV gL蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO:6序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，编码hCMV UL128蛋白的mRNA包含与SEQ IDNO:2序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，编码hCMV UL130蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO:3序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，编码hCMV UL131A蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO:4序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，和/或编码hCMV gB蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO:1序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码hCMV gH蛋白的mRNA包含SEQ ID NO:5序列的核苷酸序列，编码hCMV gL蛋白的mRNA包含SEQ ID NO:6序列的核苷酸序列，编码hCMV UL128蛋白的mRNA包含SEQ ID NO:2序列的核苷酸序列，编码hCMV UL130蛋白的mRNA包含SEQ ID NO:3序列的核苷酸序列，编码hCMV UL131A蛋白的mRNA包含SEQ ID NO:4序列的核苷酸序列，和/或编码hCMV gB蛋白的mRNA包含SEQ ID NO:1序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码hCMV gH多肽的开放阅读框包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少90％同一性的序列，编码hCMV gL多肽的开放阅读框包含与SEQ ID NO:12的序列具有至少90％同一性的序列，编码hCMV UL128多肽的开放阅读框包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％同一性的序列，编码hCMV UL130多肽的开放阅读框包含与SEQ ID NO:9的序列具有至少90％同一性的序列，编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框包含与SEQ ID NO:10的序列具有至少90％同一性的序列，和/或编码hCMV gB多肽的开放阅读框包含与SEQ IDNO:7的序列具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方案中，编码hCMV gH多肽的开放阅读框包含SEQ ID NO:11，编码hCMVgL多肽的开放阅读框包含SEQ ID NO:12，编码hCMV UL128多肽的开放阅读框包含SEQ IDNO:8，编码hCMV UL130多肽的开放阅读框包含SEQ ID NO:9，编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框包含SEQ ID NO:10，和/或编码hCMV gB多肽的开放阅读框包含SEQ ID NO:7的序列。
在一些实施方案中，(a)-(f)的mRNA多核苷酸中的每一者还包含polyA尾。在一些实施方案中，所述polyA尾的长度为100个核苷酸。
在一些实施方案中，所述hCMV gH多肽包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述hCMV gL多肽包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述hCMV UL128多肽包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述hCMV UL130多肽包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述hCMV UL131A多肽包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，和/或所述hCMV gB多肽包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述hCMV gH多肽包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，所述hCMVgL多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，所述hCMV UL128多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，所述hCMV UL130多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，所述hCMV UL131A多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和/或所述hCMV gB多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
本公开的方面涉及用于在受试者中产生针对hCMV的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的本文所述的hCMV免疫原性组合物，从而在所述人类受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应。
在一些实施方案中，所述hCMV免疫原性组合物经由肌肉内注射施用。在一些实施方案中，所述人类受试者在施用hCMV mRNA疫苗之前呈CMV血清阳性。在一些实施方案中，所述人类受试者在施用hCMV mRNA疫苗之前呈CMV血清阴性。在一些实施方案中，所述hCMV免疫原性组合物以25μg-300μg mRNA的剂量施用。在一些实施方案中，所述hCMV免疫原性组合物以50μg-150μgmRNA的剂量施用。在一些实施方案中，所述hCMV免疫原性组合物以50μg的剂量施用。在一些实施方案中，所述hCMV免疫原性组合物以100μg的剂量施用。在一些实施方案中，所述hCMV免疫原性组合物以150μg的剂量施用。
在一些实施方案中，所述hCMV免疫原性组合物被施用至少一次、至少两次或至少三次。在一些实施方案中，所述hCMV免疫原性组合物通过初次免疫并接着一次加强免疫施用。在一些实施方案中，所述hCMV免疫原性组合物通过初次免疫并接着两次加强剂免疫施用。
在一些实施方案中，所述有效量足以在施用hCMV免疫原性组合物后第29天、第56天、第84天、第168天或第196天中的任一天产生针对上皮细胞感染的血清中和性抗CMV抗体滴度。在一些实施方案中，所述有效量足以在施用hCMV免疫原性组合物后第29天、第56天、第84天、第168天或第196天中的任一天产生针对成纤维细胞感染的血清中和性抗CMV抗体滴度。在一些实施方案中，所述有效量足以在免疫后第29天、第56天、第84天、第168天或第196天中的任一天产生针对上皮细胞感染的血清中和性抗CMV抗体滴度，并且在施用hCMV免疫原性组合物后的一个或多个时间点产生基线后/基线滴度的相关几何平均比(GMR)。在一些实施方案中，所述有效量足以在免疫后第29天、第56天、第84天、第168天或第196天中的任一天产生针对成纤维细胞感染的血清中和性抗CMV抗体滴度，并且在施用hCMV免疫原性组合物后的一个或多个时间点产生基线后/基线滴度的相关几何平均比(GMR)。在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，针对上皮细胞感染的中和抗体(nAb)相对于基线增加≥2倍、≥3倍或≥4倍的参与者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，针对成纤维细胞感染的中和抗体(nAb)相对于基线增加≥2倍、≥3倍或≥4倍的参与者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
本公开的方面涉及用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hCMV)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物包含(a)包含编码hCMV gH多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；(b)包含编码hCMV gL多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(c)包含编码hCMVUL128多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(d)包含编码hCMV UL130多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(e)包含编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；和(f)包含编码hCMV gB多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸，从而在所述人类受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应，其中所述hCMV免疫原性组合物以25μg-300μgmRNA的剂量施用，并且其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，针对上皮细胞感染的中和抗体(nAb)相对于基线增加≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥11倍、≥12倍或≥13倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
本公开的其他方面涉及用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hCMV)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物包含(a)包含编码hCMV gH多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；(b)包含编码hCMV gL多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(c)包含编码hCMV UL128多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(d)包含编码hCMV UL130多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(e)包含编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；和(f)包含编码hCMV gB多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸，从而在所述人类受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应，其中所述hCMV免疫原性组合物以25μg-300μgmRNA的剂量施用，并且其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，针对成纤维细胞感染的中和抗体(nAb)相对于基线增加≥2倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
本公开的方面涉及用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hCMV)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物包含(a)包含编码hCMV gH多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；(b)包含编码hCMV gL多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(c)包含编码hCMVUL128多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(d)包含编码hCMV UL130多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(e)包含编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；和(f)包含编码hCMV gB多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸，从而在所述人类受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应，其中所述hCMV免疫原性组合物以25μg-300μgmRNA的剂量施用，并且其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，抗五聚体结合抗体(bAb)相对于基线增加≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
本公开的其他方面涉及用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hCMV)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物包含(a)包含编码hCMV gH多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；(b)包含编码hCMV gL多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(c)包含编码hCMV UL128多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(d)包含编码hCMV UL130多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(e)包含编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；和(f)包含编码hCMV gB多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸，从而在所述人类受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应，其中所述hCMV免疫原性组合物以25μg-300μgmRNA的剂量施用，并且其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，抗gB结合抗体(Ab)相对于基线增加≥2倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在一些实施方案中，在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，在人类受试者中测量的针对上皮细胞感染的中和抗体的几何平均比(GMR)为约8-14。在一些实施方案中，在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，人类受试者中抗五聚体结合抗体(bAb)的几何平均比(GMR)为约6-10。
在一些实施方案中，在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，人类受试者中针对成纤维细胞感染的中和抗体的几何平均比(GMR)为约2。在一些实施方案中，在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，人类受试者中的抗gB结合抗体(Ab)的几何平均比(GMR)为约2。
本发明的每个限制可涵盖本发明的各种实施方案。因此，预期涉及任一要素或要素组合的本发明的每个限制均可包括在本发明的每个方面中。本发明的应用不限于在以下描述中阐述或在附图中说明的构造细节和组件排列。本发明能够具有其他实施方案并且能够以各种方式实践或进行。
附图说明
附图不旨在按比例绘制。在附图中，各图中说明的每个相同或几乎相同元件由相同数字表示。出于清晰的目的，并非每个组件均可在每个附图中标出。在所述附图中：
图1A和图1B提供的示意图显示本文所述的hCMV免疫原性组合物包含编码病毒抗原gB和五聚体(gH/gL/UL128/UL130/UL131A)的mRNA。CMV向性与不同糖蛋白相关。gB和五聚体是中和抗体的重要靶标。血清阳性个体中的大多数中和抗体针对五聚体。
图2A和图2B提供的图显示hCMV免疫原性组合物(例如，hCMV mRNA疫苗)内的组分，其包括编码gB、gH、gL、UL128、UL130和UL131A的mRNA。图2A提供的图显示疫苗的每个mRNA组分的降解速率(k观测)与mRNA构建体的长度有关。如图2A所示，较高降解速率与较大mRNA分子gH和gB相关。图2B显示100μg RNA剂量的包含hCMV mRNA的免疫原性组合物中每个mRNA组分的量，其中基于相等质量(左栏)或基于预先指定的摩尔比(右栏)包括mRNA组分。所述量以两种方式显示：质量(μg)和摩尔数(纳摩尔)。
图3A至图3B提供的图显示，相对于使用相等质量比的hCMV mRNA组分，相对于gL、UL128、UL130和UL131A中的每一者包括2倍gH和2倍gB的摩尔比的hCMV mRNA组分增加体外hCMV五聚体和hCMV gB的表达水平(如由Emax所指示)，并且增加hCMV五聚体和hCMV gB的相对效力。
图4提供的图显示基于摩尔含量设计的制剂即使在给与显著较少的gL、UL130、UL128和UL131时也可在小鼠中维持强抗体反应。在上图中，两种制剂(第8组和第1组)的含量以质量(mg)和摩尔数(皮摩尔)显示，并且条柱的高度反映每个mRNA的相对量。在第1组中，gH的含量是产生五聚体的限制因素(每剂0.6皮摩尔)。在第8组中，gL、UL130、UL128和UL131中每一者的含量经设计也是每剂0.6皮摩尔，从而使五聚体剂量以摩尔计与第1组匹配。在下图中，为第8组和第1组绘制五聚体特异性抗体反应随总质量剂量变化的图。当第8组使用较低总剂量(2.3mg相对于3mg)和显著较少的gL、UL130、UL128和UL131时，反应水平类似。此外，相对于第1组，第8组中的gB为1.2倍。
图5提供的图显示个别地增加每个hCMV五聚体组分的摩尔比对抗五聚体IgG反应的影响。结果表明过量gH增加小鼠的抗五聚体IgG。
图6A至图6D提供的图显示对于基于指定摩尔比的mRNA组分的三种制剂(第1批、第2批和第3批)，与相等质量比(第4批)相比，抗gB抗体和抗五聚体抗体在小鼠中的剂量反应。图6A显示当hCMV mRNA免疫原性组合物是基于相等质量比或建议摩尔比时，以μg和皮摩尔计的每个mRNA分子的量。图6B显示当在一系列hCMV mRNA免疫原性组合物中调节相对摩尔含量时抗gB抗体的剂量反应。随着gB含量增加，观察到抗体反应增加。图6C显示当在一系列hCMV mRNA免疫原性组合物中调节相对摩尔含量时抗五聚体抗体的剂量反应。随着gH含量增加，观察到抗体反应增加。图6D显示当在一系列hCMV mRNA免疫原性组合物中调节相对摩尔含量时抗五聚体抗体的剂量反应。在第1批、第2批和第3批中，UL131A是限制性五聚体组分，并且在那些组中，随着UL131A含量增加，观察到抗体反应增加。在第4批中，gH是限制性五聚体组分，并且给与显著过量的UL131A。第4批中五聚体限制性gH的摩尔含量等于第1批中五聚体限制性UL131A的摩尔含量，但第4批的抗体反应小于第1批的抗体反应，指示过量gH有利于最大化抗体反应。hCMV五聚体以gH作为基础组分形成，其他五聚体多肽可从gH组装于其上。因此，当缺乏gH时，五聚体形成受阻。
图7提供的图显示hCMV mRNA疫苗内组分随时间的理论灭活，其中mRNA组分是基于指定摩尔比的mRNA组分(上图)或基于相等质量组分(下图)配制。灭活速率是基于图2A中所示的速率-长度关系。上图揭示在相对于其他mRNA组分具有2倍gB和2倍gH的hCMV mRNA疫苗中，gH和gB预计将维持过量至少36个月。而下图显示，在相等质量制剂中，gH和gB并未维持相等质量比例，因为随时间推移发生灭活。
图8A至图8B提供的图显示绘制于以摩尔计的X轴上的I期临床试验中hCMV mRNA疫苗在人类中的中和抗体反应。绘制值使用如下hCMV疫苗，其中mRNA组分是基于相等质量配制，但此处显示为计算的皮摩尔数。提供沿X轴的箭头以展示基于微克的替代制剂在X轴上重叠的位置。使用此X轴允许将两种不同设计的制剂绘制在同一连续轴上，以能够为后续试验进行剂量选择，而绘制总质量剂量(mg)会在两种制剂之间产生不连续剂量反应曲线。将剂量递增阶段A和B以及剂量选择阶段B(30、90、180μg)以个别受试者形式绘制。将剂量选择阶段C(300μg)数据以GMT+-95％置信区间形式绘制直至研究非盲。图8A显示针对上皮细胞感染的中和抗体(nAb)(主要是五聚体特异性nAb)。图8B显示针对成纤维细胞感染的中和抗体(nAb)(主要是gB特异性nAb)。
图9A至图9B提供的图显示确保hCMV疫苗小瓶在到期之前有效的标称剂量选择。图9A显示针对上皮细胞感染的中和抗体(nAb)。图9B显示针对成纤维细胞感染的中和抗体(nAb)。所显示的正态高斯分布(normal gaussian distribution)是基于纯度的批次理论分布。
图10提供的图显示基于gB纯度百分比随时间的变化，二十二批hCMV疫苗在5℃下的模型化降解。所述数据展示一级动力学。
图11提供的图显示在不同gB纯度水平下小鼠的抗五聚体反应(上图)和抗gB反应(下图)。所述图展示，直至gB纯度在约26个月降至低于49％时，对五聚体和gB两者的免疫反应才受影响。这种结果指示，gB mRNA可作为批次效力随时间变化的单一指标。
图12提供的示意图描绘II期临床试验研究设计的概述。缩写：IST，内部安全性团队；mRNA，信使核糖核酸。
图13提供的图显示用生理盐水(N.盐水)制备的冻干制剂剂量随高稀释度的pH变化。商业USP生理盐水的pH范围为4.5-7.0，并且生理盐水的测量pH为6.3。
图14A至图14B提供的图显示基于摩尔比的两种制剂增加体外hCMV五聚体和hCMVgB的表达水平。
图15A至图15B提供的图显示对于基于mRNA组分的摩尔比(0.4g和1g规模)的两种制剂，与相等质量比(0.03g规模)相比，抗gB抗体和抗五聚体抗体在小鼠中的剂量反应。图15A显示抗gB抗体的剂量反应。图15B显示抗五聚体抗体的剂量反应。规模是指用于使用体外转录(IVT)制造mRNA的批次的大小。
图16A至图16B提供的图比较由不同制剂引发的CMV中和抗体滴度，所述不同制剂来自使用0.03g与1.0g规模mRNA的体外转录(IVT)制造获得的不同制造批次。图16A显示在上皮细胞中，与基于相等质量比的小规模液体制剂(0.03g规模)相比，基于摩尔比的大规模冻干制剂(1g规模)引发较高CMV中和抗体滴度。图16B显示基于摩尔比的大规模冻干制剂(1g规模)在2μg mRNA的剂量下引发高CMV中和抗体滴度。
图17显示CMV血清状态和疫苗接种组，即抗体介导的免疫原性的符合方案组直至II期试验第3个月(第二次疫苗接种后1个月)，针对上皮细胞感染的中和抗体滴度。Neg：CMV血清阴性，Pos：CMV血清阳性。50μg、100μg和150μg是指mRNA疫苗的剂量。使用对数转换值的t分布计算置信区间(CI)。黑色参考实线指示基线时所有CMV血清阳性受试者的基线GMT。
图18显示CMV血清状态和疫苗接种组，即抗体介导的免疫原性的符合方案组直至II期试验第3个月(第二次疫苗接种后1个月)，针对成纤维细胞感染的中和抗体滴度。Neg：CMV血清阴性，Pos：CMV血清阳性。50μg、100μg和150μg是指mRNA疫苗的剂量。使用对数转换值的t分布计算置信区间(CI)。黑色参考实线指示基线时所有CMV血清阳性受试者的基线GMT。
图19显示CMV血清状态和疫苗接种组，即抗体介导的免疫原性的符合方案组直至II期试验第7个月(第三次疫苗接种后1个月)，针对上皮细胞感染的中和抗体滴度。Neg：CMV血清阴性，Pos：CMV血清阳性。50μg、100μg和150μg是指mRNA疫苗的剂量。使用对数转换值的t分布计算置信区间(CI)。黑色参考实线指示基线时所有CMV血清阳性受试者的基线GMT。
图20显示CMV血清状态和疫苗接种组，即抗体介导的免疫原性的符合方案组直至II期试验第7个月(第二次疫苗接种后1个月)，针对成纤维细胞感染的中和抗体滴度。Neg：CMV血清阴性，Pos：CMV血清阳性。50μg、100μg和150μg是指mRNA疫苗的剂量。使用对数转换值的t分布计算置信区间(CI)。黑色参考实线指示基线时所有CMV血清阳性受试者的基线GMT。
图21显示CMV血清状态和疫苗接种组，即抗体介导的免疫原性的符合方案组直至II期试验第7个月(第二次疫苗接种后1个月)的抗五聚体结合抗体滴度。Neg：CMV血清阴性，Pos：CMV血清阳性。50μg、100μg和150μg是指mRNA疫苗的剂量。使用对数转换值的t分布计算置信区间(CI)。黑色参考实线指示基线时所有CMV血清阳性受试者的基线GMT。
图22显示CMV血清状态和疫苗接种组，即抗体介导的免疫原性的符合方案组直至II期试验第7个月(第二次疫苗接种后1个月)的抗gB结合抗体滴度。Neg：CMV血清阴性，Pos：CMV血清阳性。50μg、100μg和150μg是指mRNA疫苗的剂量。使用对数转换值的t分布计算置信区间(CI)。黑色参考实线指示基线时所有CMV血清阳性受试者的基线GMT。
图23是显示实施例7中所述的III期研究的研究流程图的示意图。缩写：B＝血液取样以获得由于原发性CMV感染所致的血清转化(CMV血清阴性组)；CMV＝巨细胞病毒；D＝天；EOS＝研究结束；I＝血清取样以获得抗体介导的免疫原性；M＝月；n＝参与者总数；U＝尿液取样以获得CMV血清阳性组中的CMV脱落。
图24是显示实施例8中所述的婴儿结果子研究中的先天性CMV感染预测的示意图。
图25是显示实施例8中所述的婴儿结果子研究中新生儿的样品收集方案的示意图。
具体实施方式
以相等质量比(例如，gH:gL:UL128:UL130:UL131A:gB的mRNA质量比为约1:1:1:1:1:1)含有编码hCMV五聚体(gH、gL、UL128、UL130和UL131A)和gB的mRNA的HCMV免疫原性组合物(例如疫苗，如mRNA疫苗)在I期临床试验研究中已展示有效诱导针对hCMV的中和抗体。然而，对所有mRNA组分使用相等质量比由于分子量差异而使得一些mRNA组分以摩尔计过表现，而其他则表现不足。令人惊讶地，本文显示在包括gH、gL、UL128、UL130、UL131A和gB的hCMV免疫原性组合物中指定特定mRNA组分的摩尔比引起特性改进。特别是，使用大致等摩尔比的gL、UL128、UL130和UL131A，同时增加gB和/或gH相对于hCMV免疫原性组合物中其他mRNA组分的摩尔比改进五聚体表达，改进gB表达，改进抗五聚体抗体反应并且改进抗gB抗体反应。另外，这种摩尔比通过维持产品效力使得hCMV免疫原性组合物的保质期增加。
调节多价hCMV mRNA疫苗内mRNA比率的基本原理至少部分基于疫苗内mRNA翻译成蛋白质后hCMV五聚体形成的摩尔化学计量。以匹配摩尔化学计量的比率提供个别mRNA构建体使得给予患者的单位质量mRNA的蛋白质表达最大。gB和gH是免疫原性组合物中的最大糖蛋白组分，并且gH是较小五聚体蛋白复合在其上以形成成熟五聚体的基础结构。此外，基于储存期间mRNA降解的相对速率(其至少部分取决于mRNA构建体长度)调节比率，使得可在整个药品保质期内实现最佳功能性能。如实施例中所示，最大mRNA可作为整个疫苗批次效力的替代物。只要gB组分保持超过49％未因降解改性，整个疫苗的免疫原性就是完整的。含有大致等摩尔量的UL128、gL、UL130和UL131A以及过量(例如，至少1.5倍或至少2倍)摩尔量的gB和gH的变化比率在本文中展现出在体外和在小鼠中有效。对于给定总剂量，与基于相等质量比的hCMV mRNA疫苗相比，基于摩尔比的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可使效力增加，如由蛋白质表达和/或改进的抗体反应所示。
在一些实施方案中，基于摩尔比的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可使效力增加约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或大于50％。在某些实施方案中，基于摩尔比的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可产生约40％的效力增加。在一些实施方案中，基于摩尔比的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可产生约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或大于50％的商品成本降低。在某些实施方案中，基于摩尔比的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可使商品成本降低约40％。在一些实施方案中，基于摩尔比的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可由于给与的脂质减少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或大于50％使耐受性增加。在某些实施方案中，基于摩尔比的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可由于给与的脂质减少约40％使耐受性增加。
抗原
抗原是能够诱导免疫反应(例如，使免疫系统产生针对抗原的抗体)的蛋白质或多糖。在本文中，除非另外说明，否则术语抗原的使用涵盖诱导(或能够诱导)针对hCMV的免疫反应的免疫原性蛋白和免疫原性片段。应理解，术语“蛋白质”涵盖肽并且术语“抗原”涵盖抗原片段。
HCMV包括参与病毒附着和进入不同细胞类型中的数种表面糖蛋白。由gH/gL/UL128/UL130/UL131A构成的五聚体复合物(PC)(Hahn等人,2004；Ryckman等人,2008；Wang和Shenk,2005b，其中每一者均通过引用并入本文)介导进入内皮细胞、上皮细胞和骨髓细胞中。
HCMV蛋白UL128、UL130和UL131A与gH和gL蛋白一起组装形成异源五聚体复合物，命名为gH/gL/UL128-131A，存在于HCMV表面上。自然变体以及缺失和突变分析表明具有gH/gL/UL128-131A复合物的蛋白质具有感染某些细胞类型的能力，所述细胞类型包括例如内皮细胞、上皮细胞和白细胞。
HCMV通过将其包膜与质膜(成纤维细胞)或内体膜(上皮细胞和内皮细胞)融合而进入细胞。HCMV通过使用包膜糖蛋白M(gM)或gB附着于细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖来起始细胞进入。这个步骤后接着是与触发进入或起始细胞内信号传导的细胞表面受体相互作用。进入受体功能由gH/gL糖蛋白复合物提供。已知不同gH/gL复合物有助于进入上皮细胞、内皮细胞或成纤维细胞中。例如，尽管进入成纤维细胞需要gH/gL异源二聚体，但进入上皮细胞和内皮细胞除gH/gL外还需要五聚体复合物gH/gL/UL128/UL130/UL131。因此，不同gH/gL复合物与上皮/内皮细胞和成纤维细胞上的不同进入受体接合。受体接合后接着是膜融合，其为由gB和gH/gL介导的过程。早期抗体研究支持gB和gH/gL两者在hCMV进入中的关键作用。gB是进入和细胞传播所必需的。gB和gH/gL是细胞融合所必需的并且足以用于细胞融合，因此构成HCMV的“核心融合机构”，所述机构在其他疱疹病毒中是保守的。因此，四种糖蛋白复合物在病毒附着、结合、融合和进入宿主细胞中起关键作用。
涉及gH/gL/UL128-131A复合物的研究显示hCMV糖蛋白gB、gH、gL、gM和gN以及UL128、UL130和UL131A蛋白具有免疫原性，并且参与多种细胞类型的免疫刺激反应。此外，UL128、UL130和UL131A基因在hCMV分离株中相对保守，因此代表疫苗接种的有吸引力靶标。此外，新近研究表明，针对五聚体gH/gL/UL128-131复合物中表位的抗体中和向内皮细胞、上皮细胞和其他细胞类型中的进入，从而阻断hCMV感染数种细胞类型的能力。
不希望受任何理论束缚，中和抗体中的大多数可针对包膜糖蛋白(Britt等人,1990；Fouts等人,2012；Macagno等人,2010；Marshall等人,1992，通过引用并入本文)，而强T细胞反应可针对被膜蛋白pp65和非结构蛋白如IE1和IE2(Blanco-Lobo等人,2016；Borysiewicz等人,1988；Kern等人,2002，通过引用并入本文)。
HCMV包膜糖蛋白复合物(例如，gH/gL/UL128/UL130/UL131A)代表抗病毒免疫反应的主要抗原靶标。本公开的实施方案提供RNA(例如，mRNA)疫苗，其包括编码HCMV抗原、特别是来自HCMV糖蛋白复合物中的一者的HCMV抗原的多核苷酸。本公开的实施方案提供RNA(例如，mRNA)疫苗，其包括编码至少一种hCMV抗原性多肽的至少一种多核苷酸。本文提供的HCMV RNA疫苗可用于诱导平衡免疫反应，所述平衡免疫反应包含细胞免疫和体液免疫两者，而无与DNA疫苗和活减毒疫苗相关的许多风险。
将名称为“Nucleic Acid Vaccines”的国际申请第PCT/US2015/027400号(WO2015/164674)、名称为“HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE”的国际申请第PCT/US2016/058310号(WO2017/070613)、名称为“HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE”的国际申请第PCT/US2017/057748号(WO2018/075980)、名称为“HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE”的美国专利第10,064,935号、名称为“HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE”的美国专利第10,383,937号、名称为“HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE”的美国专利第10,064,935号和名称为“HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE”的美国专利第10,716,846号的全部内容通过引用并入本文。
本公开的免疫原性组合物(例如疫苗，如mRNA疫苗)的hCMV抗原如本文表13中所提供。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包含：(a)包含编码hCMV gH多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；(b)包含编码hCMV gL多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(c)包含编码hCMV UL128多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(d)包含编码hCMV UL130多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(e)包含编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；和(f)包含编码hCMV gB多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸。在一些实施方案中，hCMV疫苗组分包含表13中提供的序列。
在一些实施方案中，编码hCMV gH蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO:5序列的核苷酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码hCMV gL蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO:6序列的核苷酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码hCMV UL128蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO:2序列的核苷酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码hCMV UL130蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO:3序列的核苷酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码hCMV UL131A蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO:4序列的核苷酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码hCMV gB蛋白的mRNA包含与SEQ ID NO:1序列的核苷酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码hCMV gH多肽的mRNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码hCMV gL多肽的mRNA包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，编码hCMV UL128多肽的mRNA包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码hCMV UL130多肽的mRNA包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码hCMV UL131A多肽的mRNA包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码hCMV gB多肽的mRNA包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码hCMV gH多肽的开放阅读框包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的序列。
在一些实施方案中，编码hCMV gL多肽的开放阅读框包含与SEQ ID NO:12的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的序列。
在一些实施方案中，编码hCMV UL128多肽的开放阅读框包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的序列。
在一些实施方案中，编码hCMV UL130多肽的开放阅读框包含与SEQ ID NO:9的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的序列。
在一些实施方案中，编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框包含与SEQ ID NO:10的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的序列。
在一些实施方案中，编码hCMV gH多肽的mRNA包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，编码hCMV gL多肽的mRNA包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，编码hCMV UL128多肽的mRNA包含SEQ IDNO:8的核苷酸序列的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，编码hCMV UL130多肽的mRNA包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，编码hCMV UL131A多肽的mRNA包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，编码hCMV gB多肽的mRNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列的开放阅读框(ORF)。
在一些实施方案中，hCMV gB多肽包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的序列。
在一些实施方案中，hCMV gH多肽包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，hCMV gL多肽包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，hCMV UL128多肽包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，hCMV UL130多肽包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，hCMV UL131A多肽包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，hCMV gB多肽包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或大于99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，hCMV gH多肽包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，hCMV gL多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，hCMV UL128多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，hCMV UL130多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，hCMV UL131A多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，hCMV gB多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的mRNA组分以相等质量存在。在其他实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的mRNA组分不以相等质量存在。在本文中发现，至少部分由于降解，以相等质量包括mRNA组分使一些较长mRNA构建体的表现不足。因此，如实施例中所说明，本文开发了基于mRNA组分的摩尔比的替代方法来配制hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的mRNA组分。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包含(a)包含编码hCMVgH多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；(b)包含编码hCMV gL多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(c)包含编码hCMV UL128多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(d)包含编码hCMV UL130多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(e)包含编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；和(f)包含编码hCMV gB多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸，其中：免疫原性组合物中(a):(f)的摩尔比为约1:1；免疫原性组合物中(b):(c):(d):(e)的摩尔比为约1:1:1:1；并且免疫原性组合物中(a)和(f)中的每一者与(b)、(c)、(d)或(e)中任一者的摩尔比为约1.5:1至2:1(例如，1.5:1至2:1、1.5:1至1.9:1、1.5:1至1.8:1、1.5:1至1.7:1、1.5:1至1.6:1、1.6:1至2:1、1.6:1至1.9:1、1.6:1至1.8:1、1.6:1至1.7:1、1.7:1至2:1、1.7:1至1.9:1、1.7:1至1.8:1、1.8:1至2:1、1.8:1至1.9:1或1.9:1至2:1)。
在一些实施方案中，免疫原性组合物中(a)和(f)中的每一者与(b)、(c)、(d)或(e)中任一者的摩尔比为约1.5:1至2:1(例如，1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1)。在一些实施方案中，免疫原性组合物中(a)与(b)、(c)、(d)或(e)中任一者的摩尔比为约1.5:1至2:1(例如，1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1)。在一些实施方案中，免疫原性组合物中(f)与(b)、(c)、(d)或(e)中任一者的摩尔比为约1.5:1至2:1(例如，1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1)。在一些实施方案中，免疫原性组合物中(a)与(b)、(c)、(d)或(e)中任一者的摩尔比为约1.5:1至2:1(例如，1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1)，并且免疫原性组合物中(f)与(b)、(c)、(d)或(e)中任一者的摩尔比为约1.5:1至2:1(例如，1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1)。在一些实施方案中，(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约1.5:1:1:1:1:1.5。在一些实施方案中，(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2。
在一些实施方案中，与本文所述的hCMV免疫原性组合物相关的mRNA还可包含5'帽(例如，7mG(5')ppp(5')NlmpNp)、polyA尾(例如，约100个核苷酸)或5'帽和polyA尾。
应理解，本公开的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可包含信号序列。还应理解，本公开的hCMV mRNA疫苗可包括任何5′非翻译区(UTR)和/或任何3′UTR。示例性UTR序列如表13中所提供；然而，可使用其他UTR序列或其他UTR序列可替换本文所述的任何UTR序列。也可从本文提供的疫苗构建体中去除UTR。
不希望受任何理论束缚，使用摩尔比确定每个mRNA组分的量的本文所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)，相对于mRNA组分以相等质量存在的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可具有增加的稳定性。这种增加的稳定性可有助于确保hCMV免疫原性组合物在含有这些组合物的药物产品的整个保质期内是稳定的，并且在药物产品的指定到期日期之前仍足够有效地施用于受试者。
mRNA构建体的稳定性可通过本领域普通技术人员已知的任何方式测量。在一些实施方案中，基于测量mRNA构建体的降解和/或纯度来计算mRNA构建体的稳定性。预期本文所述hCMV免疫原性组合物内的较长mRNA构建体，例如gH和gB比相同hCMV免疫原性组合物内的较短mRNA构建体降解得快。因此，在一些实施方案中，本文所述hCMV免疫原性组合物的稳定性通过测量gH和/或gB的降解和/或纯度来测量。如本文所用，“纯度”是指相对于以质量计mRNA(例如，编码gB的mRNA)的总输入，全长完整mRNA(例如，编码gB的mRNA)的量。
在一些实施方案中，本文所述hCMV免疫原性组合物的所有mRNA组分在整个预测保质期(例如，长达2年)中在适当储存条件下(例如，在大于0℃且小于或等于10℃的温度下)维持至少45％(例如，至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或更大)的纯度。在一些实施方案中，gH和/或gB在整个预测保质期(例如，长达2年)中在适当储存条件下(例如，在大于或等于-80℃且小于或等于10℃的温度，例如-80、-70、-40、-20、0、5或10℃下)维持至少45％(例如，至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或更大)的纯度。
在一些实施方案中，当储存在大于或等于-80℃且小于或等于10℃的温度下时，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)稳定至少三个月(例如，至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少13个月、至少14个月、至少15个月、至少16个月、至少17个月、至少18个月、至少19个月、至少20个月、至少21个月、至少22个月、至少23个月、至少24个月、至少25个月、至少26个月、至少27个月、至少28个月、至少29个月、至少30个月、至少31个月、至少32个月、至少33个月、至少34个月、至少35个月、至少36个月或更久)。在一些实施方案中，将hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)储存在约-80、-70、-40、-20、0、5或10℃的温度下。在一些实施方案中，将免疫原性组合物(例如，疫苗)储存在约-80℃的温度下。在一些实施方案中，将免疫原性组合物(例如，疫苗)储存在约-20℃的温度下。在一些实施方案中，将免疫原性组合物(例如，疫苗)储存在约5℃的温度下。在一些实施方案中，当储存在约-80℃、-20℃或5℃的温度下时，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)稳定至少三个月(例如，至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少15个月、至少18个月、至少21个月、至少24个月、至少30个月或至少36个月)。
在一些实施方案中，当储存在大于或等于-80℃且小于或等于10℃的温度(例如，-80、-70、-40、-20、0、5或10℃)下时，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)稳定至少十二至十八个月。在一些实施方案中，当储存在约-80℃的温度下时，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)稳定至少十二至十八个月。在一些实施方案中，当储存在约-20℃的温度下时，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)稳定至少十二至十八个月。在一些实施方案中，当储存在约5℃的温度下时，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)稳定至少十二至十八个月。
在一些实施方案中，相对于mRNA组分以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，mRNA组分基于指定摩尔比的本文所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)具有增加的稳定性(例如，增加至少20％、至少50％、至少80％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多)。在一些实施方案中，当储存在大于或等于-80℃且小于或等于10℃的温度(例如，-80、-70、-40、-20、0、5或10℃)下至少三个月(例如，至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少15个月、至少18个月、至少21个月、至少24个月或至少36个月)时，相对于mRNA组分以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，mRNA组分基于指定摩尔比的本文所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)具有增加的稳定性(例如，增加至少20％、至少50％、至少80％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多)。
在一些实施方案中，当储存在大于或等于-80℃且小于或等于10℃的温度(例如，-80、-70、-40、-20、0、5或10℃)下至少二十四个月时，相对于mRNA组分以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，mRNA组分基于指定摩尔比的本文所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)具有增加的稳定性(例如，增加至少20％、至少50％、至少80％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多)。在一些实施方案中，当储存在约-80、-20或5℃下至少二十四个月时，相对于mRNA组分以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，mRNA组分基于指定摩尔比的本文所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)具有增加的稳定性(例如，增加至少20％、至少50％、至少80％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多)。
在一些实施方案中，相对于mRNA以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，mRNA组分基于指定摩尔比的本文所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)产生增加(例如，增加至少10％、至少20％、至少50％、至少90％、至少2倍或至少10倍)的五聚体表达(例如，体外或体内)。
在一些实施方案中，相对于mRNA以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，mRNA组分基于指定摩尔比的本文所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)产生增加(例如，增加至少10％、至少20％、至少50％、至少90％、至少2倍或至少10倍)的gB表达(例如，体外或体内)。
在一些实施方案中，相对于mRNA以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，mRNA组分基于指定摩尔比的本文所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)诱导增加(例如，增加至少10％、至少20％、至少50％、至少90％、至少2倍或至少10倍)的抗五聚体抗体水平。
在一些实施方案中，相对于mRNA以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，mRNA组分基于指定摩尔比的本文所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)诱导增加(例如，增加至少10％、至少20％、至少50％、至少90％、至少2倍或至少10倍)的抗gB抗体水平。
核酸
本公开的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包含至少一种(一种或多种)核糖核酸(RNA)，其具有编码至少一种hCMV抗原的开放阅读框。在一些实施方案中，RNA是具有编码至少一种hCMV抗原的开放阅读框的信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)还包含(至少一个)5′UTR、3′UTR、polyA尾和/或5′帽。
核酸包含核苷酸(核苷酸单体)的聚合物，也称为多核苷酸。核酸可为或可包括例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，其包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2'-氨基官能化的2'-氨基-LNA和具有2'-氨基官能化的2'-氨基-α-LNA)、亚乙基核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)和/或其嵌合体和/或组合。
信使RNA(mRNA)是编码(至少一种)蛋白质(氨基酸的天然存在、非天然存在或经修饰聚合物)的任何核糖核酸，并且可体外、体内、原位或离体翻译产生所编码的蛋白质。熟练技术人员应理解，除非另外说明，否则本申请中所述的核酸序列可在代表性DNA序列中引用“T”，但当序列表示RNA(例如，mRNA)时，“T”用“U”替换。因此，本文通过特定序列识别号公开并识别的任何DNA也公开与所述DNA互补的相应RNA(例如，mRNA)序列，其中DNA序列中的每个“T”用“U”替换。
开放阅读框(ORF)是DNA或RNA的连续区段，其以起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG或AUG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA，或者UAA、UAG或UGA)终止。ORF典型地编码蛋白质。应理解，本文公开的序列还可包含其他元件，例如5′和3′UTR，但与ORF不同，那些元件不一定必须存在于本公开的疫苗中。
变体
在一些实施方案中，本公开的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包含编码hCMV抗原变体的mRNA。抗原或其他多肽变体是指氨基酸序列与野生型、天然或参考序列不同的分子。与天然或参考序列相比，抗原/多肽变体可在氨基酸序列内的某些位置处具有取代、缺失和/或插入。通常，变体与野生型、天然或参考序列具有至少50％同一性。在一些实施方案中，变体与野生型、天然或参考序列具有至少80％或至少90％同一性。
由本公开的核酸编码的变体抗原/多肽可含有赋予如下多种期望特性中的任一者的氨基酸变化，例如增强其免疫原性、增强其表达和/或改进其稳定性或在受试者中的PK/PD特性。可使用常规突变诱发技术制备变体抗原/多肽，并且适当时进行测定以确定其是否具有所要特性。确定表达水平和免疫原性的测定是本领域中众所周知的。类似地，可使用本领域公认的技术来测量蛋白质变体的PK/PD特性，例如通过确定疫苗接种受试者中抗原随时间的表达和/或通过观察诱导的免疫反应的持久性。由变体核酸编码的蛋白质的稳定性可通过测定热稳定性或尿素变性后的稳定性来测量，或者可使用计算机预测来测量。用于此类实验和计算机确定的方法是本领域中已知的。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包含如下mRNA ORF，所述mRNA ORF具有由本文提供的任一序列(参见例如表13)识别的核苷酸序列，或具有与由本文提供的任一序列识别的核苷酸序列具至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性(包括其间所有值)的核苷酸序列。
术语“同一性”是指通过比较序列确定的两种或更多种多肽(例如，抗原)或多核苷酸(核酸)的序列之间的关系。同一性也是指通过两个或更多个氨基酸残基或核酸残基的串之间的匹配数确定的序列之间的序列相关程度。同一性测量两个或更多个序列中较小序列之间的一致匹配百分比，其中由特定数学模型或计算机程序(例如，“算法”)解决空位比对(如果存在)。可通过已知方法容易地计算相关抗原或核酸的同一性。应用于多肽或多核苷酸序列的“同一性百分比(％)”定义为在比对序列和必要时引入空位以实现最大同一性百分比之后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基同一的残基(氨基酸残基或核酸残基)的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域中众所周知的。应理解，同一性取决于同一性百分比的计算，但由于计算中引入的空位和罚分，其值可不同。一般而言，如通过本文所述和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定，特定多核苷酸或多肽(例如，抗原)的变体与特定参考多核苷酸或多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性。此类比对工具包括BLAST套件(StephenF.Altschul等人,(1997),“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs”,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)的工具。另一种流行局部比对技术是基于Smith-Waterman算法(Smith,T.F.和Waterman,M.S.(1981)“Identification of common molecular subsequences.”J.Mol.Biol.147:195-197)。基于动态程序化的通用全局比对技术是Needleman-Wunsch算法(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)“Ageneral method applicable to the search for similarities in theamino acid sequences of two proteins.”J.Mol.Biol.48:443-453)。最近已开发一种快速最佳全局序列比对算法(Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm；FOGSAA)，据称所述算法比其他最佳全局比对方法(包括Needleman-Wunsch算法)更快地产生核苷酸和蛋白质序列的全局比对。
因此，编码相对于参考序列，特别是本文公开的多肽(例如，抗原)序列含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽的多核苷酸包括在本公开的范围内。例如，可向肽序列(例如，在N末端或C末端)添加序列标签或氨基酸，例如一种或多种赖氨酸。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可用于提高肽溶解度或允许生物素化。或者，位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区域的氨基酸残基可任选地缺失以提供截短序列。某些氨基酸(例如，C末端或N末端残基)可替代地根据序列的用途缺失，所述用途例如表达所述序列以作为可溶性较大序列的一部分，或与固体支撑物连接。在一些实施方案中，用于(或编码)信号序列、终止序列、跨膜域、接头、多聚域(例如，折叠区)等的序列可用实现相同或类似功能的替代序列取代。在一些实施方案中，可例如通过引入更大氨基酸来填充蛋白质核心中的空腔以改进稳定性。在其他实施方案中，可用疏水性残基替换掩埋的氢键网以改进稳定性。在其他实施方案中，糖基化位点可去除并用适当残基替换。此类序列容易由本领域技术人员识别。还应理解，本文提供的一些序列含有可例如在用于制备RNA(例如，mRNA)疫苗之前缺失的序列标签或末端肽序列(例如，在N末端或C末端)。
如本领域技术人员所公认，认为蛋白质片段、功能性蛋白质域和同源蛋白质也在目标hCMV抗原的范围内。例如，本文提供了参考蛋白质的任何蛋白质片段(意指至少一个氨基酸残基比参考抗原序列短但其他方面同一的多肽序列)，条件是所述片段具有免疫原性并且赋予针对hCMV病原体的保护性免疫反应。除与参考蛋白质同一但截短的变体外，在一些实施方案中，相对于本文提供或提及的任何序列，抗原包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变。抗原/抗原多肽的长度可在约4、6或8个氨基酸至全长蛋白质的范围内。
稳定化元件
除其他结构特征，例如5'-帽结构或3'-poly(A)尾外，天然存在的真核mRNA分子可含有稳定化元件，包括但不限于在其5'末端的非翻译区(UTR)(5'UTR)和/或在其3'末端的非翻译区(UTR)(3'UTR)。5'UTR和3'UTR典型地从基因组DNA转录，并且是未成熟mRNA的元件。成熟mRNA的特征性结构特征，例如5'帽和3'-poly(A)尾通常在mRNA加工期间添加至经转录(未成熟)mRNA。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包括至少一种RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸具有编码具有至少一种修饰的至少一种抗原多肽的开放阅读框、至少一个5'末端帽并且配制在脂质纳米粒子内。多核苷酸的5'加帽可根据制造商方案在体外转录反应期间使用以下化学RNA帽类似物同时完成：3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G[ARCA帽]；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G(New EnglandBioLabs,Ipswich,MA)，以产生5'-鸟苷帽结构。可使用牛痘病毒加帽酶在转录后完成经修饰RNA的5'加帽，以产生“帽0”结构：m7G(5')ppp(5')G(New England BioLabs,Ipswich,MA)。帽1结构可使用牛痘病毒加帽酶和2'-O甲基转移酶产生，以产生：m7G(5')ppp(5')G-2′-O-甲基。帽2结构可从帽1结构在使用2'-O甲基转移酶进行5'-倒数第三个核苷酸的2'-O-甲基化后产生。帽3结构可从帽2结构在使用2'-O甲基转移酶进行5'-倒数第四个核苷酸的2′-O-甲基化后产生。酶可来源于重组来源。
3'-poly(A)尾典型地是添加至经转录mRNA的3'末端的腺嘌呤核苷酸区段。在一些情况下，其可包含多达约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3'-poly(A)尾的长度可为关于个别mRNA的稳定性的必需元件。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包括一种或多种稳定化元件。稳定化元件可包括例如组蛋白茎-环。已报告32kDa茎-环结合蛋白(SLBP)。在细胞核和细胞质两者中，其与组蛋白茎-环在组蛋白信息的3′末端处结合。其表达水平由细胞周期调节；其在S期达峰值，此时组蛋白mRNA水平也升高。所述蛋白已展示为由U7 snRNP对组蛋白前mRNA的有效3′末端加工所必需。SLBP在加工后继续与茎-环结合，然后在细胞质中刺激成熟组蛋白mRNA翻译成组蛋白。SLBP的RNA结合域在后生动物和原生动物中保守；其与组蛋白茎-环的结合取决于环的结构。最小结合位点包括相对于茎-环的5′端至少三个核苷酸和3'端两个核苷酸。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包括编码区、至少一种组蛋白茎-环和任选地poly(A)序列或聚腺苷酸化信号。poly(A)序列或聚腺苷酸化信号通常应提高所编码蛋白质的表达水平。在一些实施方案中，所编码蛋白质不是组蛋白、报告蛋白(例如，荧光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、EGFP)或标记或选择蛋白(例如，α-珠蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤:鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。
在一些实施方案中，poly(A)序列或聚腺苷酸化信号与至少一种组蛋白茎-环的组合(尽管两者都代表自然界中的替代机制)协同作用以将蛋白质表达增加至超过用个别元件中的任一者观察到的水平。poly(A)与至少一种组蛋白茎-环组合的协同作用不取决于元件的顺序或poly(A)序列的长度。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)不包含组蛋白下游元件(HDE)。“组蛋白下游元件”(HDE)包括天然存在茎-环的3′端约15至20个核苷酸的富含嘌呤的多核苷酸区段，其代表参与将组蛋白前mRNA加工为成熟组蛋白mRNA的U7 snRNA的结合位点。在一些实施方案中，核酸不包括内含子。
hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可含有或可不含增强子和/或启动子序列，所述序列可经修饰或未修饰或者可经活化或灭活。在一些实施方案中，组蛋白茎-环通常来源于组蛋白基因，并且包括由短序列组成的间隔子分隔的两个相邻部分或完全逆向互补序列的分子内碱基配对，从而形成结构的环。未配对的环区典型地不能与茎环元件中的任一者进行碱基配对。其更常出现在RNA中，因为它是许多RNA二级结构的关键组分，但也可存在于单链DNA中。茎-环结构的稳定性通常取决于长度、错配或凸起的数量以及配对区的碱基组成。在一些实施方案中，可得到摆动碱基配对(非Watson-Crick碱基配对)。在一些实施方案中，至少一种组蛋白茎-环序列包含15至45个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)中一个或多个富含AU的序列被去除。这些序列，有时称为AURES，是在3′UTR中发现的去稳定序列。可从RNA疫苗去除AURES。或者，AURES可保留在RNA疫苗中。
信号肽
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包含具有编码与hCMV抗原融合的信号肽的ORF的mRNA。信号肽包含蛋白质的N末端15-60个氨基酸，其典型地为在分泌途径上跨膜转座所需，因此广泛控制真核生物和原核生物两者中大多数蛋白质进入分泌途径。在真核生物中，新生前体蛋白(前蛋白)的信号肽将核糖体引导至粗面内质网(ER)膜，并且起始生长肽链传输穿过所述膜以进行加工。ER加工产生成熟蛋白质，其中信号肽从前体蛋白切割，典型地由宿主细胞的ER中存在的信号肽酶切割，或者信号肽保持未切割并用作膜锚。信号肽也可促进蛋白质靶向细胞膜。
信号肽可具有15-60个氨基酸的长度。例如，信号肽的长度可为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸。在一些实施方案中，信号肽的长度为20-60、25-60、30-60、35-60、40-60、45-60、50-60、55-60、15-55、20-55、25-55、30-55、35-55、40-55、45-55、50-55、15-50、20-50、25-50、30-50、35-50、40-50、45-50、15-45、20-45、25-45、30-45、35-45、40-45、15-40、20-40、25-40、30-40、35-40、15-35、20-35、25-35、30-35、15-30、20-30、25-30、15-25、20-25或15-20个氨基酸。
来自异源基因的信号肽(其调节自然界中除hCMV抗原外的基因的表达)是本领域中已知的，并且可测试所述信号肽的所需特性并且然后并入本公开的核酸中。在一些实施方案中，信号肽可包含以下序列之一：MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLPQGVVG(SEQ ID NO:25)、MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO:26)；METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:13)；MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS(SEQ ID NO:27)；MKCLLYLAFLFIGVNCA(SEQ ID NO:28)；MWLVSLAIVTACAGA(SEQ ID NO:29)。
序列优化
在一些实施方案中，编码本公开的抗原的ORF经密码子优化。密码子优化方法是本领域中已知的。例如，本文提供的任何一个或多个序列的ORF可经密码子优化。在一些实施方案中，可使用密码子优化匹配靶标生物体和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；偏好GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；最小化可损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基运行；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；去除/添加编码蛋白中的翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、去除或改组蛋白质域；插入或缺失限制性位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调节翻译率以使蛋白质的各种域正确折叠；或者减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域中已知的，非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo ParkCA)和/或专有方法的服务。在一些实施方案中，使用优化算法优化开放阅读框(ORF)序列。
在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在或野生型序列ORF(例如，编码hCMV抗原的天然存在或野生型mRNA序列)具有小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码hCMV抗原的天然存在或野生型mRNA序列)具有小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码hCMV抗原的天然存在或野生型mRNA序列)具有小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码hCMV抗原的天然存在或野生型mRNA序列)具有小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码hCMV抗原的天然存在或野生型mRNA序列)具有小于75％的序列同一性。
在一些实施方案中，经密码子优化的mRNA序列与天然存在或野生型序列(例如，编码hCMV抗原的天然存在或野生型mRNA序列)具有65％至85％(例如，约67％至约85％或约67％至约80％)的序列同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码hCMV抗原的天然存在或野生型mRNA序列)具有65％至75％或约80％的序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化mRNA序列编码的抗原的免疫原性与非密码子优化序列编码的hCMV抗原的免疫原性相等或更高(例如，高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％)。
当转染至哺乳动物宿主细胞中时，经修饰mRNA的稳定性为12-18小时或超过18小时，例如24、36、48、60、72或超过72小时，并且能够由哺乳动物宿主细胞表达。
在一些实施方案中，经密码子优化的RNA可为其中G/C水平提高的RNA。核酸分子(例如，mRNA)的G/C含量可影响RNA的稳定性。具有增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的RNA在功能上可比含有较大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的RNA稳定。举例来说，WO02/098443公开了一种药物组合物，其含有通过翻译区中的序列修饰稳定化的mRNA。由于遗传密码的简并性，修饰通过用那些促进较高RNA稳定性而不改变所得氨基酸的密码子取代现有密码子来发挥作用。所述方法限于RNA的编码区。
未化学修饰的核苷酸
在一些实施方案中，本公开的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)中的至少一种RNA(例如，mRNA)未化学修饰，并且包含由腺苷、鸟苷、胞嘧啶和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准核苷残基，例如经转录RNA中存在的标准核苷残基(例如，A、G、C或U)。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准脱氧核糖核苷，例如DNA中存在的标准脱氧核糖核苷(例如，dA、dG、dC或dT)。
化学修饰
在一些实施方案中，本公开的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包含具有编码至少一种hCMV抗原的开放阅读框的至少一种核酸(例如，RNA)，其中所述核酸包含可为标准(未修饰)或如本领域中已知修饰的核苷酸和/或核苷。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含经修饰核苷酸或核苷。此类经修饰核苷酸和核苷可为天然存在的经修饰核苷酸和核苷或非天然存在的经修饰核苷酸和核苷。此类修饰可包括本领域中公认的核苷酸和/或核苷的糖、主链或核碱基部分上的修饰。
在一些实施方案中，本公开天然存在的经修饰核苷酸或核苷是本领域中通常已知或公认的。此类天然存在的经修饰核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于广泛认可的MODOMICS数据库中。
在一些实施方案中，本公开的非天然存在的经修饰核苷酸或核苷是本领域中通常已知或公认的。此类非天然存在的经修饰核苷酸和核苷的非限制性实例可尤其见于公开的美国申请第PCT/US2012/058519号；第PCT/US2013/075177号；第PCT/US2014/058897号；第PCT/US2014/058891号；第PCT/US2014/070413号；第PCT/US2015/36773号；第PCT/US2015/36759号；第PCT/US2015/36771号；或第PCT/IB2017/051367号，所述申请均通过引用并入本文。
因此，本公开的核酸(例如，DNA核酸和RNA核酸，例如mRNA核酸)可包含标准核苷酸和核苷、天然存在的核苷酸和核苷、非天然存在的核苷酸和核苷或其任何组合。
在一些实施方案中，本公开的核酸(例如，DNA核酸和RNA核酸，例如mRNA核酸)包含各种(超过一种)不同类型的标准和/或经修饰核苷酸和核苷。在一些实施方案中，核酸的特定区域含有一种、两种或更多种(任选地不同)类型的标准和/或经修饰核苷酸和核苷。
在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未修饰核酸，引入细胞或生物体的经修饰RNA核酸(例如，经修饰mRNA核酸)分别在细胞或生物体中展现降低的降解。
在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未修饰核酸，引入细胞或生物体的经修饰RNA核酸(例如，经修饰mRNA核酸)可分别在细胞或生物体中展现降低的免疫原性(例如，降低的先天反应)。
在一些实施方案中，核酸(例如RNA核酸，如mRNA核酸)包含在核酸的合成期间或合成后引入的非天然修饰核苷酸以实现所需功能或特性。修饰可存在于核苷间键联、嘌呤或嘧啶碱基或者糖上。修饰可使用化学合成或使用聚合酶在链末端或链中任何其它地方引入。核酸的任何区域均可经化学修饰。
本公开提供核酸(例如RNA核酸，如mRNA核酸)的经修饰核苷和核苷酸。“核苷”是指含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物以及有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中也称为“核碱基”)的化合物。“核苷酸”是指核苷，包括磷酸基团。经修饰核苷酸可通过任何有用方法(例如化学、酶促或重组)合成，以包括一种或多种经修饰或非天然核苷。核酸可包含一个或多个连接核苷区域。此类区域可具有可变的主链键联。键联可为标准磷酸二酯键联，在这种情况下核酸将包含核苷酸区域。
经修饰核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且涵盖核苷酸和/或包含非标准或经修饰碱基的经修饰核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的排列允许非标准碱基与标准碱基之间或两个互补非标准碱基结构之间形成氢键结，例如在具有至少一种化学修饰的那些核酸中。此类非标准碱基配对的一个实例是经修饰核苷酸肌苷和腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合可并入本公开的核酸中。
在一些实施方案中，核酸(例如RNA核酸，如mRNA核酸)中的经修饰核碱基包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)和/或假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，核酸(例如RNA核酸，如mRNA核酸)中的经修饰核碱基包含5-甲氧基甲基尿苷、5-甲基硫基尿苷、1-甲氧基甲基假尿苷、5-甲基胞苷和/或5-甲氧基胞苷。在一些实施方案中，多核糖核苷酸包括至少两种(例如，2、3、4或更多种)任何上述经修饰核碱基的组合，包括但不限于化学修饰。
在一些实施方案中，本公开的mRNA在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代，并且在核酸的一个或多个或所有胞苷位置处包含5-甲基胞苷取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处包含假尿苷(ψ)取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处包含假尿苷(ψ)取代，并且在核酸的一个或多个或所有胞苷位置处包含5-甲基胞苷取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处包含尿苷。
在一些实施方案中，mRNA对特定修饰均一修饰(例如，完全修饰、在整个序列中修饰)。例如，可用1-甲基-假尿苷对核酸均一修饰，意指所述mRNA序列中的所有尿苷残基均经1-甲基-假尿苷替换。类似地，核酸可通过用经修饰残基(例如上述残基)替换而对存在于序列中的任何类型的核苷残基均一修饰。
本公开的核酸可沿分子的整个长度部分或完全修饰。例如，在本公开的核酸中，或在其预定序列区域中(例如，在包括或不包括polyA尾的mRNA中)，核苷酸的一个或多个或所有或给定类型(例如，嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中任何一者或多者或全部)可均一修饰。在一些实施方案中，本公开的核酸中(或其序列区域中)的所有核苷酸X均为经修饰核苷酸，其中X可为核苷酸A、G、U、C中的任一者，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一者。
核酸可含有约1％至约100％经修饰核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于核苷酸的一种或多种类型，即A、G、U或C中的任何一者或多者)或任何居间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。应理解，任何剩余百分比均因存在未修饰A、G、U或C引起。
mRNA可含有最少1％和最多100％经修饰核苷酸，或任何居间百分比，例如至少5％经修饰核苷酸、至少10％经修饰核苷酸、至少25％经修饰核苷酸、至少50％经修饰核苷酸、至少80％经修饰核苷酸或至少90％经修饰核苷酸。例如，核酸可含有经修饰嘧啶，例如经修饰尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，核酸中尿嘧啶的至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％用经修饰尿嘧啶(例如，5-取代的尿嘧啶)替换。经修饰尿嘧啶可用具有单一独特结构的化合物替换，或者可用具有不同结构(例如，2、3、4或更多种独特结构)的多种化合物替换。在一些实施方案中，核酸中胞嘧啶的至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％用经修饰胞嘧啶(例如，5-取代的胞嘧啶)替换。经修饰胞嘧啶可用具有单一独特结构的化合物替换，或者可用具有不同结构(例如，2、3、4或更多种独特结构)的多种化合物替换。
非翻译区(UTR)
本公开的mRNA可包含充当或用作非翻译区的一个或多个区域或部分。当mRNA经设计以编码至少一种目标抗原时，核酸可包含这些非翻译区(UTR)中的一者或多者。核酸的野生型非翻译区经转录但未翻译。在mRNA中，5′UTR在转录起始位点处起始，并持续至起始密码子，但不包括起始密码子；而3′UTR在紧邻终止密码子之后处起始并持续直至转录终止信号为止。越来越多的证据表明UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥调节作用。UTR的调节特征可并入本公开的多核苷酸中，以尤其提高分子的稳定性。也可并入特定特征，以确保在将转录本误引导至不合需要的器官位点的情形下，受控地下调所述转录本。多种5′UTR和3′UTR序列是本领域中已知并可用。
5′UTR是mRNA中位于起始密码子(由核糖体翻译的mRNA转录本的第一个密码子)的直接上游(5′)的区域。5′UTR不编码蛋白质(非编码)。天然5′UTR具有在翻译起始中起作用的特征。其具有如Kozak序列的特征，通常已知Kozak序列参与核糖体起始许多基因的翻译所用的过程。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG(SEQ ID NO:30)，其中R是距起始密码子(AUG)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后接着另一个‘G’。也已知5'UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。
在本公开的一些实施方案中，5′UTR是异源UTR，即为自然界中发现的与不同ORF相关的UTR。在另一个实施方案中，5'UTR是合成UTR，即在自然界中不存在。合成UTR包括已经突变以改进其特性，例如增加基因表达的UTR，以及完全合成的UTR。示例性5'UTR包括来源于非洲爪蟾或人类的α-珠蛋白或β-珠蛋白(US8278063；US9012219)、人类细胞色素b-245α多肽和羟基类固醇(17b)脱氢酶，以及烟草蚀刻病毒(US8278063、9012219)。也可使用CMV立即早期1(IE1)基因(US20140206753、WO2013/185069)，序列GGGAUCCUACC(SEQ ID NO:18)(WO2014144196)。在另一个实施方案中，TOP基因的5′UTR是缺少5′TOP基序(寡嘧啶束)的TOP基因的5′UTR(例如，WO/2015101414、WO2015101415、WO/2015/062738、WO2015024667、WO2015024667)；来源于核糖体蛋白大32(L32)基因的5'UTR元件(WO/2015101414、WO2015101415、WO/2015/062738)、来源于羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)的5'UTR的5'UTR元件(WO2015024667)，或可使用来源于ATP5A1的5'UTR的5'UTR元件(WO2015024667)。在一些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)代替5'UTR。
在一些实施方案中，本公开的5'UTR包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列。
3′UTR是mRNA中位于终止密码子(传导翻译终止信号的mRNA转录本的密码子)的直接下游(3′)的区域。3′UTR不编码蛋白质(非编码)。已知天然或野生型3′UTR中包埋有腺苷和尿苷区段。这些富含AU的特征在具有高翻转率的基因中特别普遍。基于富含AU的元件(ARE)的序列特征和功能特性，ARE可分为三类(Chen等人,1995)：I类ARE在富含U的区域内含有AUUUA基序的若干分散拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠UUAUUUA(U/A)(U/A)(SEQ ID NO:18)九聚体。含有这类ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。III类ARE的定义不太明确。这些富含U的区域不含AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成素是这种类别的两个充分研究的实例。已知大多数与ARE结合的蛋白质会使信使不稳定，而ELAV家族的成员(最尤其HuR)已证明可增加mRNA的稳定性。HuR结合于所有三种类别的ARE。将HuR特异性结合位点工程改造至核酸分子的3′UTR中将引起HuR结合，并因此在体内稳定信息。
3'UTR可为异源或合成的。关于3'UTR，本领域中已知珠蛋白UTR，包括非洲爪蟾β-珠蛋白UTR和人类β-珠蛋白UTR(US8278063、US9012219、US20110086907)。已开发通过从头至尾克隆两个连续人类β-珠蛋白3'UTR而在一些细胞类型中具有增强的稳定性的经修饰β-珠蛋白构建体，并且所述构建体是本领域中众所周知的(US2012/0195936、WO2014/071963)。此外，α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、UTR及其突变体也是本领域中已知的(WO2015101415、WO2015024667)。非专利文献中mRNA构建体中描述的其他3'UTR包括CYBA(Ferizi等人,2015)和白蛋白(Thess等人,2015)。其他示例性3'UTR包括牛或人类生长激素(野生型或修饰型)(WO2013/185069、US20140206753、WO2014152774)、兔β珠蛋白和B型肝炎病毒(HBV)的3'UTR，α-珠蛋白3'UTR和病毒VEEV 3'UTR序列也是本领域中已知的。在一些实施方案中，使用序列UUUGAAUU(WO2014144196)。在一些实施方案中，使用人类和小鼠核糖体蛋白的3'UTR。其他实例包括rps9 3'UTR(WO2015101414)、FIG4(WO2015101415)和人类白蛋白7(WO2015101415)。
在一些实施方案中，本公开的3'UTR包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
本领域普通技术人员应理解异源或合成5'UTR可与任何所需3'UTR序列一起使用。例如，异源5'UTR可与具有异源3'UTR的合成3'UTR一起使用。
特征的组合可包括在侧接区中并且可包含在其他特征中。例如，ORF可侧接可含有强Kozak翻译起始信号的5'UTR和/或可包括用于模板化添加poly-A尾的oligo(dT)序列的3'UTR。5'UTR可包含来自相同和/或不同基因的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，例如美国专利申请公开第20100293625号和PCT/US2014/069155中所述的5'UTR，所述文献通过引用整体并入本文。
RNA的体外转录
可使用体外转录(IVT)系统转录编码本文所述多核苷酸的cDNA。RNA的体外转录是本领域中已知的，并且描述于国际公开WO/2014/152027中，所述文献通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，RNA转录本通过如下方法产生：在体外转录反应中使用未扩增线性化DNA模板来产生RNA转录本。在一些实施方案中，模板DNA是经分离DNA。在一些实施方案中，模板DNA是cDNA。在一些实施方案中，cDNA通过反转录RNA多核苷酸，例如但不限于hCMV mRNA形成。在一些实施方案中，用质粒DNA模板转染细胞，例如细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，例如DH-1细胞。在一些实施方案中，培养经转染细胞以复制质粒DNA，然后分离并纯化。在一些实施方案中，DNA模板包括RNA聚合酶启动子，例如位于目标基因的5'端并与其可操作地连接的T7启动子。
在一些实施方案中，体外转录模板编码5'非翻译(UTR)区，含有开放阅读框，并编码3'UTR和polyA尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度取决于模板编码的mRNA。
当产生RNA转录本时，5'UTR可包含启动子序列。此类启动子序列是本领域中已知的。应理解，此类启动子序列不存在于本公开的疫苗中。
polyA尾可含有10至300个单磷酸腺苷。例如，polyA尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，polyA尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关生物学环境中(例如，在细胞中、在体内)，poly(A)尾用于保护mRNA免于酶促降解，例如在细胞质中，并有助于转录终止和/或从细胞核输出mRNA和翻译。
在一些实施方案中，核酸包括200至3,000个核苷酸。例如，核酸可包括200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000或2000至3000个核苷酸)。
在一些实施方案中，RNA转录本经由酶促加帽进行加帽。在一些实施方案中，RNA包含5'末端帽，例如7mG(5')ppp(5')NlmpNp。
化学合成
固相化学合成。本公开的核酸可全部或部分使用固相技术制造。核酸的固相化学合成是一种自动化方法，其中将分子固定在固体支撑物上并且在反应物溶液中逐步合成。固相合成可用于核酸序列中化学修饰的位点特异性引入。
液相化学合成。通过依次添加单体结构单元合成本公开的核酸可在液相中进行。
合成方法的组合。上文讨论的合成方法各自具有其优势和局限性。已尝试将这些方法组合以克服所述局限性。所述方法组合在本公开的范围内。固相或液相化学合成以及酶促连接的使用提供一种产生仅通过化学合成不能获得的长链核酸的有效方法。
核酸区域或子区域的连接
也可使用通过连接酶组装核酸。DNA或RNA连接酶经由形成磷酸二酯键促进多核苷酸链5'和3'端的分子间连接。核酸如嵌合多核苷酸和/或环状核酸可通过连接一个或多个区域或子区域来制备。DNA片段可通过连接酶催化的反应接合，以产生具有不同功能的重组DNA。两种寡脱氧核苷酸，一种具有5'磷酰基，并且另一种具有游离3'羟基，用作DNA连接酶的底物。
纯化
本文所述核酸的纯化可包括但不限于核酸提纯、质量保证和质量控制。可通过本领域中已知的方法进行提纯，例如但不限于
Figure BDA0004094056490000491
珠粒(Beckman CoulterGenomics,Danvers,MA)、poly-T珠粒、LNATM oligo-T捕获探针(/>
Figure BDA0004094056490000492
Inc,Vedbaek,Denmark)或基于HPLC的纯化方法，例如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)。术语“纯化”在关于核酸使用时，例如“经纯化核酸”是指与至少一种污染物分离的核酸。“污染物”是使另一者不合适、不纯或劣质的任何物质。因此，经纯化核酸(例如，DNA和RNA)以不同于其在自然界中发现的形式存在或存在于不同于其在自然界中发现的环境中，或以不同于对其进行处理或纯化方法之前存在的形式存在或存在于对其进行处理或纯化方法之前存在的环境中。
质量保证和/或质量控制检查可使用如下方法进行，例如但不限于凝胶电泳、UV吸光度或分析型HPLC。
在一些实施方案中，可通过包括但不限于反转录酶-PCR的方法对核酸进行测序。
定量
在一些实施方案中，本公开的核酸可在胞外体中定量或在来源于一种或多种体液时定量。体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、眼房液、羊水、耵聍、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、库珀氏液(cowper's fluid)或射精前液、汗液、粪便、毛发、眼泪、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺吸出物、囊胚腔液和脐带血。或者，可从选自由以下组成的组的器官获取胞外体：肺、心脏、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结肠、乳腺、前列腺、脑、食道、肝和胎盘。
可使用构建体特异性探针、细胞计数法、qRT-PCR、实时PCR、PCR、流式细胞计数法、电泳、质谱或其组合进行测定，而胞外体可使用免疫组织化学方法例如酶联免疫吸附测定(ELISA)法进行分离。胞外体也可通过尺寸排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合分离。
这些方法使研究人员能够实时监测剩余或递送的核酸的水平。这是可能的，因为在一些实施方案中，本公开的核酸由于结构或化学修饰而不同于内源形式。
在一些实施方案中，可使用例如但不限于紫外可见光谱(UV/Vis)的方法来定量核酸。UV/Vis光谱仪的非限制性实例是
Figure BDA0004094056490000511
光谱仪(ThermoFisher,Waltham,MA)。可分析经定量核酸以确定所述核酸是否可具有合适大小，检查核酸未发生降解。核酸的降解可通过如下方法检查，例如但不限于：琼脂糖凝胶电泳；基于HPLC的纯化方法，例如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)；液相色谱-质谱(LCMS)；毛细管电泳(CE)和毛细管凝胶电泳(CGE)。
脂质纳米粒子(LNP)
在一些实施方案中，将本公开的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)配制于一种或多种脂质纳米粒子(LNP)中。脂质纳米粒子典型地包含可离子化氨基(阳离子)脂质、非阳离子脂质、固醇和PEG脂质组分以及目标核酸运载物。本公开的脂质纳米粒子可使用本领域中通常已知的组分、组合物和方法产生；参见例如PCT/US2016/052352；PCT/US2016/068300；PCT/US2017/037551；PCT/US2015/027400；PCT/US2016/047406；PCT/US2016000129；PCT/US2016/014280；PCT/US2016/014280；PCT/US2017/038426；PCT/US2014/027077；PCT/US2014/055394；PCT/US2016/52117；PCT/US2012/069610；PCT/US2017/027492；PCT/US2016/059575和PCT/US2016/069491，所述文献均通过引用整体并入本文。
本公开的疫苗典型地配制于脂质纳米粒子中。可例如使用混合方法制备疫苗，所述混合方法例如两种流体流的微流体和T形接合器混合，所述两种流体流中的一者含有mRNA，并且另一者具有脂质组分。在一些实施方案中，疫苗通过在醇(例如，乙醇)中组合可离子化氨基脂质、磷脂(例如DOPE或DSPC)、PEG脂质(例如1,2-二肉豆蔻酰基-OT-甘油甲氧基聚乙二醇，也称为PEG-DMG)和结构脂质(例如，胆固醇)制备。脂质可组合产生期望摩尔比，并且用水和醇(例如，乙醇)稀释至例如约5.5mM至约25mM的最终脂质浓度。
可例如通过将脂质溶液与mRNA溶液以约5:1至约50:1的脂质组分与mRNA wt:wt比组合来制备包括mRNA和脂质组分的疫苗。可使用基于微流体的系统(例如，NanoAssemblr)以约10ml/min至约18ml/min的流速将脂质溶液快速注射至例如mRNA溶液中以产生悬浮液(例如，水与醇的比率为约1:1至约4:1)。
可通过透析处理疫苗以去除醇(例如，乙醇)并实现缓冲液交换。制剂可用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析，例如，以大于初始产物的体积(例如，使用Slide-A-Lyzer盒(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rockford,IL))，分子量截止值为例如10kD。前述示例性方法诱导纳米沉淀和粒子形成。可使用包括但不限于T型接合器和直接注射的替代方法来实现相同纳米沉淀。
本公开的疫苗典型地配制于脂质纳米粒子中。在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含至少一种可离子化氨基脂质、至少一种非阳离子脂质、至少一种固醇和/或至少一种经聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。
本公开的脂质纳米粒子由脂质混合物构成，并且根据脂质纳米粒子中每个脂质组分的摩尔分数或摩尔百分比来测量其量。摩尔百分比通过将摩尔分数乘以100％获得。当脂质混合物以数值计数时，未说明mRNA和任何水。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含20-60mol％可离子化氨基脂质。例如，脂质纳米粒子可包含20-50mol％、20-40mol％、20-30mol％、30-60mol％、30-50mol％、30-40mol％、40-60mol％、40-50mol％或50-60mol％可离子化氨基脂质。在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含20mol％、30mol％、40mol％、50mol％或60mol％可离子化氨基脂质。
可离子化氨基脂质有时在文献中称为阳离子脂质，但本文采用可离子化氨基脂质命名法来反映所讨论脂质仅在某些pH条件下为阳离子的。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含5-25mol％非阳离子脂质。例如，脂质纳米粒子可包含如下非阳离子脂质，所述非阳离子脂质包含5-20mol％、5-15mol％、5-10mol％、10-25mol％、10-20mol％、10-25mol％、15-25mol％、15-20mol％或20-25mol％非阳离子脂质。在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含5mol％、10mol％、15mol％、20mol％或25mol％非阳离子脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含25-55mol％固醇。例如，脂质纳米粒子可包含如下固醇，其包含25-50mol％、25-45mol％、25-40mol％、25-35mol％、25-30mol％、30-55mol％、30-50mol％、30-45mol％、30-40mol％、30-35mol％、35-55mol％、35-50mol％、35-45mol％、35-40mol％、40-55mol％、40-50mol％、40-45mol％、45-55mol％、45-50mol％或50-55mol％固醇。在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％或55mol％摩尔百分比的固醇。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含0.5-15mol％经PEG修饰的脂质。例如，脂质纳米粒子可包含0.5-10mol％、0.5-5mol％、1-15mol％、1-10mol％、1-5mol％、2-15mol％、2-10mol％、2-5mol％、5-15mol％、5-10mol％或10-15mol％摩尔百分比的经PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含0.5mol％、1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％或15mol％摩尔百分比的经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含20-60％摩尔比的可离子化氨基脂质、5-25％摩尔比的非阳离子脂质、25-55％摩尔比的固醇和0.5-15％摩尔比的经PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含49mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、10mol％DSPC和2.5mol％DMG-PEG。在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含48mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、11mol％DSPC和2.5mol％DMG-PEG。在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含47mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、11.5mol％DSPC和3mol％DMG-PEG。
在一些实施方案中，本公开的可离子化氨基脂质包含具有以下结构的化合物：
Figure BDA0004094056490000541
在一些实施方案中，本公开的可离子化氨基脂质包含具有以下结构的化合物：
Figure BDA0004094056490000542
在一些实施方案中，本公开的非阳离子脂质包含1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、l,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半丁二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其混合物。
在一些实施方案中，本公开的经PEG修饰的脂质包含经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油、经PEG修饰的二烷基甘油及其混合物。在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质是DMG-PEG、PEG-c-DOMG(也称为PEG-DOMG)、PEG-DSG和/或PEG-DPG。
在一些实施方案中，本公开的固醇包含胆固醇、粪固醇、麦固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、芸苔固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚及其混合物。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含化合物1的可离子化氨基脂质，其中非阳离子脂质是DSPC，结构脂质是胆固醇，并且PEG脂质是DMG-PEG。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含45-55摩尔％可离子化氨基脂质。例如，脂质纳米粒子可包含45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55摩尔％可离子化氨基脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含5-15摩尔％DSPC。例如，脂质纳米粒子可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15摩尔％DSPC。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含35-40摩尔％胆固醇。例如，脂质纳米粒子可包含35、36、37、38、39或40摩尔％胆固醇。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含1-2摩尔％DMG-PEG。例如，脂质纳米粒子可包含1、1.5或2摩尔％DMG-PEG。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含50摩尔％可离子化氨基脂质、10摩尔％DSPC、38.5摩尔％胆固醇和1.5摩尔％DMG-PEG。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约2:1至约30:1的N:P比率。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约6:1的N:P比率。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约3:1的N:P比率。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约10:1至约100:1的可离子化氨基脂质组分与RNA的wt/wt比率。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约20:1的可离子化氨基脂质组分与RNA的wt/wt比率。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约10:1的可离子化氨基脂质组分与RNA的wt/wt比率。
在一些实施方案中，本公开的LNP的平均直径为约50nm至约150nm。
在一些实施方案中，本公开的LNP的平均直径为约70nm至约120nm。
多价疫苗
如本文提供的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可包括编码相同或不同hCMV物种的两种或更多种抗原的mRNA或多种mRNA。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包括编码两种或更多种抗原的RNA或多种RNA。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的mRNA可编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多种抗原。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包含编码hCMV gH、hCMV gL、hCMV UL128、hCMV UL130、hCMV UL131A和hCMV gB的至少一种RNA。
在一些实施方案中，编码抗原的两种或更多种不同RNA(例如，mRNA)可配制于同一脂质纳米粒子中。在其他实施方案中，编码抗原的两种或更多种不同RNA可配制于单独脂质纳米粒子中(例如，每个RNA配制于单一脂质纳米粒子中)。然后可将脂质纳米粒子组合并以单一疫苗组合物(例如，包含编码多种抗原的多种RNA)形式施用或可分别施用。
药物制剂
本文提供用于预防或治疗例如人类和其他哺乳动物的hCMV的组合物(例如，药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可用作治疗剂或防治剂。其可用于医学中以预防和/或治疗感染性疾病。
在一些实施方案中，可向受试者(例如哺乳动物受试者，如人类受试者)施用含有本文所述mRNA的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)，并且RNA多核苷酸在体内翻译产生抗原性多肽(抗原)。
hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的“有效量”至少部分基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、RNA的物理特征(例如，长度、核苷酸组成和/或经修饰核苷的程度)、疫苗的其他组分和其他决定因素，例如受试者的年龄、体重、身高、性别和一般健康状况。典型地，有效量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)提供诱导或加强的免疫反应，所述免疫反应随受试者细胞中抗原产生而变化。在一些实施方案中，有效量的含有具有至少一种化学修饰的RNA多核苷酸的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)比含有编码相同抗原或肽抗原的相应未修饰多核苷酸的组合物有效。增加的抗原产生可通过以下展现：细胞转染(用RNA疫苗转染的细胞的百分比)增加、从多核苷酸进行的蛋白质翻译和/或表达增加、核酸降解减少(例如，通过从经修饰多核苷酸进行的蛋白质翻译的持续时间增加展现)或宿主细胞的抗原特异性免疫反应改变。
术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载体的组合，从而使得所述组合物尤其适用于体内或离体诊断或治疗用途。“药学上可接受的载体”在施用于受试者之后或之时不会引起不期望的生理作用。药物组合物中的载体在其与活性成分相容并且能够使其稳定的意义上也必须是“可接受的”。一种或多种增溶剂可用作用于递送活性剂的药物载体。药学上可接受的载体的实例包括但不限于生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂，以实现可用作剂型的组合物。其他载体的实例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和月桂基硫酸钠。Remington's Pharmaceutical Sciences中描述了其他合适的药物载体和稀释剂以及其使用的药物辅料。
在一些实施方案中，根据本公开的免疫组合物(例如，包括多核苷酸和其所编码多肽的RNA疫苗)可用于治疗或预防hCMV感染。hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可作为主动免疫方案的一部分防治性或治疗性地施用于健康个体或在潜伏期期间的感染早期或在症状出现后的活性感染期间施用。在一些实施方案中，向细胞、组织或受试者提供的本公开的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的量可为对免疫防治有效的量。
hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可与其他防治性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例，防治性或治疗性化合物可为佐剂或加强剂。如本文所用，当提及防治性组合物，例如疫苗时，术语“加强剂”是指额外施用防治性(疫苗)组合物。可在较早施用防治性组合物之后给与加强剂(或加强疫苗)。防治性组合物的初始施用与加强剂之间的施用时间可为但不限于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或超过99年。在示例性实施方案中，防治性组合物的初始施用与加强剂之间的施用时间可为但不限于1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年。在一些实施方案中，施用超过一次(例如，1、2、3或更多次)加强剂。在一些实施方案中，在初始施用之后施用两次加强剂(例如，一次在第2个月开始左右并且一次在第6个月开始左右)。
在一些实施方案中，类似于本领域中已知的灭活疫苗的施用，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可经肌肉内(例如，向三角肌施用)、鼻内或皮内施用。
hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可根据感染的流行率或未满足的医学需求的程度或水平而用于多种环境中。作为非限制性实例，RNA疫苗可用于治疗和/或预防多种感染性疾病。RNA疫苗具有优越特性，因为其产生的抗体滴度大得多、中和免疫性更好、产生更持久免疫反应和/或比市售疫苗更早产生反应。
本文提供了如下药物组合物，其包括任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)和/或复合物。
hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可单独或与一种或多种其他组分一起配制或施用。例如，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可包含其他组分，包括但不限于佐剂。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)不包括佐剂(其不含佐剂)。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包括佐剂。可使用适用于疫苗的任何已知佐剂。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)包括MF59佐剂系统(例如，如O'Hagan等人,Expert Rev Vaccines.2007年10月；6(5):699-710中所述，所述文献通过引用并入本文)。
hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制或施用。在一些实施方案中，疫苗组合物包含至少一种其他活性物质，例如治疗活性物质、防治活性物质或两者的组合。疫苗组合物可为无菌、无热原质或既无菌也无热原质的。医药剂例如疫苗组合物的配制和/或制造中的一般考虑因素可见于例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005(通过引用整体并入本文)中。
在一些实施方案中，向人类，例如人类患者或受试者施用hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指RNA疫苗或其中含有的多核苷酸，例如编码抗原的RNA多核苷酸(例如，mRNA多核苷酸)。
本文所述的疫苗组合物的制剂可通过药理学领域中已知或之后开发的任何方法制备。一般而言，此类制备方法包括如下步骤：使活性成分(例如，mRNA多核苷酸)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，然后需要和/或必要时，将产物分成、成形和/或包装成所需单次剂量或多次剂量单位。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量根据所治疗受试者的身份、体型和/或疾患并且另外根据待施用所述组合物的途径而变化。举例来说，组合物可包含0.1％至100％，例如0.5％至50％、1-30％、5-80％、至少80％(w/w)活性成分。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)使用一种或多种用于如下用途的赋形剂配制：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如，来自储槽制剂)；(4)改变生物分布(例如，靶向特定组织或细胞类型)；(5)增加体内所编码蛋白的翻译；和/或(6)改变体内所编码蛋白(抗原)的释放曲线。除传统赋形剂如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂外，赋形剂还可包括但不限于类脂质、脂质体、脂质纳米粒子、聚合物、脂质体复合物、核-壳纳米粒子、肽、蛋白质、用hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)转染的细胞(例如，用于移植至受试者中)、透明质酸酶、纳米粒子模拟物和其组合。
在一些实施方案中，将本文所述的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)配制于LNP制剂中并冻干。经冻干组合物可用适当溶液重构以供施用。在一些实施方案中，经冻干组合物用含有0.9％氯化钠的溶液重构。在一些实施方案中，然后将重构组合物用tris蔗糖稀释剂SD-0724稀释至用于在适当体积(例如，0.5mL)中递送适当剂量水平的浓度。
给药/施用
本文提供了用于预防和/或治疗人类和其他哺乳动物的hCMV感染的组合物(例如，药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。可使用hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)作为治疗剂或防治剂。在一些方面中，使用本公开的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)提供针对hCMV的防治性保护。在一些方面，使用本公开的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)治疗hCMV感染。在一些实施方案中，本公开的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)用于免疫效应细胞的引发，例如，以离体激活外周血单核细胞(PBMC)，然后将所述细胞注入(再注入)至受试者中。
受试者可为任何哺乳动物，包括非人类灵长类动物和人类受试者。典型地，受试者是人类受试者。
在一些实施方案中，向受试者(例如，哺乳动物受试者，例如人类受试者)施用有效量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)以诱导抗原特异性免疫反应。体内表达并翻译编码hCMV抗原的RNA以产生抗原，所述抗原然后刺激受试者的免疫反应。在施用hCMV mRNA疫苗之前，受试者可为hCMV血清阳性(例如，先前具有天然hCMV感染)或hCMV血清阴性(例如，先前不具有天然hCMV感染)。
可在施用本公开的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后实现针对hCMV的防治性保护。可施用疫苗一次、两次、三次、四次或更多次，但施用一次疫苗可能就足够(任选地接着施用一次或多次加强剂)。尽管不太需要，但可向受感染个体施用疫苗以实现治疗反应。可能需要相应地调节给药。
在本公开的方面中，提供一种在受试者中引发针对hCMV的免疫反应的方法。所述方法涉及向受试者施用本文所述的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)，从而在受试者中诱导特异于hCMV抗原(例如，hCMV gH、gL、UL128、UL130、UL131A和/或gB)的免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应是诱导针对hCMV抗原(例如，hCMV gH、gL、UL128、UL130、UL131A和/或gB)的中和抗体。在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者中的抗抗原抗体滴度相对于用防治有效剂量的针对hCMV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的抗抗原抗体滴度有所增加。“抗抗原抗体”是特异性结合于抗原的血清抗体。
在一些实施方案中，防治有效剂量是在临床上可接受的水平下预防感染病毒的有效剂量。在一些实施方案中，有效剂量是疫苗的包装插页中所列出的剂量。在一些实施方案中，如在施用后1-72小时(例如，1-72小时、1-60小时、1-45小时、1-30小时、1-15小时、15-72小时、15-60小时、15-45小时、15-30小时、30-72小时、30-60小时、30-45小时、45-72小时、45-60小时或60-72小时)在施用hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的受试者的血清中所测量，有效剂量足以产生可检测水平的hCMV抗原(例如，gH、gL、UL128、UL130、UL131A和/或gB多肽)。在一些实施方案中，如在施用后1-72小时(例如，1-72小时、1-60小时、1-45小时、1-30小时、1-15小时、15-72小时、15-60小时、15-45小时、15-30小时、30-72小时、30-60小时、30-45小时、45-72小时、45-60小时或60-72小时)在施用hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的受试者的血清中所测量，有效剂量足以产生由针对hCMV抗原(例如，gH、gL、UL128、UL130、UL131A和/或gB多肽)的中和抗体产生的中和滴度。
如本文所用的传统疫苗是指除本公开的mRNA疫苗外的疫苗。例如，传统疫苗包括但不限于活微生物疫苗、灭活微生物疫苗、亚单元疫苗、蛋白抗原疫苗、DNA疫苗、病毒样粒子(VLP)疫苗等。在示例性实施方案中，传统疫苗是已获得监管批准和/或由国家药物监管机构(例如，美国食品和药物管理局(FDA)或欧洲药品管理局(EMA))登记的疫苗。
在一些实施方案中，在疫苗接种后，相对于用防治有效剂量的针对hCMV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者或未进行疫苗接种的受试者中的抗抗原抗体滴度，所述受试者中的抗抗原抗体滴度增加1log至10log。在一些实施方案中，在疫苗接种后，相对于用防治有效剂量的针对hCMV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者或未进行疫苗接种的受试者中的抗抗原抗体滴度，所述受试者中的抗抗原抗体滴度增加1log、2log、3log、4log、5log或10log。
在本公开的其他方面，提供了一种在受试者中引发针对hCMV的免疫反应的方法。所述方法涉及向受试者施用本文所述的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)，从而在受试者中诱导特异于hCMV抗原的免疫反应，其中所述受试者中的免疫反应等于用相对于所述RNA疫苗2倍至100倍剂量水平的针对hCMV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于用相对于所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)两倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于用相对于所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)三倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于用相对于所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)4倍、5倍、10倍、50倍或100倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于用相对于所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)10倍至1000倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于用相对于所述hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)100倍至1000倍剂量水平的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在其他实施方案中，通过确定受试者中的[蛋白质]抗体滴度来评定免疫反应。在其他实施方案中，测试来自免疫受试者的血清或抗体中和病毒摄取或减少人类B淋巴细胞的hCMV转化的能力。在其他实施方案中，使用本领域公认的技术测量促进强T细胞反应的能力。
本公开的其他方面提供通过如下方式在受试者中引发针对hCMV的免疫反应的方法：向受试者施用包含具有编码至少一种hCMV抗原的开放阅读框的至少一种RNA多核苷酸的hCMV mRNA疫苗，从而在受试者中诱导特异于hCMV抗原的免疫反应，其中所述受试者中的免疫反应相对于用防治有效剂量的针对hCMV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中诱导的免疫反应早2天至10周被诱导。在一些实施方案中，在用相对于所述RNA疫苗2倍至100倍剂量水平的防治有效剂量的传统疫苗进行免疫接种的受试者中诱导受试者的免疫反应。
在一些实施方案中，所述受试者中的免疫反应相对于用防治有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者中诱导的免疫反应早2天、3天、1周、2周、3周、5周或10周被诱导。
hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)可通过产生治疗有效结果的任何途径施用。这些包括但不限于皮内、肌肉内、鼻内和/或皮下施用。本公开提供了包括向有需要的受试者施用RNA疫苗的方法。所需精确量根据如下因素在不同受试者之间变化：受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用方式、其活动方式等。hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)典型地以剂量单位形式配制以易于施用和获得给药均一性。然而，应理解，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的总日用量可由主治医师在合理医学判断范围内确定。对于任何特定患者的特定治疗有效、防治有效或适当成像剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和所述病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗持续时间；与所用特定化合物组合或同时使用的药物；和医学领域中众所周知的类似因素。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)以约1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、17μg、18μg、19μg、20μg、21μg、22μg、23μg、24μg、25μg、26μg、27μg、28μg、29μg、30μg、31μg、32μg、33μg、34μg、35μg、36μg、37μg、38μg、39μg、40μg、41μg、42μg、43μg、44μg、45μg、46μg、47μg、48μg、49μg、50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、60μg、61μg、62μg、63μg、64μg、65μg、66μg、67μg、68μg、69μg、70μg、71μg、72μg、73μg、74μg、75μg、76μg、77μg、78μg、79μg、80μg、81μg、82μg、83μg、84μg、85μg、86μg、87μg、88μg、89μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg或500μg(包括其间的所有值)的剂量施用。
如本文所用，本公开的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的剂量是指脂质纳米粒子制剂中的mRNA总微克数。如本文所用，“mRNA总微克数”是指单次施用的总剂量或标称剂量，其中认为RNA杂质、降解的mRNA和其他无活性mRNA仍计入总量。在本公开中提及剂量时不包括脂质组分的重量。
在一些实施方案中，以约50-150μg的剂量施用hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)。在一些实施方案中，仅施用一次剂量，而在其他实施方案中，施用多次剂量(例如，一次、两次或三次剂量)。在施用多次剂量的实施方案中，第一剂量与后续剂量之间的剂量可相同或不同。在一些实施方案中，如本文所提供，hCMV免疫原性组合物(例如，包括编码gH/gL/UL128/UL130/UL131A/gB的mRNA的mRNA疫苗)的有效量可低至150μg，其例如以单次剂量施用。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为50-150μg的单次剂量。例如，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量可为50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、60μg、61μg、62μg、63μg、64μg、65μg、66μg、67μg、68μg、69μg、70μg、71μg、72μg、73μg、74μg、75μg、76μg、77μg、78μg、79μg、80μg、81μg、82μg、83μg、84μg、85μg、86μg、87μg、88μg、89μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg或150μg(包括其间所有值)的单次剂量。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为50μg的单次剂量。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为100μg的单次剂量。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为150μg的单次剂量。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为50μg、100μg或150μg。在一些实施方案中，有效剂量以初次免疫后接相同有效剂量的单次加强的形式施用。在一些实施方案中，有效剂量以初次免疫后接相同有效剂量的两次连续加强剂免疫的形式施用。在一些实施方案中，有效剂量为50μg hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)，并且以50μg初次免疫后接50μg的两次连续加强剂免疫的形式施用。在一些实施方案中，有效剂量为100μg hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)，并且以100μg初次免疫后接100μg的两次连续加强剂免疫的形式施用。在一些实施方案中，有效剂量为150μg hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)，并且以150μg初次免疫后接150μg的两次连续加强剂免疫的形式施用。在一些实施方案中，加强剂免疫应至少相隔两周。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为50-150μg的两次剂量。例如，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量可为50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、60μg、61μg、62μg、63μg、64μg、65μg、66μg、67μg、68μg、69μg、70μg、71μg、72μg、73μg、74μg、75μg、76μg、77μg、78μg、79μg、80μg、81μg、82μg、83μg、84μg、85μg、86μg、87μg、88μg、89μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg或150μg(包括其间所有值)的两次剂量。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为50μg的两次剂量。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为100μg的两次剂量。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为150μg的两次剂量。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为50-150μg的三次剂量。例如，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量可为50μg、51μg、52μg、53μg、54μg、55μg、56μg、57μg、58μg、59μg、60μg、61μg、62μg、63μg、64μg、65μg、66μg、67μg、68μg、69μg、70μg、71μg、72μg、73μg、74μg、75μg、76μg、77μg、78μg、79μg、80μg、81μg、82μg、83μg、84μg、85μg、86μg、87μg、88μg、89μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg或150μg(包括其间所有值)的三次剂量。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为50μg的三次剂量。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为100μg的三次剂量。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为150μg的三次剂量。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为50μg-150μg的超过3次(例如，4、5或更多次)剂量。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为50μg的超过3次(例如，4、5或更多次)剂量。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为100μg的超过3次(例如，4、5或更多次)剂量。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为150μg的超过3次(例如，4、5或更多次)剂量。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量是指组合物中完整mRNA的量。如本文所用，“完整mRNA”是指能够在受试者中产生hCMV抗原和/或诱导针对抗原的免疫反应的完整mRNA转录本。hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)中完整mRNA的量与长度、降解速率和产生免疫原性组合物的时间长度有关。当根据临床结果确定有效量时，可根据hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)中存在的总mRNA(即，总剂量)或根据hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)中存在的完整mRNA提及所述剂量。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为5-35pmol(例如，5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、15-35、15-30、15-25、15-20、20-35、20-30、20-25、25-35、25-30或30-35pmol)单次剂量的五聚体组分和4-50pmol(例如，4-50、10-50、10-40、10-30、10-20、20-50、20-40、20-30、30-50、30-40或40-50pmol)单次剂量的gB mRNA。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为10-30pmol(例如，10-30、10-20或20-30pmol)单次剂量的五聚体组分和15-45pmol(例如，15-45、15-30或30-45pmol)单次剂量的gB mRNA。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35pmol(包括其间所有值)单次剂量的五聚体组分和10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50pmol(包括其间所有值)单次剂量的gB mRNA。
在某些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量或剂量不需要每个组分的皮摩尔数相等。例如，可能需要较大皮摩尔剂量的编码含有例如gH和gB的组分的完整跨膜域的mRNA，以确保这些组分不会变成限制性的。另外，在一些实施方案中，因稳定性或其他生物化学或生物物理要求，6种mRNA中每一者的皮摩尔剂量可个别确定。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为5-35pmol(例如，5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、15-35、15-30、15-25、15-20、20-35、20-30、20-25、25-35、25-30或30-35pmol)两次剂量的五聚体组分和4-50pmol(例如，4-50、10-50、10-40、10-30、10-20、20-50、20-40、20-30、30-50、30-40或40-50pmol)两次剂量的gB mRNA。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为10-30pmol(例如，10-30、10-20或20-30pmol)两次剂量的五聚体组分和15-45pmol(例如，15-45、15-30或30-45pmol)两次剂量的完整gB mRNA。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35pmol(包括其间所有值)两次剂量的五聚体组分和10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50pmol(包括其间所有值)两次剂量的gB mRNA。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为5-35pmol(例如，5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、15-35、15-30、15-25、15-20、20-35、20-30、20-25、25-35、25-30或30-35pmol)三次剂量的五聚体组分和4-50pmol(例如，4-50、10-50、10-40、10-30、10-20、20-50、20-40、20-30、30-50、30-40或40-50pmol)三次剂量的完整gB mRNA。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为10-30pmol(例如，10-30、10-20或20-30pmol)三次剂量的五聚体组分和15-45pmol(例如，15-45、15-30或30-45pmol)三次剂量的完整gB mRNA。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35pmol(包括其间所有值)三次剂量的五聚体组分和10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50pmol(包括其间所有值)三次剂量的完整gB mRNA。
在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为5-35pmol(例如，5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、15-35、15-30、15-25、15-20、20-35、20-30、20-25、25-35、25-30或30-35pmol)超过三次(例如，4、5或更多次)剂量的五聚体组分和4-50pmol(例如，4-50、10-50、10-40、10-30、10-20、20-50、20-40、20-30、30-50、30-40或40-50pmol)超过三次(例如，4、5或更多次)剂量的完整gB mRNA。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为10-30pmol(例如，10-30、10-20或20-30pmol)超过三次(例如，4、5或更多次)剂量的五聚体组分和15-45pmol(例如，15-45、15-30或30-45pmol)超过三次(例如，4、5或更多次)剂量的完整gB mRNA。在一些实施方案中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的有效量为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35pmol(包括其间所有值)超过三次(例如，4、5或更多次)剂量的五聚体组分和10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50pmol(包括其间所有值)超过三次(例如，4、5或更多次)剂量的完整gB mRNA。
在一些实施方案中，在本文所述的某些完整mRNA剂量中，hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)含有gB:gH:gL:UL128:UL130:UL131A摩尔比为2:2:1:1:1:1的mRNA。
在一些实施方案中，向受试者施用(本文所述任何剂量中)一次、两次、三次或超过三次剂量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)。在一些实施方案中，向受试者施用(本文所述任何剂量中)一次、两次或三次剂量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)。在一些实施方案中，在第1天、约第2个月开始时(例如，第29天)和约第6个月开始时(例如，第169天)施用所述剂量。
在一些实施方案中，在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天、第23天、第24天、第25天、第26天、第27天、第28天、第29天、第30天、第31天、第32天、第33天、第34天、第35天、第36天、第37天、第38天、第39天、第40天、第41天、第42天、第43天、第44天、第45天、第46天、第47天、第48天、第49天、第50天、第51天、第52天、第53天、第54天、第55天、第56天、第57天、第58天、第59天、第60天、第61天、第62天、第63天、第64天、第65天、第66天、第67天、第68天、第69天、第70天、第71天、第72天、第73天、第74天、第75天、第76天、第77天、第78天、第79天、第80天、第81天、第82天、第83天、第84天、第85天、第86天、第87天、第88天、第89天、第90天、第91天、第92天、第93天、第94天、第95天、第96天、第97天、第98天、第99天、第100天、第101天、第102天、第103天、第104天、第105天、第106天、第107天、第108天、第109天、第110天、第111天、第112天、第113天、第114天、第115天、第116天、第117天、第118天、第119天、第120天、第121天、第122天、第123天、第124天、第125天、第126天、第127天、第128天、第129天、第130天、第131天、第132天、第133天、第134天、第135天、第136天、第137天、第138天、第139天、第140天、第141天、第142天、第143天、第144天、第145天、第146天、第147天、第148天、第149天、第150天、第151天、第152天、第153天、第154天、第155天、第156天、第157天、第158天、第159天、第160天、第161天、第162天、第163天、第164天、第165天、第166天、第167天、第168天、第169天、第170天、第171天、第172天、第173天、第174天、第175天、第176天、第177天、第178天、第179天、第180天、第181天、第182天、第183天、第184天、第185天、第186天、第187天、第188天、第189天、第190天、第191天、第192天、第193天、第194天、第195天、第196天、第197天、第198天、第199天向受试者施用一次剂量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)。在一些实施方案中，在第199天后向受试者施用一次剂量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)。
可将本文所述的hCMV mRNA疫苗配制成本文所述或本领域中已知的剂型，例如鼻内、气管内或注射剂(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌肉内、皮内、心内、腹膜内和皮下)。
疫苗功效
本公开的一些方面提供hCMV mRNA疫苗的制剂，其中以有效量配制所述hCMV mRNA疫苗，以在受试者中产生抗原特异性免疫反应(例如，产生特异于抗hCMV抗原的抗体)。“有效量”是hCMV mRNA疫苗有效产生抗原特异性免疫反应的剂量。本文也提供了在受试者中诱导抗原特异性免疫反应的方法。
如本文所用，对本公开的疫苗或LNP的免疫反应是受试者中对疫苗中存在的(一种或多种)hCMV蛋白的体液和/或细胞免疫反应的发展。出于本公开的目的，“体液”免疫反应是指由包括例如分泌型(IgA)或IgG分子的抗体分子介导的免疫反应，而“细胞”免疫反应是由T-淋巴细胞(例如，CD4+辅助细胞和/或CD8+T细胞(例如，CTL)和/或其他白细胞介导的免疫反应。细胞免疫的一个重要方面涉及溶细胞性T细胞(CTL)的抗原特异性反应。CTL对与主要组织相容性复合物(MHC)编码的蛋白质相关并且在细胞表面表达的肽抗原具有特异性。CTL有助于诱导并促进细胞内微生物的破坏或感染此类微生物的细胞的裂解。细胞免疫的另一方面涉及辅助T细胞的抗原特异性反应。辅助T细胞用于帮助刺激所述功能，并且将非特异性效应细胞的活性集中于在其表面呈现与MHC分子相关的肽抗原的细胞。细胞免疫反应也引起细胞因子、趋化因子和由活化T细胞和/或其他白细胞(包括来源于CD4+和CD8+T细胞的白细胞)产生的其他此类分子的产生。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应通过测量施用本文所提供的hCMV mRNA疫苗的受试者中的抗hCMV抗原抗体滴度表征。抗体滴度是受试者内抗体量的量度，例如特异于特定抗原(例如，抗hCMV抗原)或抗原的表位的抗体。抗体滴度典型地表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种用于确定抗体滴度的常见测定。
在一些实施方案中，使用抗体滴度评定受试者是否已感染或确定是否需要免疫。在一些实施方案中，使用抗体滴度确定自身免疫反应的强度、确定是否需要加强剂免疫、确定先前疫苗是否有效和识别任何最近或先前感染。根据本公开，可使用抗体滴度确定hCMVmRNA疫苗在受试者中诱导的免疫反应的强度。
在一些实施方案中，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照增加至少1log。例如，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照可增加至少1.5、至少2、至少2.5、至少3log、至少4log或至少5log或更多。在一些实施方案中，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照增加1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5log。在一些实施方案中，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照增加1-5log。例如，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照可增加1-1.5、1-2、1-2.5、1-3、1-4、1-5、1.5-2、1.5-2.5、1.5-3、1.5-4、1.5-5、2-2.5、2-3、2-4、2-5、2.5-3、2.5-4、2.5-5、3-4、3-5或4-5log。
在一些实施方案中，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照可增加至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施方案中，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照增加2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照增加2-10倍。例如，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照可增加2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10倍。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应测量为针对hCMV的血清中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT)比，称为几何平均比(GMR)。几何平均滴度(GMT)是一组受试者的平均抗体滴度，其通过将所有值相乘并且取数值的第n次方根来计算，其中n是具有可用数据的受试者的数量。
在一些实施方案中，施用有效量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)引发针对hCMV的血清中和抗体滴度。在一些实施方案中，施用单次剂量(例如，本文所述的任何剂量)或多次剂量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)引发针对hCMV的血清中和抗体滴度。
在一些实施方案中，本文所述的有效量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)足以在免疫后第1天、第29天、第56天、第84天、第168天或第196天产生针对上皮细胞hCMV感染的血清中和抗CMV抗体的几何平均滴度(GMT)，和基线后/基线滴度的相关GMR。在一些实施方案中，本文所述的有效量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)足以在免疫后第1天、第29天、第56天、第84天、第168天或第196天产生针对成纤维细胞hCMV感染的血清中和抗体滴度，和基线后/基线滴度的GMR。
在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的受试者中，针对hCMV的血清中和抗体的GMT相对于基线增加至少2倍(例如，至少2倍、至少3倍、至少4倍)。在一些实施方案中，在施用单次剂量(例如，≥50μg，例如50μg、100μg或150μg的单次剂量)的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后，受试者中针对hCMV的血清中和抗体的GMT相对于基线增加至少2倍至10倍。在一些实施方案中，在施用两次剂量(例如，≥50μg，例如50μg、100μg或150μg的两次剂量)的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后，受试者中针对hCMV的血清中和抗体的GMT相对于基线增加至少2倍至10倍。在一些实施方案中，在施用三次剂量(例如，≥50μg，例如50μg、100μg或150μg的三次剂量)的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后，受试者中针对hCMV的血清中和抗体的GMT相对于基线增加至少2倍至10倍。
在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，针对上皮细胞感染的中和抗体(nAb)GMT相对于基线GMT增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍或51倍。在一些实施方案中，时间点在施用两次剂量的免疫原性组合物之后。在一些实施方案中，时间点在施用三次剂量的免疫原性组合物之后。
在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，针对上皮细胞感染的nAb相对于基线增加≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥11倍、≥12倍或≥13倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在一些实施方案中，施用有效量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)引发针对hCMV gB蛋白的血清中和抗体滴度。在一些实施方案中，施用单次剂量(例如，本文所述的任何剂量)或多次剂量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)引发针对hCMV gB蛋白的血清中和抗体滴度。
在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的受试者中，针对hCMV gB蛋白的血清中和抗体的GMT相对于基线增加至少2倍(例如，至少2倍、至少3倍、至少4倍)。在一些实施方案中，在施用单次剂量(例如，≥50μg，例如50μg、100μg或150μg的单次剂量)的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后，受试者中针对hCMV gB蛋白的血清中和抗体的GMT相对于基线增加至少2倍至10倍。在一些实施方案中，在施用两次剂量(例如，≥50μg，例如50μg、100μg或150μg的两次剂量)的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后，受试者中针对hCMV gB蛋白的血清中和抗体的GMT相对于基线增加至少2倍至10倍。在一些实施方案中，在施用三次剂量(例如，≥50μg，例如50μg、100μg或150μg的三次剂量)的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后，受试者中针对hCMV gB蛋白的血清中和抗体的GMT相对于基线增加至少2倍至10倍。
在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，针对成纤维细胞感染的nAb相对于基线增加≥2倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在一些实施方案中，施用有效量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)引发针对hCMV的抗原特异性T细胞反应。在一些实施方案中，施用单次剂量(例如，本文所述的任何剂量)或多次剂量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)引发针对hCMV的抗原特异性T细胞反应。在一些实施方案中，施用有效量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)引发针对hCMV gB蛋白的抗原特异性T细胞反应。在一些实施方案中，施用单次剂量(例如，本文所述的任何剂量)或多次剂量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)引发针对hCMV gB蛋白的抗原特异性T细胞反应。在一些实施方案中，施用有效量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)引发针对hCMV五聚体的抗原特异性T细胞反应。在一些实施方案中，施用单次剂量(例如，本文所述的任何剂量)或多次剂量的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)引发针对hCMV五聚体的抗原特异性T细胞反应。在一些实施方案中，T细胞反应(例如，针对hCMV、hCMVgB蛋白或hCMV五聚体)包含干扰素-γ(IFN-γ)分泌。
在一些实施方案中，对照/基线是未施用hCMV mRNA疫苗的受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度。在一些实施方案中，对照/基线是在患有天然hCMV感染的受试者，即在施用hCMV mRNA疫苗之前为hCMV血清阳性的受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度。在一些实施方案中，对照/基线是在施用hCMV mRNA疫苗之前为hCMV血清阴性的受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度。在一些实施方案中，针对hCMV的血清中和抗体的GMT以剂量依赖方式增加。
在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的受试者中，针对hCMV五聚体的结合抗体反应的GMT(抗五聚体抗体滴度)相对于基线增加至少2倍(例如，至少2倍、至少3倍、至少4倍)。在一些实施方案中，在施用单次剂量(例如，≥50μg，例如50μg、100μg或150μg的单次剂量)的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后，受试者中针对hCMV五聚体的结合抗体反应的GMT相对于基线增加至少2倍至10倍。在一些实施方案中，在施用两次剂量(例如，≥50μg，例如50μg、100μg或150μg的两次剂量)的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后，受试者中针对hCMV五聚体的结合抗体反应的GMT相对于基线增加至少2倍至10倍。在一些实施方案中，在施用三次剂量(例如，≥50μg，例如50μg、100μg或150μg的三次剂量)的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后，受试者中针对hCMV的结合抗体反应的GMT相对于基线增加至少2倍至10倍。
在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，抗五聚体结合抗体(bAb)GMT相对于基线GMT增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方案中，时间点在施用两次剂量的免疫原性组合物之后。在一些实施方案中，时间点在施用三次剂量的免疫原性组合物之后。
在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，抗五聚体结合抗体(bAb)相对于基线增加≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)的受试者中，针对gB的结合抗体反应的GMT相对于基线增加至少2倍(例如，至少2倍、至少3倍、至少4倍)。在一些实施方案中，在施用单次剂量(例如，≥50μg，例如50μg、100μg或150μg的单次剂量)的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后，受试者中针对抗gB的结合抗体反应的GMT相对于基线增加至少2倍至10倍。在一些实施方案中，在施用两次剂量(例如，≥50μg，例如50μg、100μg或150μg的两次剂量)的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后，受试者中针对抗gB的结合抗体反应的GMT相对于基线增加至少2倍至10倍。在一些实施方案中，在施用三次剂量(例如，≥50μg，例如50μg、100μg或150μg的三次剂量)的hCMV免疫原性组合物(例如，mRNA疫苗)后，受试者中针对抗gB的结合抗体反应的GMT相对于基线增加至少2倍至10倍。
在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，抗gB结合抗体(Ab)GMT相对于基线GMT增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方案中，时间点在施用单次剂量的免疫原性组合物之后。在一些实施方案中，时间点在施用两次剂量的免疫原性组合物之后。在一些实施方案中，时间点在施用三次剂量的免疫原性组合物之后。在一些实施方案中，在施用一次剂量后约10天至2周内GMT反应达最大值。
在一些实施方案中，在施用hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，抗gB结合抗体(Ab)相对于基线增加≥2倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在一些实施方案中，在鼠类模型中测量hCMV mRNA疫苗有效的能力。例如，可向鼠类模型施用hCMV mRNA疫苗，并且对所述鼠类模型的中和抗体滴度的诱导进行测定。也可使用病毒攻击研究来评定本公开的疫苗的功效。例如，可向用hCMV攻击的鼠类模型施用hCMVmRNA疫苗，并且对所述鼠类模型的存活和/或免疫反应(例如，中和抗体反应、T细胞反应(例如，细胞因子反应))进行测定。
在一些实施方案中，hCMV mRNA疫苗的有效量是与重组hCMV蛋白疫苗的护理标准剂量相比降低的剂量。如本文所提供的“护理标准”是指医学或心理学治疗指南并且可为一般或特定的。“护理标准”基于科学证据和参与给定疾患治疗的医学专业人员之间的合作指定适当治疗。其为医师/临床医生针对某种类型的患者、疾病或临床情况应遵循的诊断和治疗方法。本文所提供的“护理标准剂量”是指医师/临床医生或其他医学专业人员在遵循治疗或预防hCMV或hCMV相关疾患的护理标准指南的同时向受试者施用以治疗或预防hCMV或hCMV相关疾患的重组或纯化hCMV蛋白疫苗或者活减毒或灭活hCMV mRNA疫苗或者hCMV VLP疫苗的剂量。
在一些实施方案中，施用有效量的hCMV mRNA疫苗的受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度等于施用护理标准剂量的重组或纯化hCMV蛋白疫苗或者活减毒或灭活hCMV mRNA疫苗或者hCMV VLP疫苗的对照受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度。
可使用标准分析(参见例如Weinberg等人,J Infect Dis.2010年6月1日；201(11):1607-10)来评定疫苗功效。例如，疫苗功效可通过双盲、随机化临床对照试验来测量。疫苗功效可表示为未接种疫苗(ARU)与接种疫苗(ARV)研究组之间的疾病发作率(AR)的成比例降低，并且可使用下式从接种疫苗组之间的疾病相对风险(RR)计算：
功效＝(ARU–ARV)/ARU x 100；和
功效＝(1-RR)x 100。
同样，可使用标准分析(参见例如Weinberg等人,J Infect Dis.2010年6月1日；201(11):1607-10)来评定疫苗有效性。疫苗有效性是对疫苗(其可能已经证实具有高疫苗功效)如何减少群体中的疾病的评定。这种量度可评定疫苗接种程序在自然场所条件下而非受控临床试验中的益处与不利影响的净平衡，而不仅仅疫苗本身。疫苗有效性与疫苗功效(效力)成比例，但也受群体中靶标组的免疫情况以及影响住院、门诊访视或费用的“真实世界”结果的其他非疫苗相关因素的影响。例如，可使用回顾性病例对照分析，其中比较一组感染病例和适当对照之间的疫苗接种率。疫苗有效性可表示为比率差异，使用尽管接种疫苗但仍产生感染的优势比(OR)：
有效性＝(1-OR)x 100。
在一些实施方案中，相对于未接种疫苗的对照受试者，hCMV mRNA疫苗的功效为至少60％。例如，相对于未接种疫苗的对照受试者，hCMV mRNA疫苗的功效可为至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少98％或100％。
消除性免疫。消除性免疫是指预防病原体有效感染宿主的独特免疫状态。在一些实施方案中，有效量的本公开的hCMV mRNA疫苗足以在受试者中提供消除性免疫至少1年。例如，有效量的本公开的hCMV mRNA疫苗可足以在受试者中提供消除性免疫至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。在一些实施方案中，有效量的本公开的hCMV mRNA疫苗足以以比对照低至少5倍的剂量在受试者中提供消除性免疫。例如，有效量可足以以比对照低至少10倍、15倍或20倍的剂量在受试者中提供消除性免疫。
可检测抗原。在一些实施方案中，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量，有效量的本公开的hCMV mRNA疫苗足以产生可检测水平的hCMV抗原。
滴度。抗体滴度是受试者内抗体量的量度，例如特异于特定抗原(例如，抗hCMV抗原)的抗体。抗体滴度典型地表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种用于确定抗体滴度的常见测定。
在一些实施方案中，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量，有效量的本公开的hCMV mRNA疫苗足以产生1,000-10,000中和抗体滴度，所述中和抗体滴度由针对hCMV抗原的中和抗体产生。在一些实施方案中，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量，有效量足以产生1,000-5,000中和抗体滴度，所述中和抗体滴度由针对hCMV抗原的中和抗体产生。在一些实施方案中，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量，有效量足以产生5,000-10,000中和抗体滴度，所述中和抗体滴度由针对hCMV抗原的中和抗体产生。
在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少100NT50。例如，中和抗体滴度可为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000NT50。在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少10,000NT50。
在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少100个中和单位/毫升(NU/mL)。例如，中和抗体滴度可为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000NU/mL。在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少10,000NU/mL。
在一些实施方案中，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照增加至少1log。例如，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度可相对于对照增加至少2、3、4、5、6、7、8、9或10log。
在一些实施方案中，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，受试者中产生的抗hCMV抗原抗体滴度相对于对照增加至少3、4、5、6、7、8、9或10倍。
在一些实施方案中，通常使用几何平均值来描述成比例的增长，几何平均值是n个数字乘积的n次方根。在一些实施方案中，使用几何平均值表征受试者中产生的抗体滴度。
实施例
为了更充分理解本申请中描述的发明，阐述如下实施例。提供本申请中描述的实施例以说明本申请中提供的系统和方法，并且所述实施例不应以任何方式解释为限制其范围。
实施例1：选择hCMV mRNA免疫原性组合物中mRNA构建体的最佳比率使得可在整个保质期内发挥最大效力
在I期临床试验研究中，发现以相等质量比含有编码hCMV五聚体的所有组分(gH、gL、UL128、UL130和UL131A)和gB(图1A和图1B)的mRNA的hCMV mRNA疫苗可有效诱导针对hCMV的中和抗体。然而，由于个别mRNA构建体的分子量不同，使用相等质量比会导致个别mRNA组分的摩尔剂量极其不同，其中一些过量存在，而其他则表现不足。特别是，在相等质量比制剂中，对应于gB和gH的最大mRNA构建体以摩尔计表现不足。
假设以匹配摩尔化学计量的比率提供个别mRNA构建体可使得给予患者的单位质量mRNA的蛋白质表达最大。也假设对应于gB和gH的较大mRNA构建体可比较小mRNA构建体降解得快，并且这种降解可限制基于mRNA的疫苗的整体稳定性。因此，研究了基于储存期间mRNA降解的预测相对速率进一步调节mRNA组分的摩尔比是否可在整个药品保质期内实现最佳功能性能。
研究了包含等摩尔量的UL128、gL、UL130和UL131A以及2倍摩尔量的gB和gH的制剂，并且在体外和体内研究中与之前使用的相等质量比进行比较。令人惊讶地发现，对于给定总剂量，基于hCMV mRNA疫苗组分的建议摩尔比配制mRNA组分使较大糖蛋白抗原(gB和五聚体)两者的蛋白表达增加。在体外细胞培养实验中测量到gB和五聚体表达增加，并且当施用于小鼠时，与使用相等质量比相比，也引起抗gB和抗五聚体IgG两者的抗体反应改进。
不希望受任何理论束缚，包含相等摩尔量的gL、UL128、UL130和UL131A以及2倍摩尔量的gB和gH的制剂会补偿五聚体蛋白质化学计量和mRNA降解的差异速率。参见图2A。除了基于摩尔计算个别组分的剂量外，通过相对于1倍等摩尔量的编码与gH复合的蛋白质如gL、UL128、UL130和UL131A的mRNA的量，同时添加2倍摩尔量的gH和gB获得进一步改进。以这种方式配制的疫苗使这些高分子量mRNA组分相对于其他较低分子量mRNA组分的摩尔剂量升高。将这种设计与基于相等质量比配制mRNA组分时对比(图2B)。在图3中，两个单独实施例中的体外表达数据显示，与相等质量制剂相比，基于摩尔化学计量并具有2倍gH的制剂的五聚体表达增加。通过增加的Emax观察到增加的表达。令人惊讶地，与基于相等质量的hCMVmRNA免疫原性组合物相比，基于上述摩尔比的hCMV mRNA免疫原性组合物在使用较低总剂量时在小鼠中实现相等或略高的抗体反应(图4)。
发现当每个mRNA构建体通过将其摩尔比增加至2倍而其他mRNA组分以相等摩尔比存在以产生过量添加的构建体来测试时，过量gH对增加小鼠中抗五聚体IgG反应的影响最大(图5)。显著地，发现当基于本文所述的摩尔比配制mRNA组分时，相对于基于相等质量比配制，需要较低总剂量的hCMV mRNA免疫原性组合物在小鼠中展现增加的抗gB和抗五聚体抗体反应(图6A至图6D)。
基于计算的理论灭活速率，发现本文所述hCMV mRNA免疫原性组合物中建议摩尔比的mRNA组分足以补偿较长mRNA构建体的降解，并且维持过量gH和gB至少36个月，这对应于含有这些组分的药品的预测保质期(图7)。过量较长gH和gB构建体补偿随时间变化的灭活，同时维持最大有效性的产物(图7)。
本文所述hCMV mRNA疫苗中建议摩尔比的mRNA使疫苗的整个保质期内的效力最大。特定而言，基于等摩尔浓度的较小mRNA(gL、UL130、UL128和UL131)与过量较长mRNA构建体(gH和gB)的组合物利用靶标蛋白复合物的结构化学计量，相对于相等质量制剂增加gB含量，并且补偿已知的mRNA灭活机制。这种方法也提供使用较少mRNA进行大剂量定义的可能性，从而可提供较低商品成本和较佳耐受性。此外，由于gL、UL128、UL130和UL131均与膜锚定gH结合并组装成称为五聚体的较大糖蛋白复合物，因此与五聚体的其他较小成员相比，宜使gH永不限制供应。由于gH形成五聚体的基础结构，并且其他较小蛋白质需要组装于其上以形成成熟五聚体复合物，如果基础组分供应不足，则成熟五聚体也将供应不足。
实施例2：II期选择临床试验
I期临床试验使用包含相等质量比的五聚体组分和gB的hCMV mRNA疫苗进行。I期临床试验数据指示，针对上皮细胞感染的中和抗体滴度(来源于成功五聚体表达和免疫反应)通常超过针对成纤维细胞感染的中和抗体滴度(来源于成功gB表达和免疫反应)。因此，在评价I期数据和来自自然感染的血清阳性患者的数据以设计用于后续临床试验的剂量时，使完整gB中和免疫反应达最大是一个驱动因素。将hCMV I期临床试验数据用以摩尔计的X轴绘制，以使得可在I期(相等质量)数据与建议的II期(基于摩尔的)数据(尽管I期和II期疫苗制剂中使用的mRNA组分浓度不同，但将所述数据绘制在一个连续x轴上)之间进行比较。在同一连续x轴上绘制I期和II期数据可获得包括性剂量反应曲线，所述曲线可用于后续临床试验的剂量选择。图8A和图8B的x轴分别描绘完整五聚体mRNA的皮摩尔数和完整gBmRNA的皮摩尔数。基于总剂量(μg)、药品中mRNA的比率、药品的实际纯度和每种mRNA的分子量对每个I期剂量计算这些值(图8A至图8B)。
图8A和图8B中提供的图显示针对成纤维细胞(gB)和上皮细胞(五聚体)感染的中和抗体滴度(nAb)。在两个图中，血清阳性基准水平用红色水平线表示。gB和五聚体的血清阳性基准水平是特异于这些抗原并且在先前感染hCMV并康复的未接种疫苗的患者中发现的抗体滴度。注意到基准血清阳性五聚体滴度远高于基准gB滴度。将来自I期剂量递增阶段A和B以及I期剂量选择阶段B(30、90、180μg)的数据以个别受试者形式绘制。将来自I期的数据，即300μg剂量组C剂量后数据点1(PD1)和剂量后数据点2(PD2)数据以GMT+-95％置信区间形式绘制。在X轴下方的文本框中，箭头指示建议的II期(P202)剂量，所述剂量使用摩尔数计算，但表示为LNP中总mRNA的重量(50、100、150μg)。
在图8A中，基于指示建议剂量的II期(P202)数据预期为9-29皮摩尔完整五聚体mRNA，所述数据对应于I期试验中先前显示的剂量反应曲线中在2次或3次剂量后引发通常处于或高于血清阳性基准的中和抗体的部分。I期比率在3次剂量后容易地实现5皮摩尔的血清阳性基准(参见3次剂量后，图8A)，甚至许多受试者在2次剂量后(参见PD 2，图8A和图8B)达到12皮摩尔的基准血清阳性水平。由于对于上皮细胞感染，针对五聚体诱导的中和抗体反应很强，因此不必设计II期制剂以使其剂量水平延伸至更高皮摩尔剂量的五聚体mRNA组分。实际上，II期制剂将以略低的每剂量总质量实现9-29皮摩尔的完整五聚体mRNA组分。然而，基于摩尔的剂量设计使剂量选择能够达到这些基准水平并且具有至少26个月的产品稳定性。例如，与II期150μg剂量相比，I期阶段C 300μg剂量递送显著多的完整五聚体。参见图8A。
相比之下，在图8B中，针对gB的成纤维细胞nAb数据显示，对于gB抗原，实现血清阳性基准更具挑战性，因为相对于五聚体其免疫原性降低。使用20-25皮摩尔完整gB，并非所有患者在PD2或PD3后均实现血清阳性基准nAb水平。因此，将实施例1中描述的II期mRNA摩尔比设计为每总质量剂量递送更多gB mRNA，从而将剂量曲线延伸至更高皮摩尔剂量的gBmRNA。实际上，II期基于摩尔比的制剂将以低很多的总质量剂量递送16-47皮摩尔的完整gBmRNA。在这种情况下，P101C 300μg剂量递送的完整gB比P202 150μg剂量少。
接下来，如图9A和图9B所示，这些剂量反应曲线用于可视化本文所述的II期临床试验的预测剂量，并且图9A和图9B中所示的可视化技术连同所得数据也用于为III期临床试验选择最佳剂量。由于与gB免疫原性相比，五聚体免疫原性显著较高，因此预期使针对gB的成纤维细胞nAb滴度达最大将确定最小所需剂量，并且如果遵循建议的摩尔比设计，则上皮nAb滴度与五聚体关联将绰绰有余。
在不考虑LNP功能、其他质量属性、细胞功能、免疫反应以及mRNA和蛋白质的序列特异性方面的情况下，本文提供的剂量选择策略将编码完整跨膜蛋白的mRNA的含量和纯度与中和抗体反应相关联。基于这种研究，剂量反应曲线可用于限定未来临床研究的剂量。
对每个小瓶中直至到期的最小所需剂量的预测包括对预期影响剂量强度的所有要素进行模型化，例如浓度(例如，过程内控制(IPC)测定和稀释)和纯度(例如，降解)。IPC测定测量总mRNA含量。III期临床试验受试者和市售疫苗患者将接受一系列剂量强度。编码完整跨膜蛋白的mRNA的总剂量(μg)以如下方式计算：500μL mRNA浓度(g/L)x纯度(％)。
选择标称剂量以确保到期小瓶是有效的(图9A至图9B)。例如，150μg标称剂量(具有分布的靶标剂量)可为III期和商业供应提供5℃两年保质期。到期时，小瓶递送的剂量强度在100μg标称剂量范围内。图10提供在5℃下的降解模型化。因为在小鼠研究中相等质量比hCMV mRNA疫苗抗体反应展示当gB纯度降低至50％时出现临界下降，并且降解速率模型化预测50％gB代表在5℃下约2年，因此出于功效原因确定要求到期时具有50％gB纯度(图11)。注意到，在小鼠测定中一直维持免疫原性目标直至26个月后gB纯度降至低于49％。关联鼠类免疫原性的变化以预测人类反应取决于剂量反应曲线的敏感性。在小鼠中测试的剂量(0.5和2μg)位于剂量反应曲线的最陡峭部分。人类剂量选择目标为饱和nAb水平(预期对纯度的敏感性较低)。基于当前模型化，预期150μg剂量为免疫原性有效的并具有良好耐受性。
实施例3.评价hCMV mRNA疫苗在健康成人中的安全性和免疫原性的II期、随机化、观察者盲式、安慰剂对照、剂量发现试验
该II期研究的目的是评价hCMV mRNA免疫原性组合物在招募时为CMV血清阴性或CMV血清阳性的健康成人(18至40岁)中的安全性和免疫原性。hCMV mRNA疫苗已展现非临床安全性和免疫原性，并且具有预防人类原发性CMV感染和CMV阳性个体中CMV再感染/再活化的潜力。
研究疫苗的描述
本研究中评价的针对CMV感染的hCMV mRNA疫苗由脂质纳米粒子(LNP)制剂中的6种不同mRNA序列组成，所述mRNA序列编码针对人类CMV感染的nAb反应的6种病毒蛋白靶标(全长CMV gB和五聚体gH/gL/UL128/UL130/UL131A糖蛋白复合物[五聚体])。6种mRNA以约1:1:1:1:2:2的gL:UL128:UL130:UL131A:gH:gB摩尔比存在于hCMV mRNA疫苗中。
LNP制剂包括4种脂质赋形剂：8-((2-羟基乙基)(6-氧代-6(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(一种阳离子可离子化氨基脂质)，和市售脂质胆固醇、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2000 DMG)(Mui等人,2013)。
将hCMV mRNA疫苗注射剂以520μg冻干产品的形式提供于一次性玻璃小瓶中，并储存在-25℃至-15℃(-13℉至5℉)下直至使用。在适当剂量制备后，将0.5mL体积的hCMVmRNA疫苗注射剂肌肉内注射至三角肌中。
将冻干疫苗用0.6mL 0.9％氯化钠注射剂(USP)重构，然后用tris蔗糖稀释剂SD-0724稀释至用于在0.5mL体积中递送指定剂量水平的浓度。施用0.5mL体积的0.9％氯化钠注射剂(USP)(生理盐水)安慰剂。
研究设计
为该II期研究建议的设计和剂量水平是基于来自正在进行的I期研究的累积安全性和免疫原性数据。对I期研究的30μg、90μg和180μg剂量水平组的安全性和免疫原性数据的中期分析表明，hCMV mRNA疫苗通常在CMV血清阴性和CMV血清阳性的成人中均具有良好耐受性。在CMV血清阴性参与者中，在2次剂量(在第0个月、第2个月时施用)的hCMV mRNA疫苗后，在所有剂量水平下均观察到针对上皮细胞和成纤维细胞感染两者的中和抗体(nAb)，并且在第二次剂量后1个月测量免疫反应。另外，遵循相同疫苗接种时间表，在所有剂量水平下，在CMV血清阳性参与者中，针对上皮细胞和成纤维细胞进入所必需的病毒蛋白的抗体水平均得到加强。
本文所述的II期研究使用剂量递增、依序招募设计评价3次剂量水平的hCMV mRNA免疫原性组合物在18至40岁CMV血清阴性和CMV血清阳性成人中的安全性和免疫原性，并且旨在使得可选择用于进一步开发的单次剂量。
研究设计的示意图如图12中所呈现。所述研究包括两个治疗组，即CMV血清阴性组和CMV血清阳性组，所述治疗组同时招募。随机化通过CMV血清状态经由以依序方式进行交互响应技术(IRT)分为3个不同剂量水平。在每个剂量水平下，将受试者以3:1比率随机分组以接受hCMV mRNA疫苗或安慰剂，所述hCMV mRNA疫苗或安慰剂按3次疫苗接种(第0个月、第2个月、第6个月)时间表施用。
治疗组
CMV血清阴性组
在CMV血清阴性组中，每个剂量水平有60名受试者。剂量水平为50μg、100μg或150μg。在每个剂量水平下，将受试者以3:1比率随机分组以接受hCMV mRNA疫苗或安慰剂，所述hCMV mRNA疫苗或安慰剂按3次疫苗接种(第0个月、第2个月、第6个月)时间表施用。
CMV血清阳性组
在CMV血清阳性组中，每个剂量水平有24名受试者。剂量水平为50μg、100μg或150μg。在每个剂量水平下，将受试者以3:1比率随机分组以接受hCMV mRNA疫苗或安慰剂，所述hCMV mRNA疫苗或安慰剂按3次疫苗接种(第0个月、第2个月、第6个月)时间表施用。
筛查期
在首次门诊访视期间进行每个受试者的筛查。筛查可在访视第1天之前至多28天进行。筛查访视可在2次单独门诊访视中进行。
治疗期
向所有受试者施用三次剂量，在访视第1天、第56天和第168天。
估计研究持续时间
每个受试者的研究持续时间为约18个月。
样品大小
招募约252名受试者，包括约72名CMV血清阳性受试者和约180名CMV血清阴性受试者。认为建议受试者的数量足以提供不同剂量水平的hCMV mRNA疫苗的安全性和免疫原性的描述性总结。总共189名受试者接受hCMV mRNA疫苗。
目标和终点
主要目标
研究的主要目标如下：
1.评价按3次疫苗接种(第0个月、第2个月、第6个月)时间表施用的不同剂量水平的hCMV mRNA疫苗的安全性。
2.评价用按3次疫苗接种(第0个月、第2个月、第6个月)时间表施用的不同剂量水平的hCMV mRNA疫苗进行疫苗接种后针对成纤维细胞和上皮细胞感染的中和抗CMV抗体反应。
次要目标
研究的次要目标如下：
1.评价按3次疫苗接种时间表用不同剂量水平的hCMV mRNA疫苗进行疫苗接种后的抗原特异性抗体反应。
2.通过招募时的CMV血清状态评价hCMV mRNA疫苗的免疫原性。
探索性目标
研究的探索性目标如下：
1.评价用不同剂量水平的hCMV mRNA疫苗进行疫苗接种后的细胞介导的免疫反应。
2.在CMV血清阳性受试者中，评定与安慰剂相比，用hCMV mRNA疫苗进行免疫接种后免疫反应的可能作用。
主要终点
1.每次疫苗接种后7天内出现设定记录的局部和全身AR。
2.每次疫苗接种后28天内出现非设定记录的AE。
3.在最后一次疫苗接种后6个月内出现医疗不良事件(MAAE)，以及整个研究期间出现严重不良事件(SAE)。
4.在每个时间点，针对上皮细胞感染和针对成纤维细胞感染的血清中和抗CMV抗体的几何平均滴度(GMT)，以及基线后/基线滴度的相关几何平均比(GMR)。
5.在每个时间点，针对上皮细胞感染和针对成纤维细胞感染的nAb相对于基线增加≥2倍、3倍和4倍的受试者比例。
次要终点
1.在每个时间点，如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的抗gB特异性IgG和抗五聚体特异性IgG的GMT，以及基线后/基线滴度的相关GMR。
2.在CMV血清阳性组和CMV血清阴性组中，在每个时间点，GMT，GMR，针对上皮细胞感染和针对成纤维细胞感染的血清nAb相对于基线增加≥2倍、3倍和4倍的受试者的比例，和在每个时间点，抗原特异性IgG(ELISA)的GMT和GMR。
探索性终点
1.如通过酶联免疫斑点(ELISpot)测定测量的gB和五聚体特异性干扰素(IFN)-γ分泌性T细胞。
2.发起者可自行决定进行探索性测定以评定抗CMV免疫反应或原发性CMV感染。
分析
进行以下分析
1.可对每个剂量水平进行从访视第1天至第84天(第3个月)收集的安全性和免疫原性数据的3个月中期分析。直至第196天(第7个月)的可用安全性或免疫原性数据也可作为这些中期分析的一部分进行总结。这种分析用作后续试验选择hCMV mRNA疫苗剂量水平的基础。
2.可对每个剂量水平进行从访视第1天至第196天(第7个月)收集的安全性和免疫原性数据的7个月中期分析。直至第336天(第12个月)的可用安全性或免疫原性数据也可作为这些中期分析的一部分进行总结。
3.从访视第1天至试验结束收集的安全性和免疫原性数据的最终非盲分析。
免疫原性评定
在第1天、第29天、第56天、第84天、第168天、第196天、第336天和第504天针对上皮细胞感染的血清中和抗CMV抗体滴度，和基线后/基线滴度的GMR。
在第1天、第29天、第56天、第84天、第168天、第196天、第336天和第504天针对成纤维细胞感染的血清中和抗CMV抗体滴度，和基线后/基线滴度的GMR。
与第1天相比，在第29天、第56天、第84天、第168天、第196天、第336天和第504天，针对上皮细胞感染的nAb增加≥2倍、3倍和4倍的受试者的比例。
与第1天相比，在第29天、第56天、第84天、第168天、第196天、第336天和第504天，针对成纤维细胞感染的nAb增加≥2倍、3倍和4倍的受试者的比例。
在第1天、第29天、第56天、第84天、第168天、第196天、第336天和第504天，针对上皮细胞感染的nAb高于与天然CMV感染相关的nAb滴度的受试者的比例。
在第1天、第29天、第56天、第84天、第168天、第196天、第336天和第504天，针对成纤维细胞感染的nAb高于与天然CMV感染相关的nAb滴度的受试者的比例。
在第1天、第29天、第56天、第84天、第168天、第196天、第336天和第504天通过ELISA测量的抗gB IgG的GMT，和基线后/基线滴度的GMR。
在第1天、第29天、第56天、第84天、第168天、第196天、第336天和第504天通过ELISA测量的抗五聚体IgG的GMT，和基线后/基线滴度的GMR。
实施例4：II期过程的免疫原性、体外表达和分析表征的评价
用0.4g和1g规模的基于摩尔比的冻干hCMV RNA疫苗评价II期过程的免疫原性、体外hCMV抗原表达和分析表征，并与0.03g规模的液体制剂进行比较。冻干制剂用生理盐水(测量的pH为6.3)制备成不同剂量。经稀释制剂中的pH变化如图13所示。
评价基于mRNA组分的摩尔比的两种冻干制剂(0.4g和1g规模)和基于相等质量比的液体制剂(0.03g规模)的hCMV五聚体和hCMV gB的体外表达水平。与0.03g规模液体制剂相比，0.4g或1g规模的冻干制剂产生的五聚体蛋白的体外表达较高(图14A至图14C)。
免疫后21天或36天的抗五聚体IgG滴度如图15A所示，并且免疫后21天或36天的抗gB IgG滴度如图15B所示。在0.5μg剂量下，与0.03g规模的相等质量液体制剂相比，0.4g和1g规模的冻干制剂产生的五聚体特异性和gB特异性IgG滴度较高(15-20倍)。来自接受1g规模的组的免疫反应与来自0.4g规模的反应相当。
进行大规模(1g)冻干制剂与小规模(0.03g)液体制剂的CMV中和滴度比较。与相等质量比液体制剂相比，使用基于摩尔比的冻干制剂产生的针对CMV病毒的中和滴度高26倍(图16A和图16B)。
实施例5：评价II期研究中第2次疫苗接种后1个月的免疫原性
本实施例描述了hCMV mRNA疫苗免疫原性的第3个月(第2次疫苗接种后1个月)中期分析的结果。
CMV血清阴性和CMV血清阳性参与者中的免疫原性以针对上皮细胞感染的中和抗体(nAb)反应(针对五聚体抗原的免疫反应的量度)和针对成纤维细胞感染的nAb反应(针对gB抗原的免疫反应的量度)的形式测量。结果通过平均值、中值、最小值、最大值、几何平均滴度(GMT)、相对于基线的几何平均比(GMR)以及GMT和GMR的相应95％置信区间总结。
用于测量针对上皮细胞感染的nAb的微量中和测定使用CMV分离株VR1814和ARPE-19细胞。用于测量针对成纤维细胞感染的nAb的微量中和测定使用CMV分离株AD169和HEL299细胞。
基线中和抗体
在CMV血清阴性参与者中，在基线时(第一次疫苗接种之前)针对上皮细胞感染和针对成纤维细胞感染的nAb GMT均低于所有治疗组中的定量下限(LLOQ)(报告为8，表示0.5x LLOQ)。这表明在免疫之前不存在CMV感染。
在CMV血清阳性参与者(n＝46)中，针对细胞感染的nAb的基线GMT为3,924(95％CI：2,249,6,845)，并且针对成纤维细胞感染的nAb的基线GMT为3,955(95％ CI：2,197,7,119)。这些值表示这种符合方案集合的天然获得免疫的nAb GMT，以及CMV血清阴性组中的免疫反应所比较的基准。
中和抗体(nAb)反应
在CMV血清阴性参与者中，在50μg、100μg和150μg治疗组中，在第1次疫苗接种后，针对上皮细胞感染的中和抗体(图17)分别以剂量相关方式增加至第1个月(第1次疫苗接种后1个月)的GMT达955(95％ CI 503,1,814)；2,100(95％ CI 1,074,4,110)；和3,109(95％CI 2,116,4,568)(表1)。在每个mRNA治疗组中，在第2次疫苗接种后，针对上皮细胞感染的nAb进一步增加至GMT超过所有治疗组中的血清阳性基准GMT，其中在50μg、100μg和150μg治疗组中，第3个月(第2次疫苗接种后1个月)的GMT分别为57,028(95％CI 36,725,88,554)；49,302(95％CI 32,141,75,627)；和49,706(95％CI 35,792,69,029)(表1)。
在CMV血清阴性参与者中，在50μg、100μg和150μg治疗组中，在第1次疫苗接种后，针对成纤维细胞感染的中和抗体(图18)分别增加至第1个月(第1次疫苗接种后1个月)的GMT达73(95％ CI 35,151)、175(95％ CI 86,356)和136(95％ CI 68,272)(表1)。在每个mRNA治疗组中，在第2次疫苗接种后，针对成纤维细胞感染的nAb进一步增加至GMT接近或超过所有治疗组中的血清阳性基准GMT，其中在50μg、100μg和150μg治疗组中，第3个月(第2次疫苗接种后1个月)的GMT分别为3,856(95％ CI 2,726,5,455)；3,242(95％CI 2,009,5,233)；和4,638(95％ CI 3,417,6,296)(表1)。
表1.CMV血清阴性参与者中的中和抗体反应
Figure BDA0004094056490000971
N＝治疗组中受试者的数量；n＝在相应时间点具有非缺失数据的受试者的数量；
GMT＝几何平均滴度；GMR＝几何平均比(基线后/基线滴度)；CI＝置信区间。
在CMV血清阳性参与者中，在50μg、100μg和150μg治疗组中，在第1次疫苗接种后，针对上皮细胞感染的中和抗体(图17)分别以剂量相关方式加强至第1个月(第1次疫苗接种后1个月)的GMT达27,062(95％ CI 7,392,99,073)；52,989(95％ CI 24,882,112,847)；和116,899(95％ CI 60,899,224,392)，并且相应GMR为12.0、8.9和15.6(表2)。在每个mRNA治疗组中，在50μg、100μg和150μg治疗组中，在第2次疫苗接种后，针对上皮细胞感染的nAb分别进一步加强至第3个月(第2次疫苗接种后1个月)的GMT达102,850(95％CI 64,178,164,826)；81,111(95％ CI 40,570,162,167)；和126,075(95％CI 73,077,217,509)，并且相应GMR为51.4、13.7和16.9(表2)。
在CMV血清阳性参与者中，在50μg、100μg和150μg治疗组中，在第1次疫苗接种后，针对成纤维细胞感染的中和抗体(图18)分别以剂量相关方式加强至第1个月(第1次疫苗接种后1个月)的GMT达5,686(95％ CI 1,680,19,252)；14,251(95％ CI 5,790,35,077)；和21,341(95％ CI 13,468,33,817)，并且相应GMR为2.3、2.2和3.0(表2)。在每个mRNA治疗组中，在50μg、100μg和150μg治疗组中，在第2次疫苗接种后，针对成纤维细胞感染的nAb分别进一步加强至第3个月(第2次疫苗接种后1个月)的GMT达9,970(95％ CI 6,487,15,325)；11,652(95％ CI 6,323,21,475)；和13,208(95％ CI 8,875,19,657)，并且相应GMR为4.4、1.8和1.9(表2)。
表2.CMV血清阳性参与者中的中和抗体反应
Figure BDA0004094056490000991
N＝治疗组中受试者的数量；n＝在相应时间点具有非缺失数据的受试者的数量；
GMT＝几何平均滴度；GMR＝几何平均比(基线后/基线滴度)；CI＝置信区间。
免疫原性结论
CMV血清阴性参与者
(a)在第1次疫苗接种后(第1个月)，针对上皮细胞感染的中和抗体(针对完整CMV五聚体抗原的免疫反应的量度)以通常剂量相关方式增加。第2次疫苗接种后(第3个月)，针对上皮细胞感染的nAb GMT相对于CMV血清阳性参与者的基线GMT(先前天然获得的CMV感染的量度)加强至至少12倍。在50μg、100μg和150μg治疗组中，针对上皮细胞感染的第3个月nAb GMT的数值大体类似。
(b)在第1次疫苗接种后(第1个月)，针对成纤维细胞感染的中和抗体(针对CMV gB抗原的免疫反应的量度)未显示明显增加。第2次疫苗接种后(第3个月)，针对成纤维细胞感染的nAb加强至GMT通常等于CMV血清阳性参与者中的基线GMT(先前天然获得的CMV感染的量度)。在50μg、100μg和150μg治疗组中，第3个月GMT的数值大体类似。
CMV血清阳性参与者
(a)在治疗组之间，针对上皮细胞感染的基线nAb GMT变化，并且在安慰剂治疗组中，GMT通常在基线与第3个月之间增加。在各hCMV mRNA疫苗治疗组中，针对上皮细胞感染的nAb GMT在第1次疫苗接种后(第1个月)相对于各自的基线GMT加强至至少8倍的水平，并且在第2次疫苗接种后(第3个月)相对于各自的基线GMT加强至至少13倍至超过51倍的GMT。第1次或第2次疫苗接种后的剂量相关性GMR反应不明显。
(b)在治疗组之间，针对成纤维细胞感染的基线nAb GMT变化，并且在安慰剂治疗组中，GMT通常在基线与第3个月之间增加。在每个hCMV mRNA疫苗治疗组中，针对成纤维细胞感染的nAb GMT在第1次和第2次疫苗接种后(第1个月和第3个月)相对于各自的基线GMT加强至至少2倍的水平，但由于安慰剂治疗组中的nAb GMT增加，因此与安慰剂相比，任一疫苗接种后GMR均未明显增加。与安慰剂治疗组相比，mRNA治疗组中的剂量相关性GMR反应不明显。
设定记录的安全性
记录第1次疫苗接种后设定记录的不良反应(AR)(表3)。注射部位疼痛是最常报告设定记录的局部不良反应。在CMV血清阴性和CMV血清阳性治疗组两者中，最常见设定记录的全身AR为头痛、疲劳和肌痛。未报告严重不良事件(SAE)。未发生导致研究中止的非设定记录事件。
表3.第1次疫苗接种后设定记录的不良反应(AR)
Figure BDA0004094056490001011
值表示报告每个AR的参与者的n(％)，粗体文字＝3级AR
记录第2次疫苗接种后设定记录的不良反应(表4)。第2次疫苗接种后，在CMV血清阴性和CMV血清阳性治疗组中，设定记录的AR的比率和严重程度分布大体上类似。
表4.第2次疫苗接种后设定记录的不良反应(AR)
Figure BDA0004094056490001021
值表示报告每个AR的参与者的n(％)，粗体文字＝3级AR
安全性结论
(a)无论血清状态如何，所述疫苗通常在所有剂量下均具有良好耐受性。
(b)未报告SAE。
(c)不存在导致研究中止的非设定记录事件。
(d)在第1次疫苗接种后和第2次疫苗接种后，治疗组中通常类似比例的CMV血清阴性和CMV血清阳性参与者报告至少一种设定记录的AR。
(e)总体而言，在CMV血清阴性或CMV血清阳性治疗组中，在第1次或第2次疫苗接种后报告设定记录的AR的参与者的比例不呈现剂量相关模式。
(f)总体而言，最常见设定记录的局部AR为注射部位疼痛。在CMV血清阴性和CMV血清阳性治疗组两者中，最常见设定记录的全身AR为头痛、疲劳和肌痛。
(g)第1次疫苗接种后，CMV血清阴性参与者中设定记录的全身AR的比率通常在数值上较低。3级设定记录的全身AR的报告很低，并且限于CMV血清阳性治疗组。在CMV血清阴性或CMV血清阳性治疗组中，设定记录的AR的比率未呈现剂量相关模式。
(h)第2次疫苗接种后，在CMV血清阴性和CMV血清阳性治疗组中，设定记录的AR的比率和严重程度分布大体上类似。
(i)在治疗组中，CMV血清阴性和CMV血清阳性参与者中报告总体上非设定记录的AE和3级非设定记录的AE的参与者的比例在数值上通常类似。报告治疗相关性非设定记录的AE的CMV血清阴性参与者的比例数值上高于CMV血清阳性参与者。无明显剂量相关性或CMV血清状态相关性的所报告非设定记录AE的模式。
实施例6：评价II期研究中第3次疫苗接种后1个月的免疫原性
本实施例描述了hCMV mRNA疫苗免疫原性的第7个月(第3次疫苗接种后1个月)中期分析的结果。
CMV血清阴性和CMV血清阳性参与者中的免疫原性以针对上皮细胞感染的中和抗体(nAb)反应(针对五聚体抗原的免疫反应的量度)；针对成纤维细胞感染的nAb反应(针对gB抗原的免疫反应的量度)；抗五聚体结合抗体滴度；和抗gB结合抗体滴度的形式测量。结果通过平均值、中值、最小值、最大值、几何平均滴度(GMT)、相对于基线的几何平均比(GMR)以及GMT和GMR的相应95％置信区间总结。
用于测量针对上皮细胞感染的nAb的微量中和测定使用CMV分离株VR1814和ARPE-19细胞。用于测量针对成纤维细胞感染的nAb的微量中和测定使用CMV分离株AD169和HEL299细胞。用于测量五聚体的结合ELISA测定使用重组人类CMV五聚体蛋白复合物，所述复合物由来源于VR1814分离株的全长UL75(gH)、UL115(gL)、UL128、UL130和UL131A组成。用于测量gB的结合ELISA测定使用编码与细胞质域连接的胞外域的重组人类CMV gB。
基线中和抗体
在CMV血清阴性参与者(n＝127)中，在基线时(第一次疫苗接种之前)针对上皮细胞感染和针对成纤维细胞感染的nAb GMT均低于所有治疗组中的LLOQ(报告为8，表示0.5×LLOQ)。这表明在免疫之前不存在CMV感染。
在CMV血清阳性参与者(n＝62)中，针对上皮细胞感染的nAb的基线GMT为4,732(95％ CI：3,059；7,321)，并且针对成纤维细胞感染的nAb的基线GMT为4,045(95％ CI：2,566；6,374)。这些值表示这个PP免疫原性集合的天然获得免疫的nAb GMT，以及CMV血清阴性组中的中和抗体反应可比较的基准。
中和抗体(nAb)反应
在CMV血清阴性参与者中，在第1次疫苗接种后，针对上皮细胞感染的中和抗体以剂量相关方式增加(图19，表5)。在每个mRNA治疗组中，针对上皮细胞感染的nAb在第2次疫苗接种后进一步增加，并且在第3次疫苗接种后再次增加，其增加至GMT超过所有治疗组中的血清阳性基准GMT 20倍以上(图20)。
在每个mRNA治疗组中，针对成纤维细胞感染的nAb在第2次疫苗接种后增加至GMT接近或超过所有治疗组中的血清阳性基准GMT。第3次疫苗接种后，100μg和150μg治疗组中的GMT与第2次疫苗接种后的GMT相当(图20)。
表5.CMV血清阳性参与者中的中和抗体反应
Figure BDA0004094056490001051
基线时针对上皮细胞感染的nAb的CMV血清阳性组GMT＝4,732(95％ CI：3,059；7,321)
基线时针对成纤维细胞感染的nAb的CMV血清阳性组GMT＝4,045(95％ CI：2,566；6,374)
CI＝置信区间；CMV＝巨细胞病毒；GMT＝几何平均滴度；GMR＝几何平均比(基线后/基线滴度)；N＝治疗组中参与者的数量；n＝在相应时间点具有非缺失数据的参与者的数量。
在CMV血清阳性参与者中，在第1次疫苗接种后，针对上皮细胞感染的中和抗体以剂量相关方式增加(图19，表6)。在每个mRNA治疗组中，在第3次疫苗接种后，100和150μg组中针对上皮细胞感染的nAb与第2次疫苗接种后的GMT相当(图19)。
在每个mRNA治疗组中，在第3次疫苗接种后，针对成纤维细胞感染的nAb与第2次疫苗接种后的GMT相当(图20)。
值得注意的是，对于针对上皮细胞感染的nAb和针对成纤维细胞感染的nAb两者，治疗组之间的基线GMT变化。特别是，50μg治疗组中的基线GMT在数值上低于100μg和150μg治疗组，这可能由于50μg治疗组中GMR相对较高。另外，安慰剂治疗组中的基线后GMT高于各自的基线GMT。
表6.CMV血清阳性参与者中的中和抗体反应
Figure BDA0004094056490001071
/>
Figure BDA0004094056490001081
CI＝置信区间；CMV＝巨细胞病毒；GMR＝几何平均比(基线后/基线滴度)；GMT＝几何平均滴度；N＝治疗组中参与者的数量；n＝在相应时间点具有非缺失数据的参与者的数量。
结合抗体(nAb)反应
在CMV血清阴性参与者中，抗五聚体bAb在第1次疫苗接种后略微增加(图21，表7)，然后在第2次疫苗接种后增加至GMT超过基线时CMV血清阳性组的10倍，无明显剂量关系。在所有mRNA治疗组中，第3次疫苗接种后的GMT与第2次疫苗接种相当(图21)。
在每个mRNA治疗组中，抗gB在第1次疫苗接种后不明显增加，然后在第2次疫苗接种后增加，并且在第3次疫苗接种后进一步增加(图22，表7)。第3次疫苗接种后的GMT低于基线时CMV血清阳性组的GMT。治疗组之间无明显剂量关系。
表7.CMV血清阴性参与者中的结合抗体反应
Figure BDA0004094056490001091
基线时抗五聚体结合Ab的CMV血清阳性组GMT＝395(95％CI：281；554)
基线时抗gB结合Ab的CMV血清阳性组GMT＝2,190(95％ CI：1,469；3,263)
CI＝置信区间；CMV＝巨细胞病毒；GMR＝几何平均比(基线后/基线滴度)；GMT＝几何平均滴度；N＝治疗组中参与者的数量；n＝在相应时间点具有非缺失数据的参与者的数量。
在血清阳性的参与者中，抗五聚体bAb在所有mRNA治疗组中的第一次接种后得到加强(图21，表8)，并且在第二次接种后进一步增加，没有明显的剂量关系。在第3次疫苗接种后，对于所有mRNA治疗组，抗五聚体bAb与第2次疫苗接种相当(图22)。在mRNA治疗组之间，第1次疫苗接种后GMR为至少6.2，第2次疫苗接种后为至少10.2，并且第3次疫苗接种后为至少6.8。
在所有mRNA治疗组中，第1次疫苗接种后抗gB bAb加强，并且在第2次和第3次疫苗接种后增加。在mRNA治疗组之间，在3次疫苗接种中的每一者后，GMR为至少1.8倍(图22，表8)。
表8.CMV血清阳性参与者中的结合抗体反应
Figure BDA0004094056490001101
/>
Figure BDA0004094056490001111
CI＝置信区间；GMR＝几何平均比(基线后/基线滴度)；GMT＝几何平均滴度；N＝治疗组中参与者的数量；n＝在相应时间点具有非缺失数据的参与者的数量。
免疫原性结论
CMV血清阴性参与者
(a)中和抗体反应。在所有CMV血清阴性mRNA治疗组中，与第2次疫苗接种相比，第3次疫苗接种后针对上皮细胞感染的中和Ab GMT增加，其中GMT超过CMV血清阳性组的基线GMT 20倍以上。在所有mRNA治疗组中，第2次疫苗接种后针对成纤维细胞感染的nAb GMT接近或超过CMV血清阳性组的基线GMT。第3次疫苗接种后，100μg和150μg治疗组中的nAb GMT与第2次疫苗接种后的GMT相当。
(b)结合抗体反应。第2次疫苗接种后，抗五聚体结合Ab GMT增加至超过CMV血清阳性组的基线GMT 10倍以上的水平，其中第3次疫苗接种后的GMT与第2次疫苗接种相当，并且无明显剂量关系。在mRNA治疗组中，第3次疫苗接种后抗gB结合Ab GMT在数值上高于第2次疫苗接种，无明显总剂量关系，并且在数值上低于CMV血清阳性组的基线GMT。
CMV血清阳性参与者
(a)中和抗体反应。在mRNA治疗组中，在第1次疫苗接种后针对上皮细胞感染的nAbGMR加强至至少8.6倍，在第2次疫苗接种后加强至至少14.0倍，并且在第3次疫苗接种后加强至至少12.4倍，无明显总剂量关系。在第1次疫苗接种后针对成纤维细胞感染的中和AbGMR加强至GMR达至少2.2倍，在第2次疫苗接种后达至少2.1倍，并且在第3次疫苗接种后达至少1.9倍，无明显总剂量关系。
(b)结合抗体反应。在mRNA治疗组中，在第1次疫苗接种后抗五聚体bAb GMT加强至GMR达至少6.2倍，在第2次疫苗接种后达至少10.2倍，并且在第3次疫苗接种后达至少6.8倍，无明显总剂量关系。在每个mRNA治疗组中，第1次疫苗接种后，在mRNA治疗组之间，抗gB结合Ab GMT加强至GMR达至少1.8倍，并且第2次疫苗接种与第3次疫苗接种后的GMR通常相当，无明显剂量关系。
设定记录的安全性
在CMV血清阳性和CMV血清阴性总mRNA组两者中，最常见设定记录的全身AR为头痛、疲劳、肌痛、关节痛和发寒。在CMV血清阴性总mRNA组中，第1次疫苗接种后报告头痛、疲劳、肌痛、关节痛和发寒的参与者的比率分别为27％、33％、21％、10％和13％，第2次疫苗接种后在数值上分别增加至47％、42％、44％、33％和35％，并且第3次疫苗接种后分别增加至49％、52％、47％、34％和31％。在CMV血清阳性总mRNA组中，第1次疫苗接种后报告头痛、疲劳、肌痛、关节痛和发寒的参与者的比率(分别为52％、54％、59％、43％和37％)在数值上通常与第2次疫苗接种(分别为51％、61％、70％、44％和47％)和第3次疫苗接种(分别为56％、62％、46％、41％和51％)相当。在CMV血清阴性安慰剂组中，第1次疫苗接种后头痛、疲劳、肌痛、关节痛和发寒的比率分别为37％、33％、16％、7％和10％；第2次疫苗接种后分别为38％、25％、5％、5％和2.5％，并且第3次疫苗接种后分别为22％、8％、0％、0％和3％。在CMV血清阳性安慰剂组中，第1次疫苗接种后头痛、疲劳、肌痛、关节痛和发寒的比率分别为35％、25％、10％、5％和0％；第2次疫苗接种后分别为43％、14％、7％、7％和0％，并且第3次疫苗接种后分别为20％、7％、0％、0％和0％(表9和表10)。
表9.CMV血清阴性参与者中设定记录的全身不良反应的总结
Figure BDA0004094056490001131
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AR＝不良反应；CMV＝巨细胞病毒；n＝治疗组中参与者的数量；总mRNA＝合并的所有mRNA治疗组。
表10.CMV血清阳性参与者中设定记录的全身不良反应的总结
Figure BDA0004094056490001141
AR＝不良反应；CMV＝巨细胞病毒；n＝治疗组中参与者的数量；总mRNA＝合并的所有mRNA治疗组。
安全性结论
(a)无论血清状态如何，所述疫苗通常在所有剂量下均具有良好耐受性。迄今为止，研究中尚未遇到方案定义的暂停规则。
(b)在接受疫苗的参与者中报告单一SAE(滤泡性甲状腺癌)，其与治疗无关。
(c)不存在导致研究中止的非设定记录事件。导致停止研究疫苗的TEAE很少发生。
(d)在第1次、第2次和第3次疫苗接种后，疫苗治疗组中通常相当比例的CMV血清阴性和CMV血清阳性参与者报告至少一种设定记录的AR。
(e)在CMV血清阴性或CMV血清阳性疫苗治疗组中，在第1次、第2次或第3次疫苗接种后报告设定记录的AR的参与者的比例不呈现剂量相关模式。
(f)在CMV血清阴性和CMV血清阳性疫苗治疗组两者中，最常见设定记录的局部AR是注射部位疼痛。在疫苗治疗组中，第3次疫苗接种后的总频率与第2次疫苗接种后的频率通常相当。在两个CMV血清阴性mRNA治疗组中，第2次与第3次疫苗接种之间的3级严重程度注射部位疼痛的总频率类似，并且在CMV血清阳性mRNA治疗组中，第3次疫苗接种后数值上低于第2次疫苗接种。
(g)在CMV血清阴性和CMV血清阳性疫苗治疗组两者中，最常见设定记录的全身AR是头痛、疲劳、肌痛、关节痛和发寒。第2次疫苗接种后报告设定记录的全身AR的参与者的比例通常在数值上高于第1次疫苗接种，并且第3次疫苗接种后与第2次疫苗接种在数值上相当。第3次疫苗接种后发热的频率在数值上高于第2次疫苗接种，但3级发热(定义为口腔温度39.0℃-40.0℃/102.1-104.0℉)比率相当。
(h)在CMV血清阴性组和CMV血清阳性组中，非设定记录的AE或MAAE的分布无明显总体模式或差异，并且比率通常相当。
(i)实验室结果分析揭示无安全性问题。
实施例7：评价hCMV mRNA巨细胞病毒(CMV)疫苗在16至40岁健康受试者中的功效、安全性和免疫原性的III期、随机化、观察者盲式、安慰剂对照研究
该III期研究的目的是评价针对原发性巨细胞病毒(CMV)感染的hCMV mRNA疫苗在招募时为CMV血清阴性或CMV血清阳性的16至40岁健康女性中的疫苗安全性、功效和免疫原性。
研究疫苗的描述
如上所述，hCMV mRNA疫苗由脂质纳米粒子(LNP)制剂中的6种mRNA序列组成，所述mRNA序列编码针对人类CMV感染的中和抗体(nAb)反应的重要靶标(全长CMV糖蛋白B[gB]和五聚体gH/gL/UL128/UL130/UL131A糖蛋白复合物[五聚体])。
LNP制剂包括4种脂质赋形剂：8-((2-羟基乙基)(6-氧代-6(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(一种专有可离子化氨基脂质)，和市售脂质胆固醇、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，和1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2000-DMG)。
将hCMV mRNA疫苗注射剂储存在2℃至8℃下直至使用。在适当剂量制备后，将0.5mL体积的hCMV mRNA疫苗注射剂肌肉内注射至三角肌中，优选在非优势组中。
将hCMV mRNA疫苗的III期制剂以151μg/小瓶的总mRNA含量填充于2R I型玻璃小瓶中并冻干。使用前，将冻干药品用0.7mL0.9％氯化钠注射剂重构，以形成浓度为0.2mg/mL的均一LNP分散液以供施用。
将0.5mL体积的0.9％氯化钠注射剂(生理盐水)安慰剂肌肉内注射至三角肌中，优选在非优势组中。
研究设计
主要功效目标是展示针对原发性巨细胞病毒(CMV)感染的hCMV mRNA疫苗在招募时为CMV血清阴性的女性受试者中的疫苗作用。原发性CMV感染定义为如通过基于平台的自动免疫测定所测量，针对CMV的血清免疫球蛋白G(IgG)从阴性结果(基线/第1天)变为阳性结果的血清转化，所述自动免疫测定基于在第三次注射后28天开始评定的不由hCMV mRNA疫苗编码的4种重组CMV抗原(pp150、pp28、pp52、pp38)中的至少一者。在基线时为CMV血清阳性的女性受试者和男性受试者将不包括在主要功效分析中。
研究总共招募约8,100名受试者：CMV血清阴性组：5,500名女性受试者和600名男性受试者，以及CMV血清阳性组：1,400名女性受试者和600名男性受试者。
受试者将以1:1的比率随机分配以接受100μg hCMV mRNA疫苗或安慰剂。在第1天访视时，根据预先产生的随机化方案，使用集中交互响应技术以盲式进行随机化。对于每个血清状态组(CMV血清阴性、CMV血清阳性)，随机化通过性别(女性、男性)和年龄(≥16至<18岁，≥18至<20岁，和≥20至≤40岁)进行划分以平衡治疗分配。至少400名招募的CMV血清阴性女性受试者在≥16至<18岁组中。每个参与者将参与两个阶段：疫苗接种阶段(第1天至第7个月[第197天；第三次注射后28天])和随访阶段(第7个月后[第198天])至第30个月(第887天；第三次注射后约24个月)。完成疫苗接种阶段后，受试者将在随访阶段期间约每3个月进行预定研究访视，以进行安全性和研究评定。
所有受试者将在第1天接受第一次注射，并且在第2个月(第57天)接受第二次注射的相同治疗，并且在第6个月(第169天)接受第三次注射。在研究过程中，受试者将有约14次研究访视和约18次安全性电话呼叫/电子日记(eDiary)安全性和监视提示。在疫苗接种阶段，将使用eDiary在每次注射后7天内收集局部和全身设定记录的不良反应(AR)。将记录第7天之后仍在进行的任何设定记录AR，直至不再报告，不超过28天。从每次注射之日开始至每次注射后28天收集非设定记录的不良事件(AE)。从第1天开始至最后一次注射后6个月收集医疗护理AE(MAAE)。从同意至研究结束(EOS)收集严重不良事件(SAE)。收集导致退出进一步注射或研究参与的死亡、AESI和AE，直至EOS。将在第1天至EOS的研究期间收集所有妊娠受试者中的妊娠安全性和一般结果数据，包括自发和自愿终止妊娠以及先天性异常。妊娠安全性和一般结果数据可在EOS之后收集(即，对于EOS访视后继续妊娠)。
受试者将在研究过程中进行预定血液采样以评定合格性、由于原发性CMV感染引起的血清转化(CMV血清阴性组)、疫苗诱导的抗体反应和抗体持久性。对程序和访视的更详细概述可见于评定时间表(SOA)(表11和表12)中。
表11：评定时间表-疫苗接种阶段(筛查-第197天/第7个月)
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Figure BDA0004094056490001191
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Figure BDA0004094056490001201
缩写：AE＝不良事件；AR＝不良反应；CMV＝巨细胞病毒；D＝天；eDiary＝电子日记；ePRO＝电子患者报告结果；EQ-5D-5L＝EuroQol-5维5水平(EuroQol-5 Dimension5Level)；ICF＝知情同意书；HRPQ＝健康相关的生产力问卷；IgG＝免疫球蛋白G；IgM＝免疫球蛋白M；M＝月；MAAE＝医疗护理不良事件；min＝分钟；N/A＝不适用；PCR＝聚合酶链反应；SAE＝严重不良事件；S＝研究场所访视；SC＝安全性(电话)呼叫。
表12：评定时间表-随访阶段(第7个月后-第30个月)
Figure BDA0004094056490001211
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Figure BDA0004094056490001241
缩写：AE＝不良事件；CMV＝巨细胞病毒；D＝天；eD＝电子日记；EOS＝研究结束；ePRO＝电子患者报告结果；EQ-5D-5L＝EuroQol-5维5水平；HRPQ＝健康相关的生产力问卷；M＝月；MAAE＝医疗护理不良事件；SAE＝严重不良事件；S*＝研究场所访视或家庭访视；SC＝安全性(电话)呼叫。
所述研究是观察者盲式的，其中仅负责研究疫苗制备、施用和/或担责任的受托非盲式研究工作人员才能进行研究治疗分配。在研究进行期间，参与者或参与者的父母/法律上可接受的代表(LAR)、研究者或负责研究评定/安全性的研究场所工作人员均不能进行治疗分配。在紧急情况下，研究者可揭盲。
受试者可经历需要非预定访视的AE；这些AE将作为MAAE记录。也可能存在如下情况，其中研究者要求参与者在报告AE后返回进行非预定访视。必要时可在这些访视时进行其他检查，以确保研究期间受试者的安全性和健康。每个非预定访视均应完成电子病例报告表。
将关于以下对所有受试者进行最少30个月(第三次注射后24个月)的安全性随访：原发性CMV感染所致的血清转化(CMV血清阴性组)、CMV脱落(CMV血清阳性组)、妊娠结果，以及直至EOS的SAE和最后一次注射后6个月的MAAE(表12)。
在第一次或第二次疫苗接种后停止进一步疫苗接种但未撤回同意书的受试者将如上述进行安全性随访，并且将提供血液样品以测试免疫原性、原发性CMV感染所致的血清转化(CMV血清阴性组)和CMV脱落(CMV血清阳性组)(表12)。
巨细胞病毒血清阴性组：
巨细胞病毒血清阴性组受试者将在以下研究访视时提供用于评定原发性CMV感染所致的血清转化的血液样品和用于妊娠测试的尿液样品：第1天、第2个月(第57天)、第3个月(第85天)、第6个月(第169天)、第7个月(第197天)、第10个月(第287天)、第12个月(第347天)、第15个月(第437天)、第18个月(第527天)、第21个月(第617天)、第24个月(第707天)、第27个月(第797天)和第30个月(第887天，EOS)。(表11和表12。)
将联系第3个月至EOS符合原发性CMV感染所致的血清转化的主要终点的受试者，以进行非预定研究访视(血清转化访视)来进行临床评定，包括血液、尿液和唾液采样以进行CMV聚合酶链反应(PCR)，之后其将返回计划的访视时间表。在血清转化访视后，收集尿液以用于在所有后续预定研究访视至EOS时进行CMV PCR。参与者符合原发性CMV感染所致的血清转化的标准后，将不能在后续访视中完成血清收集以测试原发性CMV感染。
在CMV血清学阴性组中，预计大部分原发性CMV感染所致的血清转化是无症状的，并且将在预定研究访视时通过计划的血清学监测测试进行检测。将通过在第3个月开始的预定研究访视时的方案定义标准、安全性电话呼叫并经由eDiary安全性监视提示(在第8个月开始)，评定受试者的症状是否符合可能的症状性原发性CMV感染的标准。将指示在预定研究访视之间，在安全性电话呼叫期间，或在随访阶段期间经由eDiary符合可能的症状性原发性CMV感染的方案定义标准的受试者返回研究场所进行CMV疾病评定访视(非预定访视)。CMV疾病评定访视包括身体检查；收集血液样品以测试血液学、化学、原发性CMV感染所致的血清转化和爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus；EBV)组；和收集尿液样品以进行CMV PCR。研究者可自行决定进行HIV抗体、HIV病毒负荷和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的测试。另外，通过方案定义标准报告可能的症状性原发性CMV感染的症状的受试者也可接受电子患者报告结果(ePRO)问卷，以收集参与者报告的健康状况和健康相关的生产力信息。问卷可包括EuroQol 5维5水平(EQ 5D 5L)和健康相关生产力问卷(HRPQ)，其可基于CMV疾病评定访视或基于经由安全性eDiary报告的症状并且基于ePRO问卷的可用性和实施时间线触发。
巨细胞病毒血清阳性组：
将在以下研究访视时对巨细胞病毒血清阳性组受试者进行尿液取样以进行CMV脱落和尿液妊娠测试：第1天、第2个月(第57天)、第3个月(第85天)、第6个月(第169天)、第7个月(第197天)、第10个月(第287天)、第12个月(第347天)、第15个月(第437天)、第18个月(第527天)、第21个月(第617天)、第24个月(第707天)、第27个月(第797天)和第30个月(第887天，EOS)。(表11和表12)。
研究持续时间：
每个参与者的研究持续时间为约30个月。
样品大小：
CMV血清阳性受试者的样品大小由安全性决定。将约2,000名CMV血清阳性女性和男性受试者以1:1比率随机分配至hCMV疫苗和安慰剂组中。在1,000名CMV血清阳性受试者暴露于hCMV疫苗的情况下，所述研究具有至少90％的可能性观察到至少1名CMV血清阳性参与者发生AE，AE比率实际为0.25％。
CMV血清阴性男性受试者的样品大小由安全性决定。将约600名CMV血清阴性男性受试者以1:1比率随机分配至hCMV疫苗和安慰剂组中。在300名CMV血清阴性男性受试者暴露于hCMV疫苗的情况下，所述研究具有至少95％的可能性观察到至少1名CMV血清阴性男性参与者发生AE，AE比率实际为1％。
目标和终点
主要目标：
本研究的主要目标如下：
1)展示hCMV mRNA疫苗在CMV血清阴性女性受试者中预防原发性CMV感染的功效
2)评价按3次剂量注射时间表施用的hCMV mRNA疫苗在所有受试者中的安全性和反应原性。
次要目标：
本研究的次要目标如下：
1)评价按3次剂量注射时间表施用的hCMV mRNA疫苗在所有受试者中的免疫原性。
2)评价hCMV mRNA疫苗在第三次注射后24个月内在所有受试者中的免疫原性的持续性。
探索性目标：
本研究的探索性目标如下：
1)评价hCMV mRNA疫苗在符合原发性CMV感染所致的血清转化的终点的CMV血清阴性受试者中对CMV感染动力学的影响，如通过血液、尿液和唾液中的CMV PCR所测量。
2)评价hCMV mRNA疫苗在CMV血清阳性受试者中对尿液CMV脱落的频率和水平的影响。
3)在接受hCMV mRNA疫苗的CMV血清阴性女性受试者中，评定符合原发性CMV感染所致的血清转化的终点的受试者和不符合原发性CMV感染所致的血清转化的终点的受试者中抗原特异性nAb和结合抗体的水平。
4)评价hCMV mRNA疫苗在CMV血清阴性受试者中对症状性原发性CMV感染的发病率的影响。
5)评价在CMV血清阴性受试者中接受hCMV mRNA疫苗后的免疫标志物与原发性CMV感染的风险的相关性。
6)描述hCMV mRNA疫苗在接受2次剂量的3次剂量方案的CMV血清阴性受试者中预防原发性CMV感染的作用。
7)评价在CMV血清阴性受试者中症状性原发性CMV感染对参与者报告的健康状况和健康相关生产力的影响。
8)在CMV血清阴性男性受试者中，评价hCMV mRNA疫苗对原发性CMV感染的发病率的影响。
主要终点：
本研究的主要终点如下：
1)原发性CMV感染，其定义为如通过基于平台的自动免疫测定所测量，血清IgG从阴性变为阳性结果的血清转化，所述自动免疫测定基于在第三次注射后28天开始评定的不由hCMV mRNA疫苗编码的4种重组CMV抗原(pp150、pp28、pp52、pp38)中的至少一者。
2)每次注射后7天内设定记录的AR，每次注射后28天内非设定记录的AE，第1天至最后一次注射后6个月的MAAE，第1天至EOS的AESI，和同意时至EOS的SAE。
次要终点：
本研究的次要终点如下：
1)第1天、第3个月、第7个月和第12个月的抗原特异性nAb和结合抗体GMT。
2)第18个月、第24个月和第30个月的抗原特异性nAb和结合抗体GMT。
分析
免疫原性评定
本研究的免疫原性将如下评定：
1)如通过针对上皮细胞感染的nAb滴度和针对成纤维细胞感染的nAb滴度所测量，针对疫苗抗原的血清功能性抗体水平。
2)如通过特异于gB和五聚体蛋白的酶联免疫吸附测定所测量，针对疫苗抗原的血清结合抗体滴度。
安全性评定
安全性评定包括监测和记录每个受试者的以下内容：
1)在每次注射后7天内(即，注射之日和后续6天)发生的设定记录的局部和全身AR。将记录第7天之后仍在进行的设定记录AR，直至不再报告，不超过28天。将使用eDiary每天记录设定记录的AR。
a)设定记录的局部AR包括注射部位疼痛、注射部位红斑[发红]、注射部位肿胀/硬结[发硬]和疫苗接种臂同侧的局部腋窝肿胀或压痛。
b)设定记录的全身AR包括头痛、疲劳、肌痛(全身肌肉疼痛)、关节痛(数个关节疼痛)、恶心、发热和发寒。
2)在第8个月开始，受试者将在评定时间表中指定的时间点接受安全性eDiary提示。安全性eDiary将提示参与者报告相关安全性事件的发生。如果eDiary提示识别出相关安全性事件，则经培训研究场所工作人员将在1个工作日内致电参与者，或如果参与者未完成eDiary，则在eDiary完成窗关闭后的2个工作日内致电参与者，以收集与以下有关的信息：MAAE(最后一次注射后至多6个月)、导致退出的AE、SAE和关于与那些事件相关的伴随用药的信息。仅对于CMV血清阴性组，安全性eDiary也将提示参与者报告可与症状性CMV一致的症状。对于尚未因原发性CMV感染而血清转化的CMV血清阴性受试者，场所工作人员将审查安全性eDiary中报告的症状，并且确定是否需要进行CMV疾病评定访视。
3)在第1天和每次注射后28天期间(即，每次注射的第一天和后续27天)观察到或报告的设定记录的AE。
4)导致第1天至第30个月(第887天)停止给药和/或研究参与或退出研究的AE。
5)第1天至最后一次注射后6个月或退出研究的MAAE。
6)第1天至第30个月(第887天)或退出研究的AESI。
7)同意时至第30个月(第887天)或退出研究的SAE。
8)生命征象测量。
9)身体检查结果。
10)每次研究访视时进行妊娠测试。对于在研究期间第1天至EOS妊娠的受试者，将收集妊娠安全性和结果数据；对于在EOS访视后继续妊娠，可收集EOS后的数据。
实施例8：参与阶段III期间妊娠的受试者的婴儿结果的子研究
该子研究的目的在于评定实施例7中所述的hCMV mRNA疫苗主要III期研究过程期间妊娠的女性受试者的活产中巨细胞病毒(CMV)相关结果。此子研究中的所有目标和终点都是探索性的。
由于密切暴露于幼儿的招募需求，hCMV mRNA疫苗主要研究正在招募具有CMV感染和再感染风险的女性群体。由于开发hCMV mRNA疫苗的最终目标是通过在准母亲中建立或增强针对CMV的孕前免疫来预防先天性CMV感染，因此此子研究提供一个独特机会来收集关于CMV感染或再感染风险增加的母亲群体中婴儿结果的信息。该hCMV mRNA疫苗子研究的目标在于评定所有招募的新生儿的CMV脱落，基于临床记录评定先天性CMV(cCMV)的诊断，并评定配对母/婴血液样品中疫苗诱导抗体的胎盘转移。
鉴于hCMV mRNA疫苗主要III期研究中估计招募6,900名(5,500名CMV血清阴性和1,400名CMV血清阳性)女性，并且基于对CMV血清阴性孕妇中每年妊娠发病率、活产、原发性CMV感染率，以及CMV血清阴性和CMV血清阳性孕妇中cCMV感染率的公开估计，估计在参与hCMV mRNA疫苗主要III期研究过程期间最多可存在约1,200例活产，并且预期患有cCMV感染的新生儿数量将极低(图24)。
子研究设计
此子研究可招募在hCMV mRNA疫苗主要III期研究中接受至少1次研究疫苗接种并且在研究参与期间的任何时间妊娠并计划分娩的所有受试者。妊娠定义为在参与hCMVmRNA疫苗主要III期研究过程期间获得的阳性尿液妊娠测试。在参与hCMV mRNA疫苗主要III期研究期间妊娠的所有受试者将不接受任何其他研究注射，但将继续按照安全性、妊娠结果、免疫原性、原发性CMV感染所致的血清转化(CMV血清阴性受试者)、CMV脱落(CMV血清阳性受试者)随访，并且将提供于hCMV mRNA疫苗子研究中。另外，作为hCMV mRNA疫苗主要III期研究的一部分，妊娠的CMV血清阴性受试者可选择更频繁地(每个月一次)返回研究场所进行血液测试，以检测原发性CMV感染所致的血清转化。
此子研究中无随机化程序。所有研究场所工作人员、CRO盲式团队和发起者将继续对个别治疗分配保持盲式。
参与的持续时间可从hCMV mRNA疫苗受试者符合妊娠定义并且提供同意书并确定具有参与hCMV mRNA疫苗子研究的合格性开始直至分娩后6周。如果分娩日期距EOS访视少于6周或在EOS访视后发生，则参与此子研究可延长至hCMV mRNA疫苗的EOS访视(母体研究)后。
预计多达约1,200名受试者和其婴儿具有参与此子研究的合格性。受试者将为其自身和其婴儿提供对于每个子研究程序的个别同意书。
子研究程序可包括以下：
1.在分娩后3周内对新生儿进行1次尿液和唾液采样。
2.请求和审查受试者和/或婴儿医疗记录。
3.如果在受试者研究场所的操作能力范围内，则收集1组配对样品*：分娩≤72小时获得的母亲静脉血和分娩≤72小时获得的新生儿脐带血或新生儿静脉血(如果允许)。
*母亲样品和新生儿样品无需同时收集，只要两者均在分娩≤72小时采集即可。
此子研究将按照方案、GCP和所有适用的监管要求进行。
目标和终点
探索性目标
1.评定治疗组中在hCMV mRNA疫苗III期主要研究期间妊娠的所有受试者的新生儿的CMV脱落发生率。
2.在符合以下任一标准的婴儿中评定a)cCMV感染的临床诊断的存在，和b)cCMV疾病的临床诊断的存在和严重程度：
i)具有在hCMV mRNA疫苗主要研究妊娠报告表中报告的异常；
ii)对于阳性CMV PCR结果，符合目标1下的探索性终点；
iii)为如下CMV血清阴性受试者所生，其在妊娠前或妊娠期间符合1℃MV感染所致的血清转化的主要终点。
3.测量疫苗诱导的五聚体特异性和gB特异性IgG在招募时CMV血清阴性受试者的活产中经胎盘转移的有效性。
探索性终点
1.新生儿唾液和尿液呈CMV PCR阳性，或生命3周内采集的新生儿尿液呈CMV PCR阳性。
2.基于对婴儿和/或受试者医疗记录的审查，临床诊断出cCMV感染，所述医疗记录文件证实符合已公布的cCMV感染标准的测试结果。
在符合临床诊断的cCMV感染标准的婴儿中，基于婴儿医疗记录的审查评定cCMV疾病的临床诊断和cCMV疾病严重程度。
3.分娩≤72小时获得的母亲血液和分娩≤72小时获得的新生儿脐带血或静脉血的配对样品中五聚体特异性和gB特异性结合抗体滴度和nAb滴度的新生儿:母亲比率。
分析
研究评定和程序
对于子研究中的受试者可完成以下研究评定和程序：
1.尿液妊娠测试(如果主要hCMV mRNA疫苗主要研究或其他医疗记录中未记录阳性尿液妊娠测试)。
2.在分娩后3周内对新生儿进行1次尿液或唾液+/-尿液采样以进行CMV PCR。适当时，这些样品可在出生设施或研究诊所收集(图24)。通过PCR确定唾液样品测试呈CMV阳性后将进行尿液采样以进行CMV PCR测试。如果在研究诊所进行，则使用尿袋收集新生儿尿液样品。在最后一次母乳喂养后至少90分钟，使用口腔拭子收集唾液样品。首席研究者将立即将受试者和其婴儿转交于受试者的儿科医生，并向受试者的产科医生告知任何婴儿尿液或唾液样品返回阳性CMV PCR结果。
cCMV感染和疾病的临床诊断将基于婴儿±受试者医疗记录中记录的临床评定和诊断。
3.如果发生或报告以下任何情况，则请求和审查受试者和/或婴儿医疗记录：
a.从分娩后3周内采集的样品(如上)确定婴儿具有阳性尿液或唾液CMV PCR结果；
b.在作为hCMV mRNA疫苗主要研究的一部分完成的妊娠报告表上报告先天性异常或婴儿异常；
c.婴儿为如下CMV血清阴性受试者所生，其在妊娠前或妊娠期间符合原发性CMV感染所致的血清转化的主要终点。
对医疗记录进行审查，以确定支持cCMV感染和疾病诊断的标准。
4.如果在受试者研究场所的操作能力范围内，则收集1组配对样品：分娩≤72小时获得的母亲血液和分娩≤72小时获得的新生儿脐带血或新生儿静脉血。这些样品的免疫原性评定可包括：
a.如通过酶联免疫吸附测定所测量，针对五聚体和gB疫苗抗原的血清结合抗体水平。
b.如通过针对上皮细胞感染的nAb滴度和针对成纤维细胞感染的nAb滴度所测量，针对五聚体和gB疫苗抗原的血清功能性抗体水平。
免疫原性评定
此研究不进行临床功效的评定。此子研究的所有目标都是探索性的。
安全性评定
如hCMV mRNA疫苗主要III期研究(实施例7)中所述评定安全性。
序列
应理解，本文所述的任何mRNA序列可包括5′UTR和/或3′UTR。UTR序列可选自以下序列，或可使用其他已知UTR序列。也应理解，本文所述的任何mRNA构建体还可包含polyA尾和/或帽(例如，7mG(5')ppp(5')NlmpNp)。此外，尽管本文所述的许多mRNA和编码的抗原序列包括信号肽和/或肽标签(例如，C末端His标签)，但应理解，指示信号肽和/或肽标签可用不同信号肽和/或肽标签替换，或者可去除信号肽和/或肽标签。
5'UTR:GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGA GCCACC(SEQ ID NO:13)
3'UTR:UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCU UGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACC CCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:14)
表13-hCMV mRNA和抗原序列
Figure BDA0004094056490001361
/>
Figure BDA0004094056490001371
/>
Figure BDA0004094056490001381
/>
Figure BDA0004094056490001391
/>
Figure BDA0004094056490001401
/>
Figure BDA0004094056490001411
/>
Figure BDA0004094056490001421
等同物
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请都通过引用关于各自所引用的主题并入，在一些情况下，其可涵盖整个文件。以下PCT公开的说明书的全部内容，包括所有附图和所有部分(包括序列表或氨基酸/多核苷酸)通过引用并入本申请中：2016年10月21日提交并且名称为“HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE”的PCT公开第WO2017/070613号，和2017年10月20日提交并且名称为“HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE”的PCT公开第WO2018/075980号，2020年9月11日提交并且名称为“HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE”的PCT公开第WO2021/050864号，和2018年9月4日授权并且名称为“HUMAN CYTOMEGALOVIRUS RNAVACCINES”的美国专利第10,064,935号，和2019年8月20日授权并且名称为“HUMANCYTOMEGALOVIRUS RNA VACCINES”的美国专利第10,383,937号，和2020年7月21日授权并且名称为“HUMAN CYTOMEGALOVIRUS RNA VACCINES”的美国专利第10,716,846号和2020年6月30日授权并且名称为“HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE”的美国专利第10,695,419号。
除非明确相反地指示，否则本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”应理解为意指“至少一”。还应理解，除非明确相反地指示，否则在本文要求保护的包括超过一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不必限于方法的步骤或动作所述的顺序。
在权利要求书以及上述说明书中，所有过渡短语如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……组成”等应理解为开放式的，即意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册(United States Patent Office Manual of PatentExamining Procedures)第2111.03节所述，仅过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭或半封闭式过渡短语。
数值前的术语“约”和“基本上”意指所述数值±10％。
在提供值范围的情况下，本文中尤其涵盖并描述所述范围的上限与下限之间的每个值。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定与本文所述的公开内容的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由所附权利要求书所涵盖。
序列表
<110> 摩登纳特斯有限公司(ModernaTX, Inc.)
<120> 人类巨细胞病毒疫苗
<130> M1378.70132WO00
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 63/136,117
<151> 2021-01-11
<150> US 63/079,421
<151> 2020-09-16
<150> US 63/070,134
<151> 2020-08-25
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2887
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 1
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug gaauccagga 60
ucuggugccu gguagucugc guuaacuugu guaucgucug ucugggugcu gcgguuuccu 120
caucuucuac ucguggaacu ucugcuacuc acagucacca uuccucucau acgacgucug 180
cugcucacuc ucgauccggu ucagucucuc aacgcguaac uucuucccaa acggucagcc 240
augguguuaa cgagaccauc uacaacacua cccucaagua cggagaugug guggggguca 300
auaccaccaa guaccccuau cgcguguguu cuauggccca ggguacggau cuuauucgcu 360
uugaacguaa uaucgucugc accucgauga agcccaucaa ugaagaccug gacgagggca 420
ucaugguggu cuacaaacgc aacaucgucg cgcacaccuu uaagguacga gucuaccaga 480
agguuuugac guuucgucgu agcuacgcuu acauccacac cacuuaucug cugggcagca 540
acacggaaua cguggcgccu ccuauguggg agauucauca uaucaacagc cacagucagu 600
gcuacaguuc cuacagccgc guuauagcag gcacgguuuu cguggcuuau cauagggaca 660
gcuaugaaaa caaaaccaug caauuaaugc ccgacgauua uuccaacacc cacaguaccc 720
guuacgugac ggucaaggau caauggcaca gccgcggcag caccuggcuc uaucgugaga 780
ccuguaaucu gaauuguaug gugaccauca cuacugcgcg cuccaaauau ccuuaucauu 840
uuuucgccac uuccacgggu gacgugguug acauuucucc uuucuacaac ggaaccaauc 900
gcaaugccag cuacuuugga gaaaacgccg acaaguuuuu cauuuuuccg aacuacacua 960
ucgucuccga cuuuggaaga ccgaauucug cguuagagac ccacagguug guggcuuuuc 1020
uugaacgugc ggacucggug aucuccuggg auauacagga cgaaaagaau gucacuuguc 1080
aacucacuuu cugggaagcc ucggaacgca ccauucguuc cgaagccgag gacucguauc 1140
acuuuucuuc ugccaaaaug accgccacuu ucuuaucuaa gaagcaagag gugaacaugu 1200
ccgacucugc gcuggacugc guacgugaug aggcuauaaa uaaguuacag cagauuuuca 1260
auacuucaua caaucaaaca uaugaaaaau auggaaacgu guccgucuuu gaaaccacug 1320
gugguuuggu aguguucugg caagguauca agcaaaaauc ucugguggaa cucgaacguu 1380
uggccaaccg cuccagucug aaucuuacuc auaauagaac caaaagaagu acagauggca 1440
acaaugcaac ucauuuaucc aacauggaau cggugcacaa ucuggucuac gcccagcugc 1500
aguucaccua ugacacguug cgcgguuaca ucaaccgggc gcuggcgcaa aucgcagaag 1560
ccuggugugu ggaucaacgg cgcacccuag aggucuucaa ggaacucagc aagaucaacc 1620
cgucagccau ucucucggcc auuuacaaca aaccgauugc cgcgcguuuc augggugaug 1680
ucuugggccu ggccagcugc gugaccauca accaaaccag cgucaaggug cugcgugaua 1740
ugaacgugaa ggagucgcca ggacgcugcu acucacgacc cguggucauc uuuaauuucg 1800
ccaacagcuc guacgugcag uacggucaac ugggcgagga caacgaaauc cuguugggca 1860
accaccgcac ugaggaaugu cagcuuccca gccucaagau cuucaucgcc gggaacucgg 1920
ccuacgagua cguggacuac cucuucaaac gcaugauuga ccucagcagu aucuccaccg 1980
ucgacagcau gaucgcccug gauaucgacc cgcuggaaaa uaccgacuuc aggguacugg 2040
aacuuuacuc gcagaaagag cugcguucca gcaacguuuu ugaccucgaa gagaucaugc 2100
gcgaauucaa cucguacaag cagcggguaa aguacgugga ggacaaggua gucgacccgc 2160
uaccgcccua ccucaagggu cuggacgacc ucaugagcgg ccugggcgcc gcgggaaagg 2220
ccguuggcgu agccauuggg gccgugggug gcgcgguggc cuccgugguc gaaggcguug 2280
ccaccuuccu caaaaacccc uucggagcgu ucaccaucau ccucguggcc auagcuguag 2340
ucauuaucac uuauuugauc uauacucgac agcggcguuu gugcacgcag ccgcugcaga 2400
accucuuucc cuaucuggug uccgccgacg ggaccaccgu gacgucgggc agcaccaaag 2460
acacgucguu acaggcuccg ccuuccuacg aggaaagugu uuauaauucu ggucgcaaag 2520
gaccgggacc accgucgucu gaugcaucca cggcggcucc gccuuacacc aacgagcagg 2580
cuuaccagau gcuucuggcc cuggcccguc uggacgcaga gcagcgagcg cagcagaacg 2640
guacagauuc uuuggacgga cggacuggca cgcaggacaa gggacagaag cccaaccuac 2700
uagaccgacu gcgacaucgc aaaaacggcu accgacacuu gaaagacucu gacgaagaag 2760
agaacgucug auaauaggcu ggagccucgg uggccaugcu ucuugccccu ugggccuccc 2820
cccagccccu ccuccccuuc cugcacccgu acccccgugg ucuuugaaua aagucugagu 2880
gggcggc 2887
<210> 2
<211> 679
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 2
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug agucccaaag 60
aucugacgcc guucuugacg gcguuguggc ugcuauuggg ucacagccgc gugccgcggg 120
ugcgcgcaga agaauguugc gaauucauaa acgucaacca cccgccggaa cgcuguuacg 180
auuucaaaau gugcaaucgc uucaccgucg cgcugcggug uccggacggc gaagucugcu 240
acagucccga gaaaacggcu gagauucgcg ggaucgucac caccaugacc cauucauuga 300
cacgccaggu cguacacaac aaacugacga gcugcaacua caauccguua uaccucgaag 360
cugacgggcg aauacgcugc ggcaaaguaa acgacaaggc gcaguaccug cugggcgccg 420
cuggcagcgu ucccuaucga uggaucaauc uggaauacga caagauaacc cggaucgugg 480
gccuggauca guaccuggag agcguuaaga aacacaaacg gcuggaugug ugccgcgcua 540
aaaugggcua uaugcugcag ugauaauagg cuggagccuc gguggccaug cuucuugccc 600
cuugggccuc cccccagccc cuccuccccu uccugcaccc guacccccgu ggucuuugaa 660
uaaagucuga gugggcggc 679
<210> 3
<211> 808
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 3
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug cugcggcuuc 60
ugcuucguca ccacuuucac ugccugcuuc ugugcgcggu uugggcaacg cccugucugg 120
cgucuccgug gucgacgcua acagcaaacc agaauccguc cccgccaugg ucuaaacuga 180
cguauuccaa accgcaugac gcggcgacgu uuuacugucc uuuucucuau cccucgcccc 240
cacgaucccc cuugcaauuc ucgggguucc agcggguauc aacggguccc gagugucgca 300
acgagacccu guaucugcug uacaaccggg aaggccagac cuugguggag agaagcucca 360
ccugggugaa aaaggugauc ugguaccuga gcggucggaa ccaaaccauc cuccaacgga 420
ugccccgaac ggcuucgaaa ccgagcgacg gaaacgugca gaucagcgug gaagacgcca 480
agauuuuugg agcgcacaug gugcccaagc agaccaagcu gcuacgcuuc gucgucaacg 540
auggcacacg uuaucagaug ugugugauga agcuggagag cugggcucac gucuuccggg 600
acuacagcgu gucuuuucag gugcgauuga cguucaccga ggccaauaac cagacuuaca 660
ccuucugcac ccaucccaau cucaucguuu gauaauaggc uggagccucg guggccaugc 720
uucuugcccc uugggccucc ccccagcccc uccuccccuu ccugcacccg uacccccgug 780
gucuuugaau aaagucugag ugggcggc 808
<210> 4
<211> 553
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 4
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug cggcuguguc 60
ggguguggcu gucuguuugu cugugcgccg uggugcuggg ucagugccag cgggaaaccg 120
cggaaaagaa cgauuauuac cgaguaccgc auuacuggga cgcgugcucu cgcgcgcugc 180
ccgaccaaac ccguuacaag uauguggaac agcucgugga ccucacguug aacuaccacu 240
acgaugcgag ccacggcuug gacaacuuug acgugcucaa gagaaucaac gugaccgagg 300
ugucguugcu caucagcgac uuuagacguc agaaccgucg cggcggcacc aacaaaagga 360
ccacguucaa cgccgccggu ucgcuggcgc cacacgcccg gagccucgag uucagcgugc 420
ggcucuuugc caacugauaa uaggcuggag ccucgguggc caugcuucuu gccccuuggg 480
ccucccccca gccccuccuc cccuuccugc acccguaccc ccguggucuu ugaauaaagu 540
cugagugggc ggc 553
<210> 5
<211> 2392
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 5
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug cggccaggcc 60
uccccuccua ccucaucauc cucgccgucu gucucuucag ccaccuacuu ucgucacgau 120
auggcgcaga agccguaucc gaaccgcugg acaaagcguu ucaccuacug cucaacaccu 180
acgggagacc cauccgcuuc cugcgugaaa auaccaccca guguaccuac aacagcagcc 240
uccguaacag cacggucguc agggaaaacg ccaucaguuu caacuucuuc caaagcuaua 300
aucaauacua uguauuccau augccucgau gucucuuugc ggguccucug gcggagcagu 360
uucugaacca gguagaucug accgaaaccc uggaaagaua ccaacagaga cuuaacacuu 420
acgcgcuggu auccaaagac cuggccagcu accgaucuuu cucgcagcag cuaaaggcac 480
aagacagccu aggugaacag cccaccacug ugccaccgcc cauugaccug ucaauaccuc 540
acguuuggau gccaccgcaa accacuccac acggcuggac agaaucacau accaccucag 600
gacuacaccg accacacuuu aaccagaccu guauccucuu ugauggacac gaucuacuau 660
ucagcaccgu cacaccuugu uugcaccaag gcuuuuaccu caucgacgaa cuacguuacg 720
uuaaaauaac acugaccgag gacuucuucg uaguuacggu guccauagac gacgacacac 780
ccaugcugcu uaucuucggc caucuuccac gcguacuuuu caaagcgccc uaucaacgcg 840
acaacuuuau acuacgacaa acugagaaac acgagcuccu ggugcuaguu aagaaagauc 900
aacugaaccg ucacucuuau cucaaagacc cggacuuucu ugacgccgca cuugacuuca 960
acuaccuaga ccucagcgca cuacuacgua acagcuuuca ccguuacgcc guggauguac 1020
ucaagagcgg ucgaugucag augcuggacc gccgcacggu agaaauggcc uucgccuacg 1080
cauuagcacu guucgcagca gcccgacaag aagaggccgg cgcccaaguc uccgucccac 1140
gggcccuaga ccgccaggcc gcacucuuac aaauacaaga auuuaugauc accugccucu 1200
cacaaacacc accacgcacc acguugcugc uguaucccac ggccguggac cuggccaaac 1260
gagcccuuug gacaccgaau cagaucaccg acaucaccag ccucguacgc cuggucuaca 1320
uacucucuaa acagaaucag caacaucuca ucccccaaug ggcacuacga cagaucgccg 1380
acuuugcccu aaaacuacac aaaacgcacc uggccucuuu ucuuucagcc uucgcacgcc 1440
aagaacucua ccucaugggc agccucgucc acuccaugcu gguacauacg acggagagac 1500
gcgaaaucuu caucguagaa acgggccucu guucauuggc cgagcuauca cacuuuacgc 1560
aguuguuagc ucauccacac cacgaauacc ucagcgaccu guacacaccc uguuccagua 1620
gcgggcgacg cgaucacucg cucgaacgcc ucacgcgucu cuuccccgau gccaccgucc 1680
ccgcuaccgu ucccgccgcc cucuccaucc uaucuaccau gcaaccaagc acgcuggaaa 1740
ccuuccccga ccuguuuugc uugccgcucg gcgaauccuu cuccgcgcug accgucuccg 1800
aacacgucag uuauaucgua acaaaccagu accugaucaa agguaucucc uacccugucu 1860
ccaccaccgu cguaggccag agccucauca ucacccagac ggacagucaa acuaaaugcg 1920
aacugacgcg caacaugcau accacacaca gcaucacagu ggcgcucaac auuucgcuag 1980
aaaacugcgc cuuuugccaa agcgcccugc uagaauacga cgacacgcaa ggcgucauca 2040
acaucaugua caugcacgac ucggacgacg uccuuuucgc ccuggauccc uacaacgaag 2100
ugguggucuc aucuccgcga acucacuacc ucaugcuuuu gaagaacggu acgguacuag 2160
aaguaacuga cgucgucgug gacgccaccg acagucgucu ccucaugaug uccgucuacg 2220
cgcuaucggc caucaucggc aucuaucugc ucuaccgcau gcucaagaca ugcugauaau 2280
aggcuggagc cucgguggcc augcuucuug ccccuugggc cuccccccag ccccuccucc 2340
ccuuccugca cccguacccc cguggucuuu gaauaaaguc ugagugggcg gc 2392
<210> 6
<211> 1000
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 6
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug ugccgccgcc 60
cggauugcgg cuucucuuuc ucaccuggac cggugauacu gcuguggugu ugccuucugc 120
ugcccauugu uuccucagcc gccgucagcg ucgcuccuac cgccgccgag aaaguccccg 180
cggagugccc cgaacuaacg cgccgaugcu uguuggguga gguguuugag ggugacaagu 240
augaaaguug gcugcgcccg uuggugaaug uuaccgggcg cgauggcccg cuaucgcaac 300
uuauccguua ccgucccguu acgccggagg ccgccaacuc cgugcuguug gacgaggcuu 360
uccuggacac ucuggcccug cuguacaaca auccggauca auugcgggcc cugcugacgc 420
uguugagcuc ggacacagcg ccgcgcugga ugacggugau gcgcggcuac agcgagugcg 480
gcgauggcuc gccggccgug uacacgugcg uggacgaccu gugccgcggc uacgaccuca 540
cgcgacuguc auacgggcgc agcaucuuca cggaacacgu guuaggcuuc gagcuggugc 600
caccgucucu cuuuaacgug gugguggcca uacgcaacga agccacgcgu accaaccgcg 660
ccgugcgucu gcccgugagc accgcugccg cgcccgaggg caucacgcuc uuuuacggcc 720
uguacaacgc agugaaggaa uucugccugc gucaccagcu ggacccgccg cugcuacgcc 780
accuagauaa auacuacgcc ggacugccgc ccgagcugaa gcagacgcgc gucaaccugc 840
cggcucacuc gcgcuauggc ccucaagcag uggaugcucg cugauaauag gcuggagccu 900
cgguggccau gcuucuugcc ccuugggccu ccccccagcc ccuccucccc uuccugcacc 960
cguacccccg uggucuuuga auaaagucug agugggcggc 1000
<210> 7
<211> 2721
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 7
auggaaucca ggaucuggug ccugguaguc ugcguuaacu uguguaucgu cugucugggu 60
gcugcgguuu ccucaucuuc uacucgugga acuucugcua cucacaguca ccauuccucu 120
cauacgacgu cugcugcuca cucucgaucc gguucagucu cucaacgcgu aacuucuucc 180
caaacgguca gccauggugu uaacgagacc aucuacaaca cuacccucaa guacggagau 240
gugguggggg ucaauaccac caaguacccc uaucgcgugu guucuauggc ccaggguacg 300
gaucuuauuc gcuuugaacg uaauaucguc ugcaccucga ugaagcccau caaugaagac 360
cuggacgagg gcaucauggu ggucuacaaa cgcaacaucg ucgcgcacac cuuuaaggua 420
cgagucuacc agaagguuuu gacguuucgu cguagcuacg cuuacaucca caccacuuau 480
cugcugggca gcaacacgga auacguggcg ccuccuaugu gggagauuca ucauaucaac 540
agccacaguc agugcuacag uuccuacagc cgcguuauag caggcacggu uuucguggcu 600
uaucauaggg acagcuauga aaacaaaacc augcaauuaa ugcccgacga uuauuccaac 660
acccacagua cccguuacgu gacggucaag gaucaauggc acagccgcgg cagcaccugg 720
cucuaucgug agaccuguaa ucugaauugu auggugacca ucacuacugc gcgcuccaaa 780
uauccuuauc auuuuuucgc cacuuccacg ggugacgugg uugacauuuc uccuuucuac 840
aacggaacca aucgcaaugc cagcuacuuu ggagaaaacg ccgacaaguu uuucauuuuu 900
ccgaacuaca cuaucgucuc cgacuuugga agaccgaauu cugcguuaga gacccacagg 960
uugguggcuu uucuugaacg ugcggacucg gugaucuccu gggauauaca ggacgaaaag 1020
aaugucacuu gucaacucac uuucugggaa gccucggaac gcaccauucg uuccgaagcc 1080
gaggacucgu aucacuuuuc uucugccaaa augaccgcca cuuucuuauc uaagaagcaa 1140
gaggugaaca uguccgacuc ugcgcuggac ugcguacgug augaggcuau aaauaaguua 1200
cagcagauuu ucaauacuuc auacaaucaa acauaugaaa aauauggaaa cguguccguc 1260
uuugaaacca cuggugguuu gguaguguuc uggcaaggua ucaagcaaaa aucucuggug 1320
gaacucgaac guuuggccaa ccgcuccagu cugaaucuua cucauaauag aaccaaaaga 1380
aguacagaug gcaacaaugc aacucauuua uccaacaugg aaucggugca caaucugguc 1440
uacgcccagc ugcaguucac cuaugacacg uugcgcgguu acaucaaccg ggcgcuggcg 1500
caaaucgcag aagccuggug uguggaucaa cggcgcaccc uagaggucuu caaggaacuc 1560
agcaagauca acccgucagc cauucucucg gccauuuaca acaaaccgau ugccgcgcgu 1620
uucaugggug augucuuggg ccuggccagc ugcgugacca ucaaccaaac cagcgucaag 1680
gugcugcgug auaugaacgu gaaggagucg ccaggacgcu gcuacucacg acccgugguc 1740
aucuuuaauu ucgccaacag cucguacgug caguacgguc aacugggcga ggacaacgaa 1800
auccuguugg gcaaccaccg cacugaggaa ugucagcuuc ccagccucaa gaucuucauc 1860
gccgggaacu cggccuacga guacguggac uaccucuuca aacgcaugau ugaccucagc 1920
aguaucucca ccgucgacag caugaucgcc cuggauaucg acccgcugga aaauaccgac 1980
uucaggguac uggaacuuua cucgcagaaa gagcugcguu ccagcaacgu uuuugaccuc 2040
gaagagauca ugcgcgaauu caacucguac aagcagcggg uaaaguacgu ggaggacaag 2100
guagucgacc cgcuaccgcc cuaccucaag ggucuggacg accucaugag cggccugggc 2160
gccgcgggaa aggccguugg cguagccauu ggggccgugg guggcgcggu ggccuccgug 2220
gucgaaggcg uugccaccuu ccucaaaaac cccuucggag cguucaccau cauccucgug 2280
gccauagcug uagucauuau cacuuauuug aucuauacuc gacagcggcg uuugugcacg 2340
cagccgcugc agaaccucuu ucccuaucug guguccgccg acgggaccac cgugacgucg 2400
ggcagcacca aagacacguc guuacaggcu ccgccuuccu acgaggaaag uguuuauaau 2460
ucuggucgca aaggaccggg accaccgucg ucugaugcau ccacggcggc uccgccuuac 2520
accaacgagc aggcuuacca gaugcuucug gcccuggccc gucuggacgc agagcagcga 2580
gcgcagcaga acgguacaga uucuuuggac ggacggacug gcacgcagga caagggacag 2640
aagcccaacc uacuagaccg acugcgacau cgcaaaaacg gcuaccgaca cuugaaagac 2700
ucugacgaag aagagaacgu c 2721
<210> 8
<211> 513
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 8
augaguccca aagaucugac gccguucuug acggcguugu ggcugcuauu gggucacagc 60
cgcgugccgc gggugcgcgc agaagaaugu ugcgaauuca uaaacgucaa ccacccgccg 120
gaacgcuguu acgauuucaa aaugugcaau cgcuucaccg ucgcgcugcg guguccggac 180
ggcgaagucu gcuacagucc cgagaaaacg gcugagauuc gcgggaucgu caccaccaug 240
acccauucau ugacacgcca ggucguacac aacaaacuga cgagcugcaa cuacaauccg 300
uuauaccucg aagcugacgg gcgaauacgc ugcggcaaag uaaacgacaa ggcgcaguac 360
cugcugggcg ccgcuggcag cguucccuau cgauggauca aucuggaaua cgacaagaua 420
acccggaucg ugggccugga ucaguaccug gagagcguua agaaacacaa acggcuggau 480
gugugccgcg cuaaaauggg cuauaugcug cag 513
<210> 9
<211> 642
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 9
augcugcggc uucugcuucg ucaccacuuu cacugccugc uucugugcgc gguuugggca 60
acgcccuguc uggcgucucc guggucgacg cuaacagcaa accagaaucc guccccgcca 120
uggucuaaac ugacguauuc caaaccgcau gacgcggcga cguuuuacug uccuuuucuc 180
uaucccucgc ccccacgauc ccccuugcaa uucucggggu uccagcgggu aucaacgggu 240
cccgaguguc gcaacgagac ccuguaucug cuguacaacc gggaaggcca gaccuuggug 300
gagagaagcu ccaccugggu gaaaaaggug aucugguacc ugagcggucg gaaccaaacc 360
auccuccaac ggaugccccg aacggcuucg aaaccgagcg acggaaacgu gcagaucagc 420
guggaagacg ccaagauuuu uggagcgcac auggugccca agcagaccaa gcugcuacgc 480
uucgucguca acgauggcac acguuaucag auguguguga ugaagcugga gagcugggcu 540
cacgucuucc gggacuacag cgugucuuuu caggugcgau ugacguucac cgaggccaau 600
aaccagacuu acaccuucug cacccauccc aaucucaucg uu 642
<210> 10
<211> 387
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 10
augcggcugu gucgggugug gcugucuguu ugucugugcg ccguggugcu gggucagugc 60
cagcgggaaa ccgcggaaaa gaacgauuau uaccgaguac cgcauuacug ggacgcgugc 120
ucucgcgcgc ugcccgacca aacccguuac aaguaugugg aacagcucgu ggaccucacg 180
uugaacuacc acuacgaugc gagccacggc uuggacaacu uugacgugcu caagagaauc 240
aacgugaccg aggugucguu gcucaucagc gacuuuagac gucagaaccg ucgcggcggc 300
accaacaaaa ggaccacguu caacgccgcc gguucgcugg cgccacacgc ccggagccuc 360
gaguucagcg ugcggcucuu ugccaac 387
<210> 11
<211> 2226
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 11
augcggccag gccuccccuc cuaccucauc auccucgccg ucugucucuu cagccaccua 60
cuuucgucac gauauggcgc agaagccgua uccgaaccgc uggacaaagc guuucaccua 120
cugcucaaca ccuacgggag acccauccgc uuccugcgug aaaauaccac ccaguguacc 180
uacaacagca gccuccguaa cagcacgguc gucagggaaa acgccaucag uuucaacuuc 240
uuccaaagcu auaaucaaua cuauguauuc cauaugccuc gaugucucuu ugcggguccu 300
cuggcggagc aguuucugaa ccagguagau cugaccgaaa cccuggaaag auaccaacag 360
agacuuaaca cuuacgcgcu gguauccaaa gaccuggcca gcuaccgauc uuucucgcag 420
cagcuaaagg cacaagacag ccuaggugaa cagcccacca cugugccacc gcccauugac 480
cugucaauac cucacguuug gaugccaccg caaaccacuc cacacggcug gacagaauca 540
cauaccaccu caggacuaca ccgaccacac uuuaaccaga ccuguauccu cuuugaugga 600
cacgaucuac uauucagcac cgucacaccu uguuugcacc aaggcuuuua ccucaucgac 660
gaacuacguu acguuaaaau aacacugacc gaggacuucu ucguaguuac gguguccaua 720
gacgacgaca cacccaugcu gcuuaucuuc ggccaucuuc cacgcguacu uuucaaagcg 780
cccuaucaac gcgacaacuu uauacuacga caaacugaga aacacgagcu ccuggugcua 840
guuaagaaag aucaacugaa ccgucacucu uaucucaaag acccggacuu ucuugacgcc 900
gcacuugacu ucaacuaccu agaccucagc gcacuacuac guaacagcuu ucaccguuac 960
gccguggaug uacucaagag cggucgaugu cagaugcugg accgccgcac gguagaaaug 1020
gccuucgccu acgcauuagc acuguucgca gcagcccgac aagaagaggc cggcgcccaa 1080
gucuccgucc cacgggcccu agaccgccag gccgcacucu uacaaauaca agaauuuaug 1140
aucaccugcc ucucacaaac accaccacgc accacguugc ugcuguaucc cacggccgug 1200
gaccuggcca aacgagcccu uuggacaccg aaucagauca ccgacaucac cagccucgua 1260
cgccuggucu acauacucuc uaaacagaau cagcaacauc ucauccccca augggcacua 1320
cgacagaucg ccgacuuugc ccuaaaacua cacaaaacgc accuggccuc uuuucuuuca 1380
gccuucgcac gccaagaacu cuaccucaug ggcagccucg uccacuccau gcugguacau 1440
acgacggaga gacgcgaaau cuucaucgua gaaacgggcc ucuguucauu ggccgagcua 1500
ucacacuuua cgcaguuguu agcucaucca caccacgaau accucagcga ccuguacaca 1560
cccuguucca guagcgggcg acgcgaucac ucgcucgaac gccucacgcg ucucuucccc 1620
gaugccaccg uccccgcuac cguucccgcc gcccucucca uccuaucuac caugcaacca 1680
agcacgcugg aaaccuuccc cgaccuguuu ugcuugccgc ucggcgaauc cuucuccgcg 1740
cugaccgucu ccgaacacgu caguuauauc guaacaaacc aguaccugau caaagguauc 1800
uccuacccug ucuccaccac cgucguaggc cagagccuca ucaucaccca gacggacagu 1860
caaacuaaau gcgaacugac gcgcaacaug cauaccacac acagcaucac aguggcgcuc 1920
aacauuucgc uagaaaacug cgccuuuugc caaagcgccc ugcuagaaua cgacgacacg 1980
caaggcguca ucaacaucau guacaugcac gacucggacg acguccuuuu cgcccuggau 2040
cccuacaacg aagugguggu cucaucuccg cgaacucacu accucaugcu uuugaagaac 2100
gguacgguac uagaaguaac ugacgucguc guggacgcca ccgacagucg ucuccucaug 2160
auguccgucu acgcgcuauc ggccaucauc ggcaucuauc ugcucuaccg caugcucaag 2220
acaugc 2226
<210> 12
<211> 834
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 12
augugccgcc gcccggauug cggcuucucu uucucaccug gaccggugau acugcugugg 60
uguugccuuc ugcugcccau uguuuccuca gccgccguca gcgucgcucc uaccgccgcc 120
gagaaagucc ccgcggagug ccccgaacua acgcgccgau gcuuguuggg ugagguguuu 180
gagggugaca aguaugaaag uuggcugcgc ccguugguga auguuaccgg gcgcgauggc 240
ccgcuaucgc aacuuauccg uuaccguccc guuacgccgg aggccgccaa cuccgugcug 300
uuggacgagg cuuuccugga cacucuggcc cugcuguaca acaauccgga ucaauugcgg 360
gcccugcuga cgcuguugag cucggacaca gcgccgcgcu ggaugacggu gaugcgcggc 420
uacagcgagu gcggcgaugg cucgccggcc guguacacgu gcguggacga ccugugccgc 480
ggcuacgacc ucacgcgacu gucauacggg cgcagcaucu ucacggaaca cguguuaggc 540
uucgagcugg ugccaccguc ucucuuuaac gugguggugg ccauacgcaa cgaagccacg 600
cguaccaacc gcgccgugcg ucugcccgug agcaccgcug ccgcgcccga gggcaucacg 660
cucuuuuacg gccuguacaa cgcagugaag gaauucugcc ugcgucacca gcuggacccg 720
ccgcugcuac gccaccuaga uaaauacuac gccggacugc cgcccgagcu gaagcagacg 780
cgcgucaacc ugccggcuca cucgcgcuau ggcccucaag caguggaugc ucgc 834
<210> 13
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 13
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccacc 47
<210> 14
<211> 119
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 14
ugauaauagg cuggagccuc gguggccaug cuucuugccc cuugggccuc cccccagccc 60
cuccuccccu uccugcaccc guacccccgu ggucuuugaa uaaagucuga gugggcggc 119
<210> 15
<211> 907
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 15
Met Glu Ser Arg Ile Trp Cys Leu Val Val Cys Val Asn Leu Cys Ile
1 5 10 15
Val Cys Leu Gly Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Thr Arg Gly Thr Ser
20 25 30
Ala Thr His Ser His His Ser Ser His Thr Thr Ser Ala Ala His Ser
35 40 45
Arg Ser Gly Ser Val Ser Gln Arg Val Thr Ser Ser Gln Thr Val Ser
50 55 60
His Gly Val Asn Glu Thr Ile Tyr Asn Thr Thr Leu Lys Tyr Gly Asp
65 70 75 80
Val Val Gly Val Asn Thr Thr Lys Tyr Pro Tyr Arg Val Cys Ser Met
85 90 95
Ala Gln Gly Thr Asp Leu Ile Arg Phe Glu Arg Asn Ile Val Cys Thr
100 105 110
Ser Met Lys Pro Ile Asn Glu Asp Leu Asp Glu Gly Ile Met Val Val
115 120 125
Tyr Lys Arg Asn Ile Val Ala His Thr Phe Lys Val Arg Val Tyr Gln
130 135 140
Lys Val Leu Thr Phe Arg Arg Ser Tyr Ala Tyr Ile His Thr Thr Tyr
145 150 155 160
Leu Leu Gly Ser Asn Thr Glu Tyr Val Ala Pro Pro Met Trp Glu Ile
165 170 175
His His Ile Asn Ser His Ser Gln Cys Tyr Ser Ser Tyr Ser Arg Val
180 185 190
Ile Ala Gly Thr Val Phe Val Ala Tyr His Arg Asp Ser Tyr Glu Asn
195 200 205
Lys Thr Met Gln Leu Met Pro Asp Asp Tyr Ser Asn Thr His Ser Thr
210 215 220
Arg Tyr Val Thr Val Lys Asp Gln Trp His Ser Arg Gly Ser Thr Trp
225 230 235 240
Leu Tyr Arg Glu Thr Cys Asn Leu Asn Cys Met Val Thr Ile Thr Thr
245 250 255
Ala Arg Ser Lys Tyr Pro Tyr His Phe Phe Ala Thr Ser Thr Gly Asp
260 265 270
Val Val Asp Ile Ser Pro Phe Tyr Asn Gly Thr Asn Arg Asn Ala Ser
275 280 285
Tyr Phe Gly Glu Asn Ala Asp Lys Phe Phe Ile Phe Pro Asn Tyr Thr
290 295 300
Ile Val Ser Asp Phe Gly Arg Pro Asn Ser Ala Leu Glu Thr His Arg
305 310 315 320
Leu Val Ala Phe Leu Glu Arg Ala Asp Ser Val Ile Ser Trp Asp Ile
325 330 335
Gln Asp Glu Lys Asn Val Thr Cys Gln Leu Thr Phe Trp Glu Ala Ser
340 345 350
Glu Arg Thr Ile Arg Ser Glu Ala Glu Asp Ser Tyr His Phe Ser Ser
355 360 365
Ala Lys Met Thr Ala Thr Phe Leu Ser Lys Lys Gln Glu Val Asn Met
370 375 380
Ser Asp Ser Ala Leu Asp Cys Val Arg Asp Glu Ala Ile Asn Lys Leu
385 390 395 400
Gln Gln Ile Phe Asn Thr Ser Tyr Asn Gln Thr Tyr Glu Lys Tyr Gly
405 410 415
Asn Val Ser Val Phe Glu Thr Thr Gly Gly Leu Val Val Phe Trp Gln
420 425 430
Gly Ile Lys Gln Lys Ser Leu Val Glu Leu Glu Arg Leu Ala Asn Arg
435 440 445
Ser Ser Leu Asn Leu Thr His Asn Arg Thr Lys Arg Ser Thr Asp Gly
450 455 460
Asn Asn Ala Thr His Leu Ser Asn Met Glu Ser Val His Asn Leu Val
465 470 475 480
Tyr Ala Gln Leu Gln Phe Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Gly Tyr Ile Asn
485 490 495
Arg Ala Leu Ala Gln Ile Ala Glu Ala Trp Cys Val Asp Gln Arg Arg
500 505 510
Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile
515 520 525
Leu Ser Ala Ile Tyr Asn Lys Pro Ile Ala Ala Arg Phe Met Gly Asp
530 535 540
Val Leu Gly Leu Ala Ser Cys Val Thr Ile Asn Gln Thr Ser Val Lys
545 550 555 560
Val Leu Arg Asp Met Asn Val Lys Glu Ser Pro Gly Arg Cys Tyr Ser
565 570 575
Arg Pro Val Val Ile Phe Asn Phe Ala Asn Ser Ser Tyr Val Gln Tyr
580 585 590
Gly Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Asn His Arg Thr
595 600 605
Glu Glu Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ser
610 615 620
Ala Tyr Glu Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Lys Arg Met Ile Asp Leu Ser
625 630 635 640
Ser Ile Ser Thr Val Asp Ser Met Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro Leu
645 650 655
Glu Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu
660 665 670
Arg Ser Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn
675 680 685
Ser Tyr Lys Gln Arg Val Lys Tyr Val Glu Asp Lys Val Val Asp Pro
690 695 700
Leu Pro Pro Tyr Leu Lys Gly Leu Asp Asp Leu Met Ser Gly Leu Gly
705 710 715 720
Ala Ala Gly Lys Ala Val Gly Val Ala Ile Gly Ala Val Gly Gly Ala
725 730 735
Val Ala Ser Val Val Glu Gly Val Ala Thr Phe Leu Lys Asn Pro Phe
740 745 750
Gly Ala Phe Thr Ile Ile Leu Val Ala Ile Ala Val Val Ile Ile Thr
755 760 765
Tyr Leu Ile Tyr Thr Arg Gln Arg Arg Leu Cys Thr Gln Pro Leu Gln
770 775 780
Asn Leu Phe Pro Tyr Leu Val Ser Ala Asp Gly Thr Thr Val Thr Ser
785 790 795 800
Gly Ser Thr Lys Asp Thr Ser Leu Gln Ala Pro Pro Ser Tyr Glu Glu
805 810 815
Ser Val Tyr Asn Ser Gly Arg Lys Gly Pro Gly Pro Pro Ser Ser Asp
820 825 830
Ala Ser Thr Ala Ala Pro Pro Tyr Thr Asn Glu Gln Ala Tyr Gln Met
835 840 845
Leu Leu Ala Leu Ala Arg Leu Asp Ala Glu Gln Arg Ala Gln Gln Asn
850 855 860
Gly Thr Asp Ser Leu Asp Gly Arg Thr Gly Thr Gln Asp Lys Gly Gln
865 870 875 880
Lys Pro Asn Leu Leu Asp Arg Leu Arg His Arg Lys Asn Gly Tyr Arg
885 890 895
His Leu Lys Asp Ser Asp Glu Glu Glu Asn Val
900 905
<210> 16
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 16
Met Ser Pro Lys Asp Leu Thr Pro Phe Leu Thr Ala Leu Trp Leu Leu
1 5 10 15
Leu Gly His Ser Arg Val Pro Arg Val Arg Ala Glu Glu Cys Cys Glu
20 25 30
Phe Ile Asn Val Asn His Pro Pro Glu Arg Cys Tyr Asp Phe Lys Met
35 40 45
Cys Asn Arg Phe Thr Val Ala Leu Arg Cys Pro Asp Gly Glu Val Cys
50 55 60
Tyr Ser Pro Glu Lys Thr Ala Glu Ile Arg Gly Ile Val Thr Thr Met
65 70 75 80
Thr His Ser Leu Thr Arg Gln Val Val His Asn Lys Leu Thr Ser Cys
85 90 95
Asn Tyr Asn Pro Leu Tyr Leu Glu Ala Asp Gly Arg Ile Arg Cys Gly
100 105 110
Lys Val Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Leu Leu Gly Ala Ala Gly Ser Val
115 120 125
Pro Tyr Arg Trp Ile Asn Leu Glu Tyr Asp Lys Ile Thr Arg Ile Val
130 135 140
Gly Leu Asp Gln Tyr Leu Glu Ser Val Lys Lys His Lys Arg Leu Asp
145 150 155 160
Val Cys Arg Ala Lys Met Gly Tyr Met Leu Gln
165 170
<210> 17
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 17
Met Leu Arg Leu Leu Leu Arg His His Phe His Cys Leu Leu Leu Cys
1 5 10 15
Ala Val Trp Ala Thr Pro Cys Leu Ala Ser Pro Trp Ser Thr Leu Thr
20 25 30
Ala Asn Gln Asn Pro Ser Pro Pro Trp Ser Lys Leu Thr Tyr Ser Lys
35 40 45
Pro His Asp Ala Ala Thr Phe Tyr Cys Pro Phe Leu Tyr Pro Ser Pro
50 55 60
Pro Arg Ser Pro Leu Gln Phe Ser Gly Phe Gln Arg Val Ser Thr Gly
65 70 75 80
Pro Glu Cys Arg Asn Glu Thr Leu Tyr Leu Leu Tyr Asn Arg Glu Gly
85 90 95
Gln Thr Leu Val Glu Arg Ser Ser Thr Trp Val Lys Lys Val Ile Trp
100 105 110
Tyr Leu Ser Gly Arg Asn Gln Thr Ile Leu Gln Arg Met Pro Arg Thr
115 120 125
Ala Ser Lys Pro Ser Asp Gly Asn Val Gln Ile Ser Val Glu Asp Ala
130 135 140
Lys Ile Phe Gly Ala His Met Val Pro Lys Gln Thr Lys Leu Leu Arg
145 150 155 160
Phe Val Val Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Gln Met Cys Val Met Lys Leu
165 170 175
Glu Ser Trp Ala His Val Phe Arg Asp Tyr Ser Val Ser Phe Gln Val
180 185 190
Arg Leu Thr Phe Thr Glu Ala Asn Asn Gln Thr Tyr Thr Phe Cys Thr
195 200 205
His Pro Asn Leu Ile Val
210
<210> 18
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 18
Met Arg Leu Cys Arg Val Trp Leu Ser Val Cys Leu Cys Ala Val Val
1 5 10 15
Leu Gly Gln Cys Gln Arg Glu Thr Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg
20 25 30
Val Pro His Tyr Trp Asp Ala Cys Ser Arg Ala Leu Pro Asp Gln Thr
35 40 45
Arg Tyr Lys Tyr Val Glu Gln Leu Val Asp Leu Thr Leu Asn Tyr His
50 55 60
Tyr Asp Ala Ser His Gly Leu Asp Asn Phe Asp Val Leu Lys Arg Ile
65 70 75 80
Asn Val Thr Glu Val Ser Leu Leu Ile Ser Asp Phe Arg Arg Gln Asn
85 90 95
Arg Arg Gly Gly Thr Asn Lys Arg Thr Thr Phe Asn Ala Ala Gly Ser
100 105 110
Leu Ala Pro His Ala Arg Ser Leu Glu Phe Ser Val Arg Leu Phe Ala
115 120 125
Asn
<210> 19
<211> 742
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 19
Met Arg Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Leu Ile Ile Leu Ala Val Cys Leu
1 5 10 15
Phe Ser His Leu Leu Ser Ser Arg Tyr Gly Ala Glu Ala Val Ser Glu
20 25 30
Pro Leu Asp Lys Ala Phe His Leu Leu Leu Asn Thr Tyr Gly Arg Pro
35 40 45
Ile Arg Phe Leu Arg Glu Asn Thr Thr Gln Cys Thr Tyr Asn Ser Ser
50 55 60
Leu Arg Asn Ser Thr Val Val Arg Glu Asn Ala Ile Ser Phe Asn Phe
65 70 75 80
Phe Gln Ser Tyr Asn Gln Tyr Tyr Val Phe His Met Pro Arg Cys Leu
85 90 95
Phe Ala Gly Pro Leu Ala Glu Gln Phe Leu Asn Gln Val Asp Leu Thr
100 105 110
Glu Thr Leu Glu Arg Tyr Gln Gln Arg Leu Asn Thr Tyr Ala Leu Val
115 120 125
Ser Lys Asp Leu Ala Ser Tyr Arg Ser Phe Ser Gln Gln Leu Lys Ala
130 135 140
Gln Asp Ser Leu Gly Glu Gln Pro Thr Thr Val Pro Pro Pro Ile Asp
145 150 155 160
Leu Ser Ile Pro His Val Trp Met Pro Pro Gln Thr Thr Pro His Gly
165 170 175
Trp Thr Glu Ser His Thr Thr Ser Gly Leu His Arg Pro His Phe Asn
180 185 190
Gln Thr Cys Ile Leu Phe Asp Gly His Asp Leu Leu Phe Ser Thr Val
195 200 205
Thr Pro Cys Leu His Gln Gly Phe Tyr Leu Ile Asp Glu Leu Arg Tyr
210 215 220
Val Lys Ile Thr Leu Thr Glu Asp Phe Phe Val Val Thr Val Ser Ile
225 230 235 240
Asp Asp Asp Thr Pro Met Leu Leu Ile Phe Gly His Leu Pro Arg Val
245 250 255
Leu Phe Lys Ala Pro Tyr Gln Arg Asp Asn Phe Ile Leu Arg Gln Thr
260 265 270
Glu Lys His Glu Leu Leu Val Leu Val Lys Lys Asp Gln Leu Asn Arg
275 280 285
His Ser Tyr Leu Lys Asp Pro Asp Phe Leu Asp Ala Ala Leu Asp Phe
290 295 300
Asn Tyr Leu Asp Leu Ser Ala Leu Leu Arg Asn Ser Phe His Arg Tyr
305 310 315 320
Ala Val Asp Val Leu Lys Ser Gly Arg Cys Gln Met Leu Asp Arg Arg
325 330 335
Thr Val Glu Met Ala Phe Ala Tyr Ala Leu Ala Leu Phe Ala Ala Ala
340 345 350
Arg Gln Glu Glu Ala Gly Ala Gln Val Ser Val Pro Arg Ala Leu Asp
355 360 365
Arg Gln Ala Ala Leu Leu Gln Ile Gln Glu Phe Met Ile Thr Cys Leu
370 375 380
Ser Gln Thr Pro Pro Arg Thr Thr Leu Leu Leu Tyr Pro Thr Ala Val
385 390 395 400
Asp Leu Ala Lys Arg Ala Leu Trp Thr Pro Asn Gln Ile Thr Asp Ile
405 410 415
Thr Ser Leu Val Arg Leu Val Tyr Ile Leu Ser Lys Gln Asn Gln Gln
420 425 430
His Leu Ile Pro Gln Trp Ala Leu Arg Gln Ile Ala Asp Phe Ala Leu
435 440 445
Lys Leu His Lys Thr His Leu Ala Ser Phe Leu Ser Ala Phe Ala Arg
450 455 460
Gln Glu Leu Tyr Leu Met Gly Ser Leu Val His Ser Met Leu Val His
465 470 475 480
Thr Thr Glu Arg Arg Glu Ile Phe Ile Val Glu Thr Gly Leu Cys Ser
485 490 495
Leu Ala Glu Leu Ser His Phe Thr Gln Leu Leu Ala His Pro His His
500 505 510
Glu Tyr Leu Ser Asp Leu Tyr Thr Pro Cys Ser Ser Ser Gly Arg Arg
515 520 525
Asp His Ser Leu Glu Arg Leu Thr Arg Leu Phe Pro Asp Ala Thr Val
530 535 540
Pro Ala Thr Val Pro Ala Ala Leu Ser Ile Leu Ser Thr Met Gln Pro
545 550 555 560
Ser Thr Leu Glu Thr Phe Pro Asp Leu Phe Cys Leu Pro Leu Gly Glu
565 570 575
Ser Phe Ser Ala Leu Thr Val Ser Glu His Val Ser Tyr Ile Val Thr
580 585 590
Asn Gln Tyr Leu Ile Lys Gly Ile Ser Tyr Pro Val Ser Thr Thr Val
595 600 605
Val Gly Gln Ser Leu Ile Ile Thr Gln Thr Asp Ser Gln Thr Lys Cys
610 615 620
Glu Leu Thr Arg Asn Met His Thr Thr His Ser Ile Thr Val Ala Leu
625 630 635 640
Asn Ile Ser Leu Glu Asn Cys Ala Phe Cys Gln Ser Ala Leu Leu Glu
645 650 655
Tyr Asp Asp Thr Gln Gly Val Ile Asn Ile Met Tyr Met His Asp Ser
660 665 670
Asp Asp Val Leu Phe Ala Leu Asp Pro Tyr Asn Glu Val Val Val Ser
675 680 685
Ser Pro Arg Thr His Tyr Leu Met Leu Leu Lys Asn Gly Thr Val Leu
690 695 700
Glu Val Thr Asp Val Val Val Asp Ala Thr Asp Ser Arg Leu Leu Met
705 710 715 720
Met Ser Val Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Ile Gly Ile Tyr Leu Leu Tyr
725 730 735
Arg Met Leu Lys Thr Cys
740
<210> 20
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 20
Met Cys Arg Arg Pro Asp Cys Gly Phe Ser Phe Ser Pro Gly Pro Val
1 5 10 15
Ile Leu Leu Trp Cys Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Val Ser Val Ala Pro Thr Ala Ala Glu Lys Val Pro Ala Glu Cys Pro
35 40 45
Glu Leu Thr Arg Arg Cys Leu Leu Gly Glu Val Phe Glu Gly Asp Lys
50 55 60
Tyr Glu Ser Trp Leu Arg Pro Leu Val Asn Val Thr Gly Arg Asp Gly
65 70 75 80
Pro Leu Ser Gln Leu Ile Arg Tyr Arg Pro Val Thr Pro Glu Ala Ala
85 90 95
Asn Ser Val Leu Leu Asp Glu Ala Phe Leu Asp Thr Leu Ala Leu Leu
100 105 110
Tyr Asn Asn Pro Asp Gln Leu Arg Ala Leu Leu Thr Leu Leu Ser Ser
115 120 125
Asp Thr Ala Pro Arg Trp Met Thr Val Met Arg Gly Tyr Ser Glu Cys
130 135 140
Gly Asp Gly Ser Pro Ala Val Tyr Thr Cys Val Asp Asp Leu Cys Arg
145 150 155 160
Gly Tyr Asp Leu Thr Arg Leu Ser Tyr Gly Arg Ser Ile Phe Thr Glu
165 170 175
His Val Leu Gly Phe Glu Leu Val Pro Pro Ser Leu Phe Asn Val Val
180 185 190
Val Ala Ile Arg Asn Glu Ala Thr Arg Thr Asn Arg Ala Val Arg Leu
195 200 205
Pro Val Ser Thr Ala Ala Ala Pro Glu Gly Ile Thr Leu Phe Tyr Gly
210 215 220
Leu Tyr Asn Ala Val Lys Glu Phe Cys Leu Arg His Gln Leu Asp Pro
225 230 235 240
Pro Leu Leu Arg His Leu Asp Lys Tyr Tyr Ala Gly Leu Pro Pro Glu
245 250 255
Leu Lys Gln Thr Arg Val Asn Leu Pro Ala His Ser Arg Tyr Gly Pro
260 265 270
Gln Ala Val Asp Ala Arg
275
<210> 21
<211> 8
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 21
uuugaauu 8
<210> 22
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_RNA
<222> (8)..(8)
<223> n可为U或A
<220>
<221> misc_RNA
<222> (9)..(9)
<223> n可为U或A
<400> 22
uuauuuann 9
<210> 23
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 23
gggauccuac c 11
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 24
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly
20
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 25
Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Pro Gln Gly Val Val Gly
20 25 30
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 26
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser
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<211> 24
<212> PRT
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<220>
<223> 合成
<400> 27
Met Leu Gly Ser Asn Ser Gly Gln Arg Val Val Phe Thr Ile Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser
20
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<211> 17
<212> PRT
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<220>
<223> 合成
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Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
1 5 10 15
Ala
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<223> 合成
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Met Trp Leu Val Ser Leu Ala Ile Val Thr Ala Cys Ala Gly Ala
1 5 10 15
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<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 30
ccrccaugg 9

Claims (69)

1.一种人类巨细胞病毒(hCMV)免疫原性组合物，所述组合物包含(a)包含编码hCMV gH多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；(b)包含编码hCMV gL多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(c)包含编码hCMV UL128多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(d)包含编码hCMV UL130多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(e)包含编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；和(f)包含编码hCMV gB多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸，其中：
所述免疫原性组合物中(a):(f)的摩尔比为约1:1；
所述免疫原性组合物中(b):(c):(d):(e)的摩尔比为约1:1:1:1；并且
所述免疫原性组合物中(a)和(f)中的每一者与(b)、(c)、(d)或(e)中任一者的摩尔比为约1.5:1至2:1。
2.如权利要求1所述的hCMV免疫原性组合物，其中(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2。
3.如权利要求1或2所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述hCMV免疫原性组合物维持液体制剂形式直至用于向患者施用。
4.如权利要求1或2所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述hCMV免疫原性组合物维持冻干制剂形式直至用于向患者施用。
5.如权利要求1-4中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中当储存在大于0℃且小于或等于10℃的温度下时，所述hCMV免疫原性组合物稳定至少三个月。
6.如权利要求5所述的hCMV免疫原性组合物，其中当储存在大于0℃且小于或等于10℃的温度下时，所述hCMV免疫原性组合物稳定至少十二至十八个月。
7.如权利要求6所述的hCMV免疫原性组合物，其中当储存在大于0℃且小于或等于10℃的温度下时，所述hCMV免疫原性组合物稳定至少二十四个月。
8.如权利要求1-7中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中当储存在约5℃的温度下时，所述hCMV免疫原性组合物稳定至少三个月。
9.如权利要求8所述的hCMV免疫原性组合物，其中当储存在约5℃的温度下时，所述hCMV免疫原性组合物稳定至少十二至十八个月。
10.如权利要求9所述的hCMV免疫原性组合物，其中当储存在约5℃的温度下时，所述hCMV免疫原性组合物稳定至少二十四个月。
11.如权利要求1-10中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物具有增加的稳定性。
12.如权利要求11所述的hCMV免疫原性组合物，其中当在大于0℃且小于或等于10℃的温度下储存至少三个月时，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物具有增加的稳定性。
13.如权利要求12所述的hCMV免疫原性组合物，其中当在大于0℃且小于或等于10℃的温度下储存至少二十四个月时，相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物具有增加的稳定性。
14.如权利要求1-13中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物具有增加的五聚体表达。
15.如权利要求1-14中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物诱导增加的五聚体抗体水平。
16.如权利要求1-15中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物具有增加的gB表达。
17.如权利要求1-16中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中相对于(a)-(f)以大致相等质量存在的hCMV免疫原性组合物，所述hCMV免疫原性组合物诱导增加的gB抗体水平。
18.如权利要求1-17中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中将(a)-(f)的所述mRNA多核苷酸以足以在受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应的量配制于至少一种脂质纳米粒子中。
19.如权利要求1-18中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中将(a)-(f)的所述mRNA多核苷酸以足以在受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应的量配制于至少一种脂质纳米粒子中并冻干。
20.如权利要求1-19中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中(a)-(f)的所述mRNA多核苷酸中的至少一者包含化学修饰。
21.如权利要求20所述的hCMV免疫原性组合物，其中mRNA多核苷酸(a)-(f)的所述开放阅读框中至少80％的尿嘧啶具有选自N1-甲基-假尿苷或N1-乙基-假尿苷的化学修饰。
22.如权利要求21所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述化学修饰在所述尿嘧啶的碳5位置处。
23.如权利要求1-22中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中(a)-(f)的所述mRNA多核苷酸中的至少一者还包含至少一个5'末端帽，即7mG(5')ppp(5')N1mpNp。
24.如权利要求18-23中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含：可离子化氨基脂质；胆固醇；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)。
25.如权利要求24所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述可离子化氨基脂质包含化合物I：
Figure FDA0004094056480000041
26.如权利要求24或25所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含20-60mol％可离子化氨基脂质、25-55mol％胆固醇、5-25mol％DSPC和0.5-15mol％DMG-PEG。
27.如权利要求26所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含45-55mol％可离子化氨基脂质、35-40mol％胆固醇、5-15mol％DSPC和1-2mol％DMG-PEG。
28.如权利要求27所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含50mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、10mol％DSPC和1.5mol％DMG-PEG。
29.如权利要求27所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含49mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、10mol％DSPC和2.5mol％DMG-PEG。
30.如权利要求27所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含48mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、11mol％DSPC和2.5mol％DMG-PEG。
31.如权利要求27所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述脂质纳米粒子包含如下脂质混合物，其包含47mol％可离子化氨基脂质、38.5mol％胆固醇、11.5mol％DSPC和3mol％DMG-PEG。
32.如权利要求1-31中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2，并且使施用于患者的脂质比施用相等质量mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)时少10％、20％、30％、40％或50％。
33.如权利要求1-32中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2，并且使施用于患者的脂质比施用相等质量mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)时少30％。
34.如权利要求1-33中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2，并且使施用于患者的脂质比施用相等质量mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)时少40％。
35.如权利要求1-34中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)的摩尔比为约2:1:1:1:1:2，并且使施用于患者的脂质比施用相等质量mRNA(a):(b):(c):(d):(e):(f)时少50％。
36.如权利要求1-35中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中编码hCMV gH蛋白的所述mRNA包含与SEQ ID NO:5序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，编码hCMV gL蛋白的所述mRNA包含与SEQ ID NO:6序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，编码hCMV UL128蛋白的所述mRNA包含与SEQ ID NO:2序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，编码hCMV UL130蛋白的所述mRNA包含与SEQ ID NO:3序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，编码hCMV UL131A蛋白的所述mRNA包含与SEQ ID NO:4序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，和/或编码hCMV gB蛋白的所述mRNA包含与SEQ ID NO:1序列的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。
37.如权利要求36所述的hCMV免疫原性组合物，其中编码hCMV gH蛋白的所述mRNA包含SEQ ID NO:5序列的核苷酸序列，编码hCMV gL蛋白的所述mRNA包含SEQ ID NO:6序列的核苷酸序列，编码hCMV UL128蛋白的所述mRNA包含SEQ ID NO:2序列的核苷酸序列，编码hCMVUL130蛋白的所述mRNA包含SEQ IDNO:3序列的核苷酸序列，编码hCMV UL131A蛋白的所述mRNA包含SEQ ID NO:4序列的核苷酸序列，和/或编码hCMV gB蛋白的所述mRNA包含SEQ IDNO:1序列的核苷酸序列。
38.如权利要求1-37中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中编码所述hCMV gH多肽的所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少90％同一性的序列，编码所述hCMVgL多肽的所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:12的序列具有至少90％同一性的序列，编码所述hCMV UL128多肽的所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％同一性的序列，编码所述hCMV UL130多肽的所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:9的序列具有至少90％同一性的序列，编码所述hCMV UL131A多肽的所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:10的序列具有至少90％同一性的序列，和/或编码所述hCMV gB多肽的所述开放阅读框包含与SEQ IDNO:7的序列具有至少90％同一性的序列。
39.如权利要求38所述的hCMV免疫原性组合物，其中编码所述hCMV gH多肽的所述开放阅读框包含SEQ ID NO:11，编码所述hCMV gL多肽的所述开放阅读框包含SEQ ID NO:12，编码所述hCMV UL128多肽的所述开放阅读框包含SEQ ID NO:8，编码所述hCMV UL130多肽的所述开放阅读框包含SEQ ID NO:9，编码所述hCMV UL131A多肽的所述开放阅读框包含SEQID NO:10，和/或编码所述hCMV gB多肽的所述开放阅读框包含SEQ ID NO:7的序列。
40.如权利要求1-39中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中(a)-(f)的所述mRNA多核苷酸中的每一者还包含polyA尾。
41.如权利要求40所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述polyA尾的长度为100个核苷酸。
42.如权利要求1-41中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述hCMV gH多肽包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述hCMV gL多肽包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述hCMV UL128多肽包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述hCMV UL130多肽包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述hCMV UL131A多肽包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，和/或所述hCMV gB多肽包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
43.如权利要求42所述的hCMV免疫原性组合物，其中所述hCMV gH多肽包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，所述hCMV gL多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，所述hCMV UL128多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，所述hCMV UL130多肽包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列，所述hCMV UL131A多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和/或所述hCMV gB多肽包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列。
44.一种用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hCMV)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的权利要求1-43中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，从而在所述人类受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述hCMV免疫原性组合物经由肌肉内注射施用。
46.如权利要求44或45所述的方法，其中所述人类受试者在施用hCMV mRNA疫苗之前呈CMV血清阳性。
47.如权利要求44或45所述的方法，其中所述人类受试者在施用所述hCMV mRNA疫苗之前呈CMV血清阴性。
48.如权利要求44-47中任一项所述的方法，其中所述hCMV免疫原性组合物以25μg-300μg mRNA的剂量施用。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述hCMV免疫原性组合物以50μg-150μg mRNA的剂量施用。
50.如权利要求49中任一项所述的方法，其中所述hCMV免疫原性组合物以50μg的剂量施用。
51.如权利要求49中任一项所述的方法，其中所述hCMV免疫原性组合物以100μg的剂量施用。
52.如权利要求49中任一项所述的方法，其中所述hCMV免疫原性组合物以150μg的剂量施用。
53.如权利要求44-52中任一项所述的方法，其中施用所述hCMV免疫原性组合物至少一次、至少两次或至少三次。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述hCMV免疫原性组合物通过初次免疫并接着一次加强剂免疫施用。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述hCMV免疫原性组合物通过初次免疫并接着两次加强剂免疫施用。
56.如权利要求44-55中任一项所述的方法，其中所述有效量足以在施用所述hCMV免疫原性组合物后第29天、第56天、第84天、第168天或第196天中的任一天产生针对上皮细胞感染的血清中和性抗CMV抗体滴度。
57.如权利要求44-56中任一项所述的方法，其中所述有效量足以在施用所述hCMV免疫原性组合物后第29天、第56天、第84天、第168天或第196天中的任一天产生针对成纤维细胞感染的血清中和性抗CMV抗体滴度。
58.如权利要求44-57中任一项所述的方法，其中所述有效量足以在免疫后第29天、第56天、第84天、第168天或第196天中的任一天产生针对上皮细胞感染的血清中和性抗CMV抗体滴度，并且在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个或多个时间点产生基线后/基线滴度的相关几何平均比(GMR)。
59.如权利要求44-58中任一项所述的方法，其中所述有效量足以在免疫后第29天、第56天、第84天、第168天或第196天中的任一天产生针对成纤维细胞感染的血清中和性抗CMV抗体滴度，并且在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个或多个时间点产生基线后/基线滴度的相关几何平均比(GMR)。
60.如权利要求44-59中任一项所述的方法，其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，针对上皮细胞感染的中和抗体(nAb)相对于基线增加≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥11倍、≥12倍或≥13倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
61.如权利要求44-60中任一项所述的方法，其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，针对成纤维细胞感染的中和抗体(nAb)相对于基线增加≥2倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
62.一种用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hCMV)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的如下hCMV免疫原性组合物，其包含(a)包含编码hCMV gH多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；(b)包含编码hCMV gL多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(c)包含编码hCMV UL128多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(d)包含编码hCMV UL130多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(e)包含编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；和(f)包含编码hCMV gB多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸，从而在所述人类受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应，
其中所述hCMV免疫原性组合物以25μg-300μg mRNA的剂量施用，并且
其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，针对上皮细胞感染的中和抗体(nAb)相对于基线增加≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥11倍、≥12倍或≥13倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
63.一种用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hCMV)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的如下hCMV免疫原性组合物，其包含(a)包含编码hCMV gH多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；(b)包含编码hCMV gL多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(c)包含编码hCMV UL128多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(d)包含编码hCMV UL130多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(e)包含编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；和(f)包含编码hCMV gB多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸，从而在所述人类受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应，
其中所述hCMV免疫原性组合物以25μg-300μg mRNA的剂量施用，并且
其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，针对成纤维细胞感染的中和抗体(nAb)相对于基线增加≥2倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
64.一种用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hCMV)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的如下hCMV免疫原性组合物，其包含(a)包含编码hCMV gH多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；(b)包含编码hCMV gL多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(c)包含编码hCMV UL128多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(d)包含编码hCMV UL130多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(e)包含编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；和(f)包含编码hCMV gB多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸，从而在所述人类受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应，
其中所述hCMV免疫原性组合物以25μg-300μg mRNA的剂量施用，并且
其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，抗五聚体结合抗体(bAb)相对于基线增加≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
65.一种用于在受试者中产生针对人类巨细胞病毒(hCMV)的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的如下hCMV免疫原性组合物，其包含(a)包含编码hCMV gH多肽的开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸；(b)包含编码hCMV gL多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(c)包含编码hCMV UL128多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(d)包含编码hCMV UL130多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；(e)包含编码hCMV UL131A多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸；和(f)包含编码hCMV gB多肽的开放阅读框的mRNA多核苷酸，从而在所述人类受试者中诱导针对hCMV或hCMV抗原的抗原特异性免疫反应，
其中所述hCMV免疫原性组合物以25μg-300μg mRNA的剂量施用，并且
其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，抗gB结合抗体(Ab)相对于基线增加≥2倍的人类受试者的比例为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
66.如权利要求1-43中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，在人类受试者中测量的针对上皮细胞感染的中和抗体的几何平均比(GMR)为约8-14。
67.如权利要求1-43或66中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，人类受试者中抗五聚体结合抗体(bAb)的几何平均比(GMR)为约6-10。
68.如权利要求1-43或66-67中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，人类受试者中针对成纤维细胞感染的中和抗体的几何平均比(GMR)为约2。
69.如权利要求1-43或66-68中任一项所述的hCMV免疫原性组合物，其中在施用所述hCMV免疫原性组合物后的一个时间点，人类受试者中的抗gB结合抗体(Ab)的几何平均比(GMR)为约2。
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