CN116211732B - 一种具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂及其制备方法和应用，属于纳米制剂技术领域。本发明提供的具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将两亲性阳离子聚合物和纤连蛋白在溶剂中搅拌，充分溶解得混合溶液；(2)将所述混合溶液透析，过滤，加入交联剂搅拌均匀；(3)再次透析，过滤，干燥，即成；所述步骤(1)中的两亲性阳离子聚合物含有亲水嵌段和疏水嵌段；所述疏水嵌段含有氨基，所述交联剂含有能与氨基发生反应的特征性官能团。本发明通过两亲性阳离子聚合物，对纤连蛋白进行包裹，得到一种具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。

Description

一种具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米制剂技术领域，具体涉及一种具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂及其制备方法和应用。
背景技术
纤连蛋白(Fibronectin,FN)是存在于人体组织和细胞内的一种多功能蛋白，是细胞外基质的主要成分之一。纤连蛋白属于高分子量的糖蛋白，其分子量在440-450KDa，由两个相似的亚基构成，每个亚基有六个功能区和一个RGD序列，能够结合肝素、胶原、纤维、细胞和11种整合素等多种物质，具有促进细胞黏附、迁移、增殖、分化的作用，能显著促进成纤维细胞、内皮细胞生长、促进肉芽组织形成，同时刺激巨噬细胞对异物进行吞噬，在组织修护的各个阶段都发挥着非常重要的作用。
纤连蛋白具有安全性和有效性高、耐受性好等优点。但现有技术中，纤连蛋白存在着一定的应用局限性，如纤连蛋白作为一种高分子量糖蛋白，在经皮给药中的皮肤渗透性差，难以有效渗透进皮肤，导致纤连蛋白的修护、抗皱和舒缓的效果较差。因此，制备一种能够有效发挥纤连蛋白作用、扩展纤连蛋白应用途径的产品是目前急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的问题，提供一种具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂及其制备方法和应用。
本发明是通过下述技术方案进行实现的：
本发明提供一种具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将两亲性阳离子聚合物和纤连蛋白在溶剂中搅拌，充分溶解得混合溶液；
(2)将所述混合溶液透析，过滤，加入交联剂搅拌均匀；
(3)再次透析，过滤，干燥，即得具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂；
所述步骤(1)中的两亲性阳离子聚合物含有亲水嵌段和疏水嵌段；所述疏水嵌段含有氨基，所述交联剂含有能与氨基发生反应的特征性官能团。
本发明具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂的制备方法先将两亲性阳离子聚合物包载纤连蛋白，再与交联剂发生反应，交联剂可以使链状的两亲性阳离子聚合物经酰基化反应，发生分子链间的交联，形成网状的两亲性阳离子聚合物，网状的两亲性阳离子聚合物作为纳米制剂的壁材，可以更好地保护纤连蛋白，不容易发生突释。交联剂添加量过少或不添加，纤连蛋白容易发生突释；交联剂添加量过多，则纤连蛋白不容易释放。本发明采用了层交联改性方法，有效提高了两亲性阳离子聚合物对纤连蛋白的包载能力。本发明步骤(2)的透析处理是为了去除步骤(1)中的溶剂，有利于聚合物更好地包裹纤连蛋白纤连蛋白。步骤(3)中再次透析的目的是为了去除未反应的交联剂，使得制备得到的纳米制剂更稳定。
作为本发明所述具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂的制备方法的优选实施方式，满足以下至少一条：
(1-1)所述两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段为ξ-己内酯和氨基化ξ-己内酯的共聚物；
(1-2)所述两亲性阳离子聚合物的亲水嵌段为聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱。
优选地，所述两亲性阳离子聚合物中亲水嵌段在疏水嵌段的两端。
作为本发明所述具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂的制备方法的优选实施方式，满足以下至少一条：
(2-1)所述两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段为氨基化聚己内酯-b-聚己内酯-b-氨基化聚己内酯[(PCL-NH2)m-b-PCLn-b-(PCL-NH2)m]、聚己内酯-b-氨基化聚己内酯-b-聚己内酯(PCLn-b-(PCL-NH2)m-b-PCLn)、聚己内酯-co-氨基化聚己内酯(PCLn-co-(PCL-NH2)m)中的至少一种；所述疏水嵌段中氨基化聚己内酯的聚合度m为10～30，所述聚己内酯的聚合度n为5～15；所述疏水嵌段的数均分子量为2420～4980；
(2-2)所述两亲性阳离子聚合物的亲水嵌段的聚合度为20～40，所述亲水嵌段的数均分子量为11800-23600；
(2-3)所述两亲性阳离子聚合物的数均分子量为15511～28602。
优选地，所述两亲性阳离子聚合物的数均分子量为27322。
优选地，所述两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段为聚己内酯-co-氨基化聚己内酯。
优选地，所述两亲性阳离子聚合物的亲水嵌段聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(PMPC)由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)通过原子转移自由基聚合反应(ATRP)得到。
优选地，所述两亲性阳离子聚合物为PMPCk-b-(PCLn-co-(PCL-NH2)m)-b-PM PCk、PMPCk-b-((PCL-NH2)m-b-PCLn-b-(PCL-NH2)m)-b-PMPCk、PMPCk-b-(PCLn-b-(PCL-NH2)m-b-PCL5n)-b-PMPCk中的至少一种，其中m为10～30，n为5～15，k为20～40。
作为本发明所述具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂的制备方法的优选实施方式，所述两亲性阳离子聚合物的制备方法包括以下步骤：
S1.将两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段对应的聚合物单体在惰性气体保护下，进行开环聚合反应，得两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段；所述开环聚合反应的引发剂为两端为羟基封端的多元醇，所述开环聚合反应的催化剂为有机锡催化剂，反应温度为80℃-160℃，反应时间为8h-18h；
S2.将所述两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段溶于有机溶剂中，在惰性气体保护下，加入2-溴代异丁酰溴，在-5℃-5℃的条件下反应2h-4h，再在15℃-40℃下继续反应12h-48h，得到经溴化处理的疏水嵌段聚合物；
S3.将两亲性阳离子聚合物亲水嵌段的聚合单体2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、所述经溴化处理的疏水嵌段聚合物、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺溶于有机溶剂中，在惰性气体保护下，往反应体系中加入催化剂，在40℃-80℃条件下反应12h-48h，制得所述两亲性阳离子聚合物。
步骤S1中，选择两端为羟基封端的多元醇作为引发剂是为了需要足够小的空间位置让聚合单体在引发剂两端发生开环聚合反应。如果两个反应位点(羟基)相邻，位阻过大，不利于反应的进行。
优选地，所述步骤S2中继续反应的温度为25℃。
优选地，所述两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段氨基化聚己内酯-b-聚己内酯-b-氨基化聚己内酯先由ξ-己内酯进行开环聚合反应，再加入氨基化ξ-己内酯进行开环聚合反应制得；
所述两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段聚己内酯-b-氨基化聚己内酯-b-聚己内酯先由氨基化ξ-己内酯进行开环聚合反应，再加入ξ-己内酯进行开环聚合反应制得；
所述两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段聚己内酯-co-氨基化聚己内酯由ξ-己内酯和氨基化ξ-己内酯通过开环聚合，无规共聚反应制得。
作为本发明所述具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂的制备方法的优选实施方式，满足以下至少一条：
(3-1)所述步骤S1中，所述引发剂为乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,6-己二醇中的至少一种；优选为1,3-丙二醇；
(3-2)所述步骤S1中，所述引发剂与所述聚合物单体的摩尔比为1:(10-30)；
(3-3)所述步骤S2中，所述疏水嵌段聚合物与2-溴代异丁酰溴的摩尔比为1:(4.0-12.0)；
(3-4)所述步骤S2和所述步骤S3中，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中至少一种；优选为四氢呋喃；
(3-5)所述步骤S3中，所述催化剂为CuBr、CuCl、CuI中的至少一种；优选为CuBr；
(3-6)所述步骤S3中，所述经溴化处理的疏水嵌段聚合物与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的摩尔比为1:(20-100)；优选为1:(40-80)；
(3-7)所述步骤S3中，所述经溴化处理的疏水嵌段聚合物与N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺的摩尔比为1:(2-10)；
(3-8)所述步骤S3中，所述经溴化处理的疏水嵌段聚合物与所述催化剂的摩尔比为1:(1-3)。
优选地，所述步骤S1中，所述有机锡催化剂为辛酸亚锡、异辛酸亚锡、月桂酸亚锡中的至少一种；优选为异辛酸亚锡。
优选地，所述惰性气体为氮气、氦气、氩气中的至少一种。
优选地，在步骤S1中还包括所述两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段的纯化；所述两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段的纯化包括如下步骤：将所述步骤S1中开环聚合反应后的反应混合物滴入沉淀剂中，经沉淀纯化后，收集固体产物，在40℃-60℃条件下干燥12h-48h，得纯化后两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段；所述沉淀剂为正己烷、乙醚、石油醚中至少一种。
优选地，在步骤S3中还包括所述两亲性阳离子聚合物的纯化；所述两亲性阳离子聚合物的纯化包括如下步骤：将所述步骤S3制得的两亲性阳离子聚合物通过中性氧化铝柱，洗脱除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，将浓缩液滴入沉淀剂中，沉淀纯化，收集固体产物，在40℃-60℃条件下干燥12h-48h，得纯化后两亲性阳离子聚合物；所述洗脱采用的洗脱液为四氢呋喃溶液；所述旋蒸浓缩的温度为30℃-60℃，转速为100rpm-450rpm；所述沉淀剂为正己烷、乙醚、石油醚中至少一种。
作为本发明所述具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂的制备方法的优选实施方式，满足以下至少一条：
(4-1)所述步骤(1)中，所述两亲性阳离子聚合物与所述纤连蛋白的质量比为1:(1～4)；
(4-2)所述步骤(2)中，所述交联剂为2,3-二甲基顺丁烯二酸酐、顺丁烯二酸酐、2,3,-二甲基呋喃基顺丁烯二酸酐中的至少一种；优选为顺丁烯二酸酐；
(4-3)所述步骤(2)中，所述交联剂与所述两亲性阳离子聚合物的质量比为1:(0.5-3)。
作为本发明所述具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂的制备方法的优选实施方式，满足以下至少一条：
(5-1)所述步骤(1)中的溶剂为二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、N,N’-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、1,3-丙二醇、甘油、1,4-丁二醇、戊二醇、1,2-己二醇、乙二醇、季戊四醇、双丙甘醇、缩二乙二醇中的至少一种；
(5-2)所述步骤(1)中两亲性阳离子聚合物与所述溶剂的质量比为1:
(5-20)；
(5-3)所述步骤(1)和所述步骤(2)中的搅拌速度为100rpm-500rpm；搅拌时间为30min-90min；
(5-4)所述步骤(2)和所述步骤(3)中均采用透析袋透析，所述透析袋的透析截留分子量MWCO为500Da-5000Da，透析过程中去离子水的用量为0.5L-1.5L，透析时间为24h-72h；
(5-5)所述步骤(2)和所述步骤(3)中均采用水系滤膜进行过滤，所述水系滤膜的孔径为0.2μm-0.8μm；
(5-6)所述步骤(3)中，所述干燥为冷冻干燥、真空干燥、鼓风干燥中的至少一种，所述干燥的时间为24h-72h。
本发明地另一目的在于提供采用如所述制备方法制备所得具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
本发明的具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂由两亲性阳离子聚合物先包载纤连蛋白，再与交联剂发生交联反应制得；交联剂后与疏水嵌段中氨基酰基化反应，可以使直链状的两亲性阳离子聚合物发生分子链间的交联，使纳米制剂中间层具有独特的网状结构，本发明的纤连蛋白纳米制剂可以更好地保护纤连蛋白，有效提高两亲性阳离子聚合物对纤连蛋白的包载能力，相较于纤连蛋白，本发明的纤连蛋白纳米制剂具有更好的组织修护、抗皱和舒缓功效。
本发明的又一目的在于提供所述具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂在化妆品和药物中的应用。尤其是在制备化妆品以及制备具有组织修护的药物中的应用。
本发明纤连蛋白纳米制剂较纤连蛋白具有更优异的组织修护、抗皱和舒缓功效。皮肤渗透性更好，在化妆品和制备具有组织修护的药物中具有广泛的应用前景。
本发明的再一目的在于提供一种抗皱精华液，所述抗皱精华液包括所述的具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂，且所述具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂在所述抗皱精华液中的质量百分含量为3.0％-7.0％。
优选地，所述抗皱精华液按质量百分比计，包括以下组分：0.1％-0.3％的羟苯甲酯、1.0％-3.0％的PEG/PPG-17/6共聚物、0.05％-0.15％的β-葡聚糖、0.1％-0.3％的透明质酸钠、0.1％-0.5％的乳酸杆菌发酵产物、0.10％-0.25％的乳酸杆菌发酵溶胞产物、0.1％-0.5％的银耳(TREMELLA FUCIFORMIS)提取物、0.1％-0.5％的薯蓣(DIOSCOREAOPPOSITA)根提取物、0.7％-1.5％的丙二醇、0.95％-2.95％的1,2-己二醇、1.0％-3.0％的1,2-戊二醇、0.5％-1.5％的去离子水、0.1％-0.3％的丁二醇、0.05％-0.15％的芍药(PAEONIA ALBIFLORA)根提取物、0.05％-0.15％的白薇(CYNANCHUM ATRATUM)提取物、0.05％-0.15％的积雪草(CENTELLA ASIATICA)提取物、0.05％-0.15％龙胆(GENTIANASCABRA)根提取物、0.05％-0.15％的母菊(CHAMOMILLA RECUTITA)花提取物、3.0％-7.0％的所述的具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂、0.1％-0.3％的苯氧乙醇、0.1％-0.3％的乙基己基甘油、0.001％-0.005％的香精、0.006％-0.012％的PEG-40氢化蓖麻油；余量为水。
本发明将制得的具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂应用于抗皱精华液中，能够使得精华液具有显著的抗皱效果。
更优选地，所述抗皱精华液，按质量百分比计，包括以下组分：0.2％的羟苯甲酯、2.0％的PEG/PPG-17/6共聚物、0.1％的β-葡聚糖、0.15％的透明质酸钠、0.3％的乳酸杆菌发酵产物、0.15％的乳酸杆菌发酵溶胞产物、0.3％的银耳(TREMELLA FUCIFORMIS)提取物、0.3％的薯蓣(DIOSCOREA OPPOSITA)根提取物、1.2％的丙二醇、1.8％的1,2-己二醇、2.0％的1,2-戊二醇、1.0％的去离子水、0.2％的丁二醇、0.1％的芍药(PAEONIA ALBIFLORA)根提取物、0.1％的白薇(CYNANCHUM ATRATUM)提取物、0.1％的积雪草(CENTELLA ASIATICA)提取物、0.1％龙胆(GENTIANA SCABRA)根提取物、0.1％的母菊(CHAMOMILLA RECUTITA)花提取物、5％的所述的具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂、0.2％的苯氧乙醇、0.2％的乙基己基甘油、0.003％的香精、0.009％的PEG-40氢化蓖麻油、84.388％的水。
本发明还提供了所述的抗皱精华液的制备方法，包括如下步骤：将水、羟苯甲酯和PEG/PPG-17/6共聚物加热至80℃-90℃，混合均匀，得到混合液1；将混合液1降温至35℃-45℃，加入β-葡聚糖和透明质酸钠，混合均匀，得到混合液2；将混合液2降温至15℃-30℃，加入剩余全部组分，混合均匀，即得所述抗皱精华液。
优选地，所述的抗皱精华液的制备方法，包括如下步骤：将水、羟苯甲酯和PEG/PPG-17/6共聚物加热至85℃，混合均匀，得到混合液1；将混合液1降温至40℃，加入β-葡聚糖和透明质酸钠，混合均匀，得到混合液2；将混合液2降温至25℃，加入剩余全部组分，混合均匀，即得所述抗皱精华液。
本发明具有如下有益效果：本发明通过两亲性阳离子聚合物，对纤连蛋白进行包裹，得到一种具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。(1)本发明在制得的两亲性阳离子聚合物的基础上，采用了层交联改性方法，有效提高了两亲性阳离子聚合物对纤连蛋白的包载能力。(2)交联剂通过与两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段间的酰基化反应，可以使直链状的两亲性阳离子聚合物发生分子链间的交联，使纳米制剂中间层具有独特的网状结构，相比未经层交联改性的纳米制剂，本发明的纤连蛋白纳米制剂可以更好地保护纤连蛋白，避免其发生突释的情况。(3)2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱具有良好的皮肤亲和性，本发明以2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱为亲水嵌段制备得到的两亲性阳离子聚合物，包裹纤连蛋白，制得的纤连蛋白纳米制剂具有更好的皮肤渗透性。(4)与纤连蛋白相比，本发明的纤连蛋白纳米制剂表现出更好的组织修护、抗皱和舒缓功效。(5)将上述具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂应用于精华液中时，制备得到的精华液具有很好的抗皱功效。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40的制备(以制备1.0mmol为例)：S1.将ξ-己内酯(1.14g，10.0mmol)和氨基化ξ-己内酯(2.56g，20.0mmol)加入至1,3-丙二醇(0.076g，1.0mmol)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂异辛酸亚锡(0.037g)，在130℃条件下反应12h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，并在50℃条件下干燥24h，得到PCL10-co-(PCL-NH2)20。
S2.将PCL10-co-(PCL-NH2)20(3.776g，1.0mmol)、2-溴代异丁酰溴(1.839g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，先在0℃反应3h，再在25℃下继续反应24h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，获得溴化PCL10-co-(PCL-NH2)20。
S3.将溴化PCL10-co-(PCL-NH2)20(4.02g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(23.62g，80.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(1.39g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40(数均分子量Mn为27322)。
(1)将制得的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40(1g)和纤连蛋白(2g)溶于二甲基亚砜(10mL)中，搅拌(转速为300rpm)均匀，待阳离子聚合物和纤连蛋白充分溶解后，获得聚合物和纤连蛋白的混合溶液；
(2)将混合溶液转移至透析袋(截留分子量为3500Da)中，用去离子水(1L)透析48h；透析完毕后，将透析袋中的聚合物载药囊泡溶液通过水系滤膜(0.45μm)过滤；将顺丁烯二酐(1g)加入到聚合物载药囊泡溶液中，搅拌(450rpm)60min；
(3)将上述溶液转移至透析袋(截留分子量为3500Da)中，用去离子水(1L)透析48h；透析完毕后，将透析袋中的交联聚合物载药囊泡溶液通过水系滤膜(0.45μm)过滤；经冷冻干燥48h后，获得具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例2
两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-((PCL-NH2)10-b-PCL10-b-(PCL-NH2)10)-b-PMPC40的制备(以制备1.0mmol为例)：S1.将ξ-己内酯(1.14g，10.0mmol)加入至1,3-丙二醇(0.076g，1.0mmol)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂异辛酸亚锡(0.037g)，在130℃条件下反应12h，再往反应体系中加入氨基化ξ-己内酯(2.56g，20.0mmol)，在130℃条件下继续反应12h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，并在50℃条件下干燥24h，得到(PCL-NH2)10-b-PCL10-b-(PCL-NH2)10。
S2.将(PCL-NH2)10-b-PCL10-b-(PCL-NH2)10(3.776g，1.0mmol)、2-溴代异丁酰溴(1.839g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，先在0℃反应3h，再在25℃下继续反应24h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，获得溴化(PCL-NH2)10-b-PCL10-b-(PCL-NH2)10。
S3.将溴化(PCL-NH2)10-b-PCL10-b-(PCL-NH2)10(4.02g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(23.62g，80.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(1.39g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-((PCL-NH2)10-b-PCL10-b-(PCL-NH2)10)-b-PMPC40(数均分子量Mn为27322)。
将实施例1中的质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-((PCL-NH2)10-b-PCL10-b-(PCL-NH2)10)-b-PMPC40，其余不变，制得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例3
两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL5-b-(PCL-NH2)20-b-PCL5)-b-PMPC40的制备(以制备1.0mmol为例)：S1.将氨基化ξ-己内酯(2.56g，20.0mmol)加入至1,3-丙二醇(0.076g，1.0mmol)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂异辛酸亚锡(0.037g)，在130℃条件下反应12h，再往反应体系中加入ξ-己内酯(1.14g，10.0mmol)，在130℃条件下继续反应12h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，并在50℃条件下干燥24h，得到PCL5-b-(PCL-NH2)20-b-PCL5。
S2.将PCL5-b-(PCL-NH2)20-b-PCL5(3.776g，1.0mmol)、2-溴代异丁酰溴(1.839g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，先在0℃反应3h，再在25℃下继续反应24h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，获得溴化PCL5-b-(PCL-NH2)20-b-PCL5。
S3.将溴化PCL5-b-(PCL-NH2)20-b-PCL5(4.02g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(23.62g，80.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(1.39g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL5-b-(PCL-NH2)20-b-PCL5)-b-PMPC40(数均分子量Mn为27322)。
将实施例1中的质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL5-b-(PCL-NH2)20-b-PCL5)-b-PMPC40，其余不变，制得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例4
两亲性阳离子聚合物PMPC20-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC20的制备(以制备1.0mmol为例)：溴化PCL10-co-(PCL-NH2)20的制备步骤同实施例1。
将溴化PCL10-co-(PCL-NH2)20(4.02g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(11.81g，40.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(0.70g，4.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC20-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC20(数均分子量Mn为15511)。
将实施例1中的质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC20-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC20，其余不变，制得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例5
两亲性阳离子聚合物PMPC30-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC30的制备(以制备1.0mmol为例)：溴化PCL10-co-(PCL-NH2)20的制备步骤同实施例1。
将溴化PCL10-co-(PCL-NH2)20(4.02g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(17.71g，60.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(1.05g，6.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC30-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC30(数均分子量Mn为21416)。
将实施例1中的质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC30-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC30，其余不变，制得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例6
两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)10)-b-PMPC40的制备(以制备1.0mmol为例)：S1.将ξ-己内酯(1.14g，10.0mmol)和氨基化ξ-己内酯(1.28g，10.0mmol)加入至1,3-丙二醇(0.076g，1.0mmol)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂异辛酸亚锡(0.024g)，在130℃条件下反应12h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，并在50℃条件下干燥24h，得到PCL10-co-(PCL-NH2)10。
S2.将PCL10-co-(PCL-NH2)10(2.42g，1.0mmol)、2-溴代异丁酰溴(1.839g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，先在0℃反应3h，再在25℃下继续反应24h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，获得溴化PCL10-co-(PCL-NH2)10。
S3.将溴化PCL10-co-(PCL-NH2)10(2.54g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(23.62g，80.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(1.39g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)10)-b-PMPC40(数均分子量Mn为26042)。
将实施例1中的质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)10)-b-PMPC40，其余不变，制得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例7
两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)30)-b-PMPC40的制备(以制备1.0mmol为例)：S1.将ξ-己内酯(1.14g，10.0mmol)和氨基化ξ-己内酯(3.84g，30.0mmol)加入至1,3-丙二醇(0.076g，1.0mmol)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂异辛酸亚锡(0.05g)，在130℃条件下反应12h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，并在50℃条件下干燥24h，得到PCL10-co-(PCL-NH2)30。
S2.将PCL10-co-(PCL-NH2)30(2.42g，1.0mmol)、2-溴代异丁酰溴(1.839g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，先在0℃反应3h，再在25℃下继续反应24h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，获得溴化PCL10-co-(PCL-NH2)30。
S3.将溴化PCL10-co-(PCL-NH2)30(2.54g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(23.62g，80.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(1.39g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)30)-b-PMPC40(数均分子量Mn为28602)。
将实施例1中的质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)30)-b-PMPC40，其余不变，制得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例8
本实施例与实施例1的区别仅在于将实施例1中的质量为2g的纤连蛋白换成质量为1g的纤连蛋白，其余均与实施例1相同，制得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例9
本实施例与实施例1的区别仅在于将实施例1中的质量为2g的纤连蛋白换成质量为3g的纤连蛋白，其余均与实施例1相同，制得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例10
本实施例与实施例1的区别仅在于将实施例1中的质量为2g的纤连蛋白换成质量为4g的纤连蛋白，其余均与实施例1相同，制得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例11
本实施例与实施例1的区别仅在于将实施例1中的质量为1g的顺丁烯二酐换成质量为0.5g的顺丁烯二酐，其余均与实施例1相同，制得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例12
本实施例与实施例1的区别仅在于将实施例1中的质量为1g的顺丁烯二酐换成质量为2g的顺丁烯二酐，其余均与实施例1相同，制得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例13
本实施例与实施例1的区别仅在于将实施例1中的质量为1g的顺丁烯二酐换成质量为3g的顺丁烯二酐，其余均与实施例1相同，制得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例14
本实施例两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40的制备步骤同实施例1。
(1)将制得的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40(1.5g)和纤连蛋白(2.3g)溶于甘油(10mL)中，搅拌(转速为300rpm)均匀，待阳离子聚合物和纤连蛋白充分溶解后，获得聚合物和纤连蛋白的混合溶液；
(2)将混合溶液转移至透析袋(截留分子量为3500Da)中，用去离子水(1.2L)透析24h；透析完毕后，将透析袋中的聚合物载药囊泡溶液通过水系滤膜(0.45μm)过滤；将顺丁烯二酐(1.3g)加入到聚合物载药囊泡溶液中，充分搅拌(400rpm)60min；
(3)将上述溶液转移至透析袋(截留分子量为3500Da)中，用去离子水(1.4L)透析24h；透析完毕后，将透析袋中的交联聚合物载药囊泡溶液通过水系滤膜(0.45μm)过滤；经冷冻干燥24h后，获得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
实施例15
本实施例两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40的制备步骤同实施例1。
(1)将制得的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40(1g)和纤连蛋白(2.6g)溶于丙酮(10mL)中，搅拌(转速为300rpm)均匀，待阳离子聚合物和纤连蛋白充分溶解后，获得聚合物和纤连蛋白的混合溶液；
(2)将混合溶液转移至透析袋(截留分子量为2000Da)中，用去离子水(1L)透析48h；透析完毕后，将透析袋中的聚合物载药囊泡溶液通过水系滤膜(0.45μm)过滤；将顺丁烯二酐(2.3g)加入到聚合物载药囊泡溶液中，充分搅拌(150rpm)30min；
(3)将上述溶液转移至透析袋(截留分子量为2000Da)中，用去离子水(1L)透析48h；透析完毕后，将透析袋中的交联聚合物载药囊泡溶液通过水系滤膜(0.45μm)过滤；经冷冻干燥48h后，获得本实施例具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
对比例1
本对比例两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40的制备步骤同实施例1。
(1)将制得的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40(1g)和纤连蛋白(2g)溶于二甲基亚砜溶液(10mL)中，搅拌(转速为300rpm)均匀，待阳离子聚合物和纤连蛋白充分溶解后，获得聚合物和纤连蛋白的混合溶液；
(2)将混合溶液转移至透析袋(截留分子量为3500Da)中，用去离子水(1L)透析48h；透析完毕后，将透析袋中的聚合物载药囊泡溶液通过水系滤膜(0.45μm)过滤；经冷冻干燥48h后，获得本对比例纤连蛋白纳米制剂。
对比例1和实施例1的区别在于，对比例1未进行交联改性处理。
对比例2
两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-PCL30-b-PMPC40的制备(以制备1.0mmol为例)：S1.将ξ-己内酯(3.42g，30.0mmol)加入至1,3-丙二醇(0.076g，1.0mmol)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂异辛酸亚锡(0.034g)，在130℃条件下反应12h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，并在50℃条件下干燥24h，得到PCL30。
S2.将PCL30(3.42g，1.0mmol)、2-溴代异丁酰溴(1.839g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，先在0℃反应3h，再在25℃下继续反应24h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，获得溴化PCL30。
S3.将溴化PCL30(3.66g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(23.62g，80.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(1.39g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-PCL30-b-PMPC40(数均分子量Mn为27042)。
将实施例1中的质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-PCL30-b-PMPC40，其余不变，制得本对比例纤连蛋白纳米制剂。
对比例2和实施例1的区别在于，对比例2疏水嵌段只有PCL，交联剂需要和-NH2基团发生反应，只有PCL，加入交联剂顺丁烯二酐两亲性阳离子聚合物也无法进行交联反应。
对比例3
两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL-NH2)30-b-PMPC40的制备(以制备1.0mmol为例)：S1.将氨基化ξ-己内酯(3.84g，30.0mmol)加入至1,3-丙二醇(0.076g，1.0mmol)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂异辛酸亚锡(0.038g)，在130℃条件下反应12h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，并在50℃条件下干燥24h，得到PCL30-NH2。
S2.将(PCL-NH2)30(3.84g，1.0mmol)、2-溴代异丁酰溴(1.839g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，先在0℃反应3h，再在25℃下继续反应24h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，获得溴化(PCL-NH2)30。
S3.将溴化(PCL-NH2)30(4.08g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(23.62g，80.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(1.39g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL-NH2)30-b-PMPC40(数均分子量Mn为27462)。
将实施例1中的质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL-NH2)30-b-PMPC40，其余不变，制得本对比例纤连蛋白纳米制剂。
对比例3和实施例1的区别在于，对比例3阳离子聚合物不含PCL嵌段。
对比例4
两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40的制备步骤同实施例1。
(1)将制得的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40(1g)和顺丁烯二酐(1g)加入二甲基亚砜溶液(10mL)中，充分搅拌(450rpm)60min；
(2)再加入纤连蛋白(2g)，搅拌(转速为300rpm)均匀；
(3)将混合溶液转移至透析袋(截留分子量为3500Da)中，用去离子水(1L)透析48h；透析完毕后，将透析袋中的聚合物载药囊泡溶液通过水系滤膜(0.45μm)过滤；经冷冻干燥48h后，获得本对比例纤连蛋白纳米制剂。
对比例4和实施例1的区别在于，对比例4是阳离子聚合物先发生交联反应，再对纤连蛋白进行包裹。
对比例5
两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40的制备步骤同实施例1。
(1)将制得的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40(1g)、纤连蛋白(2g)和顺丁烯二酐(1g)加入二甲基亚砜溶液(10mL)中，充分搅拌(450rpm)60min；
(2)将混合溶液转移至透析袋(截留分子量为3500Da)中，用去离子水(1L)透析48h；透析完毕后，将透析袋中的聚合物载药囊泡溶液通过水系滤膜(0.45μm)过滤；经冷冻干燥48h后，获得本对比例纤连蛋白纳米制剂。
对比例5和实施例1的区别在于，对比例5是阳离子聚合物发生交联反应，及对纤连蛋白进行包裹过程同时进行。
对比例6
两亲性阳离子聚合物PMPC10-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC10的制备(以制备1.0mmol为例)：溴化PCL10-co-(PCL-NH2)20的制备步骤同实施例1。
将溴化PCL10-co-(PCL-NH2)20(4.02g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(5.91g，20.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(0.35g，2.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC10-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC10(数均分子量Mn为9605)。
将实施例1中的质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC10-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC10，其余不变，制得本对比例纤连蛋白纳米制剂。
对比例7
两亲性阳离子聚合物PMPC50-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC50的制备(以制备1.0mmol为例)：溴化PCL10-co-(PCL-NH2)20制备步骤同实施例1。
将溴化PCL10-co-(PCL-NH2)20(4.02g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(29.53g，100.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(1.75g，10.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC50-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC50(数均分子量Mn为33227)。
将实施例1中的质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC50-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC50，其余不变，制得本对比例纤连蛋白纳米制剂。
对比例8
两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)5)-b-PMPC40的制备(以制备1.0mmol为例)：S1.将ξ-己内酯(1.14g，10.0mmol)和氨基化ξ-己内酯(1.28g，5.0mmol)加入至1,3-丙二醇(0.076g，1.0mmol)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂异辛酸亚锡(0.024g)，在130℃条件下反应12h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，并在50℃条件下干燥24h，得到PCL10-co-(PCL-NH2)5。
S2.将PCL10-co-(PCL-NH2)5(1.78g，1.0mmol)、2-溴代异丁酰溴(1.839g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，先在0℃反应3h，再在25℃下继续反应24h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，获得溴化PCL10-co-(PCL-NH2)5。
S3.将溴化PCL10-co-(PCL-NH2)5(2.02g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(23.62g，80.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(1.39g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)5)-b-PMPC40(数均分子量Mn为25401)。
将实施例1中的质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)5)-b-PMPC40，其余不变，制得本对比例纤连蛋白纳米制剂。
对比例9
两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)40)-b-PMPC40的制备(以制备1.0mmol为例)：S1.将ξ-己内酯(1.14g，10.0mmol)和氨基化ξ-己内酯(5.12g，40.0mmol)加入至1,3-丙二醇(0.076g，1.0mmol)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂异辛酸亚锡(0.058g)，在130℃条件下反应12h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，并在50℃条件下干燥24h，得到PCL10-co-(PCL-NH2)40。
S2.将PCL10-co-(PCL-NH2)40(6.26g，1.0mmol)、2-溴代异丁酰溴(1.839g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，先在0℃反应3h，再在25℃下继续反应24h，将反应混合物滴入过量的正己烷中，经沉淀纯化后，收集固体产物，获得溴化PCL10-co-(PCL-NH2)40。
S3.将溴化PCL10-co-(PCL-NH2)40(6.50g，1.0mmol)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(23.62g，80.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(1.39g，8.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)40)-b-PMPC40(数均分子量Mn为29882)。
将实施例1中的质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的两亲性阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)40)-b-PMPC40，其余不变，制得本对比例纤连蛋白纳米制剂。
对比例10
阳离子聚合物PMPEG40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPEG40的制备(以制备1.0mmol为例)：溴化PCL10-co-(PCL-NH2)20制备步骤同实施例1。
将溴化PCL10-co-(PCL-NH2)20(4.02g，1.0mmol)、聚乙二醇丙烯酸酯(24.0g，80.0mmol)、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺(1.75g，10.0mmol)溶于四氢呋喃(50mL)中，在氮气保护下，往反应体系中加入催化剂CuBr(0.28g，2.0mmol)，在60℃条件下反应24h，将反应混合物通过中性氧化铝柱(洗脱液为四氢呋喃溶液)除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，滴加入过量的正己烷中沉淀，收集固体产物经干燥，得到所述聚合物PMPEG40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPEG40(数均分子量Mn为27700)。
将实施例1中的质量为1g的阳离子聚合物PMPC40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPC40换成质量为1g的聚合物PMPEG40-b-(PCL10-co-(PCL-NH2)20)-b-PMPEG40，其余不变，制得本对比例纤连蛋白纳米制剂。
对比例11
本对比例与实施例1的区别仅在于将实施例1中的质量为2g的纤连蛋白换成质量为0.5g的纤连蛋白，其余均与实施例1相同，制得本对比例的纤连蛋白纳米制剂。
对比例12
本对比例与实施例1的区别仅在于将实施例1中的质量为2g的纤连蛋白换成质量为5g的纤连蛋白，其余均与实施例1相同，制得本对比例的纤连蛋白纳米制剂。
对比例13
本对比例与实施例1的区别仅在于将实施例1中的质量为1g的顺丁烯二酐换成质量为0.2g的顺丁烯二酐，其余均与实施例1相同，制得本对比例的纤连蛋白纳米制剂。
对比例14
本对比例与实施例1的区别仅在于将实施例1中的质量为1g的顺丁烯二酐换成质量为4g的顺丁烯二酐，其余均与实施例1相同，制得本对比例的纤连蛋白纳米制剂。
对比例15
本对比例与实施例1的区别仅在于将实施例1中的质量为2g的纤连蛋白换成质量为2g的胶原蛋白，其余均与实施例1相同，制得本对比例的胶原蛋白纳米制剂。
测试例1-粒径测定
将实施例1-15和对比例1-15的纳米制剂，配成质量百分数为5％的水溶液，采用马尔文Nano-ZS90动态光散射粒度分析仪表征上述实施例1-15和对比例1-15样品溶液的粒径和粒径分布系数，测试角为90°，测试温度为25℃，每组实验均进行三次平行实验，实验结果取其算术平均值。测试结果见表1。
测试例2-包封率测定
准确称取10mg冻干的纤连蛋白纳米制剂充分溶解于10mL二甲基亚砜中，取5μL上述液体经高效液相色谱仪(HPLC，日本岛津)测定纤连蛋白或胶原蛋白的含量，即纤连蛋白纳米制剂/胶原蛋白纳米制剂中被包裹的纤连蛋白/胶原蛋白的含量。根据公式(1)计算纤连蛋白纳米制剂/胶原蛋白纳米制剂的包封率(EE)。HPLC系统所用分析柱为非极性C18柱，流动相为乙腈，流速为1.0mL/min，色谱柱柱温为30℃，每组实验均进行三次平行实验，实验结果取其算术平均值。测试结果见表1。
其中，WLoad表示样品中被包裹的纤连蛋白/胶原蛋白的含量；WIn Feed表示纤连蛋白纳米制剂/胶原蛋白纳米制剂制备过程中纤连蛋白/胶原蛋白的投料量。
表1实施例1-15和对比例1-15纳米制剂的粒径和包封率结果
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实施例1-15和对比例1-15的粒径表征和包封率测试结果如表1所示。对比实施例1-3可知，阳离子聚合物中，疏水嵌段聚合方式不同，最终制备得到的纤连蛋白纳米制剂的粒径和包封率不同。实施例1-3中，疏水嵌段的聚合方式分别为ξ-己内酯和氨基化ξ-己内酯共聚(实施例1)、先ξ-己内酯自聚，后氨基化ξ-己内酯自聚(实施例2)、先氨基化ξ-己内酯自聚，后ξ-己内酯自聚(实施例3)，结果表明，在实施例1-3中，实施例1的样品溶液的粒径最小，为73.2nm，且包封率最高，为80.7％。在本发明中，疏水嵌段采用ξ-己内酯和氨基化ξ-己内酯共聚的方式得到PCL10-co-(PCL-NH2)20，最终制备得到的阳离子聚合物对纤连蛋白的包裹效果最好。
对比实施例1、实施例4、实施例5、对比例6和对比例7可知，阳离子聚合物中，阳离子嵌段PMPC的聚合度不同，会影响产品的粒径和包封率。随着PMPC的聚合度增加，产品的粒径先减少后增大，包封率则先增加后降低。当阳离子嵌段PMPC的聚合度为10和50时，产品的包封率均较低(＜60％)，因此，本发明选择阳离子嵌段PMPC的聚合度为20-40，优选为40。
对比实施例1、实施例6、实施例7、对比例8和对比例9可知，阳离子聚合物中，疏水嵌段中的PCL-NH2的聚合度不同，最终影响产品的粒径和包封率。随着PCL-NH2的聚合度增加，产品的粒径逐渐增大，包封率则先增加后降低。当PCL-NH2的聚合度为5和40时，产品的包封率＜51％，低于PCL-NH2的聚合度为10、20、30的实施例，因此，本发明选择PCL-NH2的聚合度为10-30，优选为20。
对比实施例1、实施例8-10、对比例11和对比例12可知，随着纤连蛋白的投料量增加，样品的粒径逐渐增大，然而包封率先增加后降低。当聚合物与纤连蛋白的投料比为1:(1-4)时，样品的包封率>60％，尤其是当聚合物与纤连蛋白的投料比为1:2时，样品的包封率最高，为80.7％，此时样品的粒径为73.2nm。因此，本发明选择两亲性阳离子聚合物与纤连蛋白的质量比为1:(1～4)，优选为1:2。
对比实施例1、实施例11-13、对比例1、对比例13和对比例14可知，交联剂的投入量不同，最终影响产品的粒径和包封率。随着交联剂的投入量增加，样品的粒径逐渐减少，然而包封率则先增加后降低。当交联剂的投入量为0.2g和4g时，产品的包封率均较低(＜55％)，因此，本发明选择交联剂的投入量为0.5-3g，优选为1g。
对比实施例1和对比例10可知，相比非离子亲水嵌段聚乙二醇丙烯酸酯(PMPEG)，采用阳离子PMPC为亲水嵌段，所制得的聚合物对纤连蛋白进行包裹，得到的产品的粒径更小，包封率更高。
对比实施例1、对比例2和对比例3可知，阳离子聚合物的疏水嵌段中，聚合单体组成不同，最终制备得到的纤连蛋白纳米制剂的粒径和包封率不同。实施例1中，疏水嵌段由ξ-己内酯和氨基化ξ-己内酯共聚制得；对比例2中，疏水嵌段由ξ-己内酯自聚制得；对比例3中，疏水嵌段由氨基化ξ-己内酯自聚制得。结果表明，疏水嵌段采用ξ-己内酯和氨基化ξ-己内酯共聚，最终制得的阳离子聚合物对纤连蛋白的包裹效果最好。
对比实施例1、对比例4和对比例5可知，纤连蛋白纳米制剂的制备过程中，载药过程和交联反应过程的先后顺序，最终制得的纤连蛋白纳米制剂的粒径和包封率不同。实施例1样品的制备过程是先进行载药过程，后进行交联过程；对比例4样品的制备过程是先进行交联过程，后进行载药过程；对比例5样品的制备过程，是载药过程和交联过程同时进行。结果表明，在纤连蛋白纳米制剂的制备过程中，阳离子聚合物先对纤连蛋白进行包载，后采用交联剂对阳离子聚合物进行交联，所制得的样品的粒径更小，包封率更高。
对比实施例1和对比例15可知，用本发明的阳离子聚合物对对纤连蛋白进行包载，得到的纤连蛋白制剂粒径小(73.2nm)，包封率高(80.7％)，将纤连蛋白换为同等质量的胶原蛋白，制备得到的胶原蛋白制剂的粒径大(257.2nm)，包封率低(47.4％)。表明本发明的阳离子聚合物包载纤连蛋白时，具有更好的包载效果。
测试例3-透皮吸收(促渗)测试
使用透皮吸收(促渗)试验评价实施例1-7和对比例1-10的纤连蛋白纳米制剂、纤连蛋白粉末的透皮吸收(促渗)能力的影响。具体测试方法如下：
体外透皮实验选用垂直式扩散池，以裸鼠皮肤为模型(腹部皮肤，去除皮下脂肪层和血管)。接收液为PBS溶液。将皮片固定在供给池与接收池之间，皮肤层向上，平衡20min。将各样品配制成质量百分数为5％的样品溶液，并取液加入供给池，在1h、2h、6h、8h和24h后取接收液。接收液用去离子水超声破乳，然后通过高效液相色谱(HPLC，日本岛津)测定纤连蛋白的含量，并以此计算单位面积累计透过量。每组实验均进行三次平行实验，实验结果取其算术平均值。皮片上单位面积累计透过量的计算公式如公式(2)：
其中，Qn为t时间样品的单位面积累计透过率(μg/cm2)，A为渗透面积，Cn为t时间浓度测定值，Ci为t时间之前浓度测定值，V为接受液总体积，V0为取样体积。
实施例1-7和对比例1-10样品中的纤连蛋白透皮吸收表征结果如表2所示。
表2实施例1-7和对比例1-10样品中的纤连蛋白单位面积透过量
从表2可知，疏水嵌段的聚合方式、亲水嵌段PMPC的聚合度、疏水嵌段中的NH2-PCL的聚合度、疏水嵌段中聚合单体组成、纤连蛋白纳米制剂的制备过程中的载药过程和交联反应过程的先后顺序、亲水嵌段的种类均会影响样品中纤连蛋白的透皮吸收效果。
实施例1在1h、4h、8h和24h的透皮吸收效果均优于实施例2和实施例3，说明疏水嵌段单体的聚合方式影响纤连蛋白的透皮吸收效果。在本发明中，疏水嵌段采用ξ-己内酯和氨基化ξ-己内酯共聚的方式得到PCL10-co-(PCL-NH2)20，最终制得的阳离子聚合物，包裹纤连蛋白，得到的纳米制剂具有更好的透皮吸收效果。
实施例1在1h、4h、8h和24h的透皮吸收效果均优于实施例4、实施例5、对比例6和对比例7，说明阳离子亲水嵌段PMPC的聚合度影响纤连蛋白的透皮吸收效果。在本发明中，当阳离子亲水嵌段PMPC的聚合度为40时，最终产品具有更好的透皮吸收效果。
实施例1在1h、4h、8h和24h的透皮吸收效果均优于实施例6、实施例7、对比例8和对比例9，说明疏水嵌段中的PCL-NH2的聚合度影响纤连蛋白的透皮吸收效果。在本发明中，当疏水嵌段中的PCL-NH2的聚合度为20时，最终产品具有更好的透皮吸收效果。
实施例1在1h、4h、8h和24h的透皮吸收效果均优于对比例2和对比例3，说明阳离子聚合物的疏水嵌段中，聚合单体的组成影响纤连蛋白的透皮吸收效果。在本发明中，疏水嵌段选择ξ-己内酯和氨基化ξ-己内酯的共聚物，最终产品具有更好的透皮吸收效果。
实施例1在1h、4h、8h和24h的透皮吸收效果均优于对比例4和对比例5，说明纤连蛋白纳米制剂的制备过程中，载药过程和交联反应过程的先后顺序影响纤连蛋白的透皮吸收效果。在本发明中，与先交联后包裹纤连蛋白以及交联和包裹纤连蛋白同时进行的方式相比，采用先包裹纤连蛋白，后对其进行交联的方式，最终产品具有更好的透皮吸收效果。
实施例1在1h、4h、8h和24h的透皮吸收效果均优于对比例10，说明亲水嵌段的类型影响纤连蛋白的透皮吸收效果。在本发明中，采用阳离子PMPC为亲水嵌段，最终产品具有更好的透皮吸收效果。
测试例4-抗皱、紧致功效测定
(1)斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进测试
测试原理：胶原蛋白是人体的细胞外基质蛋白中含量最高的，其中I型胶原蛋白是皮肤中丰富的蛋白质。斑马鱼的I型胶原蛋白分布与人体相同，且显示出与人类的高度保守性，他们的先天表达在受精后6天大时显著下降，并在受精后10-12天之间变得非常低。测试斑马鱼I型胶原蛋白基因(collala)表达，比较实验组和空白对照组斑马鱼I型胶原蛋白基因相对表达量变化，计算I型胶原蛋白基因表达促进率可评价产品的抗皱和紧致功效。
测试方法：空白对照组：随机挑选36尾健康的受精后6天大的斑马鱼，转移至24-孔板中，每孔含12尾斑马鱼和2.5mL鱼胚胎培养液。
实验组：将实施例1的纤连蛋白纳米制剂分别溶于鱼胚胎培养液中，配制得到质量百分比为5％的样品溶液。随机挑选36尾健康的受精后6天大的斑马鱼，转移至24-孔板中，每孔含12尾斑马鱼和2.5mL5％的样品溶液(实施例2、3，对比例1-3和10的纤连蛋白纳米制剂、纤连蛋白粉末分别重复实验组的操作)。
培养过程：将上述空白对照组和实验组置于28℃恒温箱中培养24h。收集每孔中的12尾斑马鱼于1.5mL试管中，除去溶液，加入0.5mL RNAlater溶液(Invitrogen；AM7020)，冰冻储存。
RNA提取过程：除去试管中RNAlater溶液，用PBS溶液冲洗3次。置于冰浴中，除去PBS溶液，加入500μL TRIzol试剂(Invitrogen；15596018)。用颗粒杵对胚胎进行均质化，置于冰浴10min。加入100μL三氯甲烷，涡旋1min，置于冰浴5min。离心样品20min，转移上层溶液至1.5mL离心管，加入250μL异丙醇，涡旋1min，置于冰浴10min，离心样本20min。除去所有上清液，加入500μL乙醇，涡旋1min，离心样本5min，置于冰浴10min。重复此步骤3次。除去乙醇，离心样本5min，在通风橱中打开盖子风干样品10min。加入10μL无DNase/RNase(DNA酶/RNA酶)超纯蒸馏水，55℃加热15min。
cDNA合成过程：用无DNase/RNase超纯蒸馏水将上述RNA样本稀释至1000ng/7μL。用含gDNA Eraser的PrimerScript RT试剂盒(Takara；Cat no.RR047A)将RNA合成为cDNA，冰冻储存。
实时RT-PCR过程：为每个引物准备引物混合物及实时PCR主混合物。用无DNase/RNase超纯蒸馏水将cDNA样本稀释10倍。每孔PCR用96孔板加入9μL PCR主混合物及1μL稀释的cDNA样本。用光学胶膜密封PCR用96孔板，离心孔板5min，进行实时PCR扩增。市售PCR试剂盒采用SYBR Premix Ex Taq(Takara；Cat no.RR420A)。
数据和结果计算：收集实时PCR数据。计算每个基因(collala)的相对表达量作为测试结果。通过公式(3)计算胶原蛋白基因表达促进率。
其中，T表示实验组斑马鱼胶原蛋白基因相对表达量；C表示空白对照组斑马鱼胶原蛋白基因相对表达量。
(2)弹性蛋白基因(Eln1)表达促进测试
测试原理：人体皮肤中弹性蛋白是一种让体内许多组织在拉伸和收缩后维持原有形状，让皮肤在被挤压后恢复到本来形状的蛋白质。随着年龄增长，皮肤中的弹性蛋白纤维会逐渐断裂流失而令皮肤产生皱纹且失去弹性。斑马鱼皮肤和人体皮肤相比，除表皮为分化了的表皮细胞和黏液层而非角质层外，其他结构和人体皮肤高度相似。弹性蛋白基因高度保守，人体内的弹性蛋白由Eln基因合成，该基因在斑马鱼体内的对应基因为Eln1，通过测试样本是否促进斑马鱼体内Eln1基因的表达，可以评判样本是否有促进弹性蛋白再生，帮忙皮肤抗皱，实现皮肤紧致的功效。
测试方法：空白组设置、实验组设置、RNA提取过程、cDNA合成过程、实时RT-PCR过程所采用的方法同本测试例中I型胶原蛋白基因表达促进测试方法。
通过公式(4)计算弹性蛋白基因表达促进率。
其中，T表示实验组斑马鱼弹性蛋白基因相对表达量；C表示空白对照组斑马鱼弹性蛋白基因相对表达量。
表3实施例1-3、对比例1-3、对比例10、纤连蛋白样品对斑马鱼I型胶原蛋白基因和弹性蛋白基因表达的促进测试结果
实施例1-3、对比例1-3、对比例10、纤连蛋白溶液样品对斑马鱼I型胶原蛋白基因和弹性蛋白基因的表达促进测试结果如表3所示。从表中结果可看出，实施例1-3、对比例1-3、对比例10、纤连蛋白样品均可促进斑马鱼I型胶原蛋白基因和弹性蛋白基因的表达。实施例1-3的纤连蛋白纳米制剂对斑马鱼I型胶原蛋白基因和弹性蛋白基因表达的促进效果优于对比例1，说明交联步骤影响纤连蛋白纳米制剂的紧致功效。实施例1-3的纤连蛋白纳米制剂对斑马鱼I型胶原蛋白基因和弹性蛋白基因表达的促进效果优于对比例10，说明纤连蛋白纳米制剂亲水嵌段的种类影响了纤连蛋白纳米制剂的紧致功效，在本发明中，选用PMPC作为亲水嵌段的阳离子聚合物包裹纤连蛋白，得到的纳米制剂的紧致功效最好。实施例1的纤连蛋白纳米制剂对斑马鱼I型胶原蛋白基因和弹性蛋白基因表达的促进效果最优，优于实施例2、实施例3、对比例2、3，说明疏水嵌段采用ξ-己内酯和氨基化ξ-己内酯共聚的方式得到PCL10-co-(PCL-NH2)20，最终制得的纤连蛋白纳米制剂的抗皱和紧致功效最优。
测试例5-舒缓功效测定
中性粒细胞聚集抑制测试
测试原理：斑马鱼胚胎的中性粒细胞和人体中性粒细胞在形态、生化和生理功能上高度相似。中性粒细胞是在损伤或病菌入侵部位第一批出现的白细胞，作用于清除感染或有害物质。应用硫酸铜诱导斑马鱼胚胎侧线区域神经丘细胞损伤而引起中性粒细胞聚集的模型进行测试，比较受试物处理组和模型对照组的鱼胚胎侧线区域的中性粒细胞的数量变化，计算中性粒细胞抑制率以评价样品的舒缓功效。
测试方法：空白对照组：随机挑选24尾健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)的鱼胚胎培养液。
阳性对照组：随机挑选24尾健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)和0.0036mg/L吲哚美辛的鱼胚胎培养液(吲哚美辛具有舒缓作用，可以抑制中性粒细胞聚集，阳性对照用于判断实验的有效性。)。
实验组：将实施例1纤连蛋白纳米制剂溶于鱼胚胎培养液中，配制成质量百分比为5％的样品溶液。随机挑选24尾健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)和待测样品的鱼胚胎培养液(实施例2、3，对比例1-3和10的纤连蛋白纳米制剂、纤连蛋白粉末分别重复实验组的操作)。
将上述空白对照组、阳性对照组和实验组置于28℃恒温箱中培养40min。将每测试组鱼胚胎于多聚甲醛溶液(4％)中固定至少1h后，用PBST(Triton X-100的质量百分数为0.04％的PBS溶液)处理鱼胚胎3次，每次5min，然后用50％乙醇处理3min。用苏丹黑(0.4％)染色溶液对鱼胚胎进行室温染色1h后，用70％乙醇浸洗4次，每次5min，然后用PBST处理2次，每次5min。用漂白溶液(H2O2和KOH的质量百分数分别为3％和1％的混合水溶液)处理鱼胚胎10min，然后用70％乙醇溶液处理5min，PBST处理1min，用清澈液1(甘油和KOH的质量百分数分别为20％和0.25％的混合水溶液)处理15min，清澈液2(甘油和KOH的质量百分数分别为50％和0.25％的混合水溶液)处理10min，再用PBST处理3min。将鱼胚胎侧身摆放，置于体式显微镜，计数每尾鱼胚胎从肝门起四分之三尾部侧线区域的中性粒细胞数目。通过公式(5)计算中性粒细胞聚集抑制率。
其中，T表示实验组斑马鱼胚胎中性粒细胞数目的平均值；C表示空白对照组斑马鱼胚胎中性粒细胞数目的平均值。
表4实施例1-3、对比例1-3、对比例10、纤连蛋白样品对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制结果
样品 中性粒细胞数目(个) 中性粒细胞聚集抑制率(％)
阳性对照 19 30
实施例1 15 44
实施例2 17 37
实施例3 17 37
对比例1 22 18
对比例2 20 26
对比例3 23 15
对比例10 21 22
纤连蛋白 19 30
空白对照组 27 —
实施例1-3、对比例1-3、对比例10、纤连蛋白溶液样品对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制结果如表4所示。从表中结果可看出，实施例1-3、对比例1-3、对比例10、纤连蛋白溶液样品均可抑制斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集。实施例1-3的纤连蛋白纳米制剂对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集的抑制效果优于对比例1，说明交联步骤影响纤连蛋白纳米制剂的舒缓功效。实施例1-3的纤连蛋白纳米制剂对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集的抑制效果优于对比例10，说明纤连蛋白纳米制剂亲水嵌段的种类影响了纤连蛋白纳米制剂的舒缓功效，在本发明中，选用PMPC作为亲水嵌段的阳离子聚合物包裹纤连蛋白，得到的纳米制剂的舒缓功效最好。实施例1的纤连蛋白纳米制剂对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集的抑制效果最优，优于实施例2、实施例3、对比例2、3，说明疏水嵌段采用ξ-己内酯和氨基化ξ-己内酯共聚的方式得到PCL10-co-(PCL-NH2)20，最终制得的纤连蛋白纳米制剂的舒缓功效最优。
测试例6-组织修护功效
斑马鱼胚胎尾鳍修护促进测试
测试原理：当受到伤害时，皮肤必须快速重生来修复皮肤屏障。在胚胎阶段，伤口愈合十分迅速且不会留下伤疤；但过了胚胎阶段，伤口愈合需经过凝血、炎症、皮肤再生、血管再生和肉芽组织的形成，最终形成伤疤等步骤。斑马鱼在伤口修复过程中，除了不会形成凝血外，其余步骤和人类相同。斑马鱼伤口皮肤愈合非常迅速，紧接着炎症细胞迁移至伤口形成由巨噬细胞、纤维细胞、血管和胶原蛋白组成的肉芽组织。因此，斑马鱼和人类伤口愈合的主要步骤和原理十分一致，可以作为人体皮肤修护功效的检测筛查模型。
测试方法：挑选健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎，使用三卡因水溶液(质量百分比为0.4％)麻醉斑马鱼胚胎，于显微镜下用实验解剖刀切除斑马鱼胚胎尾鳍。
空白对照组：随机挑选24尾经损伤处理的斑马鱼胚胎，转移96-孔板中，每孔含一粒鱼胚胎和0.2mL鱼胚胎培养液。
阳性对照组：随机挑选24尾经损伤处理的斑马鱼胚胎，转移96-孔板中，每孔含有一粒鱼胚胎和0.2mL熟地黄提取物溶液(质量百分数为10％)。
实验组：将实施例1的纤连蛋白纳米制剂溶于鱼胚胎培养液中，配制成质量百分比为5％的样品溶液。随机挑选24尾经损伤处理的斑马鱼胚胎，转移96-孔板中，每孔含有一粒鱼胚胎和0.2mL待测样品的鱼胚胎培养液(实施例2、3，对比例1-3和10的纤连蛋白纳米制剂、纤连蛋白粉末分别重复实验组的操作)。
将上述空白对照组、阳性对照组和实验组置于28℃恒温箱中培养3h。
用三卡因将斑马鱼胚胎麻醉，然后放到体式显微镜下对每尾鱼胚胎的尾鳍长度进行计数。通过公式(6)计算斑马鱼胚胎尾鳍修护促进率。
其中，T表示实验组斑马鱼胚胎尾鳍长度的平均值；C表示空白对照组斑马鱼胚胎尾鳍长度的平均值。
表5实施例1-3、对比例1-3、对比例10、纤连蛋白样品对斑马鱼胚胎尾鳍修护促进测试结果
样品 斑马鱼胚胎尾鳍长度(μm) 斑马鱼胚胎尾鳍修护促进率(％)
实施例1 186 14.8
实施例2 183 13.0
实施例3 183 13.0
对比例1 172 6.2
对比例2 175 8.0
对比例3 176 8.6
对比例10 173 6.8
纤连蛋白 170 4.9
阳性对照组 191 17.9
空白对照组 162 —
实施例1-3、对比例1-3、对比例10、纤连蛋白溶液样品对斑马鱼胚胎尾鳍修护促进结果如表4所示。从表中结果可看出，实施例1-3、对比例1-3、对比例10、纤连蛋白溶液样品均可促进斑马鱼胚胎尾鳍的修护。实施例1-3的纤连蛋白纳米制剂对斑马鱼胚胎尾鳍的修护促进效果优于对比例1，说明交联步骤影响纤连蛋白纳米制剂的组织修护功效。实施例1-3的纤连蛋白纳米制剂对斑马鱼胚胎尾鳍的修护促进效果优于对比例10，说明纤连蛋白纳米制剂亲水嵌段的种类影响了纤连蛋白纳米制剂的组织修护功效，在本发明中，选用PMPC作为亲水嵌段的阳离子聚合物包裹纤连蛋白，得到的纳米制剂的组织修护功效最好。实施例1的纤连蛋白纳米制剂对斑马鱼胚胎尾鳍修护的促进效果最优，优于实施例2、实施例3、对比例2、3，说明疏水嵌段采用ξ-己内酯和氨基化ξ-己内酯共聚的方式得到PCL10-co-(PCL-NH2)20，最终制得的纤连蛋白纳米制剂的组织修护功效最优。
应用例
本发明还提供一种纤连蛋白纳米制剂在抗皱精华液中的应用。
一种抗皱精华液，由以下质量百分比的组分组成：A相：84.388％的水、0.2％的羟苯甲酯、2.0％的PEG/PPG-17/6共聚物、B相：0.1％的β-葡聚糖、0.15％的透明质酸钠、C相：0.3％的乳酸杆菌发酵产物、0.15％的乳酸杆菌发酵溶胞产物、0.3％的银耳(TREMELLAFUCIFORMIS)提取物、0.3％的薯蓣(DIOSCOREA OPPOSITA)根提取物、1.2％的丙二醇、1.8％的1,2-己二醇、2.0％的1,2-戊二醇、1.0％的去离子水、0.2％的丁二醇、0.1％的芍药(PAEONIA ALBIFLORA)根提取物、0.1％的白薇(CYNANCHUM ATRATUM)提取物、0.1％的积雪草(CENTELLA ASIATICA)提取物、0.1％的龙胆(GENTIANA SCABRA)根提取物、0.1％的母菊(CHAMOMILLA RECUTITA)花提取物、5.0％实施例1的纤连蛋白纳米制剂、0.2％的苯氧乙醇、0.2％的乙基己基甘油、D相：0.003％的香精、0.009％的PEG-40氢化蓖麻油。
所述抗皱精华液的制备方法为如下步骤：
(1)将A相中各物料加热至85℃，混合均匀，得到混合液1；
(2)将混合液1降温至40℃，加入B相中各物料，混合均匀，得到混合液2；
(3)将混合液2降温至25℃，加入C相、D相各物料，混合均匀，即得抗皱精华液。
将上述应用例中的质量百分比为5％的纤连蛋白纳米制剂换成质量百分比为5％的纤连蛋白，其余不变，制备得到对照精华液。
将所得抗皱精华液和对照精华液进行抗皱-人体功效评测。
测试方法：筛选出面部有皱纹的人群(30-45岁)作为抗皱功效测试志愿者，通过抗皱精华液与精华液基质对照。选取20名有效志愿者，在脸部左侧或右侧分别涂抹本发明中的应用例具有抗皱功效的抗皱精华液和精华液基质(随机分配)，测试共进行4周，分别在使用前、使用2周后和使用4周后测试对应区域的皮肤水分含量、皮肤水分流失量、皮肤紧致程度、皮肤弹性、皱纹面积等指标。表7为抗皱精华液和对照精华液的抗皱人体功效评测结果。
表7抗皱精华液和对照精华液的抗皱人体功效评测结果
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测试表明，本发明的抗皱精华液具有很好的抗皱功效。从表中可看出，使用抗皱精华液一侧的皮肤角质层水分含量的增长率比使用对照精华液一侧的要好；使用抗皱精华液一侧的皮肤经皮水分流失降低程度比使用对照精华液一侧的要好；使用抗皱精华液一侧的皮肤弹性R0值的增加程度比使用对照精华液一侧的要好；使用抗皱精华液一侧的皮肤弹性R2值的增加程度比使用对照精华液一侧的要好；使用抗皱精华液一侧的皱纹面部占比减少程度比使用对照精华液一侧的要好。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将两亲性阳离子聚合物和纤连蛋白在溶剂中搅拌，充分溶解得混合溶液，所述两亲性阳离子聚合物与纤连蛋白的质量比为1:（1~4），所述溶剂为二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、N,N’-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、1,3-丙二醇、甘油、1,4-丁二醇、戊二醇、1,2-己二醇、乙二醇、季戊四醇、双丙甘醇、缩二乙二醇中的至少一种；所述两亲性阳离子聚合物与溶剂的质量比为1:（5-20）；
（2）将所述混合溶液透析，过滤，加入交联剂搅拌均匀，所述交联剂与两亲性阳离子聚合物的质量比为1:（0.5-3），所述交联剂为2,3-二甲基顺丁烯二酸酐、顺丁烯二酸酐、2,3,-二甲基呋喃基顺丁烯二酸酐中的至少一种；
（3）再次透析，过滤，干燥，即得具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂；
所述步骤（1）中的两亲性阳离子聚合物含有亲水嵌段和疏水嵌段；所述疏水嵌段为氨基化聚己内酯-b-聚己内酯-b-氨基化聚己内酯、聚己内酯-b-氨基化聚己内酯-b-聚己内酯、聚己内酯-co-氨基化聚己内酯中的至少一种；所述疏水嵌段中氨基化聚己内酯的聚合度为10~30，所述聚己内酯的聚合度为5~15；所述疏水嵌段的数均分子量为2420~4980；所述亲水嵌段为聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱，所述亲水嵌段的聚合度为20~40，所述亲水嵌段的数均分子量为11800-23600；所述两亲性阳离子聚合物的数均分子量为15511~28602；
所述步骤（1）和所述步骤（2）中的搅拌速度为100rpm-500rpm；搅拌时间为30min-90min；所述步骤（2）和所述步骤（3）中均采用透析袋透析，所述透析袋的透析截留分子量为500Da-5000Da，透析过程中去离子水的用量为0.5L-1.5L，透析时间为24h-72h；所述步骤（2）和所述步骤（3）中均采用水系滤膜进行过滤，所述水系滤膜的孔径为0.2μm-0.8μm；所述步骤（3）中，所述干燥为冷冻干燥、真空干燥、鼓风干燥中的至少一种，所述干燥的时间为24h-72h；
所述两亲性阳离子聚合物的制备方法包括以下步骤：
S1.将两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段对应的聚合物单体在惰性气体保护下，进行开环聚合反应，得两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段；所述开环聚合反应的引发剂为乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,6-己二醇中的至少一种，所述开环聚合反应的催化剂为有机锡催化剂，反应温度为80℃-160℃，反应时间为8h-18h；所述引发剂与所述聚合物单体的摩尔比为1:（10-30）；
S2.将所述两亲性阳离子聚合物的疏水嵌段溶于有机溶剂中，在惰性气体保护下，加入2-溴代异丁酰溴，在-5℃-5℃的条件下反应2h-4h，再在15℃-40℃下继续反应12h-48h，得到经溴化处理的疏水嵌段聚合物；所述疏水嵌段聚合物与2-溴代异丁酰溴的摩尔比为1:（4.0-12.0）；所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中至少一种；
S3.将两亲性阳离子聚合物亲水嵌段的聚合单体2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、所述经溴化处理的疏水嵌段聚合物、N,N,N’,N’,N’’-五甲基二亚乙基三胺溶于有机溶剂中，在惰性气体保护下，往反应体系中加入催化剂，在40℃-80℃条件下反应12h-48h，制得所述两亲性阳离子聚合物，其中所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中至少一种；所述催化剂为CuBr、CuCl、CuI中的至少一种；所述经溴化处理的疏水嵌段聚合物与2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的摩尔比为1:（20-100）；所述经溴化处理的疏水嵌段聚合物与N,N,N’,N’,N’’-五甲基二亚乙基三胺的摩尔比为1:（2-10）；所述经溴化处理的疏水嵌段聚合物与所述催化剂的摩尔比为1:（1-3）。
2.一种采用如权利要求1所述制备方法制备所得具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂。
3.如权利要求2所述的具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂在制备化妆品和药物中的应用。
4.一种抗皱精华液，其特征在于，所述抗皱精华液包括如权利要求2所述的具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂，且所述具有组织修护、抗皱和舒缓功效的纤连蛋白纳米制剂在所述抗皱精华液中的质量百分含量为3.0%-7.0%。
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