CN116206681A - 一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法 - Google Patents

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CN116206681A CN202111473772.3A CN202111473772A CN116206681A CN 116206681 A CN116206681 A CN 116206681A CN 202111473772 A CN202111473772 A CN 202111473772A CN 116206681 A CN116206681 A CN 116206681A
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Abstract

本发明提供一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法，属于基因技术领域，包括如下步骤，收集肿瘤免疫研究中的免疫细胞基因集，基于高斯算法和细胞对算法在GBM样本中构建ICP评分，对ICP评分进行突变特征的确定，对ICP评分进行免疫原性特征的定义，基于ICP评分的构建，挖掘出内皮细胞和巨噬细胞最佳预后细胞对，结合细胞的表面分子，挖掘出CD163/MCAM最佳预后基因对，确定CD163/MCAM在细胞交互中的作用，在湘雅队列的测序数据和免疫组化样本中验证CD163/MCAM基因对的预后价值。全面收集肿瘤微环境中的免疫细胞类型，并引入细胞对算法以在GBM中开发强大的免疫特征，免疫特征可以帮助识别具有更好免疫治疗反应的GBM患者，巨噬细胞/周细胞和CD163/MCAM被证实主要影响GBM患者的生存。

Description

一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法
技术领域
本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法。
背景技术
世界卫生组织(WHO)分类将I级和II级胶质瘤定义为低级别胶质瘤 (LGG)，将III级和IV级胶质瘤定义为高级别胶质瘤(HGG)，其中胶质母细胞瘤(GBM)被公认为最具破坏性的原发性脑肿瘤，具有极高的死亡率。通常，LGG患者的10年生存率为47％，中位生存时间为11.6年，而GBM患者的中位生存时间小于15个月。尽管进行了辅助放化疗的手术切除，GBM患者的预后仍然很差。迄今为止，生物标志物包括异柠檬酸脱氢酶(IDH)、 1p19q、O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)和分子亚型包括原神经、经典和间充质已被用于GBM患者的精确分类，以促进临床管理和实现个体化治疗。
肿瘤浸润免疫细胞(TIIC)，包括T细胞、肥大细胞、肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)、癌症相关成纤维细胞(CAF)和自然杀伤(NK)细胞，可引发针对肿瘤的强烈免疫反应。TIIC在调节癌症的免疫监视和创造加速肿瘤进展的宽松微环境方面发挥着核心作用。以前的研究探索了几种TIIC在各种癌症类型中的作用，包括卵巢癌、肺腺癌、胰腺肿瘤和黑色素瘤。值得注意的是， TIICs已被提议作为免疫治疗的介质或免疫治疗靶点。此外，随着生物信息学的快速发展，为基于大规模分析的癌症研究提供了新的见解，许多研究已经在各种癌症类型中建立了基于免疫浸润细胞的风险特征。然而，TIICs在 GBM的肿瘤微环境(TME)中的综合作用缺乏深入的了解。因此，开发基于 TIIC的特征有助于确定TIIC在GBM中的预后价值并提高免疫治疗方法的疗效。然而，尽管已经开发了诸如xCell、CIBERSORT和TIMER等算法来量化基于批量/单细胞测序数据集的TIICs的表达水平，以促进TIICs的研究，但这些方法受到可能导致TIICs的不同参考基因组的限制。来自不同研究的不同研究结果。鉴于肿瘤微环境中每种TIICs的比例在一个相对稳定的范围内，探索不同TIICs的比例可以潜在地优化TME研究中TIICs的量化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法，解决背景技术中提到的技术问题。
TIICs调节癌细胞的免疫监视和免疫逃逸。TIICs在各种癌症类型中的预后价值已被报道。然而，GBM中多种TIIC的总生存获益尚未得到充分探索，也尚未就TIIC达成共识导向的风险特征。此外，考虑到不均匀的参考基因组和免疫细胞特征，以前的免疫细胞衍生的预后模型在不同转录组数据集的交叉验证中受到限制。免疫细胞和参考基因组注释的频繁更新版本可能会阻碍其广泛应用并阻碍临床实践的前景(50)。为了解决这个问题，我们收集并整合了65个免疫细胞，以建立一个强大而全面的风险特征。此外，我们引入了用于构建预后免疫特征的细胞对概念。我们探索了使用免疫细胞的相对表达水平来计算CP评分的可能性，这广泛地减少了参考基因组更新注释的影响，消除了数据标准化的需要，并提高了设计模型的准确性。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法，所述方法包括如下步骤，
步骤1：收集肿瘤免疫研究中的免疫细胞基因集，基于高斯算法和细胞对算法在GBM样本中构建ICP评分；
步骤2：对ICP评分进行突变特征的确定；
步骤3：对ICP评分进行免疫原性特征的定义；
步骤4：基于ICP评分的构建，挖掘出内皮细胞和巨噬细胞最佳预后细胞对，并进一步结合细胞的表面分子，挖掘出CD163/MCAM最佳预后基因对；
步骤5：在单细胞层面确定CD163/MCAM在细胞交互中的作用；
步骤6：在湘雅队列的测序数据和免疫组化样本中验证CD163/MCAM基因对的预后价值。
进一步地，步骤1的具体过程为，
步骤1.1：收集免疫细胞基因集和预处理，从6个队列中收集总共1127 个GBM患者样本，并被定义为整合队列，523个GBM患者样本来自 TCGA，33个GBM患者样本的单细胞RNA测序数据来自Single Cell Portal平台，来自安捷伦生成的微阵列数据集的原始数据是从GEO下载，Illumina生成的基因表达谱和相应的临床信息从TCGA和CGGA下载，来自安捷伦的数据集的原始数据使用RMA算法在limma软件包中进行背景调整处理，来自Illumina的原始数据使用lumi软件包进行处理，RNA-seq 数据的每千碱基百万片段值被转化为转录本每千碱基百万值，使用R包sva 去除计算批处理效应；
步骤1.2：免疫细胞基因集，从公开资源中整合免疫细胞特征，通过整合来自不同文献的免疫细胞类型的基因集，最终获得了65个免疫细胞特征，并提前提供了65种免疫细胞类型的列表；
步骤1.3：在GBM中开发可靠的风险模型，进行单变量Cox分析以筛选出GBM数据集TCGAGBM-RNAseq，数据集TCGAGBM-RNAseq有 523个样本具有预后价值的预后相关免疫细胞类型，然后将预后相关免疫细胞类型Ci与所有65种免疫浸润细胞类型Cj配对，对于免疫细胞类型Ci和免疫浸润细胞类型Cj开头的单元格对，Score_ij＝1(exp_Ci–exp_Cj>0) 和Score_ij＝0(exp_Ci–exp_Cj<0)，采用2年曲线下面积AUC来估计每个Score_ij的性能，并找出具有统计学显着预后和最高2年曲线下面积 AUC的细胞对，对于每个免疫细胞类型Ci，Score_ij被确定为最高的2年曲线下面积AUC，对具有最高2年曲线下面积AUC的已识别细胞对进行进一步排序，风险比HR>1，并删除重复的细胞对，随后使用基于高斯有限混合模型GMM的基于细胞对模型的分层凝聚聚类进行分类，然后使用选定的 Score_ij计算ICP分数，ICP分数＝Score_ij。
进一步地，步骤2的具体过程为，
步骤2.1：ICP评分的基因组改变，从TCGA下载与具有RNA-seq数据的GBM样本相对应的体细胞突变和体细胞拷贝数变异CNV，使用R包 maftools可视化体细胞突变，使用GISTIC 2.0分析确定与两个ICP评分组相关的CNV和改变峰的阈值拷贝数；
步骤2.2：ICP评分的免疫浸润分析，从现有技术中获取115个代谢相关信号通路的基因特征和七种类型的免疫检查点分子，收集了若干种免疫调节剂，使用xCell算法、TIMER算法、EPIC算法、MCPcounter算法、quanTlseq 算法和CIBERSORT算法识别GBM肿瘤微环境中的免疫浸润细胞。
进一步地，步骤3的具体过程为，免疫治疗反应中ICP评分的预测，收集在PRJNA482620数据集中接受抗PD1免疫治疗的GBM样本用于评估 ICP评分的预测值，尿路上皮癌队列和黑色素瘤数据集GSE78220进一步用于预测免疫治疗反应，使用DEseq2R包对来自两个数据集的原始数据进行标准化，并将原始矩阵的表达值转换为TPM值，分别在这两个队列中计算了ICP评分。
进一步地，步骤4的具体过程为，细胞对巨噬细胞/周细胞与基因对 CD163/MCAM进行鉴定，基于2y-AUC，探索与预后最相关的细胞对，对鉴定的细胞对巨噬细胞/周细胞进行了功能注释，包括生物过程、代谢途径、炎症特征和免疫浸润，CD31、NG2、PDGFR beta、CD146、Nestin用作周细胞标记，而CD11b、CD68、CD163、CD14、CD16用作巨噬细胞标记，然后将来自巨噬细胞的标记物和来自周细胞的标记物配对，还基于2y-AUC探索与预后最相关的基因对，对鉴定的基因对CD163/MCAM进行功能注释，包括生物过程、代谢途径、炎症特征和免疫浸润。
进一步地，步骤5的具体过程为，注释基因对CD163/MCAM进行单细胞测序，基于R包infercnv，肿瘤细胞首先被识别，在使用R包RunPCA 执行主成分分析PCA后，使用R包FindNeighbors定义K最近邻，基于基因改变的水平，使用R包FindClusters组合具有最高基因改变的细胞，R包 UMAP和R包tSNE用于降维，R包scCATCH用于非恶性细胞类型的注释， R包FindMarkers用于筛选出鉴定细胞类型中显着差异表达的基因，使用 Scalop算法定义单细胞水平的四种类型的GBM，使用R包CellChat探索细胞通讯模式，分析和可视化不同的受体-配体信号通路。
进一步地，步骤6的具体过程为，
步骤6.1：收集了73名GBM患者的福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织进行测序，1μgRNA用作RNA样品制备的输入材料，剪切DNA，然后使用NEBNext Ultra RNA Library PrepKit制备测序文库，然后使用Phusion高保真DNA聚合酶、通用PCR引物和索引X引物进行PCR，通过生物素标记的探针捕获目标区域后，捕获的文库在Illumina Hiseq平台上进行测序，以生成125/150bp的双端读数，内部perlscripts用于处理原始数据，然后包含adapter和ploy-N的reads，将低质量的reads去掉，得到干净的数据 cleanreads，从基因组网站获得参考基因组和基因模型注释文件，参考基因组索引是使用Hisat2 v2.0.5构建的，双端清洁读数与参考基因组对齐，然后使用FeatureCounts v1.5.0-p3计算映射到每个基因的读取数，每个基因的TPM 是根据基因长度计算的，读数计数映射到相应的基因；
步骤6.2：从医院的GBM手术切除患者为组织来源，然后用福尔马林固定组织并包埋在石蜡中，用于随后获得切片，切片为4μm，然后将切片煮沸进行抗原修复，采用3％H2O2作为内源HPR活性的阻断剂，5％BSA用于切片阻断，兔多克隆抗CD163和抗MCAM抗体，而内源HRP标记的山羊抗兔IgG是二抗，带有一抗的切片在4摄氏度下孵育过夜，底物与溶液1 和溶液2以1滴/1ml的比例混合用于检查信号，底物为3,3'-二氨基联苯胺，DAB，苏木精用于切片染色，染色后最后用光学显微镜观察，对于强度评分，负、弱、中和强四个强度等级分别被指定为等级0、等级1、等级2和等级3，至于程度评分，即为染色细胞的比例，10％、10-25％、25-50％、50-75％和>75％分别被指定为0、1、2、3和4，H分数计算为范围*强度，范围为0-12；
步骤6.3：对数秩检验用于确定生存差异，并使用R包survminer生成生存曲线，预后因素的临床意义由单变量和多变量Cox回归分析确定，通过 Pearson相关分析计算相关系数，使用R包pROC可视化接收器操作特征 ROC分析，R包maftools用于通过OncoPrint描绘TCGA的突变景观，所有统计分析均在R项目3.6.3上进行，P<0.05被认为具有统计学意义。
本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：
本发明全面收集了肿瘤微环境中的免疫细胞类型，并引入了细胞对算法以在GBM中开发强大的免疫特征，免疫特征可以帮助识别具有更好免疫治疗反应的GBM患者，此外，巨噬细胞/周细胞和CD163/MCAM被证实主要影响GBM患者的生存，基于已识别免疫细胞类型的相对丰度构建细胞对 ICP评分，因此，高ICP评分预测GBM患者的总生存期较差，此外，ICP评分与各种致瘤和免疫原性因素密切相关，可以灵敏地预测抗PD-1免疫治疗的反应，ICP评分有望加深对GBM TME中TIICs的理解，改善GBM患者的临床管理，同时，基因对CD163/MCAM有望成为GBM的潜在预后标志物和治疗靶点。
附图说明
图1是本发明方法流程图；
图2是本发明细胞对算法的流程图与相关样本数据汇总图；
图3是本发明TCGA中ICP评分的免疫原性和致瘤性特征与ICP评分相关特征数据图；
图4是本发明TCGA中ICP评分的免疫浸润特征与ICP评分相关浸润特征数据图；
图5是本发明ICP评分在免疫治疗中的预测价值与相关数据图；
图6是本发明基因对CD163/MCAM的预后价值与相关数据图；
图7是本发明单细胞测序水平的基因对CD163/MCAM的分子特征与相关数据图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
如图1所示，一种免疫浸润细胞模型的预后细胞对价值评价方法，包括如下步骤，
步骤1：收集肿瘤免疫研究中的免疫细胞基因集，基于高斯算法和细胞对算法在GBM样本中构建ICP评分，以下ICP评分简称CP评分。
步骤1.1：数据集收集和预处理：
公开的GBM队列是从Gene Expression Omnibus(GEO； https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)、癌症基因组图谱(TCGA) (https://xenabrowser.net/)和中国胶质瘤基因组图谱(CGGA； http://www.cgga.org.cn/)。总共523个GBM患者样本来自TCGA。从6个队列中收集了总共1127个GBM患者样本，并被定义为整合队列。33个 GBM患者样本(登录号SCP50和SCP393)的单细胞RNA测序数据来自 Single Cell Portal平台(http://singlecell.broadinstitute.org)。表S1中提供了平台和患者样本的信息。来自安捷伦生成的微阵列数据集的原始数据是从 GEO下载的。Illumina生成的基因表达谱和相应的临床信息从TCGA和 CGGA下载。来自安捷伦的数据集的原始数据使用RMA算法在limma软件包中进行背景调整处理。来自Illumina的原始数据使用lumi软件包进行处理(18)。RNA-seq数据的每千碱基百万片段(FPKM)值被转化为转录本每千碱基百万(TPM)值，该值与来自微阵列数据集的RMA标准化值更具可比性(19)。使用R包sva去除了计算批处理效应。
步骤1.2：免疫细胞基因集：
从公开可用的资源中整合了免疫细胞特征。通过整合来自不同文献的免疫细胞类型的基因集，最终获得了65个免疫细胞特征，并被认为是可靠的。我们之前的发现提供了65种免疫细胞类型的列表。
步骤1.3：在GBM中开发可靠的风险模型：
进行单变量Cox分析以筛选出GBM数据集TCGAGBM-RNAseq(523个样本)中具有预后价值的预后相关免疫细胞类型。然后将预后相关免疫细胞类型(Ci)与所有65种免疫浸润细胞类型(Cj)配对。对于以Ci、Ci和Cj 开头的单元格对，Score_ij＝1(exp_Ci–exp_Cj>0)和Score_ij＝0(exp_Ci –exp_Cj<0)。采用2年曲线下面积(AUC)来估计每个Score_ij的性能，并找出具有统计学显着预后和最高2年AUC的细胞对(23)。对于每个Ci， Score_ij被确定为最高的2年AUC。对具有最高2年AUC的已识别细胞对进行进一步排序，风险比(HR)>1，并删除重复的细胞对。随后，使用基于高斯有限混合模型(GMM)的基于细胞对模型的分层凝聚聚类进行分类。然后，使用这些选定的Score_ij计算CP分数：
CP分数＝Score_ij
步骤2：对ICP评分进行突变特征的确定。
步骤2.1：CP评分的基因组改变：
从TCGA下载与具有RNA-seq数据的GBM样本相对应的体细胞突变和体细胞拷贝数变异(CNV)。使用R包maftools可视化体细胞突变。使用GISTIC 2.0分析(https://gatk.broadinstitute.org)确定与两个CP评分组相关的CNV和改变峰的阈值拷贝数。
步骤2.2：CP评分的免疫浸润分析：
115个代谢相关信号通路的基因特征来自之前发表的工作。七种类型的免疫检查点分子来自之前的一项研究。收集了多种免疫调节剂。使用xCell算法、TIMER算法、EPIC算法、MCPcounter算法、quanTlseq算法和CIBERSORT 算法识别GBM肿瘤微环境中的免疫浸润细胞。
步骤3：对ICP评分进行免疫治疗分析：
免疫治疗反应中CP评分的预测，收集在PRJNA482620数据集中接受抗 PD1免疫治疗的GBM样本用于评估CP评分的预测值。IMvigor210队列 (尿路上皮癌队列)和GSE78220(黑色素瘤数据集)进一步用于预测免疫治疗反应(37,38)。使用DEseq2R包对来自两个数据集的原始数据进行标准化，并将原始矩阵的表达值转换为TPM值。分别在这两个队列中计算了CP 评分。
步骤4：基于ICP评分的构建，挖掘出内皮细胞和巨噬细胞最佳预后细胞对，并进一步结合细胞的表面分子，挖掘出CD163/MCAM最佳预后基因对。
细胞对巨噬细胞/周细胞和基因对CD163/MCAM的鉴定，基于2y-AUC，探索了与预后最相关的细胞对。对鉴定的细胞对巨噬细胞/周细胞进行了功能注释，包括生物过程、代谢途径、炎症特征、免疫浸润。
CD31、NG2、PDGFR beta、CD146、Nestin用作周细胞标记，而CD11b、 CD68、CD163、CD14、CD16用作巨噬细胞标记。然后将来自巨噬细胞的标记物和来自周细胞的标记物配对。还基于2y-AUC探索了与预后最相关的基因对。对鉴定的基因对CD163/MCAM进行了功能注释，包括生物过程、代谢途径、炎症特征和免疫浸润。
步骤5：在单细胞层面确定CD163/MCAM在细胞交互中的作用。
用于注释基因对CD163/MCAM的单细胞测序，基于R包“infercnv”，肿瘤细胞首先被识别。在使用R包“RunPCA”执行主成分分析(PCA)后，使用R包“FindNeighbors”定义K最近邻。基于基因改变的水平，使用R 包“FindClusters”组合具有最高基因改变的细胞。R包“UMAP”和R包“tSNE”用于降维。R包“scCATCH”用于非恶性细胞类型的注释。R包“FindMarkers”用于筛选出鉴定细胞类型中显着差异表达的基因。使用“Scalop”算法定义了单细胞水平的四种类型的GBM。使用R包“CellChat”探索细胞通讯模式，分析和可视化不同的受体-配体信号通路。
步骤6：在湘雅队列的测序数据和免疫组化样本中验证CD163/MCAM基因对的预后价值。
步骤6.1：湘雅队列的转录组测序，收集了73名GBM患者的福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织进行测序。简而言之，1μg RNA用作RNA样品制备的输入材料。剪切DNA，然后使用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit制备测序文库。然后使用Phusion高保真DNA聚合酶、通用PCR引物和索引(X)引物进行PCR。通过生物素标记的探针捕获目标区域后，捕获的文库在Illumina Hiseq平台上进行测序，以生成125/150bp的双端读数。内部 perlscripts用于处理原始数据(原始读取)。然后包含adapter和ploy-N的reads，将低质量的reads去掉，得到干净的数据(cleanreads)。从基因组网站 (http://genome.ucsc.edu)获得参考基因组和基因模型注释文件。参考基因组索引是使用Hisat2 v2.0.5构建的，双端清洁读数与参考基因组对齐。然后使用 FeatureCounts v1.5.0-p3计算映射到每个基因的读取数。每个基因的TPM是根据基因长度计算的，读数计数映射到这个基因。
步骤6.2：中南大学湘雅医院GBM手术切除患者(n＝45)为组织来源。然后用福尔马林固定组织并包埋在石蜡中，用于随后获得切片(4μm)。然后将切片煮沸进行抗原修复，采用3％H2O2作为内源HPR活性的阻断剂。 5％BSA用于切片阻断。兔多克隆抗CD163和抗MCAM抗体(1:50； Proteintech；中国武汉)是一抗，而HRP标记的山羊抗兔IgG是二抗。带有一抗的切片在4摄氏度下孵育过夜。底物(3,3'-二氨基联苯胺，DAB)与溶液1和2以1滴/1ml的比例混合用于检查信号。苏木精用于切片染色。染色后最后用光学显微镜观察。对于强度评分，负、弱、中和强四个强度等级分别被指定为0、1、2和3。至于程度评分(染色细胞的比例)，10％、 10-25％、25-50％、50-75％和>75％分别被指定为0、1、2、3和4。H分数计算为范围*强度，范围为0-12。
步骤6.3：对数秩检验用于确定生存差异，并使用R包survminer生成生存曲线。预后因素的临床意义由单变量和多变量Cox回归分析确定。通过 Pearson相关分析计算相关系数。使用R包pROC可视化接收器操作特征 (ROC)分析。R包maftools用于通过OncoPrint(40)描绘TCGA的突变景观。所有统计分析均在R项目3.6.3上进行。P<0.05被认为具有统计学意义。
实施过程：
CP评分的构建及其预后价值，通过单变量Cox回归分析在TCGA GBM 样本中鉴定了26种具有预后价值的免疫细胞类型，并与从先前发表的研究中收集的65种整合免疫细胞类型配对。每个细胞对根据相对表达水平被指定为1或0作为分数。计算所有细胞对的2年AUC后，确定了2年AUC最高的13个免疫细胞对。执行GMM后，基于6个免疫细胞对的CP评分最终以最高的AUC脱颖而出(图2A)。显示了具有最高2年AUC值的13个细胞对的HR。GMM分类器在所有8191个公式中排序的CP评分模型的AUC 如图2C所示。CP评分预测来自TCGA的LGG样本、GBM样本和泛神经胶质瘤样本的存活率较差(对数秩检验，p<0.001；分别为图2D、2E和2F)。此外，CP评分是湘雅队列GBM样本和泛神经胶质瘤样本中的危险因素(对数秩检验，p<0.001；分别为图2G和2H)。ROC分析的2年、3年、4年和5年AUC为0.703、0.738、0.767和0.797，证实CP评分可作为预测TCGA 的GBM患者生存状态的预后标志物(图2I)。
与CP评分相关的免疫逃逸机制，发现高CP分数与TCGA和整合队列中的N-聚糖生物合成、犬尿氨酸代谢和前列腺素生物合成显着相关(为图 2A)。已经提出癌症免疫循环来综合反映几种趋化因子和免疫调节剂的功能 (42,43)。值得注意的是，癌症免疫循环中的大部分步骤在高CP评分组中被上调，包括细胞抗原的释放、肿瘤抗原呈递和免疫细胞的募集(CD8T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、MDSC、单核细胞、中性粒细胞、NK细胞、Th1细胞、Th17细胞和Th22细胞)，以及免疫细胞在TCGA和整合队列中浸润到肿瘤中(为图3B)。
首先评估了一系列致瘤和免疫原性因素。高CP评分组表现出更高的T 细胞炎症基因表达谱(GEP)，表明抗PD-1治疗的反应率更高(图3C)。高 CP评分组还显示出较低的同源重组缺陷(HRD)，这是细胞死亡的指标(图 3D)。有趣的是，高CP分数组与更高数量的段相关(图3E)。包括TGF- β反应、白细胞分数、基质分数、干扰素γ(IFNG)、IFNG标志基因集(IFNG.GS)和干扰素刺激基因抗性特征(ISG.RS)在内的基质特征在高CP评分组中都较高。(图3F-3K)。在抗原呈递能力方面，高CP评分组呈现更高水平的T细胞受体(TCR)香农指数、TCR丰富度和更高的抗原加工和呈递机制(APM)评分(分别为图3L-3N)。
还评估了CP评分组的免疫浸润特征。因此，高CP评分组与较高水平的 ESTIMATE评分、免疫评分和基质评分相关(图4A)。基于六种不同的算法，高CP评分组与免疫抑制细胞显着相关，包括调节性T细胞(Treg)、TAM、 CAF、T辅助2细胞(Th2)和树突状细胞(DC)(图4B)。GSVA的GO结果证实，致瘤通路包括调节ERBB信号通路、Toll样受体信号通路、NF-kB转录因子活性、神经胶质细胞活化，以及免疫原性通路包括调节巨噬细胞、趋化因子产生、肥大细胞活化等。在TCGA和整合队列中的高CP评分组中激活(图4C)。此外，高CP评分组与PD-1治疗效果、T细胞信号、缺氧信号、外泌体信号和免疫抑制细胞信号显着相关，包括Tregs、骨髓源性抑制细胞 (MDSCs)、TAMs和CAFs在TCGA和整合队列(图4D)。
接下来探讨CP评分与七种类型的免疫检查点分子之间的关联。高CP 评分组与包括ICOS、PDCD1、CTLA4和CD40在内的大多数免疫检查点分子呈正相关，并且可能通过TCGA中的这些经典免疫检查点分子来逃避免疫反应(图5A)。值得注意的是，CP评分组中免疫检查点分子的表达差异不存在于体细胞突变和CNV，但与甲基化密切相关(图5A)。
CP评分预测免疫治疗反应，免疫疗法彻底改变了癌症治疗。因此，还探讨了CP评分在免疫治疗反应中的预测价值。在探索GBM患者抗PD-1免疫疗法反应的队列中，CP评分高的患者对PD-1免疫疗法的反应较小(图5B)。在黑色素瘤数据集GSE78220中，高CP评分预测较差的生存结果(图5C)。同样，具有高CP评分的患者表现出稳定的疾病和进行性疾病(图5D)。CP评分也在IMvigor210队列(尿路上皮癌数据集)中构建。正如预期的那样，高 CP评分预测较差的生存结果(图5E)。CP评分高的患者表现出疾病稳定和疾病进展(图5F)。
基于六种不同的算法，细胞组M>P与免疫抑制细胞显着相关，包括Treg、 TAM、CAF和DC(图6A)。此外，细胞组M>P预测TCGA中的存活率较差(图6C)。
基因对CD163/MCAM的功能注释，基于六种不同的算法，高组与免疫抑制细胞显着相关，包括Treg、TAM、CAF、Th2和DC(图6B)。此外，高组预测TCGA的存活率较差(图6D)。
湘雅队列中基因对CD163/MCAM的验证，在湘雅队列73个GBM样本的测序数据中，高组与存活率降低相关(图6E)。此外，对来自湘雅队列的 45个GBM样本进行了IHC染色。根据IHC染色结果中CD163和MCAM的 H-score,将45个GBM样本分为高组(CD163>MCAM)和低组(CD163<MCAM)(图6G)。值得注意的是，根据湘雅队列的IHC染色，高组也与存活率降低有关(图6F)。
CD163/MCAM在单细胞水平上的表征，为了进一步阐明基因对 CD163/MCAM在GBM肿瘤微环境中的作用，我们基于33个GBM样本进行了单细胞测序分析。肿瘤细胞被定义为具有非整倍体的细胞，在执行t-SNE 降维后，总共确定了11种细胞类型(图7A)。图6B显示了11种细胞类型之间的差异表达基因(DEG)。发现CD163在DC、小胶质细胞和M0/M1/M2 巨噬细胞中更富集，而MCAM在OPC、少突胶质细胞和血管细胞中更富集(图 7C)。根据CD163和MCAM的相对表达，进行UMAP降维后，将细胞分为高组(CD163>MCAM)和低组(CD163<MCAM)(图7D)。两组在11种细胞类型中的相对比例如图7E所示。高组更多地被M0巨噬细胞和小胶质细胞占据，而低组更多地被神经元、肿瘤和OPC占据(图7E)。GBM中的恶性细胞在单细胞水平上分为四种主要类型：神经祖细胞样(NPC-like)、少突胶质祖细胞祖细胞样(OPC-like)、星形胶质细胞样(AC-like)和间充质-基于 Neftel阐明的GBM细胞表达谱的类似(MES样)。发现AC样和MES样恶性细胞与高组更相关，而NPC样恶性细胞在低组中富集(图6F)。GSEA 结果证实，致瘤途径在低组中更被激活，而免疫原性途径在高组中更被激活 (图7G)。
图2中，A.细胞对算法的流程图。B.森林图描绘了具有最高2y-AUC 值的13个细胞对。C.逻辑回归模型的模式与AUC值相关，并由高斯混合识别。有8191个组合的9个集群。TCGA数据集中D.LGG样本、E.GBM 样本和F.神经胶质瘤样本中两个CP评分组的Kaplan-Meier曲线。对数秩检验，P<0.001。G.湘雅队列GBM样本中两个CP评分组的Kaplan-Meier曲线。对数秩检验，P<0.001。H.湘雅队列胶质瘤样本中两个CP评分组的 Kaplan-Meier曲线。对数秩检验，P<0.001。I.测量CP评分在TCGA数据集中预测GBM患者2年、3年、4年和5年生存率的敏感性的ROC曲线。ROC 曲线下面积分别为0.703、0.738、0.767和0.797。
图3中，TCGA中CP评分的免疫原性和致瘤性特征。A.说明CP评分中代谢特征表达模式的热图。B.高和低CP评分组之间癌症免疫循环各个步骤的差异。C.高和低CP分数组中的GEP分数。D.高和低CP分数组的HRD。 E.高和低CP分数组中的segments。F.高和低CP评分组中的TGF-β反应。G.高和低CP评分组中的白细胞分数。H.高和低CP评分组的基质分数。I.高和低CP评分组中的IFNG评分。J.高和低CP评分组中的IFNG.GS评分。 K.高和低CP评分组中的ISG.RS评分。L.高和低CP分数组中的TCR香农指数。M.高和低CP分数组中的TCR丰富度。N.高和低CP分数组的APM分数。
图4中，TCGA中CP评分的免疫浸润特征。A.高低CP评分组ESTIMATE 评分、免疫评分和基质评分的表达差异。B.不同算法中免疫细胞与CP评分相关性的估计。C.说明CP评分中免疫功能表达模式的热图。D.说明CP评分中免疫调节特征表达模式的热图。
图5中，CP评分在免疫治疗中的预测价值。A.说明七种免疫调节剂在CP 评分中的表达模式的热图。从左到右：CP得分；突变频率；扩增频率；两个 CP评分组中免疫调节剂的缺失频率和甲基化(基因表达与DNA甲基化值的相关性)。B.有或没有PD-1反应的患者CP评分的表达差异。P＝0.012。C. GSE78220数据集中两个CP评分组的Kaplan-Meier曲线。对数秩检验，P< 0.1412。D.具有不同PD-1临床反应状态(CR/PR和SD/PD)的组的CP评分。组间差异通过Wilcoxon检验进行比较(Wilcoxon，P＝0.036)。E.IMvigor210 数据集中CP评分组的Kaplan-Meier曲线。对数秩检验，P＝0.00174。F.具有不同PD-1临床反应状态(CR、PR、SD、PD)的组的CP评分。通过 Kruskal-Wallis检验比较组间差异(Kruskal-Wallis，P＝0.013)。
图6中，基因对CD163/MCAM的预后价值。A.不同算法中免疫细胞与细胞对巨噬细胞/周细胞之间相关性的估计。B.不同算法下免疫细胞与基因对 CD163/MCAM相关性的估计。C.TCGA中两个细胞对组的Kaplan-Meier曲线。对数秩检验，P<0.001。D.TCGA中两个基因组的Kaplan-Meier曲线。对数秩检验，P＝0.00115。E.基于湘雅队列测序数据的两个基因组的Kaplan-Meier曲线。对数秩检验，P＝0.04908。F.基于湘雅队列IHC染色的两个基因组的Kaplan-Meier曲线。对数秩检验，P＝0.02014。G.湘雅队列四个代表性样本中 CD163和MCAM的IHC染色。
图7中，单细胞测序水平的基因对CD163/MCAM的分子特征。A.用于非整倍体细胞、二倍体细胞和11种已识别细胞类型可视化的t-SNE图。B.显示 11种细胞类型之间差异表达基因的点图。C.CD163和MCAM在11种细胞类型中的表达差异。D.高组(CD163表达>MCAM表达)和低组(MCAM表达> CD163表达)细胞可视化的UMAP图。E.柱状图显示高低组11种细胞类型的比例差异。F.高低组四种细胞类型的相对比例。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤，
步骤1：收集肿瘤免疫研究中的免疫细胞基因集，基于高斯算法和细胞对算法在GBM样本中构建ICP评分；
步骤2：对ICP评分进行突变特征的确定；
步骤3：对ICP评分进行免疫原性特征的定义；
步骤4：基于ICP评分的构建，挖掘出内皮细胞和巨噬细胞最佳预后细胞对，并进一步结合细胞的表面分子，挖掘出CD163/MCAM最佳预后基因对；
步骤5：在单细胞层面确定CD163/MCAM在细胞交互中的作用；
步骤6：在湘雅队列的测序数据和免疫组化样本中验证CD163/MCAM基因对的预后价值。
2.根据权利要求1所述的一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法，其特征在于：步骤1的具体过程为，
步骤1.1：收集免疫细胞基因集和预处理，从6个队列中收集总共1127个GBM患者样本，并被定义为建模队列，523个GBM患者样本来自TCGA，33个GBM患者样本的单细胞RNA测序数据来自Single Cell Portal平台，来自安捷伦生成的微阵列数据集的原始数据是从GEO下载，Illumina生成的基因表达谱和相应的临床信息从TCGA和CGGA下载，来自安捷伦的数据集的原始数据使用RMA算法在limma软件包中进行背景调整处理，来自Illumina的原始数据使用lumi软件包进行处理，RNA-seq数据的每千碱基百万片段值被转化为转录本每千碱基百万值，使用R包sva去除计算批处理效应；
步骤1.2：免疫细胞基因集，从公开资源中整合免疫细胞特征，通过整合来自不同文献的免疫细胞类型的基因集，最终获得了65个免疫细胞特征，并提前提供了65种免疫细胞类型的列表；
步骤1.3：在GBM中开发可靠的风险模型，进行单变量Cox分析以筛选出GBM数据集TCGAGBM-RNAseq，数据集TCGAGBM-RNAseq有523个样本具有预后价值的预后相关免疫细胞类型，然后将预后相关免疫细胞类型Ci与所有65种免疫浸润细胞类型Cj配对，对于免疫细胞类型Ci和免疫浸润细胞类型Cj开头的单元格对，Score_ij＝1(exp_Ci–exp_Cj>0)和Score_ij＝0(exp_Ci–exp_Cj<0)，采用2年曲线下面积AUC来估计每个Score_ij的性能，并找出具有统计学显着预后和最高2年曲线下面积AUC的细胞对，对于每个免疫细胞类型Ci，Score_ij被确定为最高的2年曲线下面积AUC，对具有最高2年曲线下面积AUC的已识别细胞对进行进一步排序，风险比HR>1，并删除重复的细胞对，随后使用基于高斯有限混合模型GMM的基于细胞对模型的分层凝聚聚类进行分类，然后使用选定的Score_ij计算ICP分数，ICP分数＝Score_ij。
3.根据权利要求1所述的一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法，其特征在于：步骤2的具体过程为，
步骤2.1：ICP评分的基因组改变，从TCGA下载与具有RNA-seq数据的GBM样本相对应的体细胞突变和体细胞拷贝数变异CNV，使用R包maftools可视化体细胞突变，使用GISTIC2.0分析确定与两个ICP评分组相关的CNV和改变峰的阈值拷贝数；
步骤2.2：ICP评分的功能注释，从现有技术中获取115个代谢相关信号通路的基因特征和七种类型的免疫检查点分子，收集了若干种免疫调节剂，使用xCell算法、TIMER算法、EPIC算法、MCPcounter算法、quanTlseq算法或者CIBERSORT算法识别GBM肿瘤微环境中的免疫浸润细胞。
4.根据权利要求1所述的一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法，其特征在于：步骤3的具体过程为，免疫治疗反应中ICP评分的预测，收集在PRJNA482620数据集中接受抗PD1免疫治疗的GBM样本用于评估ICP评分的预测值，尿路上皮癌队列和黑色素瘤数据集GSE78220进一步用于预测免疫治疗反应，使用DEseq2 R包对来自两个数据集的原始数据进行标准化，并将原始矩阵的表达值转换为TPM值，分别在这两个队列中计算了ICP评分。
5.根据权利要求1所述的一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法，其特征在于：步骤4的具体过程为，细胞对巨噬细胞/周细胞与基因对CD163/MCAM进行鉴定，基于2y-AUC，探索与预后最相关的细胞对，对鉴定的细胞对巨噬细胞/周细胞进行了功能注释，包括生物过程、代谢途径、炎症特征和免疫浸润，CD31、NG2、PDGFRbeta、CD146、Nestin用作周细胞标记，而CD11b、CD68、CD163、CD14、CD16用作巨噬细胞标记，然后将来自巨噬细胞的标记物和来自周细胞的标记物配对，还基于2y-AUC探索与预后最相关的基因对，对鉴定的基因对CD163/MCAM进行功能注释，包括生物过程、代谢途径、炎症特征和免疫浸润。
6.根据权利要求1所述的一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法，其特征在于：步骤5的具体过程为，注释基因对CD163/MCAM进行单细胞测序，基于R包infercnv，肿瘤细胞首先被识别，在使用R包RunPCA执行主成分分析PCA后，使用R包FindNeighbors定义K最近邻，基于基因改变的水平，使用R包FindClusters组合具有最高基因改变的细胞，R包UMAP和R包tSNE用于降维，R包scCATCH用于非恶性细胞类型的注释，R包FindMarkers用于筛选出鉴定细胞类型中显着差异表达的基因，使用Scalop算法定义单细胞水平的四种类型的GBM，使用R包CellChat探索细胞通讯模式，分析和可视化不同的受体-配体信号通路。
7.根据权利要求1所述的一种免疫浸润细胞模型的预后基因对价值评价方法，其特征在于：步骤6的具体过程为，
步骤6.1：收集了73名GBM患者的福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织进行测序，1μg RNA用作RNA样品制备的输入材料，剪切DNA，然后使用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit制备测序文库，然后使用Phusion高保真DNA聚合酶、通用PCR引物和索引X引物进行PCR，通过生物素标记的探针捕获目标区域后，捕获的文库在Illumina Hiseq平台上进行测序，以生成125/150bp的双端读数，内部perlscripts用于处理原始数据，然后包含adapter和ploy-N的reads，将低质量的reads去掉，得到干净的数据cleanreads，从基因组网站获得参考基因组和基因模型注释文件，参考基因组索引是使用Hisat2 v2.0.5构建的，双端清洁读数与参考基因组对齐，然后使用FeatureCounts v1.5.0-p3计算映射到每个基因的读取数，每个基因的TPM是根据基因长度计算的，读数计数映射到相应的基因；
步骤6.2：从医院的GBM手术切除患者为组织来源，然后用福尔马林固定组织并包埋在石蜡中，用于随后获得切片，切片为4μm，然后将切片煮沸进行抗原修复，采用3％H2O2作为内源HPR活性的阻断剂，5％BSA用于切片阻断，兔多克隆抗CD163和抗MCAM抗体，而内源HRP标记的山羊抗兔IgG是二抗，带有一抗的切片在4摄氏度下孵育过夜，底物与溶液1和溶液2以1滴/1ml的比例混合用于检查信号，底物为3,3'-二氨基联苯胺，DAB，苏木精用于切片染色，染色后最后用光学显微镜观察，对于强度评分，负、弱、中、强四个强度等级分别被指定为等级0、等级1、等级2和等级3，至于程度评分，即为染色细胞的比例，10％、10-25％、25-50％、50-75％、>75％分别被指定为0、1、2、3和4，H分数计算为范围*强度，范围为0-12；
步骤6.3：对数秩检验用于确定生存差异，并使用R包survminer生成生存曲线，预后因素的临床意义由单变量和多变量Cox回归分析确定，通过Pearson相关分析计算相关系数，使用R包pROC可视化接收器操作特征ROC分析，R包maftools用于通过OncoPrint描绘TCGA的突变景观，所有统计分析均在R项目3.6.3上进行，P<0.05被认为具有统计学意义。
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