CN116199758A - 梨转录因子PbrMYB24及其促进石细胞中木质素和纤维素合成的应用 - Google Patents

梨转录因子PbrMYB24及其促进石细胞中木质素和纤维素合成的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了梨转录因子PbrMYB24及其促进石细胞中木质素和纤维素合成应用。分离自‘砀山酥梨’的转录因子PbrMYB24基因，其核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示。通过在梨果实中瞬时过量表达，证实了PbrMYB24可以促进果实石细胞和木质素和纤维素的积累过程；过表达PbrMYB24的转基因梨果肉愈伤组织和拟南芥花序茎中，木质素含量和纤维素含量显著增加，同时间苯三酚盐酸染色，翻红固绿染色和卡尔科弗卢尔荧光染色信号显著增强。由此证明PbrMYB24基因参与调控梨果实石细胞中木质素和纤维素的形成。

Description

梨转录因子PbrMYB24及其促进石细胞中木质素和纤维素合成 的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及梨转录因子PbrMYB24及其应用，具体涉及从‘砀山酥梨’中分离、克隆得到一个调控梨果实石细胞发育的MYB家族成员PbrMYB24基因。
背景技术
梨是蔷薇科(Rosaceae)桃亚科(Amygdaloideae)梨属(Pyrus L.)的多年生木本植物，是我国第三大果树树种，有超过三千年的栽培历史(滕元文,2017)。我国大面积栽培的主要是亚洲梨，包括白梨、砂梨、秋子梨和新疆梨；而欧美等西方国家主要栽培西洋梨。我国作为全球第一大梨生产国，栽培面积达1305万亩，总产量达1610万吨，分别占世界总量的67.3％和69.7％(FAO,2020)，在国际梨生产中占举足轻重的地位。但是，由于我国的一些传统的主栽品种，例如砀山酥梨，石细胞含量高，果实品质欠佳，市场竞争力弱。石细胞是梨果肉中特有的性状，大量的石细胞会影响食用口感和加工品质。因此，明确石细胞含量差异，解析石细胞形成机制，对改善梨果实品质显得尤为重要。
石细胞其实是通过次生细胞壁的逐渐加厚发育而来的厚壁组织细胞，通常所谓的果实石细胞实际为多个石细胞组成的“石细胞团”，石细胞团大小、数量和密度直接影响梨果实质地与食用口感(Xue et al.,2020)。梨果实石细胞主要由木质素和纤维素组成，石细胞中平均木质素含量(29.73％)高于平均纤维素含量(18.03％)，说明木质素是梨果实石细胞的主要成分(Zhang et al.,2020)。目前，已有的梨石细胞研究主要集中在生理学和解剖学这两方面，梨果肉石细胞的形成与木质素和纤维素的生物合成、转运、积累具有很高相关性，梨果实石细胞形成的关键基因与分子机制需要进一步解析。
木质素的生物合成是从脱去氨基的芳香族氨基酸苯丙氨酸起始，经过一系列的羟基化、甲基化、还原反应，最终产生了木质素中三个最常见的基础单体，包括松柏醇、芥子醇与对-香豆醇。这些单体在聚合成木质素的过程中分别产生了愈创木基木质素单体(G型单体)、紫丁香基木质素单体(S型单体)和对-羟基苯基木质素单体(H型单体)，最后木质素单体在LAC和POD的作用下聚合形成木质素(Vanholme et al.,2010,Vanholme et al.,2013)。纤维素的合成过程可以概括为，位于细胞膜上的玫瑰环化复合物利用细胞质中的UDP-葡萄糖作为纤维素合成的直接底物，催化葡聚糖链的延伸。然后，将葡萄糖进一步聚合形成微纤丝，并有序地沉积在细胞壁上(Zhong et al.,2019)。目前尚未见关于梨PbrMYB24基因促进石细胞中木质素和纤维素合成的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一个调控梨果实石细胞发育的PbrMYB24基因。
本发明的另一目的是提供该基因的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种分离自‘砀山酥梨’具有促进石细胞中木质素和纤维素合成的转录因子PbrMYB24基因，属于MYB家族成员，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，包含1044bp的开放阅读框；编码347个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示。
含有本发明所述PbrMYB24基因的重组表达载体。
所述的重组表达载体，以pCAMBIA1301为出发载体，所述PbrMYB24基因的插入位点为Xba I和BamHI之间。
含有本发明所述PbrMYB24基因的基因工程菌。
克隆本发明所述PbrMYB24基因cDNA序列的引物对，上游引物PbrMYB24-F1序列如SEQID No.3所示，下游引物PbrMYB24-R1序列如SEQ ID No.4所示。
本发明所述PbrMYB24基因在促进石细胞中木质素和纤维素合成中的应用。
本发明所述的重组表达载体在促进石细胞中木质素和纤维素合成的应用。
有益效果
结合共表达网络分析和转录组分析，申请者在高、低石细胞含量不同的梨品种中鉴定到一个R2R3-MYB转录因子PbrMYB24，该基因在不同品种果实中的表达量变化与石细胞含量高低呈显著正相关。通过在梨果实中瞬时过量表达，证实了PbrMYB24可以促进果实石细胞和木质素和纤维素的积累过程；过表达PbrMYB24的转基因梨果肉愈伤组织和拟南芥花序茎中，木质素含量和纤维素含量显著增加，同时间苯三酚盐酸染色，翻红固绿染色和卡尔科弗卢尔荧光染色信号显著增强。由此证明PbrMYB24基因参与调控梨果实石细胞中木质素和纤维素的形成。该基因的发现补充完善了梨中MYB转录调控的木质素代谢调控机制，为改良梨果实石细胞含量提供理论基础，并为造纸业和生物能源产业通过基因编辑降低木质素含量提供基因资源。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
1.PbrMYB24基因的发现，为改良梨果实石细胞合成提供理论依据，同时为造纸业和生物能源产业通过基因编辑降低木质素含量提供基因资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。
2.通过农杆菌介导遗传转化方法,将PbrMYB24基因在梨幼果，梨果肉愈伤组织及拟南芥中进行功能验证，结果表明本发明克隆的PbrMYB24基因具有同时调控多个基因编码木质素和纤维素合成通路中的酶的优点，为分子育种提供更高效地途径。
附图说明
图1为本发明PbrMYB24基因在不同品种及组织中的时空表达模式分析。
其中：A，20个品种花后35天果肉中PbrMYB24的表达量及石细胞含量的相关性分析。柱形图为PbrMYB24的表达量，圆点为果肉石细胞含量。‘早酥梨’花后35天果肉中PbrMYB24的表达量被设为1。B，20个品种花后35天果肉中PbrMYB24的表达量及木质素含量的相关性分析。柱形图为PbrMYB24的表达量，圆点为果肉木质素含量。C，20个品种花后35天果肉中PbrMYB24的表达量及纤维素含量的相关性分析。柱形图为PbrMYB24的表达量，圆点为果肉纤维素含量。D，‘砀山酥梨’不同发育时期的果实石细胞含量与PbrMYB24的相对表达量的相关性分析。柱形图为PbrMYB24的表达量，圆点为果肉石细胞含量。DAFB表示盛花后果实发育的天数。
图2为本发明实施例2的载体示意图。
图3为本发明PbrMYB24基因瞬时注射梨幼果的功能分析。
其中：A，瞬时表达PbrMYB24基因的梨果实切片间苯三酚盐酸染色，EV为转化空pCAMBIA1301载体的部位；EV-OE为转化35S-PbrMYB24-GFP重组载体的部位。B和C，注射部分的果肉木质素(B)和纤维素(C)含量。D，注射部分梨果肉中木质素和纤维素合成相关基因的表达量。*表示差异显著。
图4为本发明PbrMYB24基因在转基因梨果肉愈伤组织中的功能分析。
其中：A，转基因梨愈伤组织中PbrMYB24的相对表达量。EV为转化空pCAMBIA1301质粒的梨愈伤组织，其余编号：转基因梨愈伤组织。B和C，转基因梨愈伤组织中木质素(B)和纤维素(C)含量。D和E，梨愈伤组织的间苯三酚盐酸染色显示木质素的合成。F和G，卡尔科弗卢尔荧光染色的梨愈伤组织石蜡切片显示纤维素的合成。H，转基因梨愈伤组织中木质素和纤维素合成相关基因的表达量。*表示差异显著。
图5为本发明PbrMYB24基因在转基因拟南芥植株中的功能分析。
其中：A和B，野生型和转基因拟南芥植株中木质素(A)和纤维素(B)含量。WT：野生型；其余编号为转基因株系。C，野生型和转基因拟南芥植株中木质素和纤维素合成相关基因的表达量。D-K，野生型及转基因拟南芥植株花序茎的组织学分析：D-E，甲苯胺蓝染色指示细胞形态结构；F-I，Wiesner和UV光检测木质素沉积空间分布；J-K，卡尔科弗卢尔荧光染色检测纤维素沉积空间分布。L-Q，透射电镜检测次生细胞壁厚度和统计分析。*表示差异显著。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1PbrMYB24基因时空表达模式分析
‘砀山酥梨’不同组织样品采自江苏省徐州市睢宁果园。高、低石细胞含量梨品种采自江苏省农业科学院。总RNA的提取采用CTAB法(Porebski et al.,1997)，并通过分光光度计和琼脂糖胶检测提取样品的质量。取3μg提取的总RNA，用one-step gDNAremoval andcDNA synthesis kit(Transgen,China)进行反转录，方法参照说明书。荧光定量PCR所用引物为基因特异引物对：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；以GAPDH为内参基因，荧光定量试剂盒购自Roche公司。Real-timePCR所用仪器为Roche 480定量PCR仪，反应体系为：2×SYBRGreenI Master Mix 10μL，上下游引物(10μM)0.4μL，2μLcDNA，7.2μLPCR级别的水。反应条件为95℃变性5min；95℃预变性5s，60℃退火5s，72℃延伸10s重复45个循环；熔解曲线分析65℃到95℃，每5s升高1℃。
我们从高、低果肉石细胞含量品种中各选取了20个品种，检测花后35天果肉中石细胞含量，木质素含量，纤维素含量以及PbrMYB24的相对表达量后发现，果肉石细胞含量，木质素含量，纤维素含量与PbrMYB24表达量呈显著正相关，相关性分别达到0.86，0.68和0.63。(图1A-C)。PbrMYB24基因在花后21-49天的果肉组织中的表达量远高于花后63天之后的果肉组织，同时PbrMYB24的表达量与果实发育动态的石细胞含量显著相关(相关性为0.74)(图1D)。根据以上结果，我们推测PbrMYB24表达量的显著不同可能引起不同品种果肉石细胞含量的差异。
实施例2PbrMYB24基因分离克隆与超表达载体的构建
取3μg‘砀山酥梨’早期果肉RNA，用one-step gDNAremoval and cDNA synthesiskit(Transgen,China)进行反转录，方法参照说明书。根据pCAMBIA-1301载体的多克隆位点和PbrMYB24基因的编码区序列上的酶切位点分析，选择Xba I和BamH I作为内切酶。按照一般设计引物的原则用Snapgene软件设计出带有酶切位点的引物SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4。50μL的反应体系中包括200ng cDNA，1×缓冲液(TransStart FastPfu Buffer)，10mMdNTP，1U Taq聚合酶(TransStart FastPfu DNAPolymerase)(前述缓冲液和Taq聚合酶购自TRANS公司)，500nM上述引物。PCR反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性2分钟，95℃变性20秒，60℃退火20秒，72℃延伸1分钟，35个热循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。产生一条单一PCR条带产物。
PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用小量胶回收试剂盒(购自康为世纪，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)回收DNA片段。pCAMBIA1301载体的双酶切体系总体积为50μL，其中含有经过质粒提取获得的pCAMBIA1301载体质粒10μL，10×Buffer(购自NEB公司)5μL，Xba I 1μL，BamH I 1μL及水33μL。于37℃酶切3小时后回收。经过限制性内切酶消化过的表达载体pCAMBIA1301与PbrMYB24基因使用重组酶Exnase II(购自Vazyme公司)于37℃连接30分钟。反应总体积20μL，其中含有5×CE II Buffer 4μL，Exnase II 2μL，PbrMYB24基因的PCR回收产物2μL，pCAMBIA1301载体的双酶切回收产物6μL及水6μL。取连接产物10μL转化大肠杆菌感受态DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选出阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，重组质粒样品送生物公司测序。测序结果表明，PbrMYB24基因全长为1044bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，能编码348个氨基酸残基的蛋白，序列为SEQ ID NO.2所示。我们将重组载体命名为35S-PbrMYB24-GFP，构建完成的载体图谱见图2所示。应用冻融法将重组载体导入到农杆菌GV3101中。
实施例3梨果实瞬时转化及功能分析
(1)梨果实瞬时转化
用含有PbrMYB24过量表达载体的农杆菌，通过农杆菌介导法注射到花后35天左右的‘砀山酥梨’，方法如下：
1、将含有正确质粒的农杆菌于固体培养基上活化，在温度为28℃的培养箱中生长48小时；
2、在100mL锥形瓶中加入30mL含有R+与K+的液体LB培养基，用枪头挑入活化的农杆菌，在28℃、200rpm的摇床中生长12小时；
3、将菌液倒入50mL离心管6000rpm离心15分钟收集全部菌体；
4、用适量的诱导介质(10mM MgCl2、10mM MES、200mM乙酰丁香酮，pH 5.6)重悬沉淀，调整OD值在0.8-1.2，室温中用脱色摇床诱导4个小时；
5、将侵染液注入到花后35天左右的梨果实中，每次至少注射10个果实，试验进行三次生物学重复；
6、暗培养24小时，再放到光周期为16小时光照/8小时黑暗的培养箱中，温度保持22℃，培养7天；
(2)组织学分析
用刀片切开果实，间苯三酚-盐酸染色，具体步骤如下：
1、首先用30％盐酸溶液(V/V)处理1分钟；
2、10％间苯三酚溶于80％乙醇(W/V)；
3、再滴到已经过盐酸处理的切片上，染色5分钟；
4、最后用足量的水清洗终止反应。
间苯三酚-盐酸染色发现，过量表达PbrMYB24的部位木质素染色效果明显增强，注射pCAMBIA1301载体的部位与未注射的部分无明显差异(图3A)。
(3)注射部位木质素和纤维素含量检测
梨果肉愈伤组织的木质素含量分析参照溴乙酰法，木质素中的酚羟基发生乙酰化后在280nm处有特征吸收峰，280nm的吸光值高低与木质素含量正相关。具体方法如下：
1、称取0.01g左右干样于研钵中，每份材料取3个重复。加入1mLpH 7.0的PBS缓冲液，研磨至匀浆后用磷酸缓冲液洗涤研钵和研棒，将匀浆转入15mL离心管中，3000g离心5min(该方法下述离心速度和时间均相同)，缓慢倒出上清。沉淀再用5mLPBS缓冲液洗2次，5mL蒸馏水洗2次，尽可能去除可溶性糖。
2、沉淀中用移液管加入5mL氯仿-甲醇(1：1，v/v)，室温(约25℃)，150r/min振荡1h后，离心，去上清。沉淀再用5mL甲醇洗1次，再用5mL丙酮洗1次，最后用5mL蒸馏水洗1次，去掉上清。
3、于沉淀中加入5mLDMSO-H2O(9：1，v/v)，室温振荡过夜(12h)，离心后，沉淀用5mLDMSO-H2O洗2次，再用5mL蒸馏水洗3次。此时的沉淀物质为粗细胞壁材料。
4、加2mL 25％溴乙酰醋酸溶液(溴已酰：醋酸＝1:3)和4ul 60％高氯酸,于70℃保温30min后，加入0.9mL 2mol/LNaOH中止反应。
5、加5ml乙酸和0.lml 7.5mol/L氯化羟胺，并用乙酸定溶至10ml，静置10-20min后，280nm处测定吸光值。木质素含量用测定值/所用样品重量的百分数表示。
纤维素为β－葡萄糖残基组成的多糖，测量方法参照蒽酮硫酸法。具体方法如下：
1、粗细胞壁材料的提取参照上述方法。
2、粗细胞壁材料中加入5ml 4mol/LKOH室温振荡1h，离心去上清，沉淀再用5ml4mol/LKOH洗一次，5ml水洗两次。
3、上述沉淀中再加入5ml 60％H2SO4室温下振荡2h，随后用水定容到10ml，离心收集所有上清。
4、取1ml上清液加入玻璃试管中，冷水浴条件下加入2ml 0.2％蒽酮硫酸试剂，随后转移到沸水中加热5min，再水中冷却，620nm处测定吸光值。
与注射pCAMBIA1301载体的果肉部位相比较，过量表达PbrMYB24的部位木质素和纤维素含量显著升高(图3B-C)。
(4)注射部位木质素和纤维素合成相关基因相对表达量检测
RNA的提取、cDNA的合成、荧光定量PCR的体系及步骤参照实施例1。过量表达PbrMYB24的果肉部位，Pbr4CL1，Pbr4CL4，PbrCSE1，PbrCCOAMT6，PbrCCOAMT1，PbrF5H2，PbrLAC4，PbrSTONE，PbrCESA8a，PbrCESA8b，PbrMYB169及PbrNSC表达量显著上升(图3e-f)。总之，以上这些结果表明过量表达PbrMYB24会促进梨果实石细胞中木质素和纤维素合成。
表1梨实时荧光定量引物
Figure BDA0004105910470000071
Figure BDA0004105910470000081
实施例4梨果肉愈伤组织稳定转化及功能分析
(1)梨果肉愈伤组织稳定转化
用含有PbrMYB24过量表达载体的农杆菌，通过农杆菌介导法侵染梨果肉愈伤组织，方法如下：
1、将含有正确质粒的农杆菌于固体培养基上活化，在温度为28℃的培养箱中生长48小时；
2、在100mL锥形瓶中加入30mL含有R+与K+的液体LB培养基，用枪头挑入活化的农杆菌，在28℃、200rpm的摇床中生长12小时；
3、将菌液倒入50mL离心管6000rpm离心15分钟收集全部菌体；
4、用适量的MS液体培养基(100mM乙酰丁香酮，pH 5.8)重悬沉淀，调整OD值在0.8-1.2，28℃诱导1h；
5、将果肉愈伤加入到MS液体培养基中，28℃诱导15min；
6、将果肉愈伤组织用纱布过滤出来，置于MS培养基上生长2天，25℃避光暗培养；
7、将果肉愈伤铺在含有潮霉素的MS培养基上生长，筛选转基因愈伤。
(2)转基因梨果肉愈伤鉴定
RNA的提取、cDNA的合成、荧光定量PCR的体系及步骤参照实施例1。我们观察到有9个果肉愈伤组织可以在将在含有潮霉素的培养基上生长，随后在超净工作台中将这些愈伤转移到新的含有潮霉素的培养基上继续生长，其中有7个果肉愈伤组织可以正常生长，进一步通过荧光定量PCR分析这7个愈伤组织中PbrMYB24基因的相对表达量，结果表明，在7个转基因愈伤组织中，PbrMYB24基因表达量均高于转化pCAMBIA1301空载(EV)的愈伤组织，其中OE-2，OE-4和OE-6长势良好，且表达水平明显高于其他阳性愈伤(图4A)，因此我们选择这三个转基因系用于后续研究。
(3)组织学分析
将上述转基因愈伤(EV，OE-2，OE-4，OE-6)继代培育15天后，转移到含有10uM EBR的处理培养基上进行培养，生长20天后，取梨果肉愈伤用于间苯三酚-盐酸染色，具体步骤参照实施例3-2。间苯三酚-盐酸染色发现，过表达PbrMYB24的梨果肉愈伤木质素染色效果明显增强(图4D-E)，这表明PbrMYB24促进梨愈伤组织木质素合成。
进一步取少量转基因梨愈伤组织用FAA固定液在4℃固定一周时间以上，经过以下步骤制作石蜡切片：
1、脱水：依次用85％、95％、100％、100％乙醇脱水2小时，再用体积比为1：1的无水乙醇和二甲苯脱乙醇2小时；
2、透明：用二甲苯浸泡2小时，再重复一次；
3、渗蜡：将1/2体积二甲苯加入固定瓶，再加1/2体积熔蜡。在干燥箱中升温至高于石蜡熔点3℃左右，石蜡熔化后取盖，2小时后用熔化的纯蜡渗蜡2小时，重复一次；
4、包埋：将渗蜡过的材料用高于熔点温度3℃左右的纯蜡溶液包埋在叠好的纸盒里；
5、切片：用Leica RM 2015超微切片机(Leica Mikrosysteme,Germany)将样品切成5μm厚度；
6、展片：把切下的蜡带用毛笔轻轻挑起，放入35℃水浴锅中展片，待完全展开后，用载玻片挑起切片，放入37℃培养箱中干燥；
7、脱蜡：将干燥后的材料依次放入纯二甲苯10分钟(重复一次)、无水乙醇4分钟(重复一次)、95％乙醇4分钟、85％乙醇4分钟、70％乙醇2分钟；
8、卡尔科弗卢尔荧光染色：使用10ul Calcofluor White Stain对切片进行染色5分钟，然后用滤纸吸干多余的Calcofluor，再用水洗三次。
在正置荧光显微镜下UV激发观察石蜡切片，结果显示过表达PbrMYB24的梨果肉愈伤荧光信号显著增强(图4F-G)，这表明PbrMYB24促进梨愈伤组织纤维素合成。
(4)转基因愈伤组织木质素和纤维素含量分析
利用溴乙酰法测量转基因愈伤组织木质素含量，具体步骤参照实施例3-3，经测定过表达PbrMYB24的梨果肉愈伤组织木质素和纤维素含量显著高于转化空载的梨果肉愈伤组织(图4B-C)。
(5)转基因愈伤组织木质素合成相关基因相对表达量检测
RNA的提取、cDNA的合成、荧光定量PCR的体系及步骤参照实施例1。通过荧光定量PCR对转基因愈伤组织中木质素合成内源基因表达量进行分析。结果表明，与转化空载的梨果肉愈伤相比，过表达PbrMYB24的梨果肉愈伤中木质素合成相关内源基因Pbr4CL1，PbrCSE1，PbrCCr21，PbrCCOAMT1，PbrCAD24，PbrLAC4，PbrLAC19，PbrSTONE，PbrCESA8b，PbrCESA4b，PbrCESA7a，PbrCESA4a，PbrNSC及PbrMYB169表达量显著上升(图4H)。总之，以上这些结果表明过量表达PbMYB24会促进梨果肉愈伤组织木质素和纤维素合成。实施例5转基因拟南芥植株木质素和纤维素相关生理指标测定
(1)转基因拟南芥木质素和纤维素含量及测定
取野生型和T3代转基因系各6株，收集花序茎下部10cm长的茎，切成2mm长度，并混合样品烘干至恒重。取10mg干燥过后的样品提取粗细胞壁用于木质素和纤维素含量分析，具体步骤参照实施例3-3。
通过溴乙酰法分析比较了粗细胞壁中木质素含量差异，转基因系的木质素含量显著上升(图5A)。通过硫酸蒽酮法较了粗细胞壁中纤维素含量差异，转基因系的纤维素含量相较于野生型显著增加(图5B)
(2)转基因拟南芥花序茎木质素合成相关基因相对表达量检测
取野生型和转基因系4周大的植株初生花序茎，RNA的提取、cDNA的合成、荧光定量PCR的体系及步骤参照实施例1。
分析过量表达PbrMYB24拟南芥植株中的内源木质素和纤维素合成代谢基因的表达量变化发现，木质素和纤维素合成相关基因的表达量都极显著上升(图5C)，表明PbrMYB24通过激活木质素和纤维素合成相关基因的表达，引起茎杆中过度积累木质素和纤维素。
(3)转基因拟南芥花序茎组织结构观察
1石蜡切片
取野生型和转基因系8周大的植株初生花序茎的底端用FAA固定液在4℃固定一周时间以上，石蜡切片的制作步骤参考4-3。
甲苯胺蓝染色：使用1％甲苯胺蓝硼酸溶液(W/V)对切片进行染色5分钟，然后95％乙醇2分钟、100％乙醇3分钟(重复一次)、二甲苯10分钟、二甲苯5分钟，中性树胶盖片，放在37℃培养箱中干燥。
番红固绿染色：切片入番红染液中染色1-2h，自来水稍洗，洗去多余染料，之后切片入固绿染液中染色30-60s，无水乙醇三缸脱水。
卡尔科弗卢尔荧光染色：使用10ul Calcofluor White Stain对切片进行染色5分钟，然后用滤纸吸干多余的Calcofluor，再用水洗三次。
用莱卡TCs SP2光谱共聚焦显微镜观察染色切片并拍照。
2木质素自发荧光观察
未染色的切片用莱卡TCs SP2光谱共聚焦显微镜观察，二极管激光器发射405nm激光，不同样品间激光强度、放大倍数、光电倍增管的增益设置保持一致。
3透射电镜
与石蜡切片相同的样品用2.5％戊二醛固定液4℃固定12小时，取材后要迅速投入到新鲜的2.5％戊二醛固定液中；取材应在0-4℃低温下操作，取材的器械和固定液也要遇冷；由于固定液的渗透性较差，戊二醛渗透深度为0.5mm，锇酸的渗透深度为0.25mm，所以样品大小约为1.5mm×3mm，厚度不超过2mm；对于漂浮在固定液上面的材料，需要抽气使其完全浸渍于固定液下面，充分固定。方法参照(Whitehill et al.,2016)。用Image-Pro Plus软件测量木质部细胞次生细胞壁的厚度。
通过石蜡切片、木质素自发荧光检测、透射电镜检测发现，转基因拟南芥茎杆木质部细胞形态正常，但木质素显著积累、自发荧光较强且次生细胞壁更厚(图5D-Q)。
表2拟南芥实时荧光定量引物
Figure BDA0004105910470000121
主要参考文献
Porebski S,Bailey LG,Baum BR(1997)Modification of a CTAB DNAextraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenolcomponents.Plant molecular biology reporter15:8-15
Vanholme R,Cesarino I,Rataj K,Xiao Y,Sundin L,Goeminne G,Kim H,CrossJ,Morreel K,Araujo P(2013)Caffeoyl shikimate esterase(CSE)is an enzyme in thelignin biosynthetic pathway inArabidopsis.Science 341:1103-1106
Vanholme R,Demedts B,Morreel K,Ralph J,Boerjan W(2010)Ligninbiosynthesis and structure.Plant physiology 153:895-905
Whitehill JGA,Henderson H,Schuetz M,Skyba O,Yuen MMS,King J,SamuelsAL,Mansfield SD,Bohlmann J(2016)Histology and cell wall biochemistry of stonecells in the physical defence ofconifers against insects.Plant,cell&environment 39:1646-1661
XueYS,Shao-Zhuo XU,Xue C,Wang RZ,Zhang MY,Jia-Ming LI,Zhang SL,Jun WU(2020)Pearprocess:A new phenotypic tool for stone cell trait evaluation inpear fruit.Journal ofIntegrative Agriculture 19:1625-1634
Zhang J,Li J,Xue C,Wang R,Wu J(2020)The Variation of Stone CellContent in 236Germplasms of Sand Pear(Pyrus pyrifolia)and Identification ofRelated Candidate Genes.Horticultural Plant Journal:
Zhong R,Cui D,Ye ZH(2019)Secondary cell wall biosynthesis.New Phytol221:1703-1723滕元文(2017)梨属植物系统发育及东方梨品种起源研究进展.果树学报34:370-378

Claims (9)

1.一种分离自‘砀山酥梨’具有调控梨果实石细胞发育的PbrMYB24基因，其CDS序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的PbrMYB24基因编码的蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
3.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于以pCAMBIA1301为出发载体，权利要求1所述基因的插入位点为XbaI和BamHI之间。
5.含有权利要求1所述基因或权利要求3所述的重组表达载体的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于基因工程菌为农杆菌GV3101。
7.克隆权利要求1所述基因序列的引物对，其特征在于上游引物PbrMYB24-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PbrMYB24-R1序列如SEQ ID No.4所示。
8.权利要求1所述的基因在木质素和纤维素合成中的应用。
9.权利要求3所述的重组表达载体在调控梨果实石细胞和梨果肉愈伤组织及拟南芥花序茎木质素和纤维素合成中的应用。
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