CN116189919A - 一种微生物药敏的计算机分析方法、分析系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物药敏的计算机分析方法、分析系统及其应用，包括构建耐药标志物参考序列、基因分型数据库、分析逻辑映射关系的基础数据库；对耐药标志物响应序列进行物种定位，得到耐药基因分析结果；检测耐药标志物响应序列的点突变标志物，得出点突变分析结果；检测耐药标志物响应序列的结构变异标志物，得出结构变异分析结果；识别谱系分型标志物，得出遗传背景分析结果；通过分析逻辑映射关系整合多种耐药标志物分析结果运算生成分子药敏结果。该方法通过整合多种耐药标志物分析结果，不依赖于已知耐药基因的识别，可有效提升基于基因组测序的微生物分子药敏分析准确度。

Description

一种微生物药敏的计算机分析方法、分析系统及其应用
技术领域
本发明涉及计算机技术及微生物宏基因组测序生信分析领域，特别涉及一种微生物药敏的计算机分析方法、分析系统及其应用。
背景技术
感染性疾病是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病。在临床案例中，病原体感染是临床危重症患者死亡的主要原因之一。全球感染性疾病病原体呈现多样化和复杂化的发展趋势，随着病原体不断进化和新发病原体的出现，临床对于准确、及时的病原鉴定与耐药性诊断的需求也在不断升级。由于缺乏快速准确的药敏表型结果作为用药指导，临床只能依据病原诊断结果采取经验性治疗手段，药物不合理使用导致的耐药、副作用、医疗资源浪费等，已成为关乎民生和公共卫生健康的重大问题。
药敏试验（antimicrobial susceptibility testing或AST）是一种实验室技术，用于测定抗菌药物对微生物杀菌/抑菌作用的有效性。药敏试验的测定结果即为药敏表型结果（susceptibility phenotype或 resistance phenotype），一般包括耐药、敏感、中介三种药敏表型结果。衡量药敏表型结果的准确度需要与金标准结果进行符合率评价，符合率越高代表药敏表型结果越准确（参考文献”White D. Laboratory methodologies forbacterial antimicrobial susceptibility testing[J]. World Organisation forAnimal Health: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for TerrestrialAnimals, 2014.”中的introduction部分）。微生物药敏分析领域的金标准结果是指依赖体外培养(culture)步骤的表型药敏分析方法得到的药敏表型结果，是微生物药敏分析领域公认的最可靠的试验结果（参考文献”Antimicrobial susceptibility testing: Anupdated primer for clinicians in the era of antimicrobial resistance:Insights from the Society of Infectious Diseases Pharmacists[J],Pharmacotherapy, 2023, 00:1-15”中对于“gold standard reference”的介绍）。药敏试验根据检测原理不同，可分为表型药敏分析方法（phenotypic AST或culture-based AST）和分子药敏分析方法（genotypic AST或molecular AST）（参考文献“吴秀祯, 李姝丽, 王志贤,等. 抗菌药物快速表型药敏检测技术研究进展[J]. 临床检验杂志, 2021, 39(11):5.”中的背景介绍部分的第三段）。表型药敏分析方法是指依赖体外培养（culture）技术，即依赖于细菌或真菌的培养和分离，通过检测特定药物浓度下微生物的繁殖情况，进而判断微生物的耐药程度，最低抑菌浓度用MIC值表示。表型药敏分析方法中，从临床样本到生成药敏分析报告包括体外培养步骤和药敏检测步骤，临床样本经体外培养步骤得到病原菌落（colonies），表型药敏分析方法的药敏检测对象为病原菌落（colonies）本身。所述临床样本是指，由患者或正常人群提供的，专业人员采集的生物标本，包括尿液、体液、外周血、组织等。分子药敏分析方法是指基于基因测序（genomic sequencing）等分子诊断技术的、通过基因检测结果来预测微生物抗生素耐药性的新型快速的药敏试验，所述测序是指测定DNA等生物分子序列的技术。分子药敏分析方法可以对临床样本进行直接检测，分子药敏分析方法中，从临床样本到生成药敏分析报告仅仅包括药敏检测步骤，省略了表型药敏分析方法所需的体外培养步骤，分子药敏分析方法的药敏检测对象为临床样本或病原菌落中的核酸。
目前，广泛应用于临床常规药敏分析的是全自动药敏分析系统，包括Vitek2、Microscan Panel、BD Phoneix和Sensititre等，但上述方法均需要24-78h从临床样本中纯培养分离出病原菌落（colonies），并需要6-72h完成对病原菌落（colonies）的药敏检测步骤，从临床样本到生成药敏分析报告的样本总流转时间总耗时长达30h-7d，且难以应用于难培养或生长缓慢以及少见罕见的病原微生物（参考文献“吴秀祯, 李姝丽, 王志贤,等.抗菌药物快速表型药敏检测技术研究进展[J]. 临床检验杂志, 2021, 39(11):5.”中的背景介绍部分）。由此可知上述全自动药敏分析系统均是基于表型药敏分析方法，从临床样本到生成药敏分析报告的样本总流转时间总耗时较长。
分子药敏分析方法无需体外培养步骤，从临床样本到生成药敏分析报告总耗时短。但现有分子药敏分析方法多是基于耐药基因（genotype或resistance genes或resistance marker或AMR markers或molecular marker）识别的分子药敏分析方法，基于耐药基因识别的分子药敏分析方法存在以下缺陷：1）耐药基因的表达调控是生物体内的复杂过程，从基因型、到转录调控、再到蛋白质翻译及修饰，最终形成表型形状，之间隔了三个层面的生物体内调控过程。耐药基因的存在与否与金标准结果的不一致时常发生，已知耐药基因与金标准结果之间的符合率约为50-60%（参考文献”Mahfouz N, Ferreira I,Beisken S, von Haeseler A, Posch AE. Large-scale assessment of antimicrobialresistance marker databases for genetic phenotype prediction: a systematicreview[J]. J Antimicrob Chemother, 2020, 75(11): 3099-3108.”中的第一页的摘要部分：”Results: CARD and ResFinder WGS-AST performance had an overall balancedaccuracy of 0.52 (±0.12) and 0.66(±0.18), respectively. ”），根据中国合格评定国家认可委员会颁布的CNAS-GL039：2019 《分子诊断检验程序性能验证指南》中规定：“检测体系的敏感性和特异性不低于90%，分析系统判读结果与金标准结果的符合率不低于95%”，因此基于耐药基因识别的分子药敏分析方法远未达到该行业规定；2）由于微生物基因元件的可移动性及基因组的高度可塑性，新的耐药基因形式始终不间断地在整合出现。基于耐药基因识别的分子药敏分析方法是建立在已知耐药基因的基础上，对新出现或非常规耐药基因形式的耐药基因几乎无预测能力；3）目前关于耐药基因的系统性研究较少，全面准确的耐药基因预测数据库仍需要专业人员花费大量时间来构建和验证。
综前所述，表型药敏分析方法不能对临床样本进行直接检测，需要对临床样本进行体外培养步骤得到病原菌落后才能检测，从临床样本到生成药敏分析报告总耗时较长，同时，对于难培养或生长缓慢以及少见罕见的病原微生物难以应用。但现有分子药敏分析方法存在分子药敏结果预测不准确的技术问题，所述分子药敏结果是指通过分子药敏分析方法获得的药敏表型结果。目前未见分子药敏结果与金标准结果准确的对应关系。
发明内容
基于现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种微生物药敏的计算机分析方法，通过构建全新的基于结构变异分析和遗传背景分析的方法，结合基于耐药基因识别和点突变识别的分析方法，得到多种耐药标志物分析结果，进一步结合结构变异分析结果、遗传背景分析结果、耐药基因分析结果和点突变分析结果，搭建将多种耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果的全新的分析逻辑映射关系，通过多种耐药标志物分析结果和分析逻辑映射关系的整体协同作用，出乎意料地使得本发明提供的微生物药敏的计算机分析方法产出的分子药敏结果与金标准结果高度匹配，与金标准结果的符合率达到95%以上，可预测病原谱含细菌、真菌、支原体等，有效覆盖临床90%以上的常见病原微生物，显著提升了现有分子药敏分析方法的准确预测水平。
所述结构变异是指耐药标志物的大长度（碱基长度为100以上）序列变化、位置变化等结构变异信息。所述耐药标志物是指与耐药性状相关的一段核苷酸序列。所述遗传背景分析是指通过分析遗传亲缘关系推测微生物耐药性能。所述金标准结果是指通过表型药敏分析方法获得的药敏表型结果。所述分子药敏结果是指通过分子药敏分析方法获得的药敏表型结果。
本发明提供的分子药敏分析方法，通过耐药基因判读规则、点突变判读规则、结构变异判读规则、遗传背景判读规则分别输出基于耐药基因识别的耐药基因分析结果、基于点突变识别的点突变分析结果、以及结构变异分析结果和遗传背景分析结果的多种耐药标志物分析结果，搭建将耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果的全新的分析逻辑映射关系，通过多种耐药标志物分析结果的整体协同作用，意外地使得本发明提供的分子药敏分析方法产出的分子药敏结果与金标准结果的符合率达到95%以上，可预测病原谱含细菌、真菌、支原体等，有效覆盖临床90%以上的常见病原微生物，显著提升了现有分子药敏分析方法的准确预测水平。同时，本发明提供的分子药敏分析方法，可对临床样本进行直接检测，包括对于表型药敏分析方法不适用的临床样本，比如难培养或生长缓慢以及少见罕见的病原微生物，省略了现有表型药敏分析方法所必须的体外培养步骤，大大缩短了从临床样本到生成药敏分析报告的样本总流转时间，样本总流转时间控制为8小时内，实现了更快速地自动化生成药敏分析报告。本发明可满足对于临床微生物样本直接检测的灵敏度和时效性要求。
本发明提供如下技术方案：
一种微生物药敏的计算机分析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1):对微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据经质量控制后，输出净读长序列；步骤2):从基础数据库内调用耐药标志物参考序列，与净读长序列进行匹配性分析，计算净读长序列的匹配得分，若匹配得分高于设定阈值，则标记该净读长序列为耐药标志物响应序列并输出，否则该净读长序列不做分析，转由人工审阅； 步骤3):从基础数据库内调用耐药标志物与归属物种映射关系，对步骤2)的耐药标志物响应序列进行物种定位并输出；步骤4):从基础数据库内调用耐药标志物判读规则，判读耐药标志物响应序列的耐药标志物分析结果并输出，所述耐药标志物分析结果包括耐药基因分析结果、点突变分析结果、结构变异分析结果和遗传背景分析结果中的至少一种；步骤5):从基础数据库内调用分析逻辑映射关系，整合步骤4）输出的耐药基因分析结果、点突变分析结果、结构变异分析结果和遗传背景分析结果，转化为分子药敏结果并输出。
本发明的第二个目的是提供一种微生物药敏的计算机分析系统，能够实现上述的微生物药敏的计算机分析方法，包括：基础数据库、耐药基因分析子系统、点突变分析子系统、结构变异分析子系统、遗传背景分析子系统以及报告子系统；其中，所述基础数据库，包括耐药标志物参考序列、耐药标志物与归属物种映射关系、耐药标志物判读规则和分析逻辑映射关系；所述耐药标志物参考序列，用于根据微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据输出耐药标志物响应序列；所述耐药标志物与归属物种映射关系，用于判读耐药标志物响应序列的物种定位；所述分析逻辑映射关系，用于将耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果；所述耐药基因分析子系统，通过输入微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据，根据耐药基因判读规则输出耐药基因分析结果；所述点突变分析子系统，通过输入微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据，根据点突变判读规则输出点突变分析结果；所述结构变异分析子系统，通过输入微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据，根据结构变异判读规则输出结构变异分析结果；所述遗传背景分析子系统，通过输入微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据，根据遗传背景判读规则输出遗传背景分析结果；所述报告子系统，通过从所述基础数据库内调用所述分析逻辑映射关系，整合所述耐药基因分析子系统、点突变分析子系统、结构变异分析子系统、和遗传背景分析子系统输出的耐药标志物分析结果，转化为分子药敏结果，输出微生物药敏分析报告，所述耐药标志物分析结果包括耐药基因分析结果、点突变分析结果、结构变异分析结果和遗传背景分析结果中的至少一种。
本发明的第三个目的是提供一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该计算机程序被处理器执行时实现上述的微生物药敏的计算机分析方法的步骤。
本发明的第四个目的是提供一种电子设备，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时实现上述的微生物药敏的计算机分析方法的步骤。
本发明的第五个目的是提供上述的微生物药敏的计算机分析方法在微生物药物敏感性诊断中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种微生物药敏的计算机分析方法和分析系统，通过构建全新的基于结构变异分析和遗传背景分析的方法，结合基于耐药基因识别和点突变识别的分析方法，得到多种耐药标志物分析结果，进一步结合结构变异分析结果、遗传背景分析结果、耐药基因分析结果和点突变分析结果，搭建将多种耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果的全新的分析逻辑映射关系，通过多种耐药标志物分析结果和分析逻辑映射关系的整体协同作用，出乎意料地实现了以下效果：1、使得本发明提供的微生物药敏的计算机分析方法产出的分子药敏结果与金标准结果高度匹配，与金标准结果的符合率达到95%以上，可预测病原谱含细菌、真菌、支原体等，有效覆盖临床90%以上的常见病原微生物，显著提升了现有分子药敏分析方法的准确预测水平。2、实现了对临床样本的直接检测，包括对于表型药敏分析方法不适用的临床样本，比如难培养或生长缓慢以及少见罕见的病原微生物，省略了现有表型药敏分析方法所需的体外培养步骤，从临床样本到生成药敏分析报告的样本总流转时间控制为8小时内，实现更快速地自动化生成药敏分析报告，可满足对于临床微生物样本直接检测的灵敏度和时效性要求。
附图说明
图1为本发明实施例提供的微生物药敏的计算机分析系统的流程示意图；
图2为本发明实施例提供的微生物药敏的计算机分析系统的组成单元示意图；
图3为本发明实施例提供的微生物药敏的计算机分析系统的原理框图；
图4为本发明实施例提供的耐药基因判读规则的流程图；
图5为本发明实施例提供的点突变判读规则的流程图；
图6为本发明实施例提供的结构变异判读规则的流程图；
图7为本发明实施例提供的遗传背景判读规则的流程图；
图8为本发明实施例提供的报告子系统的微生物药敏分析报告界面图；
图9为本发明实施例提供的微生物药敏的计算机分析方法的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点，都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书及等同内容为保护范围。
可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。
在本发明中，除发明人已经明确定义的名称和术语，其他的名称和术语为本领域的通用名称。
本发明提出一种微生物药敏的计算机分析方法，如图9所示，包括以下步骤：
步骤1):对微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据经质量控制后，提取净读长序列；所述质量控制是指对原始测序数据进行的、避免后续分析产生假阳性结果为目标的数据过滤和加工处理方法，包括低质量读长序列过滤、接头去除、长度过滤；所述读长序列是指测序仪单个测序反应所得到的碱基序列；所述净读长序列是指原始序列数据经过所述质量控制后的碱基序列。
所述微生物样本可以为临床样本，也可以为病原菌落。
优选的，所述质量控制的测序质量分值为Q10，即90%碱基测序精度，碱基测序精度在90%以下的单条测序从原始测序数据中去除。所述测序质量分值用于评估碱基测序精度。
优选的，将原始测序数据的碱基数控制在400~1500之间，即碱基数在400以下或者在1500以上的单条测序从原始测序数据中去除。
步骤2):从基础数据库内调用耐药标志物参考序列，与净读长序列进行匹配性分析，计算净读长序列的匹配得分，若匹配得分高于设定阈值，则标记该净读长序列为耐药标志物响应序列并输出；所述匹配性分析用于评估碱基序列之间的相似度。
优选的，匹配得分score的计算公式为：score=a×k-b×m-c×n，其中，a代表碱基单元匹配加分系数，k代表匹配上的碱基数，b代表碱基单元错配罚分系数，m代表错配的碱基数，c代表碱基单元插入或缺失罚分系数，n代表单元插入或缺失的碱基数；所述设定阈值，为测序扩增子长度×0.85，且不低于350。所述扩增子为DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列。
优选的，根据微生物种属、耐药标志物类别特征的不同，经过反复拟合，单元匹配加分系数a、单元错配罚分系数b和单元插入或缺失罚分系数c均定为1、1、1，即：匹配得分score=1×k-1×m-1×n。
步骤3):从基础数据库内调用耐药标志物与归属物种映射关系，判读步骤2)输出的耐药标志物响应序列的物种定位并输出；
步骤4):从基础数据库内调用耐药标志物判读规则，输出耐药标志物响应序列的耐药标志物分析结果，所述耐药标志物分析结果包括耐药基因分析结果、点突变分析结果、结构变异分析结果和遗传背景分析结果中的至少一种；
步骤5):从基础数据库内调用分析逻辑映射关系，整合所述耐药基因分析子系统、点突变分析子系统、结构变异分析子系统、和遗传背景分析子系统输出的耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果，从报告子系统输出微生物样本药敏分析报告；其中，所述耐药基因分析子系统、点突变分析子系统、结构变异分析子系统、和遗传背景分析子系统分别执行上述微生物药敏的计算机分析方法中的步骤1）至步骤4）。
所述基础数据库，包括耐药标志物参考序列、耐药标志物与归属物种映射关系、耐药标志物判读规则和分析逻辑映射关系。所述基础数据库通过统计学方法创造性地构建了全新的耐药标志物判读规则和分析逻辑映射关系。
其中，所述分析逻辑映射关系是指通过统计学方法构建全新的已知耐药标志物的耐药标志物分析结果与分子药敏结果的对应关系。通过分析逻辑映射关系是指将本发明的耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果。所述分析逻辑映射关系可以表现为布尔运算表达式，通过布尔运算表达式整合多种耐药标志物分析结果，若布尔运算表达式运算结果为True，对应其分子药敏结果为耐药，若布尔运算表达式运算结果为False，对应其分子药敏结果为敏感。
优选的，所述分析逻辑映射关系的构建方法包括：通过在线数据库收集现有的耐药标志物及其归属物种信息；收集临床样本并通过表型药敏分析方法获取金标准结果；对临床样本进行基因组测序，使用测序数据进行分子药敏分析，得到耐药标志物分析结果；将耐药标志物分析结果与对应的金标准结果进行一致性评价，得到耐药标志物分析结果与金标准结果的对应关系；通过耐药标志物分析结果与金标准结果的对应关系得到将耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果的分析逻辑映射关系。具体构建步骤可参考基础数据库的构建方法。所述现有的耐药标志物及其归属物种信息是指迄今为止最新的、最全面的、且不断得到迭代更新的耐药标志物及归属物种信息。
优选的，所述耐药标志物与归属物种映射关系，包括耐药标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围、耐药标志物与归属物种的关联置信度；所述耐药标志物与归属物种映射关系，用于精准定位耐药标志物所归属的微生物物种；所述耐药标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围，是指用于判断某耐药标志物响应序列是否可归属某微生物物种的针对净读长序列数进行的相对定量的分析指标，通过对大量已知的耐药标志物和不同物种的物种定位基因的净读长序列数比值进行统计学分析，确定单一物种基因组中耐药标志物分布数量相对于物种定位基因分布数量的比值参考范围；所述序列数是指测序获得的碱基序列的数量。
优选的，所述耐药标志物包括耐药基因标志物、点突变标志物、结构变异标志物、谱系分型标志物的至少一种；所述耐药标志物判读规则包括耐药基因判读规则、点突变判读规则、结构变异判读规则、谱系分型判读规则的至少一种；所述耐药标志物响应序列包括耐药基因标志物响应序列、点突变标志物响应序列、结构变异标志物响应序列、谱系分型标志物响应序列的至少一种；所述耐药标志物是指与耐药性状相关的一段核苷酸序列；所述耐药标志物参考序列是指耐药标志物注释完整、非冗余、可作为参考标准的序列。所述点突变标志物，是指碱基的置换、缺失及插入；所述结构变异标志物，是指碱基长度为100以上的碱基序列的变化、位置变化；所述谱系分型标志物，是指用于确定亲缘关系远近的生物学分类的分子分型。
优选的，所述耐药基因分析结果包括耐药基因阴性/阳性判读结果，所述阴性/阳性判读是指判读结果输出为阴性或者阳性；所述点突变分析结果包括氨基酸突变信息，指的是由于突变位点的碱基发生置换、缺失及插入导致对应的氨基酸发生突变；所述位点是指染色体上一个基因或者标记的位置；所述结构变异分析结果包括结构变异类型，所述结构变异类型包括突变型和野生型，当输出结构变异结果为突变型时，结构变异结果还包括该结构变异位点，所述结构变异位点是指结构变异标志物响应序列中首个与耐药标志物参考序列不一致的位点；所述遗传背景分析结果包括谱系分型序列型，所述谱系分型序列型是指，用于确定亲缘关系远近的生物学分类的分子分型。
优选的，所述耐药基因判读规则，用于输出耐药基因标志物响应序列的耐药基因分析结果，包括以下判读步骤，如图4所示：
步骤2-1)：若微生物样本的内参基因的净读长序列数大于阳性对照中内参基因净读长序列数的80%，则进入步骤2-2)；否则该微生物样本不做分析，转由人工审阅；所述内参基因是指在不同细胞类型和不同生理状态下表达水平相对固定的一类微生物基因，可用于校正实验过程中产生的误差与变异。
步骤2-2)：使用耐药基因标志物响应序列的净读长序列数，阳性对照、阴性对照中对应基因的净读长序列数，构建第一判读模型：
Figure SMS_1
其中，D1为耐药基因标志物响应序列的净读长序列数，D2为阳性对照中对应基因的净读长序列数，D3为阴性对照中对应基因的净读长序列数；所述阳性对照为检测体系中加入已知序列(DNA或RNA序列)，用于判断检测结果可信度或作为参比，阳性对照经检测后应出现已知序列的检出；所述阴性对照，应没有DNA或RNA模板，用以指示检测过程中的核酸污染情况。
优选的，阳性对照为包含多重耐药革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌已知序列的混合核酸样本；阴性对照为DEPC-ddH2O；
若D1 、D2 、D3之间的数值关系满足步骤2-2)所述第一判读模型，则该耐药基因标志物响应序列记为阳性耐药基因标志物响应序列，进入步骤2-3)，否则不做处理；
步骤2-3)：使用阳性耐药基因标志物响应序列的净读长序列数、物种定位基因的净读长序列数，构建第二判读模型：
RMIN ≤ R1/ R2 ≤ RMAX
其中，R1为阳性耐药基因标志物响应序列的净读长序列数，R2为物种定位基因的净读长序列数，RMIN为耐药基因标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围的最低极值，RMAX为耐药基因标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围的最高极值；
若R1、R2、RMIN、RMAX之间的数值关系，满足步骤2-3)所述第二判读模型，则该耐药基因标志物响应序列判断为TRUE，输出耐药基因分析结果为，该耐药基因记为阳性，记为T；
否则该耐药基因标志物响应序列判断为FALSE，输出耐药基因分析结果为，该耐药基因记为阴性，记为F。
作为优选，所述点突变判读规则，用于输出点突变标志物响应序列的点突变分析结果，包括以下判读步骤，如图5所示：
步骤3-1)：将点突变标志物响应序列与耐药标志物参考序列进行有参对齐；所述有参对齐是指按照单个碱基逐一对齐的序列比对方法，用于确定耐药标志物的位置和方向；
步骤3-2)：若点突变标志物响应序列的净读长序列数大于100，则进入步骤3-3)，否则不做处理；
步骤3-3)：对点突变标志物响应序列中的每个突变位点进行碱基比例计算，出现频率最高的碱基即为该点突变标志物在该突变位点的碱基构成形式；
步骤3-4)：储存点突变标志物响应序列与耐药标志物参考序列不一致的突变位点，并计算突变频率，所述突变频率为突变位点的测序深度和点突变标志物响应序列数的比值；所述深度为碱基平均测序次数，深度越高，检出碱基的可信度越高。
步骤3-5)：通过碱基到氨基酸转换规则，将碱基突变转换成氨基酸突变，输出点突变分析结果为氨基酸突变信息，记为A&pos&B，其中，A代表野生型菌株中该突变位点的氨基酸名称，pos代表该突变位点的位置，B代表突变后的氨基酸名称。
作为优选，所述结构变异判读规则，用于输出结构变异响应序列的结构变异分析结果，包括以下判读步骤，如图6所示：
步骤4-1)：将结构变异标志物响应序列与耐药标志物参考序列进行有参对齐，
其中，所述结构变异标志物包括净读长序列碱基长度大于100的缺失、重复、倒位、易位、插入序列、转座子序列的至少一种；
步骤4-2)：若结构变异标志物响应序列的净读长序列数大于100，则进入步骤4-3)，否则输出结构变异分析结果为低深度，记为LD；
步骤4-3)：若比对的起始位置的碱基分布律和终止位置的碱基分布律之和大于150%，输出结构变异分析结果为野生型，记为W；否则进入步骤4-4)；所述碱基分布律为读长序列中的各种碱基的相对频率的分布规律；
步骤4-4)：若比对的起始位置的碱基分布律和终止位置的碱基分布律之和小于120%，输出结构变异分析结果为突变型，记为M，将结构变异标志物响应序列中首个与耐药标志物参考序列不一致的位点记为结构变异位点并输出，否则进行人工复核。
作为优选，所述遗传背景判读规则，用于输出谱系分型标志物响应序列的遗传背景分析结果，包括以下判读步骤，如图7所示：
步骤5-1)：将谱系分型标志物响应序列与耐药标志物参考序列进行有参对齐；
步骤5-2)：若谱系分型标志物响应序列的平均位点深度大于100，则进入步骤5-3)；否则输出遗传背景分析结果为不存在，记为NE；所述平均位点深度为一段测序序列中的每个碱基测序次数的平均值。
步骤5-3)：将谱系分型标志物响应序列与基因分型数据库进行匹配性分析，若存在与基因分型数据库中的基因分型参考序列完全匹配的谱系分型标志物响应序列，则输出对应的基因分型参考序列的唯一识别编号，记为谱系分型序列型；
否则输出遗传背景分析结果为不存在完全匹配的谱系分型序列型，记为NM。
优选的，输出耐药标志物响应序列的规则为：
6-1).将微生物样本的每一条净读长序列与耐药标志物参考序列比对得到的匹配得分进行降序排序，选取匹配得分最高的净读长序列作为备选，若有多个相同最高匹配得分的净读长序列，则都作为备选；
6-2).判断备选的净读长序列的匹配得分是否在设定阈值以上，若是，则该备选的净读长序列被认为归属于对应的耐药标志物，并被标记为耐药标志物响应序列，读长数加1；若否，则该备选的净读长序列被认为不归属于任何耐药标志物，不做处理；
作为优选，所述步骤5）中的输出微生物样本的分子药敏结果的步骤包括：利用分析逻辑映射关系，整合并分别调取耐药基因分析结果、点突变分析结果、结构变异分析结果和遗传背景分析结果；针对每种药物逐一生成TRUE或者FALSE判读结果；若判读结果是TRUE，则微生物样本对该种药物呈现耐药性，输出微生物样本的分子药敏结果为R；若判读结果是FALSE，则微生物样本对该种药物呈现敏感性，输出微生物样本的分子药敏结果为S。
如图1所示，本发明提供的一种微生物药敏的计算机分析系统，能够实现上述的微生物药敏的计算机分析方法，如图2和图3所示，包括：基础数据库、耐药基因分析子系统、点突变分析子系统、结构变异分析子系统、遗传背景分析子系统以及报告子系统；其中，所述基础数据库，包括耐药标志物参考序列、耐药标志物与归属物种映射关系、耐药标志物判读规则和分析逻辑映射关系；所述耐药标志物参考序列，用于根据微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据输出耐药标志物响应序列；所述耐药标志物与归属物种映射关系，用于判读耐药标志物响应序列的物种定位；所述耐药标志物判读规则，包括耐药基因判读规则、点突变判读规则、结构变异判读规则、遗传背景判读规则的至少一种；所述分析逻辑映射关系，用于将耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果；所述耐药基因分析子系统、点突变分析子系统、结构变异分析子系统、和遗传背景分析子系统分别执行上述微生物药敏的计算机分析方法中的步骤1）至步骤4）。
如图1所示，所述耐药基因分析子系统，通过输入微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据，根据耐药基因判读规则输出耐药基因分析结果，包括耐药基因阴性/阳性判读结果；所述点突变分析子系统，通过输入微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据，根据点突变判读规则输出点突变分析结果，包括氨基酸突变信息；所述结构变异分析子系统，通过输入微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据，根据结构变异判读规则输出结构变异分析结果，包括结构变异类型；所述遗传背景分析子系统，通过输入微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据，根据遗传背景判读规则输出遗传背景分析结果，包括谱系分型序列型；所述报告子系统，通过从所述基础数据库内调用所述分析逻辑映射关系，整合所述耐药基因分析子系统、点突变分析子系统、结构变异分析子系统、和遗传背景分析子系统输出的耐药标志物分析结果，转化为分子药敏结果，所述报告子系统输出微生物药敏分析报告。所述耐药标志物分析结果包括耐药基因分析结果、点突变分析结果、结构变异分析结果和遗传背景分析结果中的至少一种结果。优选的，所述基础数据库还包括基因分型数据库，所述基因分型数据库中包括基因分型参考序列。
本发明提供的基础数据库的构建方法如下：
（1）综合CARD、ResFinder（目前常用的细菌耐药标志物预测工具）等在线数据库中的耐药标志物、近十年内医学期刊收录记载的与金标准结果的相符度高于85%的耐药标志物，构建一级基础数据库。
（2）根据在线数据库或医学文献中记载的上述耐药标志物的来源物种，对一级基础数据库内的耐药标志物添加一级识别标签，形成二级基础数据库。一级识别标签的存储形式为：AMR001_Species。其中，AMR001代表耐药基因分析子系统中编号为001的耐药标志物，Species代表该耐药标志物的来源物种。若该耐药标志物在多个物种中都存在，则该耐药标志物以一对多的形式，产生多个识别标签；
至此，二级基础数据库内包括耐药标志物名称、耐药标志物一级识别标签、耐药标志物与归属物种映射关系；
（3）收集中国各省市4000余例覆盖阴性杆菌、阳性球菌、念珠菌、隐球菌、丝状真菌、分枝杆菌的临床分离株，并获取全基因组测序数据；使用二级数据库对上述全基因组测序数据进行分析，获取每个分离株的耐药标志物名称、耐药标志物的归属物种信息；
（4）通过表型药敏分析方法获取上述临床分离株的金标准结果，其中，细菌的药敏试验使用梅里埃VITEK2药敏试验卡、微量肉汤稀释法、常量肉汤稀释法；真菌的药敏试验使用Thermo YeastOne药敏试验卡、微量肉汤稀释法、常量肉汤稀释法。将上述金标准结果进行分类整理，转换为金标准结果标签，包括：耐药记为R，敏感记为S，中介记为I，所述中介是指介于耐药和敏感之间。将上述金标准结果标签，添加至一级识别标签后，形成二级识别标签，形成三级基础数据库。二级识别标签的存储形式为：AMR001_Species_Phenotype。其中，Phenotype代表金标准结果，包括R、S、I中的一种。
至此，三级基础数据库内包括耐药标志物名称、耐药标志物二级识别标签、耐药标志物与归属物种映射关系、耐药标志物与金标准结果的对应关系；
（5）考虑到耐药微生物的分布具有地域差异性，故从NCBI、EMBL下载全球不同国家和地区上传的、含有可溯源的金标准结果的微生物全基因组数据至少500例，构建训练集。使用三级基础数据库，对上述基因组数据进行分子药敏分析，将耐药标志物分析结果与训练集中的金标准结果进行一致性评价。针对二者结果不一致的基因组，进行耐药机制分析；若通过耐药机制分析产出新的耐药标志物，则使用步骤2）和步骤4）的标签标记方法，对新耐药标志物补充耐药标志物与归属物种映射关系、耐药标志物与金标准结果的对应关系，并添加至三级基础数据库中；
（6）采用特异性引物扩增的方式，构建耐药标志物靶向测序体系。所述靶向测序是指，针对特定基因、染色体区域或突变位点等特定序列或位点进行的高通量测序方法。收集具有明确微生物鉴定和金标准结果的临床样本至少500例，经靶向测序，获取和统计耐药标志物响应序列、物种定位基因的净读长序列数。通过对大量耐药标志物响应序列和对应的物种定位基因的净读长序列数的比值进行统计学分析，获得单一物种中耐药标志物响应序列净读长序列数相对于物种定位基因净读长序列数的比值参考范围。使用随机森林等机器学习算法，通过对大量已知耐药标志物和归属物种映射关系进行学习，确定不同物种中耐药标志物的分布和特征，建立物种分类预测模型。通过统计学方法，计算耐药标志物响应序列与上述各分类模型中的物种定位基因序列的相似性，获取耐药标志物与归属物种的关联置信度数值。相似性越高，表示该耐药标志物响应序列与该物种之间的相关性越强，耐药标志物与归属物种的关联置信度也就越高。将上述耐药标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围、耐药标志物与归属物种的关联置信度转换为标签信息，形成三级识别标签，形式四级数据库。三级识别标签的存储形式为：AMR001_Species_Phenotype_Range_CL.，其中，Range代表耐药标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围，CL代表耐药标志物与归属物种的关联置信度。
至此，四级基础数据库内包括耐药标志物名称、耐药标志物二级识别标签、耐药标志物与归属物种映射关系（含定位物种、耐药标志物与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围、耐药标志物与归属物种的关联置信度）、耐药标志物与金标准结果的对应关系。根据耐药标志物与金标准结果的对应关系，可以得到将耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果的分析逻辑映射关系。四级基础数据库在本发明中简称为基础数据库。
（7）进一步收集具有明确微生物鉴定和金标准结果的临床样本至少500例，构建测试集。经靶向测序，获取和统计耐药标志物、物种定位基因的净读长序列数。使用四级基础数据库，对上述测序净读长序列进行分子药敏分析，根据分析逻辑映射关系，将耐药标志物分析结果转化成分子药敏结果与测试集中的金标准结果进行一致性评价。本实施例中，针对521例真实临床样本产生4184个分子药敏结果（采用本发明的分子药敏分析方法），与采用VITEK2得到的金标准结果进行符合率评价，统计结果展示如表1。
Figure SMS_2
表1 方法符合率验证结果
经统计计算，使用本发明分子药敏分析方法进行的微生物耐药预测，敏感性为98.42%（1560/1585），特异性为98.14%（2538/2583），总符合率为98.32%（4098/4168），高于CNAS-GL0392019 《分子诊断检验程序性能验证指南》中 “检测体系的敏感性和特异性不低于90%，分析系统判读结果符合率不低于95%”的标准。
上述基础数据库的构建策略为使用大数据统计学方法，分别对耐药标志物与归属物种映射关系、耐药标志物与金标准结果的相关性进行比较分析，构建策略可以使用随机森林等机器学习算法进行类似功能的分析。
本发明还提供一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该计算机程序被处理器执行时实现基于计算机的微生物药敏分析方法的步骤，以及一种电子设备，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，处理器执行计算机程序时实现基于计算机的微生物药敏分析方法的步骤，以及展示微生物药敏分析方法在微生物药物敏感性诊断中的应用。
本发明提供的微生物药敏的计算机分析方法和分析系统基于高通量测序平台构建了临床样本前处理、PCR反应、文库构建、临床样本测序、生信分析、报告生成等微生物药敏检测与分析的全流程。其中，临床样本前处理含清洗浓缩、细胞裂解、核酸提取与纯化等步骤，耗时约1.5小时；PCR反应耗时2小时；文库构建遵循测序平台官方指导的建库方案，耗时约3小时；临床样本测序时间一般以批次检测耗时计算，每产生1G数据耗时约1小时，实际单个临床样本所需测序量约0.1G，即单个临床样本测序时间低于1小时；生信分析与报告生成，处理单个临床样本仅需15分钟。本发明可以针对临床样本直接检测，无需对临床样本进行分离与培养，从获取临床样本到生成微生物药敏分析报告的样本总流转时间在8小时以内，下面结合实施例具体说明。
实施例一
以一例含有肺炎克雷伯菌的临床样本为例，展示单一物种的数据处理及药敏分析过程，着重体现遗传背景分析子系统对于药敏结果准确预测的贡献价值。
首先，本实施例的临床样本的原始测序数据经过去除接头、低质量的读长过滤以及长度的筛选，输出净读长序列。
第二步，将净读长序列与基础数据库内的耐药基因标志物参考序列进行匹配性分析，输出耐药基因标志物响应序列，并统计耐药基因标志物响应序列的净读长序列数，部分结果展示如表2。其中，IC为内参基因，K_pneumoniae为肺炎克雷伯菌的物种定位基因。
Figure SMS_3
表2耐药基因标志物响应序列净读长序列数分析结果
该微生物样本的内参基因的净读长序列数为7064条，阳性对照样本中的内参基因的净读长序列数为4464条，阴性对照样本中的内参基因的净读长序列数为5975条。判读内参基因的净读长序列数7064>4464×80% 成立，满足第一判读模型，进入下一步分析。
第三步，耐药基因分析子系统输出耐药基因分析结果，包括耐药基因阴性/阳性判读结果。经分析，该微生物样本中含有K_pneumoniae物种定位基因，定位肺炎克雷伯菌；耐药基因分析子系统自动调取基础数据库中的耐药标志物与归属物种映射关系（包括耐药标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围、耐药标志物与归属物种的关联置信度）。通过计算耐药基因标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数的比值，根据耐药标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围进行阴性/阳性判读，转换为阳性/阴性判读结果，如表3所示。阳性的耐药基因以T标记同时高亮，稍后将被报告子系统以“AMRXXX_T”调取。
Figure SMS_4
表3 耐药基因分析子系统的阴性/阳性判读结果
值得一提的是，耐药标志物与归属物种的关联置信度用于判断微生物样本中耐药标志物归属物种的优先级。若同时在两种及以上物种中检出同一耐药标志物，则以耐药标志物与归属物种的关联置信度的高低进行优先级排序，并以耐药标志物与归属物种的关联置信度最高的物种作为该耐药标志物的归属物种输出。
第四步，通过点突变分析子系统输出该微生物样本的点突变分析结果包括氨基酸突变信息、突变频率，如表4所示。
Figure SMS_5
表4 点突变分析子系统的突变分析结果
从上表4可见该微生物样本中分别检测到肺炎克雷伯菌点突变标志物KP_SNP_003，肠道沙门菌点突变标志物SE_SNP_012，及大肠埃希菌点突变标志物EC_SNP_001。由于在耐药基因分析子系统中，该微生物样本仅检出肺炎克雷伯菌物种定位标志物（见上述第三步分析过程），故肠道沙门菌和大肠埃希菌点突变结果均不予考虑。KP_SNP_003的点突变标志物响应序列的净读长序列数为4588条，大于100，进入下一步分析。点突变分析子系统输出点突变分析结果为S83L，意味着第83号氨基酸位点产生了突变，丝氨酸（S）突变为亮氨酸（L）。同时，该突变位点测序深度为4530，故该样本点突变的突变频率计算为99.74%(4530/4588)。点突变分析结果稍后将被报告子系统以“S83L”调取。
第五步，通过结构变异分析子系统输出结构变异分析结果。该微生物样本中，结构变异分析结果为LD，即不存在。
第六步，通过遗传背景分析子系统输出谱系分型标志物响应序列的遗传背景分析结果，包括谱系分型序列型。
Figure SMS_6
表5 遗传背景分析子系统的谱系分型结果
如表5所示，在该微生物样本中识别到谱系分型标志物（KP_LT_001）响应序列，平均位点深度为2511，大于100，将KP_LT_001的谱系分型标志物响应序列与基础数据库内的基因分型数据库中的基因分型参考序列进行匹配性分析，存在与基因分型参考序列LT1193完全匹配的谱系分型标志物响应序列，故遗传背景分析子系统输出遗传背景分析结果为谱系分型序列型为LT1193。遗传背景分析结果稍后将被报告子系统以“LT1193”调取。
第七步，通过报告子系统整合各分析子系统的耐药标志物分析结果，根据分析逻辑映射关系转化为分子药敏结果并输出。该微生物样本中，由于物种定位肺炎克雷伯菌，报告子系统将自动调取基础数据库中肺炎克雷伯菌的分析逻辑映射关系。肺炎克雷伯菌的分析逻辑映射关系展示如表6。
Figure SMS_7
表6 肺炎克雷伯菌分析逻辑映射关系表
其中，表6第三列为布尔运算表达式，运算符OR代表不同耐药标志物之间为“或”的关系，只需满足一条即可判读耐药成立。报告子系统调用各分析子系统输出的耐药标志物分析结果，通过分析逻辑映射关系中的布尔运算表达式转换成分子药敏结果，最终输出的微生物药敏分析报告如表7所示，其中，R代表耐药，S代表敏感。
Figure SMS_8
表7 肺炎克雷伯菌药敏分析报告
将本实施例中的耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果，与VITEK2金标准结果进行对比，获得二者的相符度评价。比对结果如表8所示，本实施例提供的分子药敏结果（采用本发明的分子药敏分析方法）与VITEK2获得的金标准结果的符合率为100%。
Figure SMS_9
表8本实施例的分子药敏结果与金标准结果对比
值得一提的是，本实施例中，根据遗传背景分析子系统的遗传背景分析结果，对替加环素的耐药性做出预判，并经VITEK2验证，该株肺炎克雷伯菌对替加环素的药敏MIC为>=8μg/ml，证实为表型耐药。使用现有仅依赖耐药基因和/或点突变识别的分子药敏分析方法，例如检测耐药基因tetX4、检测多个调控基因点突变，其结果均为阴性，那么在无耐药基因和/或点突变检出的情况下，采用现有分子药敏分析方法预测极易产生假阴性结果。本实施例通过引入遗传背景分析方法，通过分析逻辑映射关系将遗传背景分析结果转化为分子药敏结果，实现对易漏检的关键药物做出耐药预判的有益效果。
实施例二
以含有屎肠球菌、粘质沙雷菌、肺炎支原体的混合临床样本为例，展示两种及以上混合物种的数据处理及药敏分析过程，着重体现结构变异分析子系统、遗传背景分析子系统对于混合样本的分子药敏结果的准确预测的贡献价值，同步展示本实施例对除细菌之外的其他少见病原体，如肺炎支原体的耐药预测能力。
首先，本实施例的临床样本的原始测序数据经过去除接头、低质量的读长过滤以及长度的筛选，输出净读长序列。
第二步，将净读长序列与基础数据库内的耐药标志物参考序列进行匹配性分析，输出耐药标志物响应序列，并统计耐药标志物响应序列的净读长序列数。部分结果展示如表9。其中，IC为内参基因，S_marcescens、E_faecium、M_pneumoniae分别为粘质沙雷菌、屎肠球菌、肺炎支原体的物种定位基因。
Figure SMS_10
表9 耐药基因分析子系统净读长序列数分析结果
该微生物样本的内参基因的净读长序列数为11544条，阳性对照样本中的内参基因的净读长序列数为8206条，阴性对照样本中的内参基因的净读长序列数为7767条。判断内参基因的净读长序列数11544>8206×0.8成立，该微生物样本无需人工审核，进入下一步分析。
第三步，通过耐药基因分析子系统输出耐药基因标志物响应序列的耐药基因分析结果，包括阴性/阳性判读结果。经分析，该微生物样本中同时含有S_marcescens物种定位基因、E_faecium物种定位基因、M_pneumoniae物种定位基因，分别定位粘质沙雷菌、屎肠球菌、肺炎支原体。同时与屎肠球菌相近的物种粪肠球菌的物种定位基因E_faecalis判读阴性，表明分辨率佳；耐药基因分析子系统自动调取基础数据库中的耐药标志物与归属物种映射关系，并计算耐药标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数的比值，根据耐药标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围进行阴性/阳性判读，输出为阴性/阳性判读结果，如表10所示。阳性的耐药基因以T标记同时高亮，稍后将被报告子系统以“AMRXXX_T”调取。
Figure SMS_11
表10 耐药基因分析子系统的物种定位与阴性/阳性判读结果
第四步，通过点突变分析子系统输出点突变标志物响应序列的点突变分析结果，包括氨基酸突变信息，如表11所示。
Figure SMS_12
表11 点突变分析子系统的点突变分析结果
从上表11可见该样本中分别检测到粘质沙雷点突变标志物SMr_SNP_001，屎肠球菌点突变标志物Efm_SNP_003，肺炎支原体点突变标志物MPn_SNP_001，均可实现清晰物种定位；同时三者的点突变标志物响应序列的净读长序列数均大于100，进入下一步分析。SMr_SNP_001分析结果为WT，意味着粘质沙雷菌在该点突变标志物上未发生任何突变；Efm_SNP_003分析结果为S84F，意味着屎肠球菌第84号氨基酸位点产生了突变，丝氨酸（S）突变为苯丙氨酸（F）；MPn_SNP_001分析结果为A2063G，意味着肺炎支原体在该点突变标志物上产生了突变。点突变分析结果稍后将被报告子系统以“WT”、“S84F”、“A2063G”调取。
第五步，通过结构变异分析子系统输出结构变异标志物响应序列的结构变异分析结果。
Figure SMS_13
表12结构变异分析子系统的结构变异分析结果
如表12所示，在该实施例样本中识别到结构变异标志物Smr_SNV_001，计算该结构变异标志物响应序列的净读长序列数为330，高于100，进行下一步结构变异分析；计算该结构变异标志物响应序列与耐药标志物参考序列比对的起始位置的碱基分布律和终止位置的碱基分布律之和为52.27%<120%；故遵循结构变异判读规则，判定该微生物样本的结构变异分析结果为“突变型”。结构变异位点为碱基第891位，以中间结果文件存储。结构变异分析结果稍后将被报告子系统以“SNV001_M”调取。
第六步，通过遗传背景分析子系统输出谱系分型标志物响应序列的遗传背景分析结果，包括谱系分型序列型。
Figure SMS_14
表13遗传背景分析子系统的遗传背景分析结果
如表13所示，在该微生物样本中识别到谱系分型标志物Efm_LT_001和Efm_LT_002的谱系分型响应序列，平均位点深度分别为1624与757，大于100，进入下一步分析。将Efm_LT_001和Efm_LT_002的谱系分型标志物响应序列，分别与基础数据库内的基因分型数据库中的基因分型参考序列进行匹配性分析，Efm_LT_001的谱系分型标志物响应序列与基因分型参考序列LT1a完全匹配， Efm_LT_002的谱系分型标志物响应序列与基因分型参考序列LT1b完全匹配，故谱系分型序列型分别为LT1a和LT1b。遗传背景分析结果稍后将被报告子系统以“LT1a”、“LT1b”调取。
第七步，报告子系统整合各分析子系统的耐药标志物分析结果，转化为分子药敏结果并输出。本实施例的微生物样本中，由于物种定位同时包括屎肠球菌、粘质沙雷菌、肺炎支原体，报告子系统将自动分别调取基础数据库中屎肠球菌、粘质沙雷菌、肺炎支原体的分析逻辑映射关系，三者分析逻辑映射关系分别展示如表14、表15、表16。
Figure SMS_15
表14屎肠球菌分析逻辑映射关系表
Figure SMS_16
表15粘质沙雷菌分析逻辑映射关系表
Figure SMS_17
表16 肺炎支原体分析逻辑映射关系表
其中表14、表15、表16的第三列为布尔运算表达式。运算符OR代表不同耐药标志物之间为“或”的关系，只需满足一条即可判读耐药成立；运算符AND代表不同耐药标志物之间为“且”的关系，需同时满足才可判读耐药；运算优先级AND>OR。报告子系统调用各分析子系统的耐药标志物分析结果，通过执行布尔运算表达式生成分子药敏结果。最终输出的微生物药敏分析报告如表17、表18、表19所示，其中R代表耐药，S代表敏感。
Figure SMS_18
表17屎肠球菌药敏分析报告
Figure SMS_19
表18粘质沙雷菌药敏分析报告
Figure SMS_20
表19肺炎支原体药敏分析报告
图8为本实施例报告子系统的微生物药敏分析报告界面图例。
将本实施例中的屎肠球菌和粘质沙雷的耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果，分别与采用VITEK2得到的金标准结果进行对比，获得二者的相符度评价。将肺炎支原体的耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果与郑州安图生物肺炎支原体培养药敏试剂盒（豫械注准20182400627）的金标准结果进行对比，获得二者的相符度评价。
比对结果如表20所示，本实施例预测的粘质沙雷菌的分子药敏结果与金标准结果的符合率为100%，屎肠球菌的分子药敏结果与金标准结果的符合率为100%，肺炎支原体的分子药敏结果与金标准结果的符合率为100%，粘质沙雷菌、屎肠球菌、肺炎支原体三者混合检出的分子药敏结果与金标准结果符合率为100%。
Figure SMS_21
表20本实施例的分子药敏结果与金标准结果对比
值得一提的是，本实施例中，根据遗传背景分析子系统的遗传背景分析结果，对屎肠球菌耐青霉素及氨苄西林的耐药性做出预判；根据结构变异分析子系统的结构变异分析结果，识别外膜孔道蛋白相关的结构变异标志物在891号位点处发生了由大片段插入导致的结构变异，对粘质沙雷菌耐碳青霉烯类药物的耐药性做出预判。经采用VITEK2的表型药敏分析方法验证，本实施例中的屎肠球菌对青霉素的MIC值为>=64μg/ml；粘质沙雷菌对亚胺培南、美罗培南的MIC值分别为>=16μg/ml和>=8μg/ml，均证实为表型耐药，采用本实施例的分子药敏分析方法得到的分子药敏结果与金标准结果相符。上述药物的分析结果，均无法通过识别耐药基因或点突变的方法获得，体现了结构变异分析与遗传背景分析策略，对于药敏分析的贡献度。进一步地，本实施例中存在三种不同病原微生物的混合，本实施例提供的微生物药敏的计算机分析方法也体现了对混合样本中不同微生物分别进行菌种关联定位、对耐药标志物准确关联定位的分析性能。最后，肺炎支原体是一种较难培养的非细菌类微生物，不能被VITEK2检测，需特殊生长培养基进行表型药敏分析，本实施例提供的微生物药敏的计算机分析方法也体现了对于难培养微生物准确进行药敏表型结果预测的分析性能。
本发明提供的分子药敏分析方法对90%以上的常见病原微生物进行了药敏分析，得到的分子药敏结果与金标准结果的符合率均在95%以上。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (13)

1.一种微生物药敏的计算机分析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1):对微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据经质量控制后，输出净读长序列；
步骤2):从基础数据库内调用耐药标志物参考序列，与净读长序列进行匹配性分析，计算净读长序列的匹配得分，若匹配得分高于设定阈值，则标记该净读长序列为耐药标志物响应序列并输出，否则该净读长序列不做分析，转由人工审阅；
步骤3):从基础数据库内调用耐药标志物与归属物种映射关系，对步骤2)的耐药标志物响应序列进行物种定位并输出；
步骤4):从基础数据库内调用耐药标志物判读规则，判读耐药标志物响应序列的耐药标志物分析结果并输出，所述耐药标志物分析结果包括耐药基因分析结果、点突变分析结果、结构变异分析结果和遗传背景分析结果中的至少一种；
步骤5):从基础数据库内调用分析逻辑映射关系，整合步骤4）输出的耐药基因分析结果、点突变分析结果、结构变异分析结果和遗传背景分析结果，转化为分子药敏结果并输出。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐药标志物与归属物种映射关系，包括耐药标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围、耐药标志物与归属物种的关联置信度。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐药标志物包括耐药基因标志物、点突变标志物、结构变异标志物、谱系分型标志物的至少一种；所述耐药标志物判读规则，包括耐药基因判读规则、点突变判读规则、结构变异判读规则、遗传背景判读规则的至少一种；所述耐药标志物响应序列包括耐药基因标志物响应序列、点突变标志物响应序列、结构变异标志物响应序列、谱系分型标志物响应序列的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐药基因分析结果包括耐药基因阴性/阳性判读结果；所述点突变分析结果包括氨基酸突变信息；所述结构变异分析结果包括结构变异类型；所述遗传背景分析结果包括谱系分型序列型。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐药基因判读规则，用于输出耐药基因标志物响应序列的耐药基因分析结果，包括以下判读步骤：
步骤2-1)：若微生物样本的内参基因的净读长序列数大于阳性对照样本的内参基因的净读长序列数的80%，则进入步骤2-2)；否则该微生物样本不做分析，转由人工审阅；
步骤2-2)：使用耐药基因标志物响应序列的净读长序列数，阳性对照、阴性对照中对应基因的净读长序列数，构建第一判读模型：
Figure QLYQS_1
，
其中，D1为耐药基因标志物响应序列的净读长序列数，
D2为阳性对照中对应基因的净读长序列数，
D3为阴性对照中对应基因的净读长序列数；
阳性对照为包含多重耐药革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌已知序列的混合核酸样本；阴性对照为DEPC-ddH2O；
若D1 、D2 、D3之间的数值关系满足步骤2-2)所述第一判读模型，则该耐药基因标志物响应序列记为阳性耐药基因标志物响应序列，进入步骤2-3)，否则不做处理；
步骤2-3)：使用阳性耐药基因标志物响应序列的净读长序列数、物种定位基因的净读长序列数，构建第二判读模型：
RMIN ≤ R1/ R2 ≤ RMAX
其中，R1为阳性耐药基因标志物响应序列的净读长序列数，
R2为物种定位基因的净读长序列数，
RMIN为耐药基因标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围的最低极值，
RMAX为耐药基因标志物响应序列与物种定位基因的净读长序列数比值参考范围的最高极值，
若R1、R2、RMIN、RMAX之间的数值关系，满足步骤2-3)所述第二判读模型，则该耐药基因标志物响应序列的耐药基因分析结果包括，该耐药基因为阳性，记为T；
否则该耐药基因标志物响应序列的耐药基因分析结果包括，该耐药基因为阴性，记为F。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述点突变判读规则，用于输出点突变标志物响应序列的点突变分析结果，包括以下判读步骤：
步骤3-1)：将点突变标志物响应序列与耐药标志物参考序列进行有参对齐；
步骤3-2)：若点突变标志物响应序列的净读长序列数大于100，则进入步骤3-3)，否则不做处理；
步骤3-3)：对点突变标志物响应序列中的每个突变位点进行碱基比例计算，出现频率最高的碱基即为该点突变标志物响应序列在该突变位点的碱基构成形式；
步骤3-4)：储存点突变标志物响应序列与耐药标志物参考序列不一致的突变位点；
步骤3-5)：通过碱基到氨基酸转换规则，将碱基突变转换成氨基酸突变，输出点突变分析结果包括氨基酸突变信息，记为A&pos&B，其中，A代表野生型菌株中该突变位点的氨基酸名称，pos代表突变位点的位置，B代表突变后的氨基酸名称。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结构变异判读规则，用于输出结构变异响应序列的结构变异分析结果，包括以下判读步骤：
步骤4-1)：将结构变异标志物响应序列与耐药标志物参考序列进行有参对齐，
其中，所述结构变异标志物包括净读长序列碱基长度大于100的缺失、重复、倒位、易位、插入序列、转座子序列的至少一种；
步骤4-2)：若结构变异标志物响应序列的净读长序列数大于100，则进入步骤4-3)，否则输出结构变异分析结果为低深度，记为LD；
步骤4-3)：若比对的起始位置的碱基分布律和终止位置的碱基分布律之和大于150%，输出结构变异分析结果为野生型，记为W；否则进入步骤4-4)；
步骤4-4)：若比对的起始位置的碱基分布律和终止位置的碱基分布律之和小于120%，输出结构变异分析结果为突变型，记为M，将结构变异标志物响应序列中首个与耐药标志物参考序列不一致的位点记为结构变异位点并输出，否则进行人工复核。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述遗传背景判读规则，用于输出谱系分型标志物响应序列的遗传背景分析结果，包括以下判读步骤：
步骤5-1)：将谱系分型标志物响应序列与耐药标志物参考序列进行有参对齐；
步骤5-2)：若谱系分型标志物响应序列的平均位点深度大于100，则进入步骤5-3)；否则输出遗传背景分析结果为不存在，记为NE；
步骤5-3)：将谱系分型标志物响应序列与基因分型数据库进行匹配性分析，若存在与基因分型数据库中的基因分型参考序列完全匹配的谱系分型标志物响应序列，则输出对应的基因分型参考序列的唯一识别编号，记为谱系分型序列型；
否则输出遗传背景分析结果为不存在完全匹配的谱系分型标志物响应序列，记为NM。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）中的输出微生物样本的分子药敏结果的步骤包括：步骤6-1）分别调取耐药基因分析结果、点突变分析结果、结构变异分析结果和遗传背景分析结果；步骤6-2）利用分析逻辑映射关系，针对每种药物逐一生成TRUE或者FALSE判读结果；
若判读结果是TRUE，则微生物样本对该种药物呈现耐药性，输出微生物样本的分子药敏结果为耐药，记为R；若判读结果是FALSE，则微生物样本对该种药物呈现敏感性，输出微生物样本的分子药敏结果为敏感，记为S。
10.一种微生物药敏的计算机分析系统，其特征在于，能够实现如权利要求1至9之任一项所述的微生物药敏的计算机分析方法，其包括：基础数据库、耐药基因分析子系统、点突变分析子系统、结构变异分析子系统、遗传背景分析子系统以及报告子系统；其中，
所述基础数据库，包括耐药标志物参考序列、耐药标志物与归属物种映射关系、耐药标志物判读规则和分析逻辑映射关系；所述耐药标志物参考序列，用于根据微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据输出耐药标志物响应序列；所述耐药标志物与归属物种映射关系，用于判读耐药标志物响应序列的物种定位；所述分析逻辑映射关系，用于将耐药标志物分析结果转化为分子药敏结果；
所述耐药基因分析子系统，通过输入微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据，根据耐药基因判读规则输出耐药基因分析结果；
所述点突变分析子系统，通过输入微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据，根据点突变判读规则输出点突变分析结果；
所述结构变异分析子系统，通过输入微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据，根据结构变异判读规则输出结构变异分析结果；
所述遗传背景分析子系统，通过输入微生物样本的核酸测序得到的原始测序数据，根据遗传背景判读规则输出遗传背景分析结果；
所述报告子系统，通过从所述基础数据库内调用所述分析逻辑映射关系，整合所述耐药基因分析子系统、点突变分析子系统、结构变异分析子系统、和遗传背景分析子系统输出的耐药标志物分析结果，转化为分子药敏结果，输出微生物药敏分析报告，所述耐药标志物分析结果包括耐药基因分析结果、点突变分析结果、结构变异分析结果和遗传背景分析结果中的至少一种。
11.一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，该计算机程序被处理器执行时实现权利要求1至9中任一项所述的微生物药敏的计算机分析方法的步骤。
12.一种电子设备，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述计算机程序时实现如权利要求1至9中任一项所述的微生物药敏的计算机分析方法的步骤。
13.如权利要求1至9之任一项所述的微生物药敏的计算机分析方法在微生物药物敏感性诊断中的应用。
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