CN116171380A - 纳秒级光热动态成像 - Google Patents
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Abstract
提供了用于执行光热动态成像的系统和方法。一种示例性方法包括：扫描样本以产生多个原始光热动态信号；接收样本的原始光热动态信号；通过对原始光热动态信号进行匹配滤波来生成多个第二信号，以抑制非调制噪声；以及对第二信号执行逆运算以在时域中获得至少一个热力学信号。
Description
相关申请
本申请要求于2021年8月5日提交的美国临时申请号63/229,841的优先权，其全部内容被包含在本文中。
政府许可权
本发明是在授权号GM136223的政府支持下进行的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
光热显微术是一种以极高灵敏度测量光学吸收的通用分析工具。与测量光衰减的传统光谱方法不同，光热检测经由探测吸收带之外的另一光束的热效应来获取吸收信息。它的高灵敏度主要得益于通过采用调制加热光束和用锁定放大器的频移探针光束的外差检测来减少背景。使用这种检测方案已经证明了1.4nm直径的单个金纳米粒子的散粒噪声限制成像。单分子检测极限也已被报道。
最近，一种新兴的无标记振动光谱成像模式使用中红外(中-IR)激光器作为泵浦源，并且可见光作为探针。在这种成像模式中，中-IR吸收对比度产生于限制在吸收体附近的瞬态热场。通过用紧密聚焦的可见光探测这样的场，可以获得高达300nm的亚微米空间分辨率。这种新的成像模式丰富了光热技术，具有巨大的分子指纹信息，并克服了传统中-IR吸收显微术和近场IR方法的局限性。
随着水环境中化学键的亚微米化学图谱绘制(mapping)能力，中红外光热成像领域随着各种创新和应用而扩展。它们包括宽场检测、光学相位检测、光声检测、与拉曼的协同集成、非接触材料表征、生物分子图谱绘制以及活细胞和其他生物的代谢成像。
尽管光热显微术的开发和应用取得了成功，但关于物体热力学和瞬态光热过程的宝贵信息很少被利用。利用锁定方法的光热外差成像(photothermal heterodyneimaging，PHI)可以揭示介质的热扩散率。这种方法已经实现了各种应用，包括观察超导转变、组织分化和揭示膜界面。然而，锁定解调通常会丢失所有光热信号的高阶谐波，提供较差的时间分辨率。
因此，很难使用PHI来解释源自嵌入介质和物体的中红外光热信号。在时域中，采用短脉冲探针的时间门控(time-gated)方法可以通过调整探针和泵浦脉冲之间的延迟来解决动力学。然而，要获得以纳秒分辨率描绘温度上升和下降的完整热力学光谱，需要数千次重复测量，这使得它不适合常规使用。
发明内容
根据本公开中描述的主题的一个方面，提供了一种用于执行光热动态成像的方法。该方法包括以下步骤：扫描样本以产生多个原始光热动态信号；接收样本的原始光热动态信号；通过对原始光热动态信号进行匹配滤波以抑制非调制噪声来生成多个第二信号，该匹配滤波在频域中通过梳状通带来执行，其中，梳状通带包括至少一个窗口，其中心位置在谐波频率处共定位以抑制非调制噪声；以及对第二信号执行逆运算以在时域中获得至少一个热力学信号。
根据本公开中描述的主题的一种实施方式，提供了一种用于执行光热动态成像的方法。该方法包括以下步骤：扫描样本以产生多个原始光热动态信号；接收样本的原始光热动态信号；通过对原始光热动态信号进行匹配滤波以抑制非调制噪声来生成多个第二信号，该匹配滤波在频域中通过梳状通带来执行，其中，梳状通带包括至少一个窗口，其中心位置在谐波频率处共定位以抑制非调制噪声；对第二信号执行逆运算以在时域中获得至少一个热力学信号；使用至少一个热力学信号确定样本的水背景；确定水背景和样本之间的热衰减差；以及在样本的光热成像中使用热衰减差来抑制水背景。
根据本公开中描述的主题的另一方面，提供了一种用于执行光热动态成像的系统。该系统包括一个或多个计算设备处理器，以及耦合到一个或多个计算设备处理器的一个或多个计算设备存储器。一个或多个计算设备存储器存储由一个或多个计算设备处理器执行的指令，其中，指令被配置为：扫描样本以产生多个原始光热动态信号；接收样本的原始光热动态信号；通过对原始光热动态信号进行匹配滤波以抑制非调制噪声来生成多个第二信号，该匹配滤波在频域中通过梳状通带执行，其中，梳状通带包括至少一个窗口，其中心位置在谐波频率处共定位以抑制非调制噪声；以及对第二信号执行逆运算以在时域中获得至少一个热力学信号。
根据本公开中描述的主题的另一种实施方式，提供了一种用于执行光热动态成像的系统。该系统包括一个或多个信号放大设备，用于放大多个原始光热动态信号。一个或多个信号采集设备被耦合到一个或多个信号放大设备。一个或多个计算设备处理器被耦合到一个或多个信号采集设备。一个或多个计算设备存储器被耦合到一个或多个计算设备处理器。一个或多个计算设备存储器存储由一个或多个计算设备处理器执行的指令，其中，该指令被配置为：扫描样本以产生多个原始光热动态信号；接收样本的原始光热动态信号；通过对原始光热动态信号进行匹配滤波以抑制非调制噪声来生成多个第二信号，该匹配滤波在频域中通过梳状通带来执行，其中，梳状通带包括至少一个窗口，其中心位置在谐波频率处共定位以抑制非调制噪声；以及对第二信号执行逆运算以在时域中获得至少一个热力学信号。
根据本公开中描述的主题的另一种实施方式，提供了一种存储指令的非暂时性计算机可读存储介质，当由计算机执行时，该指令使计算机执行用于执行光热动态成像的方法。该方法包括以下步骤：扫描样本以产生多个原始光热动态信号；接收样本的原始光热动态信号；通过对原始光热动态信号进行匹配滤波以抑制非调制噪声来生成多个第二信号，该匹配滤波在频域中通过梳状通带来执行，其中，梳状通带包括至少一个窗口，其中心位置在谐波频率处共定位以抑制非调制噪声；以及对第二信号执行逆运算以在时域中获得至少一个热力学信号。
本公开的附加特征和优点在本公开的详细描述中进行了描述，并将从中显而易见。
附图说明
本公开以示例而非限制的方式在附图中被示出，其中使用相同的参考数字来表示相似的元件。需要强调的是，各种特征可能不是按比例绘制的，并且为了讨论的清楚，各种特征的尺寸可能会任意增大或减小。
图1A-图1C是根据一些实施例的脉冲泵浦源下的光热调制图。
图2A-图2B是根据一些实施例的光热动态成像(photothermal dynamic imaging，PDI)系统的示意图。
图3A是根据一些实施例的由光热成像系统使用的数字处理的流程图。
图3B是根据一些实施例的由光热成像系统使用的梳状通带的示意图。
图4A-图4B是根据一些实施例的300nm聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)珠在1729cm-1的吸收峰和1600cm-1的非共振峰处的光热强度图像。
图4C是根据一些实施例的在相同视场中使用基于锁定(lock-in，LIA)的方法的光热强度图像。
图5A-图5C是根据一些实施例的图4A-图4B的300nm PMMA珠的光热动力学的图。
图6是示出根据一些实施例的PMMA的光谱曲线的图。
图7A是根据一些实施例的在吸收峰1729cm-1处300nm和500nm PMMA珠混合物的光热强度图像。
图7B是根据一些实施例的300nm和500nm PMMA珠的光热动力学的图。
图7C是根据一些实施例的通过随时间的导数获得的时间分辨能量通量函数的图。
图7D是根据一些实施例由PDI系统产生的衰减常数图。
图7E是根据一些实施例的图7D中选定区域的衰减常数图的直方图。
图8A是根据一些实施例的U87癌细胞在1650cm-1处的PDI采集的光热强度图像。
图8B是根据一些实施例的脂质C＝O键在1750cm-1处的中红外光热(mid-infraredphotothermal，MIP)图像。
图8C是根据一些实施例的图8A-图8B中指示的位置的MIP光谱。
图8D是根据一些实施例的图8A-图8B中指示的位置的热力学图。
图8E是根据一些实施例的通过指数拟合在图8A-图8B中指示的位置的1650cm-1处的衰减常数图。
图8F是根据一些实施例的通过指数拟合在图8A-图8B中指示的位置的1750cm-1处的衰减常数图。
图8G是根据一些实施例的图8E中指示的脂滴在1650cm-1处的热力学图。
图8H是根据一些实施例的图8F中指示的脂滴在1750cm-1处的热力学图。
图8I是根据一些实施例的在1750cm-1处与1650cm-1处的背景热力学的合并光热强度图像。
图8J是根据一些实施例的脂质内容物在1750cm-1处与蛋白质内容物在1650cm-1处的合并光热强度图像。
图9A是根据一些实施例的U87癌细胞在1750cm-1处的PDI采集的光热强度图像。
图9B是根据一些实施例的通过用谐振放大器锁定获得的1750cm-1处与图9A相同视场的MIP图像。
图9C是根据一些实施例的U87癌细胞在与图9A相同视场下的21次谐波振幅图像。
图9D是根据一些实施例的在图9A中指示的位置处的背景和脂滴的归一化热力学的图。
图9E是根据一些实施例的背景和脂滴的传递函数，衰减常数分别为5μs和300ns。
图9F是根据一些实施例的图9C中指示的线在不同频率下的强度曲线。
图10是根据一些实施例的用于执行光热动态成像的示例过程中包括的操作的过程流程图。
图11是根据一些实施例的可以包括在图2A所示的计算机系统中的组件的示意图。
具体实施方式
本文提供的附图和描述已被简化，以说明与清楚理解本文描述的设备、系统和方法相关的方面，同时为了清楚起见，消除了在典型的类似设备、系统或方法中可能存在的其他方面。普通技术人员可以认识到，其他元件和/或操作对于实施本文描述的设备、系统和方法可能是可取的和/或必要的。但是，由于这些元件和操作在本领域中是众所周知的，并且因为它们不利于更好地理解本公开，所以这里可以不提供对这些元件或操作的讨论。然而，本公开被认为固有地包括本领域普通技术人员已知的对所描述的方面的所有这些元素、变化和修改。
本文使用的术语仅用于描述特定示例性实施例，并不旨在限制。例如，如本文所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”也可以旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指示。术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(including)”和“具有(having)”是包含性的，并且因此规定了所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作，元件、组件和/或其组的存在或添加。本文描述的方法步骤、过程和操作不应被解释为须要求它们以讨论或图示的特定顺序来执行，除非明确标识为执行顺序。还应当理解，可以采用附加的或替代的步骤。
尽管本文中可以使用术语第一、第二、第三等来描述各种元件、组件、区域、层和/或部分，但这些元件、组件，区域、层或部分不应受到这些术语的限制。这些术语可以仅用于将一个元件、组件、区域、层或部分与另一元件、组件或区域、层或部分区分开来。也就是说，诸如“第一”、“第二”和其他数字术语的术语，当在本文中使用时，除非上下文明确指示，否则不暗示顺序或次序。
本文描述了具有纳秒级时间分辨率并覆盖大于25MHz带宽的中-IR光热动态成像(PDI)系统的示例实施方式。带宽可以在1kHz和1GHz之间。使用宽带电压放大器和兆赫数字转换器，获取响应于单个IR脉冲激发的热力学光谱，并与数字信号处理相结合，以滤除基本IR调制频率和谐波之外的噪声。与基于锁定的光热外差成像(PHI)相比，PDI系统可以在信噪比(signal-to-noise ratio，SNR)上实现五倍以上的提高。此外，PDI系统获得瞬态热场性质，并提供有关目标的物理性质和微环境的信息。
使用这种方法可以获得癌细胞内各种细胞器的光热动力学。与组织或细胞的均匀热响应的宏观观察不同，可以描绘细胞内高度不均匀的化学依赖热环境。通过利用水和生物分子之间的热衰减差异，在传统光热显微术中难以从水背景中分离的细胞成分现在可以基于它们的时间分辨特征来区分。
总的来说，PDI系统能够以纳秒的时间分辨率直接检测瞬态光热过程。结合中-IR激发，该方法允许对样本的固有化学和物理性质进行无损调查，并能够实现特定化学的瞬态热成像应用。
光热现象源于通过非辐射弛豫将吸收的光子能量转化为热量。在脉冲激光激发下，短于热弛豫时间的吸收能量沉积在吸收体上，并形成局部热场。它引起并发的热弹性变形，其通过局部密度变化改变局部光学折射率，这可以通过光学散射作为时间分辨的光热信号来检测。与纳米粒子的PHI检测相比，在解释中红外光热(MIP)热力学方面有两个不同之处。
首先，MIP吸收体不能通过介质中的点热源来建模，特别是在生命系统中。例如，像脂滴、蛋白质聚集和细胞质这样的键选择性目标是体积大的。热力学受到吸收体和局部介质的共同影响。其次，考虑到水在中-IR范围内的吸收，吸收体和介质在水环境中都会经历温度升高，从而影响信号对比度。因此，应考虑非均匀热扩散率内的热场演化。
中-IR泵下吸收体的局部温度演变由中-IR脉冲存在时的温度跳跃组成，如图1A所示，随后是与散热相关的指数衰减，如图1B所示。该瞬态过程通过求解以下热传递公式给出：
其中m和Cs表示吸收体的质量和比热容；dT/dt是温度随时间的变化；(Qabs-Qdiss)表示能量通量，代表吸收能量和耗散能量之间的速率差。IR脉冲持续时间(脉冲宽度)可以在1ns到1000ns之间，周期在1μs到100μs之间。
量Qabs可以近似为IIR(t)σabs，其中IIR(t)表示IR脉冲上的入射IR强度；σabs表示IR吸收截面。散热遵循牛顿(Newtown)定律，Qdiss由温度梯度驱动，并由(hS[T(t)-T0])给出，其中h和S分别表示从样本到环境的传热系数和有效传热表面积。关系式(hS[T(t)-T0])是吸收体和周围环境T0之间的随时间变化的温差。
在加热过程中，T(t)可以通过求解公式(1)得出，初始条件T(0)＝T0并且忽略IR脉冲形状：
当IR脉冲加热完成时，Qabs变为零。温度变化仅由Qdiss驱动，则T(t)被求解为：
其中Tmax是加热完成后吸收体的最高温度。
从该模型中，可以发现加热和冷却过程都可以被描述为具有时间常数τ为mCs/hS的指数过程。在加热过程中，只有激光脉冲持续时间比τ短得多,假设热扩散可以忽略不计，则满足热约束条件，并且公式(2)变为(T0+(IIRσabs/hS)t)。否则，当吸收体接近它们的热平衡状态时，温度可以缓慢地达到稳定期。
作为电阻器-电容器电路的类比，量mCs是热电容器，并且1/hS是热电阻。它们的任何一个增量都会导致相当大的时间常数。预计它们的时间常数对于具有大热容量的吸收体(诸如体积大的水和大颗粒)来说是重要的。量hS与嵌入介质的传热能力和吸收体的形状最相关。因此，热响应与样本和耦合环境的物理性质密切相关，这在像活细胞这样的异质系统中可能会有很大不同。
在频域中，由短脉冲激光引起的热响应将跨越宽带，这是将脉冲频谱与吸收体的传递函数进行复用的结果。具有时间常数τ的特定吸收体的传递函数可以近似为：
这种表示传达了关于光热信号的重要事实。首先，吸收体是瞬态热扰动的低通滤波器，在1/2πτ处截止频率为-3dB。这种关系解决了选择适当的IR重复率以避免热量残留并保持相当大的调制深度。其次，由重复率为fIR的IR产生的光热信号可以被视为这种函数的傅里叶合成，并且包含fIR的每个谐波处的分量，如图1C中直径D＝500nm PMMA珠的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠在空气中的模拟所示。
特别地，图1C示出了谐波在频域中广泛传播，带宽由截止频率确定。大的τ导致较窄的跨度。光热信号在调制频率下变得更像正弦波，并且具有很少的高阶谐波，而快速衰减信号具有许多强谐波分量。此外，这些特征突出了微环境对传统的基于锁定的MIP系统的影响。锁定方法仅恢复基本谐波振幅，并错过谐波频率下的所有其他信号，这牺牲了灵敏度，并在具有不同热响应的异质样本中导致对比度失真。此外，水背景在调制频率下最大化，并隐藏了具有微弱信号幅度的小细胞器的信号，但在频域中加载各种高阶谐波分量。
光热信号是细微的，并在大背景信号上进行调制。锁定检测方法通过抑制调制频带外的噪声来解调信号。然而，这种窄带滤波技术失去了检测带宽和时间分辨率。PDI系统利用使用匹配滤波的宽带采集方案来抑制噪声。这样，带宽、时间分辨率和灵敏度都得到了很好的保持。
图2A是根据一些实施例使用的示例中-IR PDI系统的示意图。量子级联激光器提供脉冲中-IR泵浦光束210，其穿过第一分色镜(first dichroic mirror，DM1)，并且然后用反射物镜(reflective objective，RL)聚焦在样本上。由分色镜DM反射的残余中-IR光束212用MCT检测器监测。来自连续波532nm激光器的反向传播探针光束214穿过第二分色镜(second dichroic mirror，DM2)并聚焦在水浸物镜(objective lens，OL)上。后向散射的探针光子216用50/50分束器(beam splitter，BS)收集，并且前向散射的探针光子218由反射物镜(reflective objective lens，RL)收集并由分色镜(DM3)分离。正向218和后向216探针光子都被收集并发送到连接到宽带电压放大器202的硅光电二极管PD1和PD2，如图2B所示。
图2B示出了用截止频率为25MHz的低通滤波器204滤波的电压信号，并以每秒5000万样本的采样率发送到高速数字转换器(DAQ)206。DAQ 206的采样率在每秒100万个样本和每秒30亿个样本之间。计算机208被用于同步控制扫描台209和QCL激光器。同时，放置碲化汞镉(mercury cadmium telluride，MCT)检测器以监测IR泵浦脉冲，并且信号由同一DAQ206同步数字化。
在完成样本扫描并使用定制编码软件进行处理后，每帧采集的原始PDI数据从DAQ206传输到计算机208的存储器。根据指定的像素停留时间分割整个时间轨迹。然后，在频域中用梳状通带对每个段进行滤波，每个通过窗口在谐波泵浦激光器重复频率处(对于以100kHz运行的激光器，通过窗口被选择在100kHz、200kHz、…、2MHz、2.1MHz处)。光谱分辨率根据像素停留时间来定义窗口大小。通过谐波的数量决定了热动态带宽并影响SNR。在这种情况下，可以使用16阶谐波(1.6MHz)来描述吸收对比度，从而给出最高的图像SNR。另一方面，为了定义完整的光热动态曲线，可以使用25MHz的带宽。
图3A是根据一些实施例的用于执行PDI的过程流程图。PDI原始数据是在IR泵浦下从500nm PMMA珠的中心采集的，其吸收峰为1729cm-1(步骤302)。使用宽带检测方案，单脉冲光热信号可以以超过43的信噪比(SNR)被清晰地分辨，而无需进行平均。这种单脉冲分辨能力将PDI推至前所未有的成像速度，最小采集时间为几微秒。实际上，受平台扫描速度的限制，每个像素获取的信号是数百微秒的片段。使用傅里叶变换，在频域中利用梳状通带310对每个段执行匹配滤波，以增强SNR(步骤304)。图3B示出梳状通带310，其中每个窗口312具有在频域中的谐波频率处共定位的中心位置，以抑制大部分未调制噪声314。滤波后，使用逆傅里叶变换获取滤波后的光热信号308(步骤306)。滤波后的光热信号与在时域中扩展的每个空间像素重建的X-Y-t堆栈相关(步骤306)。
PDI是在标称直径为300nm的PMMA珠上执行的。在将QCL激光器调谐到1729cm-1之后，对应于PMMA中C＝O键的吸收峰，获得PMMA珠的光热强度图像，如图4A所示。图4A示出了大多数PMMA珠在t＝440ns时达到其最高温度。图4B示出了在1600cm-1的非共振中-IR激发下没有光热对比。图4C示出了在1729cm-1的激发下的传统MIP显微镜的光热强度图像，其具有与使用锁定和共振放大器的图4A相同的视场。而锁定方法产生的SNR为71，像素停留时间为500μs，表明检测灵敏度提高了近五倍。像素停留时间被推到200μs，并且使用PDI可以实现单个PMMA珠220的SNR。
图5A示出了图4A所示PMMA珠的光热动态曲线。当前PDI系统中最高的时间分辨率最终受到几纳秒的光电二极管响应时间的限制。但是由于数字转换器206，使用50M样本/秒的采样率或20纳秒。利用所获取的时间曲线，当IR脉冲完成时，可以定量地测量的t3之后耗散过程的热衰减常数。通过使用指数拟合函数，如虚线502所示，拟合的衰减常数为300ns。
根据公式3，该时间常数由mCs/hS给出。吸收体与其微环境之间的传热参数hS可以使用关于材料密度ρ和Cs的信息来确定。在氟化钙(CaF2)衬底上的300nm PMMA粒子的情况下，传热参数被确定为7.78E-8W/K。使用有限元法(finite element method，FEM)，该参数被确定为7.65E-8W/K，这与实验测量值非常匹配。
公式1中的时间分辨能量通量函数[Qabs(t)-Qdiss(t)]可以通过取瞬态光热信号对时间的导数来直接评估，如图5B所示。根据该模型，该函数写为：
其中
是表示特定样本每开尔文散射强度变化的系数。
该函数与实验结果中的IR脉冲形状匹配良好。热力学由三个阶段组成。在加热开始时(从t1到t2)，散热可以忽略不计。与能量吸收相关的第一项占主导地位，导致类似于IR脉冲形状IIR(t)的脉冲状波形,如图5C所示。温度持续升高，直到散热项等于热流入；此时，能量通量函数变为零，并且吸收体进入热平衡状态。
由于非理想的IR脉冲形状，冷却过程发生在IR脉冲完全完成之前。从t2到t3，随着IR强度逐渐降低，耗散能量变得占主导地位，并且能量通量函数开始为负，表明吸收体已进入冷却阶段。在IR脉冲结束后(>t3)，热通量函数仅将热耗散项显示为指数衰减。这解释了为什么实验获得的300nm PMMA珠的热力学在冷却开始时具有凹函数样的衰减。
在不同的IR波长下获得光热强度以验证光谱保真度。将300nm PMMA珠的MIP光谱与用FTIR获得的PMMA膜的光谱进行比较，如图6所示。IR激光脉冲能量使原始光热光谱归一化。在整个区域观察到良好的一致性。
以上讨论的热力学模型表明，温度升高和衰减都与时间常数mCs/hS密切相关。对于嵌入均匀介质中的球形粒子hS可以近似为2πkD，其中k是介质热导率，并且D是粒子直径。因此，衰减常数与r2ρCs/k成比例。对于具有相同材料和均匀微环境的粒子，时间常数具有r2依赖性。对不同尺寸(300nm和500nm)的PMMA粒子进行热力学成像以验证这种关系，如图7A所示。除了光热强度差异之外，观察到它们的热力学存在显著差异。图7B和图7C中分别示出了图7A中所示粒子的热力学和热通量函数。300nm和500nm粒子的所得到的衰减常数分别为290ns和540ns。
拟合每个像素处的衰减信号，并生成衰减常数图，其指示热寿命以执行统计分析，如图7D所示。衰减常数图中选定区域的直方图如图7E所示，其中观察到两个峰值，分别代表中心值为280ns和495ns的300nm PMMA粒子和500nm PMMA粒子。根据该结果，在300nm和500nm PMMA粒子之间，衰减常数被缩放1.8倍。此外，当用r2依赖性进行估计时，衰减常数可以被缩放2.8倍。
CaF2衬底具有比空气(0.026W/(mK))大得多的热导率(9.71W/(mK))。这种差异是由不同粒子的基底接触面积变化的影响引起的。因此，这种微环境中的粒子将具有不同大小的表面积附着的非均匀散热能力。随着尺寸的增加，衬底的表面接触面积变大，从而增加了大粒子的传热能力。实际上，从衰变常数图中，可以观察到图7D中500nm PMAA粒子的异质热性质。中心区域比表面接触面积小的边缘具有更快的衰减。
对氧化氘(D2O)磷酸盐缓冲液(PBS)中的U87癌细胞进行了键选择PDI，以调查细胞内各种细胞器的瞬态热响应。通过将IR调谐至对应于酰胺I带的1650cm-1，细胞内富含蛋白质的内容物与图8A所示的光热强度图形成强烈对比。D2O PBS被用于维持细胞形态并减少1650cm-1处的中-IR的相当大的水吸收。
在图8A中，可以观察到细胞质中均匀分布的蛋白质内容物和来自细胞核的强信号。背景具有光热信号，但与细胞信号相比相对较弱。这是由于在该波数下残余的水吸收。通过将IR调谐到对应于来自脂质的C＝O键的1750cm-1，图8B中单个脂滴显示出强信号。
对脂滴、细胞核、细胞质和背景介质进行光热光谱分析。图8C中示出了每个内容物的光谱。细胞核和细胞质处的光谱显示酰胺I带在1655cm-1处出现强峰，并且由于N-H键的氘取代，酰胺II带在1450cm-1处偏移。在脂滴的光谱中，1750cm-1处出现强峰，表明C＝O含量较高。图8D分别显示了脂滴、细胞核、细胞质和背景介质的光热动力学。
有趣的是，脂滴的光谱显示出以1650cm-1为中心的宽峰。它与1650cm-1处的图8A的强度图的结果相匹配，其中脂滴也变得明亮。在其他报道的基于散射的光热系统中，广泛观察到脂质在该蛋白质带处的异常强烈对比。可以通过研究瞬态光热信号来调查该信号的起源，这是由本文描述的PDI方法实现的。
与IR化学特异性一起，评估了各种亚细胞成分的光热动力学，如图8D所示。结果表明，不同细胞器之间存在明显的热反应。细胞内的脂滴类似于嵌入水环境中的孤立粒子。因此，它们具有相对快速的衰减信号，时间常数为300ns。与2.5μs的脂滴相比，富含蛋白质内容物的细胞核和细胞质具有较慢的衰减信号。
有趣的是，1650cm-1处的背景具有最长的衰减，衰减常数大于5μs，这是由于其水热容量大。为了更直观的说明，生成了1650cm-1(如图8E所示)和1750cm-1(如图8F所示)的衰减常数图。从图8E和图8F的衰减图中，可以区分背景和细胞结构的不同热动力学。在图8E中虚线802所示的边缘处可以观察到细胞和背景介质之间的热边界。
脂滴在1750cm-1激发下具有范围为150ns至500ns的衰减常数，如图8F所示。然而，在1650cm-1以下，脂质的更高衰减常数没有显示出来。相反，它们具有类似于背景介质的衰减常数。细胞质和细胞核在1650cm-1激发下具有2.5μs的衰减常数。
检测到的信号通常源自散射场调制。散射强度与(ns-nm)成比例,其中ns和nm分别是样本和背景介质的折射率。这假设尺寸影响可忽略不计。在有水吸收的MIP调制中，ns(t)和nm(t)都是时间相关的。它们中的任何一个变化都会导致散射强度调制。
在1650cm-1(如图8G所示)和1750cm-1(如图8H所示)的激发下绘制了脂滴的基本动力学。事实上，所揭示的动力学表明了不同的热性质。在1750cm-1处，脂质信号LD1、LD2和LD3具有快速响应和几百纳秒量级的衰减时间。然而，在1650cm-1处，脂质信号LD1、LD2和LD3显示出相对较慢的衰减，衰减常数高于5μs。该瞬态响应类似于水背景，如图8G中的虚线804所示。
采用时间分辨光热信号的导数来确定这种串扰是否来自水背景介质和脂质之间的热交换。由于这种不同的热性质，脂质信号LD1、LD2和LD3中的1650cm-1峰应该来自水背景介质，而不是细胞器本身。在1650cm-1处没有观察到超过20纳秒的延迟，这表明在加热和信号生成期间的热扩散可以忽略不计。因此，背景介质是由于吸水导致nm变化的主要因素。
PDI系统通过利用水背景介质和脂滴LD1、LD2和LD3之间的不同热性质来区分时域中的信号贡献。可以经由评估其光热强度和衰减常数的简单程序成功地提取脂质LD1、LD2和LD3的水诱导信号，如图8I所示。在从强度图像中去除1650cm-1处的水诱导信号之后，在脂质和蛋白质之间获得了分离良好的内容物图，如图8J所示。
光热动力学结果显示，脂滴在几百纳秒内迅速衰减。同时，水背景要慢得多，在几微秒的量级。通过捕获高阶谐波信号，PDI进一步使我们能够可视化小脂质902-908，如图9A所示。当使用锁定检测时，这些小脂质902-908完全被埋在水背景中，如图9B所示。对光热动态信号进行了傅里叶分析，以更好地理解这种能力。
与脂质902-908相关联的背景信号(background signal，BD)和脂质信号(lipidsignal，LD)的瞬态光热信号如图9C所示。图9C示出了通过傅里叶变换获取的背景信号(BD)和脂质信号(LD)在100kHz下的基波分量或一阶谐波，并被绘制。背景信号(BD)和脂质信号具有快速响应并呈现高阶谐波分量。相反，水背景在基本调制频率处是局部的。因此，在基频处的锁定解调使脂滴和背景之间的对比度最小化。
背景信号(BD)和脂质信号(LD)的频率响应如图9D所示。慢背景信号具有一次和二次谐波中的分量。相比之下，快速脂质信号(LD)在频域中广泛传播，一次谐波仅包含不到五分之一的总能量。因此，脂质与背景比(L/D)增加直到21次谐波。
在锁定解调的一次谐波处，对比度最低，如图9D所示，并且脂质信号很难从背景信号中分辨出来。图9E示出了21次谐波(2.1MHz)的光热图像，展示了具有最小背景的小脂质的清晰对比度。如图9E所示的线910的强度曲线在图9F中以不同的频率绘制。在高阶谐波(0.7MHz至2.1MHz)中显示了具有适当的脂质与背景比(L/D)的脂质信号。
图10是根据一些实施例的用于执行光热动态成像的示例过程1000中包括的操作的过程流程图。这些操作可以使用存储在一个或多个非暂时性机器可读存储介质上的计算机可执行指令来实施。指令可以由一个或多个处理设备执行，诸如图2中描述的处理器208，以实施操作。
过程1000包括扫描样本以产生多个原始光热动态信号(步骤1002)。过程1000包括接收样本的原始光热动态信号(步骤1004)。过程1000包括通过对原始光热动态信号进行匹配滤波以抑制非调制噪声来生成多个第二信号(诸如过滤的光信号)。匹配滤波在频域中通过梳状通带(通带302)执行。梳状通带包括至少一个窗口(诸如窗口304)，其中心位置在谐波频率处共定位，以抑制非调制噪声(诸如噪声308)。过程1000包括对第二信号执行逆运算，以在时域中得到至少一个热力学信号。过程1000包括使用至少一个热力学信号确定样本的水背景(诸如图8A-8I中的水背景)(步骤310)。确定水背景和样本之间的热衰减差(步骤1012)。该过程包括使用热衰减差来抑制样本的光热成像(诸如图8I的良好分离的内容物图)中的水背景(步骤1014)。
图11是根据一些实施例的可以包括在计算机系统208中的组件的示意图。如图11所示，计算机系统208包括存储器1120，其可以包括非暂时性计算机可读介质，诸如计算机硬盘。存储器1120存储数据1121、计算机程序1122和操作系统1123等。操作系统1123包括用于控制计算机系统208的操作的驱动器，例如内核驱动器1144。在存储器1120中存储的计算机程序中有与方法300和1000相关联的计算机代码1124。计算机系统208中还包括驱动器接口1126、显示器接口1127、键盘接口1128、鼠标接口1129、一个或多个计算机总线1130、随机存取存储器(random access memory，RAM)1131、处理器(processor，CPU)1132和图形处理单元(graphic processing unit，GPU)1141。计算机系统208可以包括与显示器接口1127协同工作的显示器，以及与键盘接口1128协同工作的键盘，用于输入文本和用户命令。此外，计算机系统208可以包括与鼠标接口1129协同工作的鼠标，用于在显示屏上定位光标和输入用户命令。
在一些实施例中，存储器1120可以包含用于存储数据的多个存储器组件。在一些实施例中，RAM 1131可以包含用于处理计算机指令的多个RAM。
处理器1132可以是微处理器、可编程逻辑等，用于RAM 1131外的执行计算机程序，如以上提到的那些。处理器1132经由驱动器接口1126访问存储在外部设备上的计算机程序(或其他数据)。GPU 1141是一种处理设备。例如，GPU1141可以是被配置为实施和控制显示功能的可编程逻辑芯片。为此，GPU 1141可以被编程为在计算机的屏幕上渲染图像、动画和视频。GPU 1141可以位于计算机系统的主板上的插件卡或芯片组中，或者GPU 1141可以与CPU 1132在同一物理芯片中。在一些实施方式中，CPU 1132可以包含多个CPU。在一些实施例中，多个CPU可以被配置用于并行计算。
计算机系统208可以具有接收器1119，例如无线电接收器，以无线地接收和/或发送信息等。计算机系统208还可以包括一个或多个模数转换器(digital converter，ADC)1133，以将来自接收器1119的输入模拟RF信号转换为数字样本。计算机系统208还可以包括数字信号处理器(digital signal processor，DSP)1135，以对数字样本执行数字信号处理操作。DSP 1135也可以被操作以提高数字样本的质量。DSP还能够执行与信号处理无关的计算机程序。
计算机系统208包括网络接口1140，诸如以太网端口，用于接口连接到网络，诸如互联网。在一些实施例中，计算机系统208可以是连接到多个计算机系统208的服务器。
在一些实施方式中，多个电子组件，诸如GPU 1141、CPU 1132和/或DSP 1135，可以并发或同时执行一个或多个计算机程序。在一些实施方式中，GPU 1141可以包含图11中所示的每种类型的多个组件；例如，多个CPU、多个GPU、多个DSP等。每种类型的组件中的一个或多个可以被配置为并发、同时或同步执行一个或多个计算机程序。
本公开描述了一种光热动态成像(PDI)系统，其能够以纳秒时间分辨率感测瞬态光热调制。这种先进的技术能够在亚微米空间分辨率下同时检测化学特定IR吸收和物理特定热动力学。首先，人们可以检索细胞内各种细胞器的热反应。使用PDI系统，检索到的数据显示细胞质、细胞核和脂滴表现出不同的时间分辨特征。基于时间分辨特征，PDI系统能够将小信号与水介质贡献区分。
PDI系统可以通过捕获所有谐波提高SNR超过一个数量级。与传统的锁定方法相比，PDI系统对低占空比光热信号的灵敏度提高了四倍以上。这种改进利用了宽检测带宽来捕获由短脉冲IR泵浦引起的所有谐波分量。值得注意的是，这种方法主要有益于具有强大的光学参量振荡器(optical parametric oscillator，OPO)源的中-IR光热显微镜，其具有几纳秒的脉冲持续时间和几十千赫兹的固定重复率。这种短脉冲和高峰值功率激发源对于生成在导热基板上或在水环境中(在这里散热相对快速)的小物体的大调制深度而言是非常优选的。在这种情况下，光热信号的占空比小于1％，并且锁定放大器只能捕获极小部分的调制。
说明书中提及的“一种实施方式”或“实施方式”是指结合该实施方式的特定特征、结构或特性被包括在本公开的至少一种实施方式中。在说明书中不同地方出现的短语“在一种实施方式中”、“在一些实施方式中”，“在一个实例中”、“一些实例中”、“在一种情况下”、“在一些情况下”、“在一个实施例中”或“在一些实施例中”不一定都是指同一实施方式或实施例。
最后，出于说明和描述的目的，给出了本公开的实施方式的以上描述。它不旨在穷举或将本公开限制为所公开的精确形式。根据上述教导，许多修改和变化是可能的。本申请旨在本公开的范围不受该详细描述的限制，而是受本申请的权利要求的限制。如熟悉本领域的人将理解的，在不脱离本公开的精神或基本特性的情况下，本公开可以以其他特定形式被体现。因此，本公开旨在说明但不限制在以下权利要求中阐述的本公开的范围。
Claims (30)
1.一种用于执行光热动态成像的方法，所述方法包括：
扫描样本以产生多个原始光热动态信号；
接收所述样本的所述原始光热动态信号；
通过对所述原始光热动态信号进行匹配滤波以抑制非调制噪声来生成多个第二信号，所述匹配滤波是在频域中通过梳状通带执行的，其中，所述梳状通带包括至少一个窗口，其中心位置共定位在谐波频率处以抑制非调制噪声；以及
对所述第二信号执行逆运算以在时域中获得至少一个热力学信号。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括使用所述至少一个热力学信号确定所述样本的衰减常数。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括对所述至少一个热力学信号执行微分以确定所述样本的时间分辨能量通量。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个热力学信号在频域中包括多个谐波。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，通过匹配滤波生成所述多个第二信号包括在红外(IR)调制频率的基频和谐波处执行匹配滤波。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个热力学信号包括纳秒级热力学信息。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，扫描所述样本包括使所述样本经受单个红外(IR)脉冲激发，所述单个红外脉冲激发的脉冲宽度在1ns至1000ns之间，并且周期在1μs至100μs之间。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，通过匹配滤波生成所述多个第二信号包括对所述原始光热动态信号执行傅里叶变换。
9.一种用于执行光热动态成像的方法，所述方法包括：
扫描样本以产生多个原始光热动态信号；
接收所述样本的所述原始光热动态信号；
通过对所述原始光热动态信号进行匹配滤波以抑制非调制噪声来生成多个第二信号，所述匹配滤波是在频域中通过梳状通带执行的，其中，所述梳状通带包括至少一个窗口，其中心位置共定位在谐波频率处以抑制非调制噪声；
对所述第二信号执行逆运算以在时域中获得至少一个热力学信号；
使用所述至少一个热力学信号确定所述样本的水背景；
确定所述水背景和所述样本之间的热衰减差；以及
使用所述热衰减差来在所述样本的光热成像中抑制所述水背景。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，确定所述热衰减差包括对所述至少一个热力学信号执行指数拟合以确定所述水背景和所述样本的衰减常数。
11.根据权利要求9所述的方法，还包括对所述至少一个热力学信号执行微分以确定所述样本的时间分辨能量通量。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，通过匹配滤波生成所述多个第二信号包括在红外(IR)调制频率的基频和谐波处执行匹配滤波。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，所述至少一个热力学信号包括纳秒级热力学信息。
14.根据权利要求9所述的方法，其中，扫描所述样本包括使所述样本经受单个红外(IR)脉冲激发，所述单个红外脉冲激发的脉冲宽度在1ns至1000ns之间，并且周期在1μs至100μs之间。
15.根据权利要求9所述的方法，其中，通过匹配滤波生成所述多个第二信号包括对所述原始光热动态信号执行傅里叶变换。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，确定所述样本的所述水背景包括使所述样本经受1650cm-1的单个红外(IR)脉冲激发。
17.一种用于执行光热动态成像的系统，所述系统包括：
一个或多个计算设备处理器；以及
耦合到所述一个或多个计算设备处理器的一个或多个计算设备存储器，所述一个或多个计算设备存储器存储由所述一个或多个计算设备处理器执行的指令，其中，所述指令被配置为：
扫描样本以产生多个原始光热动态信号；
接收所述样本的所述原始光热动态信号；
通过对所述原始光热动态信号进行匹配滤波以抑制非调制噪声来生成多个第二信号，所述匹配滤波是在频域中通过梳状通带执行的，其中，所述梳状通带包括至少一个窗口，其中心位置共定位在谐波频率处以抑制非调制噪声；以及
对所述第二信号执行逆运算以在时域中获得至少一个热力学信号。
18.根据权利要求17所述的系统，其中，所述指令还被配置为使用所述至少一个热力学信号来确定所述样本的衰减常数。
19.根据权利要求17所述的系统，其中，所述指令还被配置为对所述至少一个热力学信号执行微分，以确定所述样本的时间分辨能量通量。
20.根据权利要求17所述的系统，其中，在通过匹配滤波生成所述多个第二信号时，所述指令被配置为在红外(IR)调制频率的基频和谐波处执行匹配滤波。
21.根据权利要求17所述的系统，其中，所述至少一个热力学信号包括纳秒级热力学信息。
22.根据权利要求17所述的系统，其中，当扫描所述样本时，所述指令被配置为使所述样本经受单个红外(IR)脉冲激发。
23.根据权利要求17所述的系统，其中，当通过匹配滤波生成所述多个第二信号时，所述指令被配置为对所述原始光热动态信号执行傅里叶变换。
24.一种用于执行光热动态成像的系统，所述系统包括：
一个或多个信号放大设备，用于放大多个原始光热动态信号；
耦合到所述一个或多个信号放大设备的一个或多个信号采集设备；
耦合到所述一个或多个信号采集设备的一个或多个计算设备处理器；以及
耦合到所述一个或多个计算设备处理器的一个或多个计算设备存储器，所述一个或多个计算设备存储器存储由所述一个或多个计算设备处理器执行的指令，其中，所述指令被配置为：
扫描样本以产生所述多个原始光热动态信号；
接收所述样本的所述原始光热动态信号；
通过对所述原始光热动态信号进行匹配滤波以抑制非调制噪声来生成多个第二信号，所述匹配滤波是在频域中通过梳状通带执行的，其中，所述梳状通带包括至少一个窗口，其中心位置共定位在谐波频率处以抑制非调制噪声；以及
对所述第二信号执行逆运算以在时域中获得至少一个热力学信号。
25.根据权利要求24所述的系统，其中，所述指令还被配置为使用所述至少一个热力学信号来确定所述样本的衰减常数。
26.根据权利要求24所述的系统，其中，所述指令还被配置为对所述至少一个热力学信号执行微分，以确定所述样本的时间分辨能量通量。
27.根据权利要求24所述的系统，其中，在通过匹配滤波生成所述多个第二信号时，所述指令被配置为在红外(IR)调制频率的基频和谐波处执行匹配滤波。
28.根据权利要求24所述的系统，其中，所述至少一个热力学信号包括纳秒级热力学信息。
29.根据权利要求24所述的系统，其中，在扫描所述样本时，所述指令被配置为使所述样本经受单个红外(IR)脉冲激发，所述单个红外脉冲激发的脉冲宽度在1ns至1000ns之间，并且周期在1μs至100μs之间。
30.根据权利要求24所述的系统，其中，当通过匹配滤波生成所述多个第二信号时，所述指令被配置为对所述原始光热动态信号执行傅里叶变换。
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