CN116157492A - 用于提高作物产量的微生物组合 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于促进作物植物的植物健康、生长和/或产量的组合物和方法，例如通过将微生物组合施用于根和/或植物生长的土壤。

Description

用于提高作物产量的微生物组合

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年4月30日提交的美国临时专利申请第63/017,970号的优先权，其全部内容通过引用方式并入本文。

背景技术

在农业产业中，某些常见问题继续阻碍着种植者在保持低成本的同时最大限度地提高生产产量的能力。这些问题包括但不限于由细菌、真菌、线虫和其他有害物和病原体引起的感染和侵染；化肥和除草剂的成本高，包括它们对环境和健康的影响；以及植物难以从不同类型的土壤中有效地吸收营养物和水。

健康的作物最关键的特征中的一个特征是健康的根际。根际是植物根系生长并吸收水和营养物的土壤区域。为了给土壤补充某些营养物，许多种植者非常依赖于使用合成化学品和化肥来提高作物产量并保护作物免受干旱和疾病的影响。然而，随着吸收能力降低，例如，当植物的根系由于疾病而受损时，向土壤中添加更多的水和/或营养物可能不会导致根系的吸收增加。相反，所施加的水和/或营养物将流过根际并流进地下水中。作为污染源，合理地使用这些物质是生态和商业的当务之急。过度依赖并长期地使用某些化肥、杀虫剂和抗生素可改变土壤生态系统、降低胁迫耐受性、增加抗性有害物的流行，并阻碍植物生长和活力。

根际的有效营养物和水吸收性不仅取决于其中存在的水和营养物的量，还取决于土壤内存在的特定微生物组。土壤含有数十亿种不同的微生物，它们彼此共存并与植物共存以形成复杂的共生关系网络。土壤微生物的特定群体是菌根真菌，它们定殖于植物的根并为植物提供土壤中的水和营养物，同时利用植物在光合作用期间产生的有机分子。菌根包括在细胞内定殖于植物根组织的内生菌根真菌和在细胞外定殖于根的外生菌根真菌。

根际中微生物的最佳组合随植物类型以及其生长的土壤类型而变化。没有两种植物物种或区域在根际内具有相同的微生物网络。因此，虽然生物制剂有可能在作物健康和土壤修复中发挥越来越重要的作用，但是由于每种植物的最佳根际微生物组的复杂性和特异性，在许多不同区域处理广泛的植物物种会带来困难。

目前作物生产方法的经济成本以及对健康和环境的不利影响持续加重基于作物的消费品的可持续性的负担。因此，持续需要改进的、无毒的和环保的方法来以低成本提高作物产量。

发明内容

本发明提供了基于微生物的产品，以及在农业应用中使用这些基于微生物的产品的方法。有利地是，本发明的基于微生物的产品和方法是环保、无毒和经济的。

在优选的实施方案中，本发明提供了基于微生物的土壤处理组合物以及这些基于微生物的土壤处理组合物用于通过例如改善根际的营养物和水分保留性质来促进作物植物的健康、生长、产量的方法。有利地是，本发明的土壤处理组合物可改善例如作物健康、生长和/或产量，甚至在作物中植物的一种或多种植物被病原体感染或作物植物的免疫健康以其他方式受损的情况下进行改善。

在一个实施方案中，本发明提供了包含微生物和/或它们的生长副产物的组合的土壤处理组合物。还提供了培养该土壤处理组合物的微生物和/或生长副产物的方法。

在一个实施方案中，该土壤处理组合物包含一种或多种菌根真菌和一种或多种不被归类为菌根真菌的另外的微生物。这些菌根真菌可选自分类群，包括例如，球囊菌属(Glomus)、无柄孢子属(Acaulospora)、丝核菌属(Rhizoctonia)、管柄囊霉属(Funneliformis)、内囊霉属(Endogone)、内养囊霉属(Entrophospora)、巨孢囊霉属(Gigaspora)、硬囊霉属(Sclerocystis)、盾巨孢囊霉属(Scutellospora)、滑锈伞属(Hebeloma)、茹菇属(Lactarius)和鹅膏菌属(Amanita)。

在某些优选的实施方案中，这些菌根真菌是一种内生菌根真菌，包括丛枝菌根、杜鹃类菌根、浆果鹃类菌根、水晶兰类菌根和/或兰科菌根。

在某些实施方案中，该一种或多种另外的微生物是酵母和/或不被表征为菌根真菌的真菌。例如，在一些实施方案中，另外的微生物可以是木霉菌属真菌(Trichodermasp.fungi)和/或异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。

在某些实施方案中，该一种或多种另外的微生物是细菌。例如，在一些实施方案中，这些另外的微生物是芽孢杆菌属细菌(Bacillus spp.bacteria)，诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。在一个具体实施方案中，该芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌NRRL B-67982菌株。

在一个示例性实施方案中，该组合物包含一种或多种菌根真菌、木霉菌属真菌和芽孢杆菌属细菌。在一个具体实施方案中，该木霉菌是哈茨木霉(T.harzianum)，并且该芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌NRRL B-67982。

在优选的实施方案中，该组合物中木霉菌与芽孢杆菌的体积和/或细胞计数比为约1:4。

在一个实施方案中，该组合物还可包含一种或多种另外的有益微生物，诸如，固氮微生物(例如，维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii))、钾动微生物(例如，金黄弗拉特氏菌(Frateuria aurantia))和其他包括例如黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、球拟假丝酵母(Starmerella bombicola)、布拉迪酵母(Saccharomyces boulardii)、西方毕赤酵母(Pichia occidentalis)、库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)和/或季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)。

该组合物中微生物和其他成分的种类和比例可根据例如被处理的植物、植物生长的土壤类型、处理时植物的健康以及其他因素来确定。因此，该组合物可针对任何给定的作物来定制。

本发明土壤处理组合物的微生物可通过小规模至大规模的培养过程获得。这些培养过程包括但不限于深层培养/发酵、固态发酵(SSF)及其变型、混合和/或组合。在优选的实施方案中，使用SSF或其变型培养微生物。

土壤处理组合物可包含发酵剩余的基质和/或纯化的或未纯化的生长副产物，诸如生物表面活性剂、酶和/或其他代谢物。这些微生物可以是活的或无活性的，但是在优选的实施方案中，这些微生物是活的。

优选地，该组合物被配制成用于施用至土壤、种子、整株植物或植物部分(包括但不限于根、块茎、茎、花和叶)。在某些实施方案中，该组合物被配制为例如液体、粉末、颗粒、微颗粒、丸粒、可湿性粉末、可流动粉末、乳液、微胶囊、油或气溶胶。

为了改善或稳定该组合物的效果，如果需要，可将该组合物与合适的佐剂混合，然后原样使用或稀释后使用。在某些实施方案中，该组合物被配制为浓缩液体制剂，或者干粉或干颗粒，该干粉或干颗粒可与水和其他组分混合以形成液体产品。在一个实施方案中，该组合物包含基质、微生物和生长副产物，将它们混合在一起并干燥形成粉末或颗粒。

在一个实施方案中，该组合物可包含葡萄糖(例如，以糖蜜的形式)、甘油、丙三醇和/或其他渗压剂物质，以在储存和运输该干燥产品期间促进渗透压。

在优选的实施方案中，提供了利用本发明的土壤处理组合物促进作物植物的健康、生长和/或产量的方法。在某些实施方案中，该方法包括使该组合物与植物(例如，根)和/或其周围环境(例如，土壤)接触。

在一个示例性实施方案中，该方法包括使一种或多种菌根真菌、木霉菌属真菌和芽孢杆菌属细菌与植物和/或其周围环境接触。在一个具体实施方案中，该木霉菌是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，并且该芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌NRRL B-67982。

在某些实施方案中，这些微生物彼此协同工作以促进作物植物的健康、生长和/或产量。

在一个实施方案中，该方法通过促进根健康和生长而起作用。更具体地，在一个实施方案中，该方法可用于改善植物根生长的根际的性质，例如营养物保留性和/或排水性质。因此，本发明方法也可用于增加植物的营养物摄取。

另外，在一个实施方案中，该方法可用于用一种或多种有益微生物接种植物的根际。例如，在优选的实施方案中，该土壤处理组合物的微生物可定殖于根际并为根在其中生长的植物提供多种益处，包括保护和营养。

有利地是，在某些实施方案中，本发明方法可用于促进由于病原体或环境应激源的感染而具有受损的免疫健康的植物的健康、生长和/或产量。因此，在某些实施方案中，本发明方法还可用于改善植物的免疫健康或免疫应答。

本发明的组合物和方法可单独使用或与其他化合物和/或方法组合使用，以有效地促进植物健康、生长和/或产量，和/或补充第一微生物和第二微生物的生长。例如，在一个实施方案中，该组合物可包括用于促进植物和/或微生物生长的营养物和/或微量营养素以及用于促进微生物生长的益生元，以及/或者可与这些营养物和/或微量营养素和该益生元同时施用。它们确切的材料和量可由受益于本公开的种植者或农业科学家来确定。

这些组合物和方法还可与其他作物管理系统组合使用。在一个实施方案中，该组合物可任选地包含天然和/或化学杀虫剂和/或驱虫剂(诸如与所施用的微生物组合相容的任何已知的商业和/或自制杀虫剂)，或者与它们一起施用。在一些实施方案中，该组合物还可包含例如除草剂、肥料和/或其他相容的土壤改良剂，包括含有营养源(例如，氮-磷-钾(NPK)和/或微量营养素)的商业产品，或者与它们一起施用。

有利地是，本发明可在不向环境中释放大量无机化合物的情况下使用。另外，这些组合物和方法利用可生物降解且毒理学安全的组分。因此，本发明可用作“绿色”土壤处理。

具体实施方式

本发明提供了基于微生物的产品，以及在农业应用中使用这些基于微生物的产品的方法。有利地是，本发明的基于微生物的产品和方法是环保、无毒和经济的。

在优选的实施方案中，本发明提供了基于微生物的土壤处理组合物以及这些基于微生物的土壤处理组合物用于通过例如改善根际的营养物和水分保留性质来促进作物植物的健康、生长和总产量的方法。有利地是，本发明的土壤处理组合物可改善例如作物健康以及作物生长和产量，甚至在作物中植物的一种或多种植物被病原体感染或作物植物的免疫健康以其他方式受损的情况下进行改善。

选择的定义

本发明利用包含“基于微生物的组合物”的土壤处理组合物，这些基于微生物的组合物是包含由于微生物或其他细胞培养物的生长而产生的组分的组合物。因此，这些基于微生物的组合物可包含微生物本身和/或微生物生长的副产物。这些微生物可以营养状态、孢子或分生孢子形式、菌丝形式、任何其他繁殖体形式或者这些形式的混合。这些微生物可以是浮游的或以生物膜形式或者两者的混合。例如，这些生长副产物可为代谢物、细胞膜成分、表达的蛋白质和/或其他细胞成分。这些微生物可以是完整的或裂解的。在优选的实施方案中，这些微生物与它们生长在其中的生长培养基一起存在于基于微生物的组合物中。这些微生物可以例如每克或每毫升组合物至少1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²或1×10¹³或者更高CFU的浓度存在。

本发明还提供了“基于微生物的产品”，这些基于微生物的产品是将在实践中应用以实现期望结果的产品。该基于微生物的产品可仅仅是从微生物培养过程中收获的基于微生物的组合物。另选地，该基于微生物的产品可包含已添加的其他成分。例如，这些附加的成分可包括稳定剂、缓冲剂、合适的载体(诸如水、盐溶液或任何其他合适的载体)、为支持微生物进一步生长而添加的营养物、非营养生长促进剂和/或有助于在其所施用的环境中跟踪微生物和/或组合物的试剂。该基于微生物的产品还可包含基于微生物的组合物的混合物。该基于微生物的产品还可包含基于微生物的组合物的一种或多种组分，已经以某种方式(诸如但不限于过滤、离心、裂解、干燥、纯化等)对该一种或多种组分进行了加工。

如本文所用，“生物膜”是微生物的复杂聚集体，其中细胞彼此粘附和/或粘附到表面。在一些实施方案中，细胞分泌围绕整个聚集体的多糖屏障。生物膜中的细胞在生理学上不同于相同生物体的浮游细胞，这些浮游细胞是可在液体培养基中漂浮或游动的单细胞。

如本文所用，“分离的”或“纯化的”化合物基本上不含与其天然相关的其他化合物(诸如细胞物质)。在微生物菌株的上下文中，“分离的”是指将菌株从其天然存在或在其中产生的环境中取出。分离的菌株可作为例如生物学上纯净的培养物或者孢子或其他形式的繁殖体而存在。

如本文所用，“生物学上纯净的培养物”是已经从与其天然相关或在其中产生的材料中分离的培养物。在一个优选的实施方案中，该培养物已经从所有其他活细胞中分离出来。在进一步优选的实施方案中，与和其他材料结合存在的相同微生物的培养物相比，生物学上纯净的培养物具有有利的特征。例如，这些有利的特征可为，提高了一种或多种生长副产物的产量。

在某些实施方案中，按重量计，纯化的化合物至少是60％的所需化合物。优选地，按重量计，制剂至少是75％(更优选地至少90％，并且最优选地至少99％)的所需化合物。例如，按重量计，纯化的化合物优选为所需化合物的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)的化合物。通过任何合适的标准方法(例如，柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱法(HPLC)分析)测量纯度。

“代谢物”是指由代谢产生的任何物质(例如，生长副产物)或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物的示例包括但不限于生物表面活性剂、生物聚合物、酶、酸、溶剂、醇、蛋白质、维生素、矿物质、微量元素和氨基酸。

本文提供的范围应理解为该范围内的所有值的简写。例如，范围1至20应理解为包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的任何数字、数字组合或子范围以及所有介于上述整数之间的小数值(例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9)。至于子范围，特别考虑了从该范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1至50的嵌套子范围可在一个方向上包括1至10、1至20、1至30和1至40或者在另一个方向上包括50至40、50至30、50至20和50至10。

如本文所用，“减少”是指负变化，并且术语“增加”是指正变化，这些变化中的每种变化至少为1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

如本文所用，“表面活性剂”是指降低两种液体之间、液体和气体之间和/或液体和固体之间的表面张力(或界面张力)的表面活性化合物。表面活性剂用作例如洗涤剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和分散剂。“生物表面活性剂”是由活生物体产生的表面活性分子。

如本文所用，“农业”意指用于食品、纤维、生物燃料、药物、化妆品、补充剂、观赏目的和其他用途的植物、藻类和/或真菌的栽培和育种。根据本发明，农业也可包括园艺学、景观美化、园艺、植物保护、果园栽培和树木栽培。农业中还包括土壤的护理、监测和维护。

所有植物和植物部分都可根据本发明进行处理。在本文中，植物应理解为意指所有植物和植物种群，诸如需要和不需要的野生植物或作物植物(包括天然存在的作物植物)。

如本文所用，“促进”意指改善或增加。例如，促进植物健康意指改善植物的生长和茁壮成长的能力(其包括增加种子发芽、出苗和/或活力)；改善耐移植冲击的能力；改善抵御有害物和/或疾病的能力；改善与杂草竞争的能力；以及改善幸免于环境应激源诸如干旱和/或过度灌溉的能力。

促进植物生长和/或促进植物生物质意指例如增加植物在地上和地下的大小和/或质量(例如增加冠层/叶片体积、芽大小、高度、树干厚度、分枝长度、新枝长度、茎长度、蛋白质含量、根大小/密度和/或总体生长指数)，和/或改善植物达到所需大小和/或质量的能力。

提高产量意指例如通过提高每株植物的果实、叶、根、花、芽、茎、种子、纤维、提取物和/或块茎的量、数量和/或大小以及/或者提高其质量来改善作物中由植物产生的终产物。

如本文所用，“预防”状况或事件或状况或事件的“预防”意指延迟、抑制、压制、阻止和/或最大程度地降低状况或事件的发生、广泛性或发展。预防可包括但不要求无限期、绝对或完全预防，这意味着迹象或征兆仍可能在以后发展。预防可包括减少这种状况或事件发生的广泛性或严重性，和/或抑制状况或事件发展到更广泛或更严重的程度。

如本文所用，在涉及有害物时所使用的术语“控制”意指杀死有害物、使有害物丧失能力、使有害物停止活动或减少有害物的种群数量或者以其他方式使有害物基本上不能繁殖和/或造成伤害。

如本文所用，“有害物”是除人以外的任何生物体，其对人或人所关注的事情(例如，农业、园艺学)是破坏性的、有毒的和/或有害的。在一些但不是所有的情况下，有害物可为致病生物体。有害物可引起感染、侵染和/或疾病或者是感染、侵染和/或疾病的媒介，或者它们可简单地以活组织为食或者对活组织造成其他物理伤害。有害物可为单细胞或多细胞生物体，包括但不限于病毒、真菌、细菌、原生动物、寄生虫和/或线虫。在某些实施方案中，与所需植物竞争资源的杂草或其他入侵植物也被认为是有害物。

如本文所用，“土壤改良剂”或“土壤调节剂”是添加到土壤中以增强土壤物理性质的任何化合物、材料或者化合物或材料的组合。土壤改良剂可包括有机和无机物质，并且还可包括例如肥料、杀虫剂和/或除草剂。营养丰富、排水良好的土壤对于植物的生长和健康是必需的，因此，土壤改良剂可通过改变土壤的营养物和水分含量来促进植物的生长和健康。土壤改良剂也可用于改善土壤的许多不同品质，包括但不限于土壤结构(例如，防止压实)；提高营养物浓度和储存能力；改善干燥土壤的保水性；以及改善渍水土壤的排水性。

如本文所用，“非生物应激源”是指对特定环境中的活生物体具有负面影响的非生物条件。非生物应激源必须对环境产生超出其正常变化范围的影响，以不利地对生物体的群体表现或个体生理机能产生影响。非生物应激源的示例包括但不限于干旱、极端温度、洪水、疾风、自然灾害、土壤pH变化、高辐射、土壤压实、污染等。“生物应激源”是由生物条件，例如动物、植物或微生物有害物引起的应激源。

过渡术语“包括”与“包含”或“含有”同义，是包含性的或开放式的，并且不排除其他未列举的要素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由...组成”排除了权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或步骤以及“那些实质上不影响本要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤”。术语“包括”的使用考虑了“由”或“基本上由”列举的组分组成的其他实施方案。

除非特别说明或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“或者”应理解为包含性的。除非特别说明或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“一”、“一个”和“该”应理解为单数或复数。

除非特别说明或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“大约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。大约可理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。

本文中变量的任何定义中的化学基团列表的描述包括作为任何单个基团或所列基团的组合的变量的定义。本文中变量或方面的实施方案的描述包括作为任何单个实施方案或与任何其他实施方案或其部分组合的实施方案。

本文引用的所有参考文献都通过引用方式整体并入本文。

土壤处理组合物

在一个实施方案中，本发明提供了包含微生物和/或它们的生长副产物的组合的土壤处理组合物。在优选的实施方案中，该土壤处理组合物可用于促进植物，优选地作物植物的健康、生长和/或产量。

有利地是，根据本发明的土壤处理组合物是无毒的，并且可以高浓度施用而不引起例如对人或其他非有害动物的皮肤或消化道的刺激。因此，当在活生物体(诸如种植者和牲畜)存在的情况下施用该基于微生物的组合物时，本发明尤其有用。

在一个实施方案中，本发明提供了包含微生物和/或它们的生长副产物的组合的土壤处理组合物。还提供了培养该土壤处理组合物的微生物和/或生长副产物的方法。

在一个实施方案中，该土壤处理组合物包含一种或多种菌根真菌和一种或多种不被归类为菌根真菌的另外的微生物。

例如，根据本发明有用的微生物可为细菌、酵母和/或真菌的非植物致病菌株。这些微生物可为天然的或转基因微生物。例如，可用特定基因转化微生物以表现出特定的特征。这些微生物也可为所需菌株的突变体。如本文所用，“突变体”意指参照微生物的菌株、遗传变体或亚型，其中与参照微生物相比，突变体具有一种或多种遗传变异(例如，点突变、错义突变、无义突变、缺失、复制、移码突变或重复扩增)。制备突变体的方法是微生物学领域公知的。例如，为此目的广泛采用了UV诱变和亚硝基胍。

如本文所用，“菌根真菌”包括与植物的根形成非寄生菌根关系的任何真菌物种。这些真菌可为外生菌根真菌和/或内生菌根真菌，包括其亚型(例如，丛枝菌根、杜鹃类菌根和兰科菌根)。

根据本发明的菌根真菌的非限制性示例包括属于以下项的种类：球囊菌门、担子菌门、子囊菌门、接合菌门、柔膜菌目和锈革孔菌目以及无柄孢子属(例如高山南芥、巴西曲霉、孔窝无梗囊霉)、鹅膏菌属(例如，毒蝇伞、毒鹅膏)、两性瘤(Amphinema)属(例如，A.byssoides、A.diadema、假芝)、硬皮地星属(例如，A.hygrometricum)、棉状菌属(例如，红蒴真藓)、地生棉状菌(例如，B.terrestris sartoryi、B.terrestris lilacinorosea、B.terrestris aurantiaca、B.terrestris sublutea、B.terrestris parksii)、Cairneyella属(例如，变异藤山柳)、鸡油菌属(例如，鸡油菌、小鸡油菌、朱红鸡油菌、弗瑞氏拟鬼伞)、土生空团菌属(例如，土生空团菌)、角担菌属(例如，喙角担菌)、丝膜菌属(例如，C.austrovenetus、皱盖丝膜菌、紫绒丝膜菌)、内囊霉属(例如，E.Pisiformis)、内养囊霉属(例如，E.colombiana)、管柄囊霉属(例如，摩西管柄囊霉)、Gamarada属(例如，G.debralockiae)、巨孢囊霉属(例如，巨大巨孢囊霉、珠状巨孢囊霉)、球囊菌属(例如，聚丛球囊霉、巴西球囊霉、明球囊霉、沙荒球囊霉、幼套球囊霉、集球囊霉、根内球囊霉、层状球囊霉、大果球囊霉、单孢球囊霉、摩西球囊霉、地表球囊霉)、铆钉菇属(例如，粘铆钉菇)、滑锈伞属(例如，H.cylindrosporum)、齿菌属(例如，卷缘齿菌)、膜盘菌属(例如，H.ericae)、丝盖伞属(例如，I.bongardii、I.sindonia)、乳菇属(例如，稀褶乳菇)、林氏孔菌属(例如，L.brevispora)、黑腹菌属(例如，M.ambiguous)、Meliniomyces属(例如，刺茶美登木)、羊肚菌属、被孢霉属(例如，多头被孢霉)、树粉孢属(例如，O.maius)、类球囊霉属(例如，巴西类球囊霉)、桩菇属(例如，卷边桩菇)、青霉菌属(例如，嗜松青霉、P.thomili)、盘菌属(例如，P.whitei)、Pezoloma属(例如，P.ericae)、脉柄牛肝菌属(例如，P.marginatus)、Piloderma属、豆马勃属(例如，彩色豆马勃)、拟棉革菌属(例如，P.tristis)、丝核菌属、Rhizodermea属(例如，R.veluwensis)、根孢囊霉属(例如，异形根孢囊霉)、须腹菌属(例如，R.luteorubescens、R.pseudoroseolus)、Rhizoscyphus属(例如，R.ericae)、红菇属(例如，R.livescens)、硬囊霉属(例如，S.sinuosum)、硬皮马勃属(例如，光硬皮马勃、疣硬皮马勃)、盾巨孢囊霉(例如，薄翅猪毛菜、异配盾巨孢囊霉)、蜡壳耳属(例如，S.sparassoidea)、Setchelliogaster属(例如，S.tenuipes)、乳牛肝菌属(例如，褐环乳牛肝菌)、亡革菌属(例如，水稻纹枯病菌)、革菌属(例如，疣革菌)、小垫革菌属(例如，T.badia、T.cinereoumbrina、T.erinalis、T.galzinii)、拟小垫革菌属(例如，T.echinospora)、粗糙孔菌属(例如，T.hymenocystis、T.stellulata、T.thelephora)、长毛盘菌属(例如，茂长毛盘菌、束长毛盘菌)、胶膜菌属(例如，美孢胶膜菌)和Tylospora属(例如，T.fibrillose)。

在某些优选的实施方案中，本发明利用内生菌根真菌，包括来自球囊菌门和球囊菌属、巨孢囊霉属、无柄孢子属、硬囊霉属和内养囊霉属的真菌。内生菌根真菌的示例包括但不限于聚丛球囊霉、巴西球囊霉、明球囊霉、沙荒球囊霉、幼套球囊霉、集球囊霉、根内球囊霉(异形根孢囊霉)、层状球囊霉、大果球囊霉、珠状巨孢囊霉、单孢球囊霉、摩西球囊霉(摩西管柄囊霉)、地表球囊霉和异配盾巨孢囊霉以及硬囊霉属。

在某些实施方案中，该一种或多种另外的微生物是酵母和/或不被表征为菌根真菌的真菌，它们包括例如，短梗霉属(例如，出芽短梗霉)、布拉霉属、假丝酵母菌属(例如，蜂生假丝酵母菌、熊蜂生假丝酵母菌和诺达假丝酵母菌)、隐球酵母属、德巴利氏酵母属(例如，汉逊德巴利氏酵母)、虫霉属、有孢汉逊酵母属(例如，葡萄有孢汉逊酵母)、汉逊酵母属、伊萨酵母属、克鲁维酵母属(例如，法弗克鲁维酵母)、须霉属、毕赤酵母属(例如，异常毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、西方毕赤酵母和库德里阿兹威氏毕赤酵母)、侧耳属(例如，糙皮侧耳)、拟酵母属(例如，蚜虫拟酵母)、酵母属(例如，布拉迪酵母、酿酒酵母和圆酵母)、斯塔莫酵母属(例如，球拟假丝酵母)、球拟酵母属、木霉菌属(例如，里氏木霉、哈茨木霉、钩状木霉和绿色木霉)、黑粉菌属(例如，玉米黑粉菌)、威克汉姆酵母属(例如，异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus))、拟威尔酵母属(例如，姆拉克拟威尔酵母)、结合酵母属(例如，拜耳结合酵母)等。

例如，在一些实施方案中，另外的微生物可以是木霉菌属真菌(诸如哈茨木霉)和/或异常威克汉姆酵母。

除了保护植物免受病原体和害虫侵害外，在优选的实施方案中，这些真菌物种的根部定殖可促进根部生长和发育、作物生产力、对非生物胁迫的抗性以及营养物的生物利用率。

在某些实施方案中，这些微生物是细菌，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。这些细菌可以是，例如农杆菌属(例如，放射形农杆菌)、固氮菌属(棕色固氮菌、圆褐固氮菌)、固氮螺菌属(例如，巴西固氮螺菌)、芽孢杆菌属(例如，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、环状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌)、弗拉特氏菌属(例如，金黄弗拉特氏菌)、微杆菌属(例如，产左聚糖微杆菌)、粘细菌(例如，黄色粘球菌、橙色标桩菌、纤维堆囊菌、Minicystis rosea)、泛菌属(例如，成团泛菌)、假单胞菌属(例如，铜绿假单胞菌、绿针假单胞菌金色亚种(Kluyver)、恶臭假单胞菌)、根瘤菌属、红螺菌属(例如，深红红螺菌)、鞘氨醇单胞菌属(例如，少动鞘氨醇单胞菌)和/或氧化硫硫杆菌(Acidothiobacillusthiooxidans)。

在某些实施方案中，这些另外的微生物是芽孢杆菌属细菌，诸如解淀粉芽孢杆菌。在一个具体实施方案中，该芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌NRRL B-67928菌株(“B.amy”)。

解淀粉芽孢杆菌“B.amy”微生物的培养物已经保藏于农业研究服务北方地区研究实验室(NRRL)(1400Independence Ave.,S.W.,Washington,DC,20250,USA)。该保藏物已由保藏机构指定为登记号NRRL B-67928，保藏日期为2020年2月26日。

本发明的培养物已经在一定条件下保藏，这些条件确保在本专利申请未决期间，待授权的专利和商标专员确定的人可以根据37CFR 1.14和35U.S.C 122获得培养物。该保藏物可根据外国专利法的要求在提交本申请的对应物或其后代的国家中获得。然而，应当理解的是，保藏物的可用性不构成在减损政府行为授予的专利权的情况下实践本发明的许可。

此外，将根据《布达佩斯微生物保藏条约》的规定，本发明的培养物保藏物将被储存并向公众开放。即，在最近一次要求提供保藏物样本之后的至少五年的时间内以及任何情况下在保藏日期之后至少30(三十)年的时间内或者在可能发布的公布培养物的任何专利的可实施期限内，应极其小心地储存该培养物保藏物，以保持其存活且未受污染。如果保藏机构因保藏物的状况而无法按要求提供样本，则保藏机构应承认有责任更换保藏物。一旦公开本发明的专利授权，对公众获得本发明的培养物保藏物的所有限制就将被不可撤回地解除。

在一些实施方案中，芽孢杆菌微生物可溶解土壤中的磷化合物。

在某些实施方案中，该微生物是能够固定和/或溶解土壤中的氮、钾、磷和/或其他微量营养素的微生物。

在一个实施方案中，该微生物是固氮微生物或固氮生物，其选自以下项的物种，例如固氮螺菌属、固氮菌属、绿菌科、蓝藻科、弗兰克氏菌属、克雷伯氏菌属、根瘤菌属、木霉菌属和一些古细菌。在一个具体实施方案中，该固氮细菌是维涅兰德固氮菌。

在另一个实施方案中，该微生物是钾动微生物或KMB，其选自例如胶冻样芽孢杆菌或金黄弗拉特氏菌。在一个具体实施方案中，该钾动微生物是金黄弗拉特氏菌。

其他微生物可包括例如绿针假单胞菌、异常威克汉姆酵母、球拟假丝酵母、布拉迪酵母、西方毕赤酵母、库德里阿兹威毕赤酵母和/或季也蒙毕赤酵母。

在一个具体实施方案中，该一种或多种另外的微生物以各自1×10⁷至1×10¹²、1×10⁸至1×10¹¹或1×10⁹至1×10¹⁰CFU/mL的浓度添加。

在一个示例性实施方案中，该组合物包含一种或多种菌根真菌、木霉菌属真菌和芽孢杆菌属细菌。在一个具体实施方案中，该木霉菌是哈茨木霉，并且该芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌NRRL B-67928。

在一个实施方案中，该组合物可包含按重量计1％至99％的木霉菌和按重量计99％至1％的芽孢杆菌。在一些实施方案中，木霉菌与芽孢杆菌的细胞计数比为约1:9至约9:1、约1:8至约8:1、约1:7至约7:1、约1:6至约6:1、约1:5至约5:1或者约1:4至约4:1。

在一个实施方案中，本发明组合物的微生物包含按重量计总组合物的约5％至20％，或约8％至15％，或约10％至12％。

在一个具体实施方案中，该组合物包含约1×10⁶至1×10¹²、1×10⁷至1×10¹¹、1×10⁸至1×10¹⁰或者1×10⁹CFU/mL的菌根真菌。

在一个实施方案中，该组合物包含约1×10⁶至1×10¹²、1×10⁷至1×10¹¹、1×10⁸至1×10¹⁰或者1×10⁹CFU/mL的木霉菌。

在一个实施方案中，该组合物包含约1×10⁶至1×10¹²、1×10⁷至1×10¹¹、1×10⁸至1×10¹⁰或者1×10⁹CFU/mL的芽孢杆菌属。

该组合物中微生物和其他成分的种类和比例可根据例如被处理的植物、植物生长的土壤类型、处理时植物的健康以及其他因素来自定义。

在一个实施方案中，施用于植物和/或其周围环境的微生物组合是针对给定的植物和/或环境所自定义的。有利地是，在一些实施方案中，微生物的组合彼此协同工作以促进植物健康、生长和/或产量。

本发明的微生物和基于微生物的组合物具有许多对促进植物健康、生长和/或产量有用的有益性质。例如，这些组合物可包含由微生物生长产生的产物，诸如生物表面活性剂、蛋白质和/或酶，以纯化的或粗制的形式。

在一个实施方案中，本发明组合物的微生物能够产生生物表面活性剂。在另一个实施方案中，生物表面活性剂可由其他微生物单独产生，并以纯化的形式或以粗制的形式添加到组合物中。粗制形式的生物表面活性剂可包含例如，生物表面活性剂和由培养产生生物表面活性剂的微生物所产生的剩余发酵培养基中的其他细胞生长产物。该粗制形式的生物表面活性剂组合物可包含约0.001％至约90％、约25％至约75％、约30％至约70％、约35％至约65％、约40％至约60％、约45％至约55％或约50％的纯净的生物表面活性剂。

生物表面活性剂形成由多种微生物诸如细菌、真菌和酵母产生的一类重要的次级代谢产物。作为两亲性分子，微生物表面活性剂降低了液体、固体和气体的分子之间的表面和界面张力。此外，根据本发明的生物表面活性剂是可生物降解的，具有低毒性，在溶解和降解土壤中的不可溶性化合物方面是有效的，并且可使用低成本和可再生资源来生产。生物表面活性剂可抑制不良的微生物粘附到多种表面上，防止生物膜的形成，并且可具有强大的乳化和破乳性质。此外，生物表面活性剂还可用于改善润湿性并实现土壤中的肥料、营养物和水的均匀溶解和/或分布。

例如，根据本发明方法的生物表面活性剂可选自例如，低分子量糖脂(例如，槐糖脂、纤维二糖脂质、鼠李糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖脂)、脂肽(例如，表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、关节炎素和地衣素)、黄酮脂、磷脂(例如，心磷脂)和高分子量聚合物(诸如脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物)。

该组合物可包含按重量或体积计0.001％至10％、0.01％至5％、0.05％至2％和/或0.1％至1％浓度的一种或多种生物表面活性剂。

有利地是，根据本发明，土壤处理组合物可包含这些微生物中的每种微生物在其中生长的培养基。该组合物可为例如按重量计，至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％的生长培养基。

发酵培养基可含有活的和/或无活性的培养物、纯化的或粗制形式的生长副产物(诸如生物表面活性剂、酶和/或其他代谢物)和/或任何残留的营养物。例如，按重量计，该组合物中生物质的量可为约0.01％至100％、约1％至90％、约5％至约80％或者约10％至约75％中的任何值。

发酵产物可在进行或不进行提取或纯化的情况下直接使用。如果需要，采用文献中描述的标准提取和/或纯化方法或技术可以很容易地实现提取和纯化。

该土壤处理组合物中的微生物可以活性或非活性形式，或者以营养细胞、生殖孢子、菌丝体、菌丝、分生孢子或任何其他形式的微生物繁殖体的形式。该组合物还可含有这些微生物形式中的任一微生物形式的组合。

在一个实施方案中，不同种类的微生物单独生长，然后混合在一起以产生该土壤处理组合物。在一个实施方案中，可共培养微生物(例如，解淀粉芽孢杆菌和黄色粘球菌)。

在一个实施方案中，该组合物优选地被配制成用于施用至土壤、种子、整株植物或植物部分(包括但不限于根、块茎、茎、秆、芽、花和叶)。在某些实施方案中，该组合物被配制为例如液体、粉末、颗粒、微颗粒、丸粒、可湿性粉末、可流动粉末、乳液、微胶囊、油或气溶胶。

为了改善或稳定该组合物的效果，如果需要，可将该组合物与合适的佐剂混合，然后原样使用或稀释后使用。在优选的实施方案中，该组合物被配制成液体、浓缩液体或者干粉或颗粒，该干粉或颗粒可与水和其他组分混合以形成液体产品。

在一个实施方案中，该组合物可包含葡萄糖(例如，以糖蜜的形式)、甘油和/或丙三醇，可作为渗压剂物质或者作为渗压剂物质的补充，以在储存和运输该干燥产品期间促进渗透压。

这些组合物可单独使用或与其他化合物和/或方法组合使用，以有效地促进植物健康、生长和/或产量，和/或补充第一微生物和第二微生物的生长。例如，在一个实施方案中，该组合物可包括用于促进植物和/或微生物生长的营养物和/或微量营养素(诸如镁、磷酸盐、氮、钾、硒、钙、硫、铁、铜和锌)和/或一种或多种益生元(诸如海带提取物、富里酸、壳多糖、腐殖酸盐和/或腐殖酸)，以及/或者可与这些营养物和/或微量营养素和/或该一种或多种益生元同时施用。它们确切的材料和量可由受益于本公开的种植者或农业科学家来确定。

这些组合物还可与其他农业化合物和/或作物管理系统组合使用。在一个实施方案中，组合物可任选地包含例如，天然和/或化学杀虫剂、驱虫剂、除草剂、肥料、水处理、非离子表面活性剂和/或土壤改良剂，或者与它们一起施用。然而，优选地，该组合物不包含苯菌灵、十二烷基二甲基氯化铵、过氧化氢/过氧乙酸、抑霉唑、丙环唑、戊唑醇或氟菌唑，以及/或者不与它们一起使用。

如果该组合物与相容的化学添加剂混合，则优选地在添加本发明组合物之前用水稀释这些化学品。

可向组合物中添加其他组分(例如，缓冲剂、载体、在相同或不同设施中生产的其他基于微生物的组合物、粘度调节剂、防腐剂、微生物生长的营养物、跟踪剂、灭微生物剂、其他微生物、表面活性剂、乳化剂、润滑剂、溶解度控制剂、pH调节剂、防腐剂、稳定剂和抗紫外光剂)。

该基于微生物的组合物的pH应适合所需的微生物。在一个优选的实施方案中，该组合物的pH为约3.5至7.0、约4.0至6.5或约5.0。

任选地，该组合物可在使用前储存。优选地，储存时间较短。因此，储存时间可小于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在一个优选的实施方案中，如果该产品中存在活细胞，则将该产品储存在较冷的温度(诸如例如低于20℃、15℃、10℃或5℃)下。

然而，该基于微生物的组合物可在不进行进一步稳定、保存和储存的情况下使用。有利地是，这些基于微生物的组合物的直接使用保持了微生物的高活力，降低了外来试剂和不良的微生物造成污染的可能性，并且保持了微生物生长副产物的活性。

在其他实施方案中，考虑到例如预期用途、预期的应用方法、发酵容器的尺寸和从微生物生长设施到使用位置的任何运输模式，可将该组合物(微生物、生长培养基或微生物和培养基)置于适当尺寸的容器中。因此，其中放置了该基于微生物的组合物的容器可以是例如1品脱至1000加仑或更大。在某些实施方案中，这些容器是1加仑、2加仑、5加仑、25加仑或更大。

根据本发明的微生物的生长

本发明利用了用于培养微生物和制备微生物代谢物和/或其他微生物生长副产物的方法。本发明还利用了适于按所需规模培养微生物和制备微生物代谢产物的培养过程。这些培养过程包括但不限于深层培养/发酵、固态发酵(SSF)及其变型、混合和/或组合。

如本文所用，“发酵”是指在受控条件下培养或生长细胞。该生长可以是好氧的或厌氧的。在优选的实施方案中，使用SSF和/或其改变的形式培养微生物。

在一个实施方案中，本发明提供了用于制备生物质(例如，活细胞材料)、细胞外代谢物(例如，小分子和分泌的蛋白质)、残余营养物和/或细胞内组分(例如，酶和其他蛋白质)的材料和方法。

根据本发明采用的微生物生长容器可为任何工业用发酵罐或培养反应器。在一个实施方案中，该容器可具有功能性调节装置/传感器或者可与功能性调节装置/传感器连接以测量培养过程中的重要因素(诸如pH、氧气、压力、温度、湿度、微生物密度和/或代谢物浓度)。

在另一个实施方案中，该容器还能够监测容器内微生物的生长(例如，测量细胞数量和生长期)。另选地，可从容器中取出每日样本，并通过本领域已知的技术(诸如稀释平板涂布技术)进行计数。稀释平板涂布是用于估计样品中的生物体的数量的简单技术。该技术还可提供一个指数，通过该指数可比较不同的环境或处理。

在一个实施方案中，该方法包括在培养过程中补充氮源。例如，氮源可为硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素和/或氯化铵。这些氮源可单独使用或两种或两种以上组合使用。

该方法可对生长中的培养物进行充氧。一个实施方案利用空气的慢动作来去除包括含氧量低的空气并引入充氧空气。在深层发酵的情况下，充氧空气可为通过机构每天补充的环境空气，该机构包括用于机械搅动液体的叶轮以及用于向液体供应气泡以将氧气溶解到液体中的曝气器。

该方法还可包括在培养过程中补充碳源。碳源通常是碳水化合物(诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露醇和/或麦芽糖)、有机酸(诸如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和/或丙酮酸)、醇(诸如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和/或甘油)和脂肪和油(诸如大豆油、芥花油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油和/或亚麻籽油)等等。这些碳源可单独使用或两种或两种以上组合使用。

在一个实施方案中，培养基中含有微生物的生长因子和微量营养物。当培育不能产生它们需要的维生素中的所有维生素的微生物时，这尤其是优选的。培养基中还可含有无机营养物，包括微量元素(诸如铁、锌、铜、锰、钼和/或钴)。此外，维生素、必需氨基酸和微量元素的来源可例如以面粉或粗粉(诸如玉米粉)的形式或提取物(诸如酵母提取物、马铃薯提取物、牛肉提取物、大豆提取物和香蕉皮提取物)的形式等或者以纯化的形式包含在内。还可含有氨基酸，例如那些用于蛋白质生物合成的氨基酸。

在一个实施方案中，还可含有无机盐。可使用的无机盐可为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、氯化钙、氯化钠、碳酸钙和/或碳酸钠。这些无机盐可单独使用或两种或两种以上组合使用。

在一些实施方案中，培养方法还可包括在培养过程之前和/或期间在培养基中加入其他的酸和/或抗菌剂。抗菌剂或抗生素用于保护培养物免受污染。

另外，还可添加消泡剂以防止在深层培养期间形成和/或积聚泡沫。

混合物的pH应适合所需的微生物。缓冲剂和pH调节剂(诸如碳酸盐和磷酸盐)可用于将pH稳定在优选的值附近。当存在高浓度金属离子时，可能需要在培养基中使用螯合剂。

微生物可以浮游形式或作为生物膜生长。在生物膜的情况下，容器内可具有基质，微生物可在该基质上以生物膜状态生长。该系统还可具有例如施加刺激(诸如剪切应力)的能力，该刺激可促进和/或改善生物膜生长特性。

在一个实施方案中，在约5℃至约100℃(优选地15℃至60℃，更优选地25℃至50℃)下实施该用于培养微生物的方法。在另一个实施方案中，可在恒温下连续进行培养。在另一个实施方案中，培养过程中可改变温度。

在一个实施方案中，该方法和培养过程中使用的设备是无菌的。培养设备(诸如反应器/容器)可与灭菌装置(例如，高压灭菌器)分开，但与之相连。培养设备还可具有在开始接种之前进行原位灭菌的灭菌单元。可通过本领域已知的方法对空气进行灭菌。例如，环境空气在被引入容器之前可穿过至少一个过滤器。在其他实施方案中，可对培养基进行巴氏灭菌，或者任选地根本不进行加热，其中可利用低水活度和低pH来控制不需要的细菌生长。

在一个实施方案中，本发明还提供了一种用于通过在适于生长和代谢物产生的条件下培养本发明的微生物菌株来制备微生物代谢物(诸如例如生物表面活性剂、酶、蛋白质、乙醇、乳酸、β-葡聚糖、肽、代谢中间物、多不饱和脂肪酸和脂质)和任选地纯化代谢物的方法。例如，通过该方法产生的代谢物含量可为至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

由所需的微生物产生的微生物生长副产物可保留在微生物中或分泌到生长培养基中。该培养基可含有稳定微生物生长副产物活性的化合物。

例如，发酵培养基的生物质含量可为5g/L至180g/L或更高或者10g/L至150g/L。

例如，细胞浓度可为至少1×10⁶至1×10¹²、1×10⁷至1×10¹¹、1×10⁸至1×10¹⁰或1×10⁹CFU/mL。

用于培养微生物和制备微生物副产物的方法和设备可分批、准连续或连续进行。

在一个实施方案中，在培养完成时(例如，在例如达到所需的细胞密度或特定代谢物的密度时)去除所有微生物培养组合物。在这个分批过程中，在收获第一批次时，开始一个全新的批次。

在另一个实施方案中，在任一时间仅去除一部分发酵产物。在该实施方案中，具有活细胞、孢子、分生孢子、菌丝和/或菌丝体的生物质作为新培养批次的接种剂保留在容器中。被取出的组合物可为无细胞培养基或者含有细胞、孢子或其他生殖繁殖体和/或其组合。这样，产生了准连续系统。

有利地是，该方法不需要复杂的设备或很高的能量消耗。所需的微生物可小规模或大规模地就地培养和利用，甚至仍与它们的培养基混合在一起。

有利地是，该基于微生物的产品可在远程位置产生。微生物生长设施可通过利用例如太阳能、风能和/或水力发电而离网运行。

基于微生物的产品的生产

本发明的一种基于微生物的产品仅仅是含有微生物和/或由微生物产生的微生物代谢产物和/或任何残留营养物的发酵培养基。发酵产物可在不进行提取或纯化的情况下直接使用。如果需要，采用文献中描述的标准提取和/或纯化方法或技术可以很容易地实现提取和纯化。

该基于微生物的产品中的微生物可以活性或非活性形式，或者以营养细胞、生殖孢子、分生孢子、菌丝体、菌丝或任何其他形式的微生物繁殖体的形式。该基于微生物的产品还可含有任何这些形式的微生物的组合。

在一个实施方案中，不同的微生物菌株单独生长，然后混合在一起以产生该基于微生物的产品。微生物可任选地与它们生长在其中的培养基混合，并在混合前干燥。

在一个实施方案中，不同菌株未混合在一起，而是作为单独的基于微生物的产品施用于植物和/或其环境。

该基于微生物的产品可在不进行进一步稳定、保存和储存的情况下使用。有利地是，这些基于微生物的产品的直接使用保持了微生物的高活力，降低了外来试剂和不良的微生物造成污染的可能性，并且保持了微生物生长副产物的活性。

在从生长容器收获该基于微生物的组合物时，可在将收获的产物放置到容器中或以其他方式运输以供使用时添加另外的组分。例如，这些添加剂可为缓冲剂、载体、在相同或不同设施中制备的其他基于微生物的组合物、粘度调节剂、防腐剂、微生物生长营养物、表面活性剂、乳化剂、润滑剂、溶解度控制剂、跟踪剂、溶剂、抗微生物剂、抗生素、pH调节剂、螯合剂、稳定剂、抗紫外光剂、其他微生物以及常用于此类制剂的其他合适的添加剂。

在一个实施方案中，可添加缓冲剂，包括有机酸和氨基酸或它们的盐。合适的缓冲剂包括柠檬酸盐、葡糖酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、乳酸盐、草酸盐、天冬氨酸盐、丙二酸盐、葡庚糖酸盐、丙酮酸盐、半乳糖二酸盐、葡糖二酸盐、丙醇二酸盐、谷氨酸盐、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、半胱氨酸、精氨酸以及它们的混合物。也可采用磷酸和亚磷酸或它们的盐。合成缓冲剂适合使用，但优选地使用天然缓冲剂(诸如上面列出的有机酸和氨基酸或它们的盐)。

在另一个实施方案中，pH调节剂包括氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾或碳酸氢钾、盐酸、硝酸、硫酸或混合物。

该基于微生物的组合物的pH应适合所需的微生物。在一个优选的实施方案中，该组合物的pH为约3.5至7.0、约4.0至6.5或约5.0。

在一个实施方案中，制剂中可包含另外的组分，诸如盐(诸如碳酸氢钠或碳酸钠、硫酸钠、磷酸钠、磷酸二氢钠)的水性制剂。

在某些实施方案中，可将粘附物质添加到组合物中以延长产品与植物部分的粘附。可使用聚合物(诸如带电荷的聚合物)或多糖基物质(例如，黄原胶、瓜尔胶、果聚糖、木聚糖、结冷胶、凝胶多糖、支链淀粉、葡聚糖等)。

在优选的实施方案中，商品级黄原胶用作粘附剂。树胶的浓度应基于商业产品中树胶的含量进行选择。如果黄原胶是高纯度的，则0.001％(w/v-黄原胶/溶液)就足够了。

在一个实施方案中，可将葡萄糖、甘油和/或甘油配制品添加到该基于微生物的产品中，以在储存和运输期间用作例如渗压剂。在一个实施方案中，可含有糖蜜。

在一个实施方案中，益生元可添加到该基于微生物的产品中和/或与该基于微生物的产品同时施加，以促进微生物生长。例如，合适的益生元包括海带提取物、富里酸、壳多糖、腐殖酸盐和/或腐殖酸。在一个具体实施方案中，益生元的施用量为约0.1L/英亩至约0.5L/英亩，或约0.2L/英亩至约0.4L/英亩。

任选地，该产品可在使用前储存。优选地，储存时间较短。因此，储存时间可小于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在一个优选的实施方案中，如果该产品中存在活细胞，则将该产品储存在较冷的温度(诸如例如低于20℃、15℃、10℃或5℃)下。

基于微生物的产品的本地生产

在本发明的某些实施方案中，微生物生长设施按所需规模制备新鲜的高密度微生物和/或所需的微生物生长副产物。微生物生长设施可位于施用地点或其附近。该设施以分批、准连续或连续培养的方式制备高密度的基于微生物的组合物。

本发明的微生物生长设施可位于将使用基于微生物的产品的位置(例如，柑橘园)。例如，微生物生长设施可距离使用位置不到300、250、200、150、100、75、50、25、15、10、5、3或1英里。

因为基于微生物的产品可在不借助于传统微生物制备的微生物稳定、保存、储存和运输过程的情况下在本地产生，所以可产生密度高得多的微生物，从而在现场应用中可用到体积更小的基于微生物的产品，或者在必要时允许密度高得多的微生物应用，以实现期望的功效。这允许生物反应器按比例缩小(例如，较小的发酵容器和更少的起始材料、营养物和pH控制剂的供应)，这使得该系统效率很高，并且可不再需要对细胞进行稳定或将细胞从其培养基分离出来。基于微生物的产品的本地生产也有助于将生长培养基包含在产品中。培养基可含有在发酵期间产生的尤其适合本地使用的试剂。

本地制备的高密度健壮微生物培养物在现场比那些在供应链中停留了一段时间的微生物培养物更有效。本发明的基于微生物的产品与传统产品相比尤其有利，在传统产品中，细胞已经与发酵生长培养基中存在的代谢物和营养物分离。运输时间的缩短实现了按照本地需求所要求的时间和体积生产和交付新鲜批次的微生物和/或其代谢物。

本发明的微生物生长设施制备新鲜的基于微生物的组合物，该基于微生物的组合物包含微生物本身、微生物代谢物和/或微生物在其中生长的培养基的其他组分。如果需要，该组合物可具有高密度的营养细胞或繁殖体或者营养细胞和繁殖体的混合物。

有利地是，该组合物可定制用于特定的场所。在一个实施方案中，微生物生长设施位于将使用该基于微生物的产品的地点(例如，柑橘园)或其附近。

有利地是，这些微生物生长设施提供了一种针对当前依赖于远距离的工业规模生产者的问题的解决方案。由于上游加工延迟、供应链瓶颈、不适当的储存和妨碍了例如活的高细胞计数产品和细胞最初生长于其中的相关培养基和代谢物的及时交付和施用的其他意外事件，这些生产者的产品质量受到影响。

微生物生长设施能够定制基于微生物的产品，以提高与目的地区的协同作用，从而提供了制造的灵活性。有利地是，在优选的实施方案中，本发明的系统利用天然存在的本地微生物及其代谢副产物的力量来改善农业生产。

单个容器的培养时间可为例如1至7天或更长。培养产物可以许多不同方式中的任一种方式收获。

在例如发酵24小时的时间内进行本地生产和交付可得到纯净的高细胞密度组合物并显著降低运输成本。考虑到在开发更有效和更强大的微生物接种剂方面的快速发展前景，消费者将从这种快速交付基于微生物的产品的能力中受益匪浅。

促进植物健康、生长和/或产量的方法

在优选的实施方案中，提供了用于促进植物健康、生长和/或产量的方法，其中将根据本发明的土壤处理组合物施用于植物和/或其周围环境。在一些实施方案中，根据本发明方法处理多个植物和/或它们的周围环境。

如本文所用，植物的“周围环境”意指植物生长的土壤和/或其他介质，该周围环境可包括根际。在某些实施方案中，周围环境不延伸超过例如距离植物至少5英里、1英里、1000英尺、500英尺、300英尺、100英尺、10英尺、8英尺或6英尺的半径。

在具体实施方案中，该方法可包括将一种或多种菌根真菌和一种或多种不被表征为菌根真菌的另外的微生物施用于植物和/或其环境。

在一个实施方案中，分开培养土壤处理组合物的单个微生物物种，然后组合以产生一种土壤处理组合物。在一个实施方案中，单个微生物没有混合在一起为一种产品，而是作为单独的处理施用于植物和/或其环境。这些单独的处理优选地是同时的，或者在时间上彼此之间在24小时内、12小时内或6小时内。

为了改善或稳定处理组合物的效果，如果需要，可将该组合物与合适的佐剂混合，然后原样使用或在稀释后使用。在优选的实施方案中，组合物被配制成干粉或颗粒，该干粉或颗粒可与水和其他组分混合以形成液体产品。

在一些实施方案中，该方法还包括在施用期间施用具有该组合物的材料(例如，促进微生物生长的营养物和/或益生元)以促进微生物生长。在一个实施方案中，营养源可包括例如氮、钾、磷、镁、蛋白质、维生素和/或碳的来源。在一个实施方案中，益生元可包括例如海带提取物、富里酸、壳多糖、腐殖酸盐和/或腐殖酸。

在一个实施方案中，该方法通过促进根健康和生长而起作用。更具体地，在一个实施方案中，该方法可用于改善植物根生长的根际的性质，例如营养物和/或水分保留性质。因此，这些方法也可用于增加植物的营养物摄取。

另外，在一个实施方案中，该方法可用于用一种或多种有益微生物接种根际。例如，在优选的实施方案中，该土壤处理组合物的微生物可定殖于根际并为根在其中生长的植物提供多种益处，包括保护和营养。

有利地是，在一个实施方案中，本发明方法可用于促进由于病原体或环境应激源(诸如例如，干旱)的感染而具有受损的免疫健康的植物的健康、生长和/或产量。因此，在某些实施方案中，本发明方法还可用于改善植物的免疫健康或免疫应答。

如本文所用，“施用”组合物或产品是指使组合物或产品与靶标或部位接触，使得该组合物或产品可对该靶标或部位产生作用。该作用可以是由于例如微生物生长和/或与植物的相互作用，以及代谢物、酶、生物表面活性剂或其他微生物生长副产物的作用。施用还可包括用组合物“处理”靶标或部位。

施用还可包括使基于微生物的产品直接与植物、植物部分和/或植物的周围环境(例如，土壤或根际)接触。微生物产品可作为种子处理物施用，或施用于土壤表面，或施用于植物或植物部分的表面(例如，施用于根、块茎、茎、花、叶、果实或花的表面)。它可作为液体、干粉、粉尘、颗粒、微颗粒、丸粒、可湿性粉末、可流动粉末、乳液、微胶囊、油、凝胶、糊剂或气溶胶进行喷雾、倾倒、喷洒、注射或铺洒。

在一个具体实施方案中，使该组合物与植物的一个或多个根接触。该组合物可例如通过喷雾或浸泡根直接施用于根，以及/或者例如通过将该组合物施用于植物生长的土壤(例如，根际)间接施用。该组合物可在种植之前或种植时施用于植物的种子，或施用于植物的任何其他部分和/或其周围环境。

在某些实施方案中，本文提供的组合物在没有机械掺入的情况下施用于土壤表面。土壤施用的有益效果可通过降雨、洒水、洪水或滴灌来激活，并且随后递送至例如植物的根。

植物和/或它们的环境可在栽培植物的过程中的任何时间点进行处理。例如，可在将种子种植于土壤中之前、同时或之后将土壤处理组合物施用于土壤。也可在此后植物发育和生长期间的任何时间点(包括在植物开花、结果时，以及在叶子脱落期间和/或之后)施用该土壤处理组合物。

在一个实施方案中，该方法可用于大规模农业环境。该方法可包括将土壤处理组合物施用于连接到灌溉系统的罐中，该灌溉系统用于向作物、果园或田地提供水、肥料或其他液体组合物。因此，植物和/或植物周围的土壤可用土壤处理组合物经由例如土壤注射、土壤灌注或使用中心枢轴灌溉系统进行处理，或用在种子犁沟上的喷雾器进行处理，或用喷洒器或滴灌器进行处理。有利地是，该方法适于一次处理数百英亩的作物、果园或田地。

在一个实施方案中，该方法可用于较小规模环境，诸如家庭花园或温室。在这种情况下，该方法可包括使用手持式草坪和花园喷雾器向植物和/或其周围环境喷洒土壤处理组合物。该组合物可与水混合，并且任选地与其他草坪和花园处理剂诸如肥料和杀虫剂混合。该组合物也可在标准的手持式喷壶中混合并倾倒在土壤上。

在一个实施方案中，本发明还可用于改善土壤的一种或多种品质，从而提高土壤用于农业、家庭和园艺目的性能。

在某些实施方案中，也可施用土壤处理组合物以促进植物的根和/或根际以及维管系统的定殖，以增强植物健康和活力。因此，可促进固定营养物的微生物，以及促进作物生长、健康和/或产量的其他有益的内源和外源微生物和/或它们的副产物。

在一个实施方案中，该方法可用于增强有益分子穿透根细胞外层。

本发明可用于改善任何类型的土壤(例如，粘土、沙土、淤泥、泥炭、白垩质、壤质土和/或它们的组合)的任何数量的品质。此外，这些方法和组合物可用于改善干燥、渍水、多孔、贫瘠、压实土壤和/或它们的组合的品质。

在一个实施方案中，该方法可用于改善渍水土壤的排水性和/或散水性。在一个实施方案中，该方法可用于改善干燥土壤的保水性。

在一个实施方案中，该方法可用于改善多孔和/或贫瘠土壤的营养物保留性。

在一个实施方案中，该方法控制病原性细菌本身。在一个实施方案中，该方法通过增强植物的免疫健康以增加避免感染的能力而起作用。

在另一个实施方案中，该方法控制可能作为病原性细菌的载体或携带者的有害物，诸如苍蝇、蚜虫、蚂蚁、甲虫和粉虱。因此，本发明方法可通过控制(例如，杀死)这些携带者有害物来防止植物病原性细菌的传播。

基于微生物的产品可单独使用或与用于有效促进植物健康、生长和/或产量的其他化合物，以及用于有效处理和防止植物病原性有害物的其他化合物组合使用。例如，该方法可与用于促进植物和/或微生物生长的营养物和/或微量营养素(诸如镁、磷酸盐、氮、钾、硒、钙、硫、铁、铜和锌)的来源和/或一种或多种益生元(诸如海带提取物、富里酸、壳多糖、腐殖酸盐和/或腐殖酸)同时使用。它们确切的材料和量可由受益于本公开的种植者或农业科学家来确定。

这些组合物还可与其他农业化合物和/或作物管理系统组合使用。在一个实施方案中，组合物可任选地包含例如，天然和/或化学杀虫剂、驱虫剂、除草剂、肥料、水处理、非离子表面活性剂和/或土壤改良剂，以及/或者与它们一起施用。

在一个实施方案中，本发明组合物与表征为以下项的农业化合物相容使用：防垢剂，诸如羟基亚乙基二膦酸；

杀菌剂，诸如硫酸链霉素和/或

(放射形农杆菌菌株K84)；

抗微生物剂，诸如二氧化氯、二癸基二甲基氯化铵、卤化杂环和/或过氧化氢/过氧乙酸；

肥料，诸如N-P-K肥料、硝酸铵钙17-0-0、硫代硫酸钾、氮(例如，10-34-0、KuglerKQ-XRN、Kugler KS-178C、Kugler KS-2075、Kugler LS 6-24-6S、UN 28、UN 32)和/或钾；

杀真菌剂，诸如百菌清、代森锰锌六亚甲基四胺、三氧化二铝、嘧菌酯、芽孢杆菌属(例如，地衣芽孢杆菌菌株3086，枯草芽孢杆菌菌株QST 713)、苯菌灵、啶酰菌胺、唑菌胺酯、克菌丹、萎锈灵、地茂散、百菌清、硫酸铜、氰霜唑、氯硝胺、烯酰吗啉，土菌灵、甲基硫菌灵、咪唑菌酮、氯苯嘧啶醇、咯菌腈、氟啶酰菌胺、氟酰胺、异菌脲、代森锰锌、代森锰、甲霜灵、咯菌腈、甲霜灵、甲霜灵、腈菌唑、氟噻唑吡乙酮、五氯硝基苯(五氯硝基苯)、磷酸、霜霉威、敌稗、唑菌胺酯、Reynoutria sachalinensis、链霉菌属(例如，灰绿链霉菌菌株K61、利迪链霉菌WYEC 108)、硫、尿素、噻苯咪唑、甲基硫菌灵、福美双、三唑酮、三唑醇和/或乙烯菌核利；

生长调节剂，诸如嘧啶醇、矮壮素、二氨基叠氮化物、多效唑和/或烯效唑；

除草剂，诸如草甘膦、乙氧氟草醚和/或二甲戊乐灵；

杀虫剂，诸如乙酰甲胺磷、印楝素、苏云金芽孢杆菌(例如，以色列亚种菌株AM 65-52)、球孢白僵菌(例如，菌株GHA)、西维因、毒死蜱、氰虫酰胺、环丙氨嗪、三氯杀螨醇、二嗪农、呋虫胺、吡虫啉、玫烟色棒束孢(例如，Apopka菌株97)、林丹和/或马拉硫磷；

水处理物，诸如过氧化氢(30％至35％)、膦酸(5％至20％)和/或亚氯酸钠；

以及糖脂、脂肽、避蚊胺、硅藻土、香茅、精油、矿物油、大蒜提取物、辣椒提取物和/或任何已知的商业和/或自制杀虫剂，这些杀虫剂受益于本公开的技术人员确定其是相容的。

优选地，这些组合物不包含以下化合物和/或不与以下化合物同时施用，或在以下化合物施用之前或之后7天至10天内施用：苯菌灵、十二烷基二甲基氯化铵、过氧化氢/过氧乙酸、抑霉唑、丙环唑、戊唑醇或氟菌唑。

在某些实施方案中，这些组合物和方法可用于增强其他化合物的效力，例如通过促进杀虫化合物渗透到植物或有害物中，或增强营养物对植物根部的生物利用度。基于微生物的产品还可用于补充其他处理，例如抗生素处理。有利地是，本发明有助于减少为了有效治疗和/或预防细菌感染而必须施用至作物或植物的抗生素的量。

在一个实施方案中，与在未处理的环境中生长的植物相比，根据本发明的方法和组合物导致以下项中的一者或多者的增加：植物的根质量、茎直径、植物高度、冠层密度、叶绿素含量、花数、芽大小、芽密度、叶表面积和/或营养物摄取，增加了至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多。

在某些实施方案中，与未处理的作物相比，根据本发明的方法和组合物导致作物产量(例如，芽数增加、纤维材料增加、种子数增加、总干物质增加)的增加，增加了至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多。

在一个实施方案中，与在未处理的环境中生长的植物相比，根据本发明的方法和组合物导致植物上或植物周围环境中的有害物数量的减少，减少了至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多。

在一个实施方案中，与在未处理环境中生长的植物相比，根据本发明的方法和组合物将由有害物引起的对植物的损害减少了约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多。

靶植物

如本文所用，术语“植物”包括但不限于任何类型的木本、观赏或装饰物种、作物或谷类、水果植物或蔬菜植物、花或树、大型藻类或微藻类、浮游植物和光合藻类(例如，绿藻莱茵衣藻)。“植物”还包括单细胞植物(例如，微藻类)和大量分化成在植物发育的任何阶段存在的群体(例如，团藻)或结构的多个植物细胞。这样的结构包括但不限于果实、种子、新枝、茎、叶、根、花瓣等。植物可以是独立的，例如在花园中，或者可以是许多植物中的一者，例如作为果园、作物或牧场的一部分。

如本文所用，“作物植物”是指任何种类的植物或藻类，为人类、动物或水生生物体的盈利和/或生计而种植，或被人类使用(例如，纺织品、化妆品和/或药物生产)，或被人类观赏以获得乐趣(例如，在景观美化或花园中的花或灌木)，或用于工业、商业或教育的任何植物或藻类或其部分。作物植物可以是通过传统的育种和优化方法或通过生物技术和重组方法或这些方法的组合而获得的植物，包括转基因植物和植物变种。

可受益于本发明的产品和方法的施用的作物植物的类型包括但不限于：行作物(例如，玉米、大豆、高粱、花生、马铃薯等)、大田作物(例如，苜蓿、小麦、谷物等)、树作物(例如，核桃、杏仁、山核桃、榛子、开心果等)、柑橘作物(例如，橙子、柠檬、葡萄柚等)、水果作物(例如，苹果、梨、草莓、蓝莓、黑莓等)、草皮作物(例如，sod)、观赏植物作物(例如，花、藤等)、蔬菜(例如，番茄、胡萝卜等)、藤本作物(例如，葡萄等)、林业(例如，松树、云杉、桉树、杨树等)、牧场(用于供养放牧动物的植物的任何混合物)。

本发明适用的植物的另外的示例包括但不限于，谷类和草(例如，小麦、大麦、黑麦、燕麦、稻、玉米、高粱、玉米)、甜菜(例如，糖或饲料甜菜)；水果(例如，葡萄、草莓、树莓、黑莓、梨果类水果、核果、软果、苹果、梨、李子、桃、杏仁、樱桃或浆果)；豆科作物(例如，菜豆、小扁豆、豌豆或大豆)；油料作物(例如，油菜、芥菜、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻、可可或花生)；葫芦科植物(例如，南瓜、黄瓜、南瓜或甜瓜)；纤维植物(例如，棉花、亚麻、大麻或黄麻)；柑橘类水果(例如，橙子、柠檬、葡萄柚或红桔)；蔬菜(例如，菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、番茄、马铃薯或柿子椒)；樟科(例如，鳄梨、樟或樟脑)；以及烟草、坚果、药草、香料、药用植物、咖啡、茄子、甘蔗、茶、胡椒、葡萄藤、啤酒花、车前草科、胶乳植物、切花和观赏植物。

在某些实施方案中，作物植物是柑橘植物。根据本发明的柑橘植物的示例包括但不限于，橙子树、柠檬树、酸橙树和葡萄柚树。其他示例包括柚子(Citrus maxima)、枸橼(Citrus medica)、大翼橙(Citrus micrantha)、橘(Citrus reticulata)、葡萄柚(Citrusparadisi)、金桔(Citrus japonica)、澳洲手指青柠(Citrus australasica)、澳洲圆青柠(Citrus australis)、澳洲沙漠青柠(Citrus glauca)、沙石青柠((Mount White Lime)、卡卡杜青柠或汉普蒂杜青柠(Citrus gracilis)、罗素河青柠(Citrus inodora)、新几内亚野生青柠(Citrus warburgiana)、布朗河手指青柠(Citrus wintersii)、马来西亚卡丹沙柠檬/马来西亚克杜克拉柠檬(Citrus halimii)、印度野橘(Citrus indica)、马蜂橙(Citrusmacroptera)和凯西大翼橙(Citrus latipes)、墨西哥青柠(Citrus x aurantiifolia)、苦橙(Citrus x aurantium)、波斯青柠(Citrus x latifolia)、柠檬(Citrus x limon)、黎檬(Citrus x limonia)、甜橙(Citrus x sinensis)、瓯柑(Citrus x tangerina)、帝王柠檬、橘柚、橙柚、橘橙、金诺橘、清见橙、明尼橘柚、白金葡萄柚、丑橘、佛手柑、枸橼、香柠檬、血橙、四季橘、克莱门氏小柑橘、梅尔柠檬和香橙。

在一些实施方案中，作物植物是柑橘植物的亲缘植物，诸如月橘、香吉果和枸橘(Citrus trifolata)。

靶植物的其他示例包括属于植物界超家族的所有植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，它们包括饲料或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、选自以下项的树或灌木：槭属、猕猴桃属、秋葵属、龙舌兰、冰草属、匍匐翦股颖、葱属、苋属、海滨草、菠萝、番荔枝属、旱芹、落花生属、桂木属、芦笋、燕麦属(例如，燕麦、野燕麦、红燕麦、野燕麦变种燕麦、杂种燕麦)、杨桃、簕竹属、冬瓜、巴西坚果、甜菜、芸苔属(例如，欧洲油菜、芸苔亚种[canola、oilseedrape、turnip rape])、Cadaba farinosa、茶树、美人蕉、大麻、辣椒属、苔草、番木瓜、大花假虎刺、山核桃属、红花、栗属、吉贝、菊苣、樟属、西瓜、柑橘属、椰属、咖啡属、芋头、可乐果属、黄麻属、芫荽、榛属、山楂属、藏红花、南瓜属、黄瓜属、菜蓟属、野胡萝卜、山蚂蝗属、龙眼、薯蓣属、柿树属、稗属、油棕属(例如，油棕、美洲油棕)、

子、苔麸、蔗茅属、枇杷、桉属、红果仔、荞麦属、水青冈属、苇状羊茅、无花果、金橘属、草莓属、银杏、大豆属(例如，大豆、Sojahispida或Soja max)、陆地棉、向日葵属(例如，向日葵)、萱草、木槿属、大麦属(例如，大麦)、番薯、胡桃属、莴苣、香豌豆属、兵豆、亚麻、荔枝、莲属、棱角丝瓜、羽扇豆属、地杨梅、番茄属(例如，番茄、L.lycopersicum、梨形番茄)、硬皮豆属、苹果属、针叶樱桃、马米杏、芒果、木薯属、人心果、紫花苜蓿、草木犀属、薄荷属、中国芒、苦瓜属、黑桑、芭蕉属、烟草属、木犀榄属、仙人掌属、鸟爪豆属、稻属(例如，水稻、阔叶稻)、黍、柳枝稷、西番莲、欧防风、狼尾草属、鳄梨属、香芹、虉草、菜豆属、梯牧草、刺葵属、芦苇草、酸浆属、松属、开心果、豌豆属、早熟禾属、杨属、牧豆树属、李属、番石榴属、石榴、西洋梨、栎属、萝卜、波叶大黄、茶藨子属、蓖麻、悬钩子属、甘蔗属、柳属、接骨木属、黑麦、芝麻属、欧白芥属、茄属(例如，马铃薯、红茄或番茄)、高粱、菠菜属、蒲桃属、万寿菊属、酸豆、可可、车轴草属、指状加拿草、小黑麦、小麦属(例如，普通小麦、硬粒小麦、圆锥小麦、T.hybernum、莫迦小麦、T.sativum、一粒小麦或小麦胚芽)、金莲花、旱金莲、越橘属、蚕豆属、豇豆属、香堇菜、葡萄属、玉米、沼生菰、枣属。

靶植物还可包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属(例如，欧洲油菜、芸苔、芥菜)，特别是用作种子油来源的那些芸苔属，苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱属(二色高粱、高梁)、粟(例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、粟(Panicum miliaceum)、狗尾粟(Setaria italica)、

子(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(海岛棉、陆地棉)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(咖啡属)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘树(柑橘属)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(芭蕉属)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Oleaeuropaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamiaintegrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗属)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

靶蔬菜植物包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，Lactucasativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(山黧豆属)和黄瓜属的成员诸如黄瓜(C.sativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃类属)、绣球花(Macrophylla hydrangea)、芙蓉花(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(蔷薇属)、郁金香(郁金香属)、水仙花(水仙属)、矮牵牛(Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。可用于实施这些实施方案的针叶树包括，例如，松树，诸如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和孟德松(Pinusradiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西部铁杉(Tsuga canadensis)；云杉(Piceaglauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；真冷杉，诸如银冷杉(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)；和雪松，诸如西部红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。这些实施方案的植物包括作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)，诸如玉米和大豆植物。

靶草皮草包括但不限于：一年生早熟禾(Poa annua)、一年生黑麦草(Loliummultiflorum)、加拿大早熟禾(Poa compressa)、紫羊茅(Festuca rubra)、细弱剪股颖(Agrostis tenuis)、匍匐翦股颖(Agrostis palustris)、沙生冰草(Agropyrondesertorum)、冰草(Agropyron cristatum)、硬羊茅(Festuca longifolia)、草地早熟禾(Poa pratensis)、鸭茅(Dactylis glomerate)、多年生黑麦草(Lolium perenne)、红羊茅(Festuca rubra)、小糠草(Agrostis alba)、粗早熟禾(Poa trivialis)、羊羊茅(Festucaovine)、无芒雀麦草(Bromus inermis)、高羊茅(Festuca arundinacea)、梯牧草(Phleumpretense)、绒毛剪股颖(Agrostis canine)、碱茅(Puccinellia distans)、蓝茎冰草(Agropyron smithii)、狗牙草(狗牙根属)、奧古斯丁草(Stenotaphrum secundatum)、结缕草(结缕草属)、百喜草(Paspalum notatum)、地毯草(Axonopus affinis)、假俭草(Eremochloa ophiuroides)、铺地狼尾草(Pennisetum clandesinum)、海雀稗(Paspalumvaginatum)、格兰马草(Bouteloua gracilis)、野牛草(Buchloe dactyloids)、垂穗草(Bouteloua curtipendula)。

其他所需植物包括提供所需种子的谷类植物、油料种子植物和豆科植物。所需的种子包括谷物种子，诸如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦、小米等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

其他所需植物包括大麻(例如，寻常大麻、印度大麻和莠草大麻)和工业大麻。

所有植物和植物部分都可根据本发明进行处理。在本文中，植物应理解为意指所有植物和植物种群，诸如需要和不需要的野生植物或作物植物(包括天然存在的作物植物)。作物植物可以是通过传统的育种和优化方法或通过生物技术和重组方法或这些方法的组合而获得的植物，包括转基因植物和植物变种。

植物部分应理解为意指植物的所有地上和地下部分和器官，诸如新枝、叶、花和根，可提及的示例是叶、针叶、秆、茎、花、果实体、果实和种子，以及根、块茎和根茎。植物部分还包括作物材料和无性与有性繁殖材料，例如扦插、块茎、根茎、切片和种子。

在一些实施方案中，植物是被病原性疾病或有害物感染的植物。在具体的实施方案中，植物感染有柑橘绿化病和/或柑橘溃疡病，以及/或者被携带这些疾病的有害物感染。

温室气体减少

在一个实施方案中，该方法可用于减少大气温室气体(例如，二氧化碳、甲烷、一氧化二氮以及它们的前体)，包括从土壤中排放的温室气体和由于农业实践而产生的温室气体。例如，这可通过提高作物中的植物碳利用和储存、增加土壤中的碳隔离、减少土壤GHG排放、改进农业氮基施肥实践、改进氮利用效率、改进水利用效率、改进土壤微生物群中的生物多样性并改进农业土壤管理来实现。

在某些实施方案中，提高植物碳利用和/或储存可以例如植物叶子增加、茎和/或树干直径增加、根生长提高和/或每单位面积植物数量增加的形式。

在某些实施方案中，增加土壤碳隔离可以例如植物根生长(例如，长度和密度)增加、微生物对植物分泌的GHG前体/有机化合物(包括来自植物根的分泌物)的摄取增加和土壤微生物定殖增加(导致土壤微生物质增加)的形式。

在一些实施方案中，减少土壤GHG排放包括减少从土壤中排放的甲烷、二氧化碳和/或一氧化二氮/它们的前体的量。例如，在一些实施方案中，这可通过降低水胁迫和/或增加植物的水利用效率来实现。例如，充足的土壤水分导致降低土壤温度以及增加营养物向植物的运输，这两者都有助于降低导致GHG排放的土壤呼吸，并降低土壤中的游离GHG前体分子。另外，在一些示例性实施方案中，这些方法可促进水在土壤中的流动，从而防止淹没和积水，这可能导致土壤的脱氧并促进厌氧产甲烷微生物的生长。

在某些实施方案中，改进的农业施肥实践、改进的氮利用效率、改进的土壤生物多样性和/或改进的土壤管理可以用一种或多种有益微生物接种植物根际的形式。例如，在优选的实施方案中，土壤处理组合物的微生物可定殖于根际并为根在其中生长的植物提供多种益处，包括保护、水合和营养。这些微生物可产生代谢物，诸如两亲性分子或生物表面活性剂，它们例如有助于促进营养物和水转移到根细胞中。因此，这些方法可替代或减少使用产生一氧化二氮前体(诸如氮和氨)的富氮肥料、杀虫剂和/或其他土壤改良剂。

有利地是，在一些实施方案中，这些方法可用于生产碳足迹减少的植物基产品，包括食品、饮料、纺织品、健康、化妆品、制药和建筑工业中的产品。

实施例

从以下通过举例说明的方式给出的实施例中，可更好地理解本发明及其许多优点。以下实施例说明了本发明的一些方法、应用、实施方案和变型。它们不应被认为是对本发明的限制。可对本发明进行许多改变和修改。

实施例1——芽孢杆菌属微生物的固态发酵

对于芽孢杆菌属孢子生产，采用麦麸基培养基。将培养基以约1英寸至2英寸的厚度铺在不锈钢盘上并灭菌。

灭菌后，将种子培养物接种在不锈钢盘中。任选地，可包括添加的营养物以促进微生物生长，包括例如盐和/或碳源，诸如糖蜜、淀粉、葡萄糖和蔗糖。为了提高生长速度和提高细菌在整个培养基中的运动性和分布，可向培养物中添加马铃薯提取物或香蕉皮提取物。

然后将所选芽孢杆菌菌株的孢子喷洒或移液管转移到基质表面上，并将盘子在32℃至40℃之间培育。将环境空气泵送通过烘箱以稳定温度。培养48小时至72小时可产生1×10¹⁰个菌株孢子/克或更多。

实施例2——真菌孢子的固态发酵

为了培育木霉菌属，将250g碱法烹制(nixtamilized)的玉米粉与去离子水混合，并在不锈钢盘中灭菌，用盖子和盘带密封。通过喷雾或移液将木霉菌种子培养物无菌接种到玉米粉培养基中。然后将盘在30℃下温育10天。10天后，可收获约10⁹繁殖体/克或更多的木霉菌。从一批收获的木霉菌繁殖体(分生孢子和/或菌丝)可处理例如1000英亩至2000英亩的土地。

实施例3——基于微生物的产品的制备

可将使用实施例1和2中所述的方法产生的微生物、基质和任何残留营养物混合和/或微粉化并干燥，以形成颗粒或粉末物质。分别生产不同的微生物菌株，然后在干燥之前或之后混合在一起。

可密封的小袋可用于储存和运输含有10⁹个细胞/g的哈茨木霉和10¹⁰个细胞/g的解淀粉芽孢杆菌的混合物的产品。可将微量营养素或类似产生的其他微生物添加到产品中。

为了准备使用，将干燥的产品溶解在水中。浓度可达到至少5×10⁹至5×10¹⁰个细胞/mL。然后在混合槽中用水将产品稀释至1×10⁶至1×10⁷个细胞/mL的浓度。

一袋可用于处理约20英亩的作物或10英亩的柑橘林。该组合物可以例如每英亩3盎司至6盎司的比率来施用。

该组合物可与一种或多种菌根真菌一起施用。例如，在一个研究中，将来自TERI(印度)的包含八种不同内生菌根真菌菌株的产品以5g/英亩的量与上述示例性组合物联合施用，从而导致玉米产量比种植者的实践增加41％。

该组合物可与另外的“起始物”材料混合以及/或者与它们同时施用，以促进组合物中微生物的初始生长。这些起始物材料可包括例如益生元和/或纳米肥料(例如，Aqua-Yield,NanoGro^TM)。

起始组合物的一个示例性制剂包含：

可溶性钾碱(K₂O)(1.0％至2.5％，或约2.0％)

镁(Mg)(0.25％至0.75％，或约0.5％)

硫(S)(2.5％至3.0％，或约2.7％)

硼(B)(0.01％至0.05％，或约0.02％)

铁(Fe)(0.25％至0.75％，或约0.5％)

锰(Mn)(0.25％至0.75％，或约0.5％)

锌(Zn)(0.25％至0.75％，或约0.5％)

腐殖酸(8％至12％，或约10％)

海带提取物(5％至10％，或约6％)

水(70％至85％，或约77％至80％)。

将微生物接种物和/或任选的促进生长的“起始物”材料与水在灌溉系统罐中混合并施用至土壤。

实施例4——微生物菌株

本发明利用有益的微生物菌株。哈茨木霉菌株可包括但不限于，T-315(ATCC20671)、T-35(ATCC 20691)、1295-7(ATCC 20846)、1295-22[T-22](ATCC 20847)、1295-74(ATCC 20848)、1295-106(ATCC 20873)、T12(ATCC 56678)、WT-6(ATCC 52443)、Rifa T-77(CMI CC 333646)、T-95(60850)、T12m(ATCC 20737)、SK-55(No.13327、BP 4326NIBH(日本))、RR17Bc(ATCC PTA 9708)、TSHTH20-1(ATCC PTA 10317)、AB 63-3(ATCC 18647)、OMZ779(ATCC 201359)、WC 47695(ATCC 201575)、m5(ATCC 201645)、(ATCC 204065)、UPM-29(ATCC 204075)、T-39(EPA 119200)和/或F11Bab(ATCC PTA 9709)。

解淀粉芽孢杆菌菌株可包括但不限于，NRRL B-67928、FZB24(EPA 72098-5、BGSC10A6)、TA208、NJN-6、N2-4、N3-8，以及具有ATCC登录号23842、23844、23843、23845、23350(菌株DSM 7)、27505、31592、49763、53495、700385、BAA-390、PTA-7544、PTA-7545、PTA-7546、PTA-7549、PTA-7791、PTA-5819、PTA-7542、PTA-7790和/或PTA-7541的那些菌株。

Claims (27)

1.一种土壤处理组合物，所述土壤处理组合物包含一种或多种菌根真菌和一种或多种不被表征为菌根真菌的另外的微生物，所述一种或多种另外的微生物选自哈茨木霉、异常威克汉姆酵母和解淀粉芽孢杆菌。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种菌根真菌选自属于以下属的真菌：球囊菌属、巨孢囊霉属、无柄孢子属、硬囊霉属和内养囊霉属。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述解淀粉芽孢杆菌是菌株NRRL B-67928。

4.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物包含所述一种或多种菌根真菌、哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌NRRL B-67928。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述组合物包含细胞计数比为1:4的哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌NRRL B-67928。

6.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含葡萄糖、甘油和丙三醇中的一者或多者。

7.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含选自海带提取物、富里酸、壳多糖、腐殖酸盐和腐殖酸的一种或多种益生元。

8.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物被配制为干粉或干颗粒。

9.一种促进植物健康、生长和/或产量的方法，其中所述方法包括向所述植物的环境施用根据权利要求1所述的组合物。

10.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括施用营养物和/或益生元用于微生物生长。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述木霉菌属真菌是哈茨木霉。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述芽孢杆菌属细菌是解淀粉芽孢杆菌。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述芽孢杆菌属细菌是解淀粉芽孢杆菌亚种绿木霉。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述组合物与所述植物的根直接接触。

15.根据权利要求9所述的方法，其中所述组合物与所述植物生长在其中的土壤接触。

16.根据权利要求9所述的方法，其中在施用前将所述组合物与水混合。

17.根据权利要求9所述的方法，其中使用灌溉系统将所述组合物施用于所述植物和/或其周围环境。

18.根据权利要求9所述的方法，其中将所述组合物与选自氮、磷和钾的一种或多种营养物的来源一起施用于所述植物和/或其周围环境。

19.根据权利要求9所述的方法，其中将所述组合物与选自海带提取物、富里酸、壳多糖、腐殖酸盐和腐殖酸的益生元同时施用于所述植物和/或其周围环境。

20.根据权利要求9所述的方法，其中所述组合物与苯菌灵、十二烷基二甲基氯化铵、过氧化氢/过氧乙酸、抑霉唑、丙环唑、戊唑醇或氟菌唑同时施用于所述植物和/或其周围环境，或在其施用之前或之后7天至10天内施用于所述植物和/或其周围环境。

21.根据权利要求9所述的方法，所述方法用于改善土壤的一种或多种品质。

22.根据权利要求21所述的方法，所述方法用于改善干燥土壤的保水性。

23.根据权利要求21所述的方法，所述方法用于改善渍水土壤的排水性和/或散水性。

24.根据权利要求21所述的方法，所述方法用于改善贫瘠土壤的营养物保留性。

25.根据权利要求9所述的方法，所述方法用于增强植物根的营养物吸收性。

26.根据权利要求9所述的方法，其中使用手持式草坪和花园喷雾器将所述组合物喷洒到所述植物和/或其周围环境上。

27.根据权利要求9所述的方法，其中所述组合物使用固态发酵产生。