CN116157159A - 使用结构域外-b纤连蛋白靶向探针的诊断和监测 - Google Patents

使用结构域外-b纤连蛋白靶向探针的诊断和监测 Download PDF

Info

Publication number
CN116157159A
CN116157159A CN202180056784.8A CN202180056784A CN116157159A CN 116157159 A CN116157159 A CN 116157159A CN 202180056784 A CN202180056784 A CN 202180056784A CN 116157159 A CN116157159 A CN 116157159A
Authority
CN
China
Prior art keywords
edb
cells
seq
tumor
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180056784.8A
Other languages
English (en)
Inventor
卢峥嵘
纳迪亚·阿亚特
瑞安·哈尔
阿米塔·M·维迪雅
彼得·乔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Case Western Reserve University
Original Assignee
Case Western Reserve University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Case Western Reserve University filed Critical Case Western Reserve University
Publication of CN116157159A publication Critical patent/CN116157159A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)

Abstract

本申请描述了一种检测受试者中耐药癌症的方法。该方法包括使受试者的组织与有效量的分子探针接触，检测组织中存在的分子探针的量，将检测到的分子探针的量与对照值进行比较，以及如果组织中存在的所述分子探针的量高于所述对照值，则检测到所述受试者的耐药癌症。所述分子探针包括下式：P‑L‑C，其中P为EDB‑FN靶向肽，C为造影剂；以及L为将所述肽共价连接到所述造影剂的非肽接头。本申请还描述了监测耐药癌症治疗的方法。

Description

使用结构域外-B纤连蛋白靶向探针的诊断和监测
政府资助
本发明是在美国国立卫生研究院授予的CA211762和CA194518的政府支持下完成的。政府对本发明拥有某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月4日提交的美国临时申请No.63/034,520和2021年4月5日提交的美国临时申请No.63,170,746的优先权，这两个申请通过引用并入本文中。
序列表
本申请包含经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并在此通过引用整体并入本文中。所述ASCII副本创建于2021年3月31日，名为CWR-029593WO ORD_ST25.txt，大小为7841个字节。
背景技术
癌症是美国男性和女性的第二大常见死因。准确的癌症早期诊断对于启动精确的、个性化的治疗干预措施以及改善被诊断为该疾病的患者的生存和生活质量至关重要。尽管在早期阶段可以通过化疗和手术治疗，但多药耐药的发展会导致复发和远处转移，这是无法治愈的。在治疗方案的早期对疗效进行准确的无创评估，能够潜在地提高癌症的存活率并降低护理成本。虽然血液标志物和PET-CT、MRI和超声波等成像方式通常用于疾病的诊断和评估，但它们无法区分耐药肿瘤和敏感肿瘤。
结构域外-B纤连蛋白(EDB-FN)是纤连蛋白的癌胚胎亚型。这种细胞外基质癌蛋白在包括结直肠癌在内的多种肿瘤中显著上调，并与上皮间质转化(EMT)、癌细胞干、增殖、血管生成、以及转移相关，所有这些都反映了肿瘤的侵袭性。临床研究表明，EDB-FN存在于肺癌、脑癌、结直肠癌和卵巢癌患者中。EDB-FN的过度表达也与乳腺肿瘤的组织学分级和口腔癌患者的生存率差相关，表明其作为多发性肿瘤的标志物的潜在作用。
另一层复杂性是，即使在同一种癌症类型中，EDB-FN表达谱也是不同的，并且对细胞或组织的分子和功能特征具有特异性。例如，使用EDB-FN-特异性肽探针ZD2-Cy5.5，本发明人先前表明，侵入性癌细胞系，例如PC3(前列腺)和MDA-MB-231(激素受体阴性乳腺癌)富含EDB-FN，而侵入性较小的癌细胞系，例如LNCaP(前列腺)和MCF7(激素受体阳性乳腺癌)显示出显著较低的EDB-FN水平。利用EDB-FN的这种差异表达，使用EDB-FN-靶向的MRI造影剂，特别是MT218[ZD2-N3-Gd(HP-DO3A)]，从无创异种移植物中差别地诊断侵入性前列腺癌和乳腺癌肿瘤。然而，仍然需要对耐药进行无创评估，监测治疗反应，并积极监测耐药癌症。
发明内容
发明人已经确定EDB-FN在高侵入性耐药结直肠癌(CRC)细胞和肿瘤中过度表达。因此，采用MT218进行的EDB-FN的MRMI可以促进耐药CRC异种移植模型的有效无创检测和差别诊断。此外，用MT218进行的MRMI还可用于监测靶向药物(包括MK2206.HCl、紫杉醇等)对耐药CRC肿瘤的治疗效果。
在一个方面，本发明提供了一种检测受试者的耐药癌症的方法。该方法包括以下步骤：使受试者的组织与有效量的包含式P-L-C的分子探针接触，其中：P为包含选自以下组的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEID NO:8和SEQ ID NO:9；C为造影剂；和L为将所述肽共价连接到所述造影剂的非肽接头，所述接头包括与所述肽的胺形成甲酰胺的羧酸、或与所述肽的半胱氨酸残基形成硫酯键的马来酰亚胺、或与所述肽的半胱氨酸残基形成硫酯的马来酰亚胺，检测所述组织中存在的所述分子探针的量，将检测到的所述分子探针的量与对照值进行比较，以及如果所述组织中存在的所述分子探针的量高于所述对照值，则检测到所述受试者中的耐药癌症。
在另一方面，本发明提供了一种监测耐药癌症治疗的方法。该方法包括以下步骤：使接受耐药癌症治疗的受试者的组织第一次与有效量的包含式P-L-C的分子探针接触，其中：P为包含选自以下组的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；C为造影剂；以及L为将所述肽共价连接到所述造影剂的非肽接头，所述接头包括与所述肽的胺形成甲酰胺的羧酸、或与所述肽的半胱氨酸残基形成硫酯键的马来酰亚胺、或与所述肽的半胱氨酸残基形成硫酯的马来酰亚胺；检测所述组织中存在的所述分子探针的第一量；使所述受试者的组织第二次与有效量的包含式P-L-C的分子探针接触；检测所述组织中存在的所述分子探针的第二量；以及比较所述分子探针的所述第一量和所述第二量以监测所述受试者的耐药癌症治疗。
在一些实施方式中，所述癌症为乳腺癌、口腔癌、胰腺癌或前列腺癌。在另外的实施方式中，在体内接触所述组织。在额外的实施方式中，所述耐药癌症正在用化疗剂进行治疗。
在一些实施方式中，所述分子探针为磁共振成像剂。在额外的实施方式中，所述分子探针的非肽接头为非肽脂族或杂脂族接头。在另外的实施方式中，所述分子探针的非肽接头在共价连接所述肽和所述造影剂时包括亚烷基二甲酰胺。
在一些实施方式中，所述分子探针的造影剂包括金属螯合剂或金属富勒烯中的至少一种。在另外的实施方式中，所述分子探针的造影剂包括含有以下中的至少一种的金属螯合剂：二乙烯三胺五乙酸盐(DTPA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷四乙酸盐(DOTA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7-三乙酸盐(DO3A)及其衍生物、乙二胺四乙酸盐(EDTA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂环十三烷四乙酸(TRITA)及其衍生物、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷四甲基乙酸盐(DOTMA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7-三甲基乙酸盐(DO3MA)及其衍生物、N,N',N”,N”'-四磷酰基甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DOTP)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基甲基膦酸)(DOTMP)及其衍生物、1,4,7,10-四氧杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基苯基膦酸)及其衍生物、或N,N'-亚乙基二-L-半胱氨酸及其衍生物。
在一些实施方式中，所述分子探针具有下式：
Figure BDA0004113382920000031
Figure BDA0004113382920000041
其中：P1为具有选自以下组的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9；L1为任选的间隔物；L2为所述肽P1的氨基或所述间隔物；以及M为选自以下组的金属：Gd+3、Eu+3、Tm+3、Dy+3、Yb+3、Mn+2、Fe+3、55Co、64Cu、67Cu、47Sc、66Ga、68Ga、90Y、97Ru、99mTc、111h、109Pd、153Sm、177Lu、186Re和188Re；或它们的盐。
在另外的实施方式中，L1包含以下中的至少一种：聚环氧烷、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙基醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、或聚氰基丙烯酸酯。
附图说明
包含在本说明书中并构成本说明书一部分的附图说明了本发明的一些实施方式，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
图1A-1H提供的图像显示，获得性的耐药性增强了CRC细胞的迁移和侵袭。A.通过亲本DLD1细胞具有对5’-FU的获得性耐药性的DLD1-DR细胞中2D单层和3D肿瘤球状体培养物的形态学变化。B.通过亲本RKO细胞具有对5’-FU和CB-839的获得性耐药性的RKO-DR细胞中2D单层和3D肿瘤球状体培养物的形态学改变。分别使用蛋白质印迹和qRT-PCR的在蛋白质和mRNA水平上的C.D.DLD1-DR和E.F.RKO-DR细胞中耐药标志物蛋白MDR1的表达增加和EMT标志物N-cad和E-cad的水平改变。蛋白质印迹条带强度标准化为肌动蛋白对照，以及蛋白水平的变化表示为敏感性与耐性的比率，与各自的的泳道相邻。与亲本细胞相比，使用transwell测定法测量耐药G.DLD1-DR和H.RKO-DR细胞中增加的通过基质胶的侵袭和迁移。细胞用0.1％结晶紫染色。条形图显示平均值±sem。使用未配对t检验，*p<0.05。比例尺＝100μm。
图2A-2F提供的图表和图像显示获得的耐药与CRC细胞中EDB-FN表达相关。在3D基质凝胶中培养的CRC细胞用EDB-FN-特异性肽探针ZD2-Cy5.5和核染色剂Hoechst染色。收获在2D单层培养物中生长的CRC细胞用于RNA提取和mRNA表达的qRT-PCR分析。与DLD-1细胞相比，耐药DLD1-DR细胞表现出：A.ZD2-Cy5.5结合增加，B.EDB-FN和C.FN1的mRNA水平提高3倍。与RKO细胞相比，耐药RKO-DR细胞表现出：D.ZD2-Cy5.5结合增加，E.EDB-FN和F.FN1的mRNA水平提高4倍和1.5倍。条形图显示平均值±sem。使用未配对t检验，*p<0.05。比例尺＝100μm(100x)和50μm(200x)。
图3A-3J提供的图表和图像显示使用MT218的EDB-FN的造影增强的MRMI有助于无创评估CRC肿瘤的耐药性。在CRC异种移植小鼠中注射40μmol/kg剂量的MT218之前和之后(25分钟)获得了T1加权FSE冠状和轴向图像。MRI的代表性冠状和轴向图像显示与非耐药DLD-1和RKO肿瘤相比，A-B.DLD1-DR和C-D.RKO-DR肿瘤的稳固的信号增强(白色箭头：肿瘤)。耐药E-F.DLD1-DR和G-H.RKO-DR肿瘤分别展现出对于DLD-1和RKO肿瘤明显较高的CNR。(n＝每组5只小鼠)。条形表示平均值±sem，点表示单个小鼠CNR。使用未配对t检验，*p<0.05。解剖后组织学显示出低分化的通过H&E的有丝分裂活性细胞，以及在耐药I.DLD1-DR和J.RKO-DR肿瘤切片中比其各自的非耐药对应物更强的抗-EDB-FN抗体G4的染色(红色和黑色箭头分别表示肿瘤细胞和成纤维细胞中的EDB-FN)。
图4A-4C提供的图表显示耐药DLD1-DR荷瘤小鼠中治疗方案的时间线和治疗效果的无创监测。A.将耐药DLD1-DR肿瘤皮下植入无胸腺nu/nu雌性小鼠的侧腹。每周用游标卡尺监测肿瘤体积。当肿瘤体积达到100mm3时，在第1周进行使用MT218的针对EDB-FN的基线MRMI。将小鼠随机分为DMSO处理的“载体”组和MK2206处理的“处理”组。在第4周，进行使用MT218的针对EDB-FN的终点MRMI，并终止实验。B.各组的平均肿瘤体积从第1周增加到第4周。C.从第1周到第4周，载体组和治疗组的单个小鼠(编号为TM1-TM10)的肿瘤体积逐渐增加(n＝每组5只小鼠)。条形表示平均值±sem，点表示单个小鼠的肿瘤体积。使用未配对t检验，*p<0.05。
图5A-5E提供的图表和图像显示使用MT218的EDB-FN的MRMI有助于对携带耐药CRC肿瘤的载体治疗小鼠的无创治疗监测。在用DMSO处理的DLD1 DR小鼠中，用40μmol/kg剂量的MT218在A.基线(第1周)和B.终点(第4周)进行的MRMI的T1加权2D自旋回波轴向图像(TM：载体组中的单个小鼠的编号)。在注射MT218之前和注射后25分钟拍摄图像。C.绘制的第1周和第4周的单个小鼠的CNR。D.载体组的平均CNR在第1周到第4周没有显著变化。E.第4周后进行的尸检组织学显示了较差分化的DLD1-DR肿瘤切片。抗EDB-FN抗体G4的免疫组织化学显示TM3的染色比TM10更强(n＝每组5只小鼠)。条形表示平均值±sem，点表示单个小鼠的肿瘤体积。使用未配对t检验，*p<0.05。
图6A-6E提供的图表和图像显示使用MT218的EDB-FN的MRMI有助于MK2206HCl处理的携带耐药CRC肿瘤的小鼠的无创治疗监测。在用100mg/kg MK2206 HCl处理的DLD1 DR小鼠中，用40μmol/kg剂量的MT218在A.基线(第1周)和B.终点(第4周)对进行的MRMI的T1加权2D自旋回波轴向图像(TM：载体组中的单个小鼠的编号)。在注射MT218之前和注射后25分钟拍摄图像。C.绘制的第1周和第4周的单个小鼠的CNR。D.治疗组的平均CNR从第1周到第4周显著增加。E.第4周后进行的尸检组织学显示了较差分化的DLD1-DR肿瘤切片。抗EDB FN抗体G4的免疫组织化学显示TM7的染色比TM9更强(n＝每组5只小鼠)。条形表示平均值±sem，点表示单个小鼠的肿瘤体积。使用未配对t检验，*p<0.05。
图7A-7F提供的图表和图像显示EDB-FN在人类结肠腺癌中过度表达，且与不良生存率相关。使用EDB-FN特异性抗体G4的免疫组织化学染色显示，来自A.未治疗患者和B.治疗患者的代表性原发性结肠腺癌组织中EDB-FN表达强烈，但在相应的正常相邻组织(NAT)中EDB-FN表达则忽略不计。代表性转移性肝脏标本的免疫组织化学染色显示，C.未治疗患者和D.治疗的患者中EDB-FN表达不同，相应的正常相邻肝组织(NAT)中则无表达。黑色和红色箭头分别表示成纤维细胞和肿瘤细胞。Kaplan-Meier曲线表明，高EDB-FN水平与结肠腺癌患者的E.不良总生存率(OS)和F.不良无进展生存率(PFS)相关(使用对数秩检验，即Mantel-Cox检验，OS的危险比*p＝0.018和*p＝0.02，PFS的危险比*p＝0.025和*p＝0.028)。
图8A-8H提供的图表和图像显示浸润性乳腺癌中EDB-FN的过度表达。A.对来自TCGA和GTEx数据库的患者数据进行的差异基因表达分析显示，与正常乳腺组织试样(Nor，n＝291)相比，乳腺肿瘤试样(BRCA，n＝1084)中EDB-FN同种型(ENST00000432072.6)显著过度表达。方框图表示每百万值的log2(TPM+1)转录物和四分位数范围的中位数，使用方差分析，*p＝6.57e-69。B.Kaplan-Meier曲线显示EDB-FN表达的乳腺癌患者的总体生存分析(*p<0.05；使用对数秩检验，即Mantel-Cox检验，危险比的*p＝0.022)。C.原发性乳腺肿瘤中EDB-FN的免疫组织化学染色模式显示成纤维细胞(绿色)、癌细胞(紫色)和肿瘤基质(红色)中的表达。与正常邻近组织(NAT)、E.淋巴结转移和F.肺和脑转移相比，在患者1和2的D.乳腺肿瘤中观察到强烈的EDB-FN染色。与激素受体阳性MCF7细胞相比，G.qRT-PCR分析显示三阴性MDA-MB-468、BT549、MDA-MB-231和Hs578T细胞中EDB-FN mRNA水平显著升高。采用18S表达作为标准。条形表示平均值±sem(n＝3)。使用Kruskal-Wallis检验，**p＝0.0013。H.通过transwell测定法比较乳腺癌细胞系不同亚型的侵袭潜能。EDB-FN过度表达三阴性癌细胞比EDB-FN低的MCF7细胞更具侵入性，其通过Matrigel涂层的transwell inserts侵袭的结晶紫染色的细胞数量增加得到证明。
图9A-9E提供的图像显示TGF-β治疗和耐药的乳腺癌细胞中改变的特征和增强的迁移。将MCF7和MDA-MB-468细胞在5ng/mL TGF-β中培养7至15天，分别获得MCF7-TGF-β和MDA-MB-468-TGF-β细胞。分别通过诱导对500nM帕博西尼(Palbociclib)和100nM紫杉醇的耐药性获得MCF7-DR和MDA-MB-468-DR细胞。A.在2D培养中，与它们的亲本系相比，MCF7-TGFβ和MCF7-DR细胞显示出明显的形态学变化，具有更多的间充质表型，而MDA-MB-468-TGFβ和MDA-MB-468-DR细胞没有显示出可见的形态学变化。B.在3D基质凝胶培养物中，与它们各自的亲本细胞相比，MCF7-TGFβ和MCF7-DR细胞显示出形成球状体的能力增强，而MDA-MB-468-TGFβ和MDA-MB-468-DR细胞形成类似的增殖网络。EMT标记物的蛋白质印迹分析显示与亲本MCF7和MDA-MB-468细胞相比，E-cadherin、N-cadherin和Slug分别在C.MCF7-TGFβ和MCF7-DR以及D.MDA-MB-468-TGFβ和MDA-MB-468-DR细胞中的蛋白表达。E.transwell测定法显示TGF-β处理的耐药MCF7和MDA-MB-468细胞的更高的侵袭潜力，其通过结晶紫染色的迁移细胞的数量增加得到证明。比例尺＝100μm。
图10A-10F提供的图表和图像显示TGF-β处理的耐药乳腺癌细胞中增加的EDB-FN表达。A.乳腺癌细胞3D培养的ZD2-Cy5.5染色显示，与亲本MCF7和MDA-MB-468细胞相比，EDB-FN表达分别在A.MCF7-TGF-β和MCF7-DR以及B.MDA-MB-468-TGF-β和MDA-MB-468-DR细胞中显著增加。与EDB-FN结合的ZD2肽在FIJI中被量化为ZD2-Cy5.5的像素强度与Hoechst的像素强度之比，显示与亲本MCF7和MDA-MB-468细胞相比，C.MCF7-TGF-β和MCF7-DR以及D.MDA-MB-468-TGF-β和MDA-MB-468-DR细胞中提高的EDB-FN水平。条形表示平均值±sem，点表示独立的重复样本。使用Mann-Whitney U检验，*p＜0.05。qRT-PCR分析显示，与亲本MCF7和MDA-MB-468细胞相比，EDB-FN分别在E.MCF7-TGFβ和MCF7-DR以及F.MDA-MB-468-TGFβ和MDA-MB-468-DR细胞中显著上调的mRNA表达。点表示来自3个独立实验的3个技术样本，线为平均值±sem。使用Mann-Whitney U检验，*p<0.05。比例尺＝100μm。
图11A-11H提供的图表和图像显示侵入性TGF-β处理的耐药乳腺癌细胞中AKT的治疗性消融减少了其侵袭和EDB-FN的过度表达。A.TGF-β处理和耐药性上调了MCF7和MDA-MB-468细胞中磷酸化AKT信号传导和SRp55的磷酸化。B.用AKT抑制剂MK2206-HCl(对于MCF7细胞为2μM，对于MDA-MB-468细胞为4μM)处理细胞2天，结果抑制了侵入性乳腺癌细胞系中的磷酸化AKT的信号传导。MK2206-HCl介导的磷酸化AKT信号传导的耗竭降低了SRp55的上调，这表明SRp55在包含EDB-FN外显子中的潜在作用。MK2206-HCl对磷酸化AKT信号传导的抑制表明，侵入性C.MCF7和D.MDA-MB-468细胞衍生物的侵入潜力降低，以及EDB-FN在E.和F.mRNA水平以及G.和H.3D培养中的表达降低。点表示来自3个独立实验的2个技术样本，线为平均值±sem。G-H.与EDB-FN结合的ZD2肽在FIJI中被量化为ZD2-Cy5.5的像素强度与Hoechst的像素强度之比。条形表示平均值±sem，点表示独立的重复样本。使用Mann-Whitney U检验，*p＜0.05。比例尺＝100μm。
图12A-12G提供的图像显示侵入性TGF-β处理的耐药乳腺癌细胞中EDB-FN和SRp55的耗竭减少了其的侵袭。TGF-β处理的耐药MCF7和MDA-MB-468细胞用100nM[siRNA]和N/P＝10的ECO/siNC(siN)、ECO/siEDB(siE)和ECO/siSRSF6(siS)纳米颗粒处理。A.EDB-FN和SRSF6的敲除导致EDB-FN表达和SRp55水平的下调，同时降低侵入性TGF-β处理的耐药B.MCF7和C.MDA-MB-468细胞的侵入潜力。用MK2206-HCl处理侵入性MDA-MB-468-DR细胞D.减少了EDB-FN表达和E.侵入。TGF-β在这些MK2206处理的细胞中的过度表达挽救了EDB-FN的表达以及这些细胞的侵袭潜能。用MK2206-HCl处理侵入性MCF7-DR细胞F.减少了EDB-FN表达和G.侵入。TGF-β在这些MK2206处理的细胞中的过度表达并不能挽救EDB-FN的表达或其侵袭潜能。比例尺＝100μm。
图13A-13D提供的图像显示用EDB-FN特异性G4抗体对人类组织中的EDB-FN的免疫组织化学染色(a)在正常舌试样中弱(n＝3)，(b)在未治疗的原发性OSCC试样中强(n＝7)，(c)在OSCC转移试样中强，(n＝2)，和(d)在新辅助原发性OSCC试样中中等(n＝4)。所有图板中的比例尺：200μm。
图14A和14B提供的图像显示(a)在2D和3D培养中生长的细胞(n＝3)在HSC3和SCC4细胞中显示出高风险特征，但在CAL27细胞中没有。(b)Transwell迁移和侵袭试验(n＝3)证实了HSC3和SCC4细胞的高侵袭潜力，但CAL27细胞没有。
图15A-15E提供的图表和图像显示(a)qRT-PCR mRNA分析(n＝3)和(b)蛋白质印迹分析(n＝3)揭露侵袭性HSC3和SCC4细胞中EDB-FN的差异和上调表达。(c)EDB FN特异性ZD2-Cy5.5(n＝3)球状体的肽结合研究显示HSC3和SCC4球状体中的强染色，但CAL27球状体中没有。根据EDB-FN表达水平，共聚焦图像的定量揭露了(d)更大的球状体和(e)HSC3和SCC4球状体中更强的ZD2-Cy5.5染色。通过单向方差分析(One-Way ANOVA)和Fisher最小显著性差异事后检验分析数据(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；n.s.，p>0.05)。
图16A-16C提供的图像显示(a)MT218对CAL27肿瘤(n＝5)的增强略低于钆特醇(gadoteridol)。(b)MT218对HSC3肿瘤(n＝4)的增强略高于钆特醇。(c)MT218对SCC4肿瘤(n＝4)的增强显著高于钆特醇。MT218和钆特醇的使用剂量分别为0.04mmol/kg和0.10mmol/kg。
图17A-17I提供的图表显示，造影增强肿瘤的CNR分析显示(a)根据EDB-FN表达，MT218对CAL27、HSC3和SCC4肿瘤的增强有显著差异，而(b)钆特醇在三种模型之间的增强无差异。MT218的增强(c)在CAL27肿瘤中普遍低于钆特醇，(d)在HSC3肿瘤中普遍高于钆特醇，和(e)在SCC4肿瘤中显著高于钆特醇。MT218受试者的最大CNR增强(f)在CAL27肿瘤中略低于钆特醇(p＝0.0957)，(g)在HSC3肿瘤中略高于钆特醇(p＝0.0639)，以及(h)在SCC4肿瘤中显著高于钆特醇。(f-h)用实线连接的开放点表示匹配的逐鼠数据，以及用虚线连接的实心点表示队列平均值。(i)根据用MT218的EDB-FN表达，三种肿瘤模型之间的平均最大CNR增强显著不同，但用钆特醇的没有。采用双向方差分析(Two-Way ANOVA)和Fisher最小显著性差异事后检验(a-e，i)和未配对t检验(f-h)分析数据(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；n.s.，p>0.05)。
图18提供的图像显示OSCC异种移植物的H&E染色(左侧，n＝3)显示分化的各种形态特征和阶段。采用EDB-FN特异性G4抗体的EDB-FN的免疫组织化学(右侧，n＝3)分别显示CAL27、HSC3和SCC4肿瘤的上皮区域中的弱、中度和强染色。比例尺：H&E图像为600μm，免疫组织化学图像为200μm。
图19A-19C提供了靶向造影剂ZD2-N3-Gd(HP-DO3A)(MT218)的结构(A)、结合亲和力测量(B)和弛豫性(C)。
图20A-20C提供了用ZD2-Cy5.5(红色)和DAPI(蓝色)染色的人胰腺癌(A)、癌前胰腺上皮内瘤变(PanIN)(B)和正常胰腺组织(C)中以10x(比例尺：200μm)放大率拍摄的结构域外-B纤连蛋白表达的荧光共聚焦图像。
图21A-21C提供了在BxPC3-GFP-Luc(BxPC3)、Capan-1和PANC-1-GFP-Luc(PANC-1)人PaCa细胞中结构域外-B纤连蛋白(EDB-FN)的蛋白质印迹，具有密度定量(A)、来源于PaCa细胞的肿瘤异种移植物(B)以及具有和不具有(NAC)G4抗-EDB-FN单克隆抗体的PaCa异种移植物中EDB-FN的免疫组织化学染色(C，比例尺200μm、放大10倍)。正常组织的蛋白质印迹和肿瘤试样的苏木精和伊红(H&E)染色也作为参考。
图22提供了注射MT218(n＝7)或Gd(HP-DO3A)(GTDL)(n＝5)之前和之后不同时间点的具有Capan-1侧腹异种移植物的小鼠的代表性T1加权2D自旋回波MR图像，其中相应的减影图像(增强后减去增强前)覆盖在增强前图像上。减影图像中肿瘤信号变化较大的区域用白色/红色表示，肿瘤信号变化较小的区域用黑色/蓝色表示。肿瘤用白色箭头标记，比例尺：5mm。
图23A和23B提供了植入BxPC3-GFP-Luc胰腺内肿瘤的小鼠的生物发光图像(A)。在注射0.1mmol/kg的MT218或Gd(HP-DO3A)(GTDL)之前和之后的不同时间点，胰腺内肿瘤的代表性T1加权2D自旋回波MR图像以及覆盖在增强前图像上的相应减影图像(n＝3)。比例尺：5mm(B)。箭头指向胰腺内BxPC3-GFP-Luc-PaCa肿瘤。
图24A和24B提供了植入PANC-1-GFP-Luc胰腺内肿瘤的小鼠的生物发光图像(A)，以及注射0.1mmol/kg MT218或Gd(HP-DO3A)(GTDL)之前和之后10分钟胰腺内肿瘤的代表性T1加权2D自旋回波MR图像(n＝6)，以及覆盖在增强前图像上的减影图像。比例尺：5mm(B)。肿瘤位置用箭头标记。
图25A-25C提供了注射MT218或Gd(HP-DO3A)(钆特醇)前后不同时间点的由MRI图像计算的Capan-1侧腹异种移植物(A)、BxPC-GFP-Luc胰腺内肿瘤(B)和肝脏的对比噪声比(CNR)。由注射MT218和Gd(HP-DO3A)(钆特醇)前后获得的MRI图像所计算的PANC-1-GFP-Luc胰腺内PaCa肿瘤的CNR(C)**p<0.01；*p<0.05。
图26A-26C提供的图像显示了前列腺癌细胞的特征。与低风险LNCaP细胞相比，LNCaP-CXCR2、C4-2和C4-2-DR细胞显示A.通过Matrigel涂层的transwell inserts的侵袭增加，B.EMT标记物N-cadherin的表达增加，和C.在用EDB-FN特异性ZD2-Cy5.5肽探针染色的3D培养中EDB-FN的表达增强。
图27A和27B提供的图表和图像显示，使用0.04mmol Gd/kg剂量的MT218的EDB-FN的造影增强MRMI有助于前列腺癌的无创评估。在无胸腺nu/nu小鼠中注射MT218之前和之后20分钟获得了T1加权2D轴向自旋回波图像。与低风险LNCaP肿瘤相比，LNCaP-CXCR2、C4-2和C4-2-DR异种移植物显示了A.稳健的信号增强和B.较高的CNR。
图28A-28D提供的图表和图像显示，使用0.04mmol Gd/kg剂量的MT218的EDB-FN的造影增强MRMI有助于鉴别诊断侵入性耐药前列腺癌。PC3-DR细胞显示A.通过Matrigel涂层的transwell inserts的侵袭减少，B.在用EDB-FN特异性ZD2-Cy5.5肽探针染色的3D培养中EDB-FN的表达降低。在无胸腺nu/nu小鼠中注射MT218之前和之后20分钟获得了T1加权2D轴向自旋回波图像。与侵入性较小的PC3-DR肿瘤相比，富含EDB FN的侵入性PC3异种移植物显示出C.稳健的信号增强和D.较高的CNR。
图29A-29D提供的图表和图像显示，使用0.04mmol Gd/kg剂量MT218的EDB-FN的造影增强MRMI有助于前列腺癌的无创主动监视。在携带C4-2肿瘤的无胸腺nu/nu小鼠中注射MT218之前和之后20分钟获得了T1加权2D轴向自旋回波图像。两只独立小鼠从第21天到第60天的C4-2肿瘤进展伴随着A-B.信号增强和C-D.CNR的稳步增加。
图30A-30D提供的图表和图像显示RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒的特征。通过动态光散射测定RGD-PEG-ECO/miR-200c和RGD-PEG-ECO/siNS纳米颗粒的尺寸分布和ζ电位(A)；与游离RNA对照相比，RGD-PEG-ECO/miR-200c和RGD-PEG-ECO/siNS纳米颗粒的琼脂糖凝胶延迟测定显示出高包封效率(B)；荧光共聚焦显微图像显示RGD-PEG-ECO/miR-200c-Cy5.5纳米颗粒在转染4小时的MDA-MB-231细胞中的有效摄取(C)，以及与未处理的细胞相比，用FACS定量的纳米颗粒摄取(D)。条形显示平均值±sem，使用未配对t检验，***p<0.005。
图31A-31P提供的图表和图像显示RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒介导的TNBC细胞中miR-200c的稳健和持续递送以及下游靶基因的下调。与RGD-PEG-ECO/siNS相比，转染RGD-PEG-ECO/miR-200c后MDA-MB-231细胞中miR-200c上调14天(A)和ZEB1下调7天(B)；与RGD-PEG-ECO/siNS相比，在以100nM miR-200c转染RGD-PEG-ECO/miR-200c后48小时，MDA-MB-231(C)和Hs578T(I)中的miR-200c水平，以及随后在两种细胞系中的ZEB1(D、J)、BMI1(E、K)、生存素(F、L)、FN1(G、M)和EDB-FN(H、N)在mRNA水平上的下调；蛋白质印迹显示，与RGD-PEG-ECO/siNS和非特异性对照相比，RGD-PEG-ECO/miR-200c在MDA-MB-231(O)和Hs578T(P)细胞中介导的下游ZEB1、BMI1、生存素和EDB-FN蛋白的下调。条形显示平均值±sem。使用未配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。
图32A-32C提供的图像显示RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒抑制TNBC细胞的迁移、侵袭和球状体形成。与RGD-PEG-ECO/siNS纳米颗粒相比，用RGD-PEG-ECO/miR-200c处理MDA-MB-231和Hs578T细胞抑制了如划痕损伤测定所示的它们的迁移(A)，如transwell测定所示的侵袭(B)，以及3D培养中肿瘤球状体的形成(C)。
图33A-33G提供的图表和图像显示，全身给药RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒明显抑制TNBC肿瘤异种移植的原发肿瘤进展。配制了一批RGD-PEG-ECO/siNS和RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒(N/P＝8，1.0mg/kg RNA剂量，2.5mol％MAL-PEG-RGD，5％蔗糖)并储存在-80℃直到使用。A)根据纳米颗粒治疗时间表的示意图对小鼠进行治疗。每周通过BLI(B-E)和卡尺测量(F、G)来监测MDA-MB-231和Hs578T肿瘤异种移植的肿瘤生长。条形和线表示平均值±sem。使用未配对t检验，*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.005。卡尺测量值与第1周相比。
图34A-34D提供的图形和图像显示用RGD-PEG-ECO/miR-200c处理的TNBC肿瘤中EDN-FN表达的MRMI。MDA-MB-231(A、B)和Hs578T(C、D)肿瘤在静脉注射MT218之前和之后不同时间点的T1加权轴旋回图像和CNR。MR图像在每周处理RGD-PEG-ECO/miR-200c和RGD-PEG-ECO/siNS之前和之后第6周获得。线表示平均值±sem。使用未配对t检验，*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.005。
图35A-35G提供的图表和图像显示，全身给药RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒导致miR-200c的上调和EDB-FN的下调。通过qRT-PCR和免疫组织化学测定用ECO/miR-200c和RGD-PEG-ECO/siNS处理的MDA-MB-231和Hs578T肿瘤中的ZEB1和EDB-FN的miR-200c和mRNA水平(A、B、C、D、E、F)和EDB-FN蛋白水平(G)，其中肿瘤在第7周被剖开。
图36A-36D提供的图表和图像显示，全身给药RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒不会在处理的小鼠中诱发明显的不良副作用。A)经RGD-PEG-ECO/miR-200c和RGD-PEG-ECO/siNS处理的小鼠显示在6周的处理期间体重没有明显差异。通过H&E染色对肝脏(B)、脾脏(C)和肾脏(D)的组织学评估显示没有明显的组织损伤。(比例尺＝100μm)
具体实施方式
本发明提供一种检测受试者中耐药癌症的方法。该方法包括使受试者的组织与有效量的分子探针接触，检测组织中存在的分子探针的量，将检测到的分子探针的量与对照值进行比较，以及如果组织中存在的分子探针的量高于对照值，则检测到受试者中的耐药癌症。所述分子探针包括下式：P-L-C，其中P为EDB-FN靶向肽，C为造影剂；以及L为将肽共价连接到造影剂的非肽接头。还提供了监测耐药癌症治疗的方法。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与这些发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文中用于描述本发明的术语仅用于描述特定实施方式，并不旨在限制本发明。如在本发明和所附权利要求书的描述中所使用的，单数形式“一”、“一个/种”和“该”也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。
规定本发明的广泛范围的数值范围和参数在某些情况下是近似值。尽管如此，具体实施例中提出的数值已尽可能精确地报告。然而，任何数值都必然包含某些误差，这些误差由各自测试测量中发现的标准偏差造成。本说明书中给出的每一个数值范围都将包括落在这种较宽的数值范围内的每一个较窄的数值范围，就好像这种较窄的数值范围都明确地写在这里一样。
如本文所用，术语“诊断”可包括确定受试者的疾病性质，以及确定疾病或疾病发作的严重程度和可能的结果和/或康复前景(预后)。“诊断”还可以包括在合理治疗的背景下的诊断，其中诊断指导治疗，包括治疗的最初选择、治疗的修改(例如，剂量和/或剂量方案的调整)等。
本文使用的“治疗”、“处理”等是指向有诸如癌症病症或疾病风险或患有诸如癌症病症或疾病的受试者提供益处的任何行动，包括通过减轻或抑制至少一种症状改善条件、延迟疾病的进展、预防或延迟疾病的发生等。受试者可能由于暴露于致癌物而处于危险之中，在遗传上易患以不需要的、快速的细胞增殖为特征的疾病等。
术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用，一般指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物，包括类猿和人类、马类(如马)、犬类(如狗)、猫科动物、各种驯养的牲畜(例如有蹄类动物，诸如猪、猪、山羊、绵羊等)，以及驯养的宠物和在动物园饲养的动物。对人类的诊断是特别有意义的。
如本文所用，术语“有机基团”用于指被归类为脂族基团、环状基团或脂族和环状基团的组合(例如，烷烃基和芳烃基)的烃基。在本发明的背景下，适用于本发明化合物的有机基团是那些不干扰化合物的抗癌活性的基团。在本发明的背景下，术语“脂族基团”是指饱和或不饱和的直链或支链烃基。该术语用于包括例如烷基、烯基和炔基。
如本文所用，术语“烷基”、“烯基”和前缀“alk-”包括直链基团和支链基团。除非另有规定，这些基团含有1至20个碳原子，其中烯基含有2至20个原子。在一些实施方式中，这些基团总共具有最多10个碳原子、最多8个碳原子，最多6个碳原子或最多4个碳原子。包括4个或更少个碳原子的烷基也可以称为低级烷基。烷基也可以通过它们所包含的碳原子数来表示(即，C1-C4烷基是包含1至4个碳原子的烷基)。
当一个基团在本文所述的任何式或方案中存在不止一次时，无论是否明确表示，每个基团(或取代基)都是独立选择的。例如，对于式-C(O)-NR2，每个R基团是独立选择的。
如本文所用，术语“多肽”旨在包括单个“多肽”以及多个“多肽”，并包括两个或多个氨基酸的任何链。因此，如本文所用，包括但不限于“肽”、“二肽”、“三肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”的术语或用于指代两个更多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语，包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替或与这些术语中的任何术语互换使用。该术语还包括经过翻译后修饰的多肽，例如糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解裂解或非天然氨基酸的修饰。
本文中“氨基酸”用于指通式为NH2–CRH–COOH的化合物，其中侧链R为H或有机基团。如果R是有机的，则R可以变化，并且是极性的或非极性的(即疏水性的)。在整个应用中使用以下缩写：A＝Ala＝丙氨酸、T＝Thr＝苏氨酸、V＝Val＝缬氨酸、C＝Cys＝半胱氨酸、L＝Leu＝亮氨酸、Y＝Tyr＝酪氨酸、I＝Ile＝异亮氨酸、N＝Asn＝天冬氨酸、P＝Pro＝脯氨酸、Q＝Gln＝谷氨酰胺、F＝Phe＝苯基丙氨酸、D＝Asp＝天门冬氨酸、W＝Trp＝色氨酸、E＝Glu＝谷氨酸、M＝Met＝甲硫氨酸、K＝Lys＝赖氨酸、G＝Gly＝甘氨酸、R＝Arg＝精氨酸、S＝Ser＝丝氨酸、H＝His＝组氨酸。除非另有说明，本文中使用的术语“氨基酸”还包括保留通式的氨基酸衍生物。
耐药癌症的检测方法
在一个方面，本发明提供了一种检测受试者中耐药癌症的方法。该方法包括以下步骤：使受试者的组织与有效量的分子探针接触，检测组织中存在的分子探针的量，将检测到的分子探针的量与对照值进行比较；以及如果组织中存在的分子探针的量高于对照值，则检测到受试者中的耐药癌症。
所述分子探针可用于检测和/或测定受试者的器官、组织或身体区域中表达EDB-FN的耐药癌细胞的存在、位置和/或分布的方法。分子探针在动物组织(例如前列腺组织)中的存在、位置和/或分布可被可视化(例如，使用本文所述的体内成像模式)。本文所用的“分布”是指在散布一个区域或体积上的空间特性。在这种情况下，“癌细胞的分布”是癌细胞散布在受试者的组织(例如前列腺组织)中的区域或体积上的空间特性。然后，分子探针的分布可以与该组织中耐药癌细胞的存在或不存在相关。
在一个方面，分子探针可以施用于受试者以评估受试者中耐药癌细胞的分布，并将该分布与特定位置相关联。外科医生通常在手术切除中使用立体定向技术和术中MRI(iMRI)。这允许他们从肿瘤的不同区域(诸如肿瘤边缘或肿瘤中心)特异性地识别组织和对组织进行取样。通常，他们还对肿瘤边缘外的肿瘤边际的组织区域进行取样，这些区域看起来大体正常，但在组织学检查时被分散的肿瘤细胞浸润。
“癌症”或“恶性肿瘤”被用作同义词，指的是以细胞不受控制和异常增殖、受影响细胞局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体其他部位(即转移)的能力以及多种特征性结构和/或分子特征中的任何一种为特征的多种疾病。“癌细胞”是指经历多阶段肿瘤进展的早期、中期或晚期的细胞。已经使用显微镜描述了肿瘤进展的早期、中期和晚期的特征。肿瘤进展的三个阶段中每个阶段的癌细胞通常具有异常的核型，包括易位、倒位、缺失、等臂染色体、单性体和额外染色体。癌细胞包括“增生细胞”，即恶性进展早期的细胞，“发育不良细胞”，即肿瘤进展中期的细胞，以及“肿瘤细胞”，即肿瘤进展晚期的细胞。癌症的实例有肉瘤、乳腺癌、肺癌、脑癌、骨癌、肝癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌和前列腺癌。在一些实施方式中，癌症为乳腺癌、口腔癌、胰腺癌或前列腺癌。肿瘤是受试者体内癌症的物理表现。
本发明提供了检测和监测耐药癌症治疗的方法。耐药癌症是一种对抗癌药物治疗产生耐药性的癌症。本领域技术人员已知耐药性的各个方面。参见Vasan等,Nature volume575,299–309(2019)。耐药癌症可包括固有耐药和后天耐药。导致耐药性的因素包括肿瘤负担、肿瘤异质性、肿瘤的物理屏障的产生或使用、免疫抑制和不可治疗的基因组驱动因素。
所述方法包括接触受试者的组织的步骤。如本文所用，接触是指使两个项目在物理上相邻并接触，或将它们放置在一个在合理短的时间内发生接触的环境中。例如，使组织与分子探针接触包括将分子探针直接应用于组织，诸如从受试者获得的活检试样。接触可包括体内、体外和体外接触。然而，接触还包括通过循环介导的接触导致分子探针和组织之间接触的全身给药。因此，在一些实施方式中，在体内接触组织。
在一些实施方式中，分子探针被全身给药于患有或疑似患有癌症的受试者。与癌症相关的一般征兆和症状包括疲劳、体重变化或皮肤下可感受到的肿块或增厚区域。大多数癌症征兆和症状是发生癌症的组织特有的。例如，头痛或癫痫发作可能是脑癌的征兆，而排尿困难可能是膀胱癌的征兆。尽管如此，癌症的各种征兆和症状对于本领域技术人员来说是众所周知的，并在国家癌症研究所网站上进行了描述。癌症的症状可表明受试者患有或疑似患有癌症，而其他风险因素，诸如遗传易感性和辐射暴露也可导致受试者疑似患有癌症。
组织区域是受试者中正在进行治疗和/或分析的组织区域。通常，组织区域位于已识别出癌症的组织内，或怀疑癌症可能通过转移扩散的组织内。组织区域可以是受试者的器官，诸如心脏、肺或血管。在其他实施方式中，组织区域可以是患病组织或疑似患病的组织，诸如肿瘤或通过转移途径与肿瘤连接的组织区域或具有与原发肿瘤组织相似特征的组织。转移途径的实例包括经体腔途径(穿透腹膜、胸膜、心包或蛛网膜下腔的表面)、淋巴途径(肿瘤细胞转移到淋巴结并从淋巴结转移到身体其他部位)和造血途径(用于肉瘤和癌)。组织区域的尺寸可以广泛变化，并且可以，例如，在约1cm3至约500cm3的尺寸范围内变化。
根据分子探针中包含的成像基团，可以使用多种不同的成像技术检测分子探针。成像方法的实例包括伽马成像、正电子发射断层扫描(PET)成像、计算机断层扫描(CT)成像、磁共振成像(MRI)、近红外成像和荧光成像。
在一些实施方式中，分子探针包括适合用作磁共振成像剂的成像基团。使用MRI进行疾病检测通常是困难的，因为与周围健康组织相比，疾病区域具有相似的信号强度。在磁共振成像的情况下，成像剂也可以称为造影剂。已知镧系元素用作造影剂。镧系化学元素包括原子序数为57至71的十五种金属化学元素，并且包括镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥。优选的镧系元素包括铕、钆和铽。为了更容易处理这些稀土金属，镧系元素优选被螯合。在一些实施方式中，选择用作成像基团的镧系元素是钆，或更具体地为钆(III)。
分子探针
本发明包括施用和检测分子探针。本文所指的分子探针通常包括下式：
P-L-C，
其中：
P为包含选自以下组的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；
C为造影剂；和
L为将所述肽共价连接到所述造影剂的非肽接头，所述接头包括与所述肽的胺形成甲酰胺的羧酸、或与所述肽的半胱氨酸残基形成硫酯键的马来酰亚胺、或与所述肽的半胱氨酸残基形成硫酯的马来酰亚胺。
本文所述的分子探针包括具有特异性结合结构域外-B纤连蛋白(EDB-FN)的肽序列的靶向肽。癌症，特别是耐药癌症具有有助于癌细胞的生存、增殖和转移的独特的肿瘤微环境。EDB-FN的高表达与耐药癌症的存在相关。
包括靶向肽的分子探针可以，诸如通过静脉内或肠胃外施用方式，全身给药于受试者，并容易靶向细胞外基质蛋白EDB-FN，以确定受试者中的癌细胞位置、分布和/或侵袭性以及肿瘤细胞边际。关于分子探针及其制备方法的描述，请参见美国专利第10,925,980号，其公开内容通过引用全部并入本文中。
在一些实施方式中，分子探针可以包括下式：
P-L-C
其中P为靶向肽；C为造影剂；L为将肽共价连接到造影剂的非肽接头。所述接头可包括与所述肽的胺形成甲酰胺的羧酸、或与所述肽的半胱氨酸残基形成硫酯键的马来酰亚胺。
在一些实施方式中，所述靶向肽可以特异性结合EDB-FN。特异性结合EDB-FN的靶向肽可以包括具有以下的氨基酸序列的线性肽：TVRTSAD(SEQ ID NO:1)、NWGDRIL(SEQ IDNO:2)、NWGKPIK(SEQ ID NO:3)、SGVKSAF(SEQ ID NO:4)、GVKSYNE(SEQ ID NO:5)、IGKTNTL(SEQ ID NO:6)、IGNSNTL(SEQ ID NO:7)、IGNTIPV(SEQ ID NO:8)和LYANSPF(SEQ ID NO:9)，具有以下的氨基酸序列的环状肽：CTVRTSADC(SEQ ID NO:10)、CNWGDRILC(SEQ ID NO:11)、CNWGKPIKC(SEQ ID NO:12)、CSGVKSAFC(SEQ ID NO:13)、CGVKSYNEC(SEQ ID NO:14)、CIGKTNTLC(SEQ ID NO:15)、CIGNSNTLC(SEQ ID NO:16)、CIGNTIPVC(SEQ ID NO:17)或CLYANSPFC(SEQ ID NO:18)，或具有以下半胱氨酸接头的线性肽：CTVRTSAD(SEQ ID NO:31)、CNWGDRIL(SEQ ID NO:32)、CNWGKPIK(SEQ ID NO:33)、CSGVKSAF(SEQ ID NO:34)、CGVKSYNE(SEQ ID NO:35)、CIGKTNTL(SEQ ID NO:36)、CIGNSNTL(SEQ ID NO:37)、CIGNTIPV(SEQ ID NO:38)和CLYANSPF(SEQ ID NO:39)。在其他实施方式中，所述靶向肽可以特异性结合EDA-FN。特异性结合EDA-FN的靶向肽可以包括具有以下的氨基酸序列的线性肽：WNYPFRL(SEQ ID NO:19)、SNTSYVN(SEQ ID NO:20)、SFSYTSG(SEQ ID NO:21)、WSPAPMS(SEQID NO:22)、TREHPAQ(SEQ ID NO:23)或ARIIDNA(SEQ ID NO:24)，具有以下的氨基酸序列的环状肽：CWNYPFRLC(SEQ ID NO:25)、CSNTSYVNC(SEQ ID NO:26)、CSFSYTSGC(SEQ ID NO:27)、CWSPAPMSC(SEQ ID NO:28)、CTREHPAQC(SEQ ID NO:29)或CARIIDNAC(SEQ ID NO:30)，或具有以下半胱氨酸接头的线性肽：CTVRTSAD(SEQ ID NO:40)、CNWGDRIL(SEQ ID NO:41)、CNWGKPIK(SEQ ID NO:42)、CSGVKSAF(SEQ ID NO:43)、CGVKSYNE(SEQ ID NO:44)、CIGKTNTL(SEQ ID NO:45)、CIGNSNTL(SEQ ID NO:46)、CIGNTIPV(SEQ ID NO:47)和CLYANSPF(SEQ IDNO:48)。
靶向肽可以进行各种改变、替换、插入和删除，这些改变在其使用中提供了某些优势。在这方面，结合EDB-FN和/或与EDB-FN络合的靶向肽可以与所述肽的序列基本上同源，而不是相同，其中进行了一个或多个改变，并且它保留了作为特异性结合和/或络合EDB-FN的功能的能力。
所述靶向肽可以是多种形式的多肽衍生物中的任何一种，包括酰胺、与蛋白质的缀合物、环化多肽、聚合多肽、类似物、片段、化学修饰多肽等衍生物。
术语“类似物”包括具有与本文特别示出的序列基本相同的氨基酸残基序列的任意肽，其中一个或多个残基已被功能类似的残基保守取代，和如本文所述的与EDB-FN特异性结合和/或络合的任意肽。保守取代的实例包括一个非极性(疏水性)残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)被取代为另一个、一个极性(亲水性)残基被取代为另一个(如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间)、一个碱性残基(如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)被取代为另一个、一个酸性残基(如天门冬氨酸或谷氨酸)被取代为另一个。
短语“保守取代”还包括使用化学衍生的残基代替非衍生的残基，前提是这种肽显示出必要的结合活性。
“化学衍生物”是指具有一个或多个通过功能性侧基反应化学衍生的残基的受试肽。此类衍生化分子包括，例如，其中游离氨基衍生化以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可以衍生化以形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可以衍生化以形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生化以形成N-苄基组氨酸。还包括作为化学衍生物的含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然氨基酸衍生物的那些多肽。例如：4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；以及鸟氨酸可以取代赖氨酸。本文所述的肽还包括相对于其序列如本文所示的肽的序列，具有一个或多个添加和/或缺失或残基的任何肽，只要保持必要的结合特异性或活性即可。
术语“片段”是指具有比本文所示氨基酸残基的多肽更短的氨基酸残基序列的任何受试肽。
还可以在肽的任一末端添加额外的残基，目的在于提供“接头”，通过该接头，所述肽可以方便地连接和/或固定到其他多肽、蛋白质、可检测部分、标签、固体基质或载体上。
氨基酸残基接头通常是至少一个残基，可以是40个或更多个残基，更常见的是1至10个残基。用于连接的典型氨基酸残基是甘氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等。此外，受试者靶向肽剂的不同之处在于通过末端-NH2酰化(例如，乙酰化或巯基乙酸酰胺化)或通过末端羧基酰胺化(例如，用氨、甲胺等末端修饰)的修饰的序列。众所周知，末端修饰有助于降低蛋白酶消化的敏感性，从而延长多肽在溶液中，特别是可能存在蛋白酶的生物流体中的半衰期。在这方面，多肽环化也是有用的末端修饰，并且特别优选，这也是由于环化形成的稳定结构，并且考虑到本文所述的这种环状肽的生物活性。
在一些实施方式中，所述非肽接头是非肽脂族或杂脂族接头。所述非肽接头可以包括共价连接所述肽与造影剂的亚烷基二甲酰胺。
在一些实施方式中，非肽接头可包括长度约1至约10个原子的第一部分和充当间隔物的第二部分。作为间隔物的接头部分可以包括非肽聚合物，其包括但不限于聚环氧烷、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙基醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳素、透明质酸和肝素。对于非肽接头的间隔物的更详细描述，参见，例如，WO/2006/107124，其通过引用并入本文中。典型地，这种接头的分子量范围为约1kDa至50kDa，这取决于特定的接头。例如，典型的PEG具有约1至5kDa的分子量，聚乙二醇具有约5kDa至50kDa，更优选约10kDa至40kDa的分子量。
造影剂通过所述接头直接与靶向肽缀合。所述造影剂的作用是通过使包括靶向肽的分子探针与EDB-FN结合而形成的络合物可视化来有助于检测或诊断方法的检测步骤。可以选择造影剂以使其产生可以被测量且强度与结合在被分析组织上的分子探针的量有关(优选成正比)的信号。
在某些实施方式中，所述造影剂包括螯合剂和金属离子。螯合剂通常具有一个或多个能够与所述接头形成共价键的基团。本文可以使用本领域已知的多种不同的螯合剂。在一个方面，螯合剂包括含有至少一个具有能够与成像剂配位的孤对电子的杂原子(例如氧、氮、硫、磷)的无环或环状化合物。非环状螯合剂的实例包括乙二胺。环状螯合剂实例包括二乙烯三胺五乙酸盐(DTPA)或其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷四乙酸盐(DOTA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7-三乙酸盐(DO3A)及其衍生物(例如HP-DO3A)、乙二胺四乙酸盐(EDTA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂环十三烷四乙酸(TRITA)及其衍生物、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷四甲基乙酸盐(DOTMA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7-三甲基乙酸盐(DO3MA)及其衍生物、N,N',N”,N”'-四磷酰基甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DOTP)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基甲基膦酸)(DOTMP)及其衍生物、1,4,7,10-四氧杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基苯基膦酸)及其衍生物、或N,N'-亚乙基二-L-半胱氨酸或其衍生物。术语“衍生物”在本文中定义为螯合剂的相应盐和酯。
金属离子的选择可根据检测技术(例如MRI、PET等)而变化。用于磁共振成像的金属离子可包括Gd+3、Eu+3、Tm+3、Dy+3、Yb+3、Mn+2、Fe+3、55Co、64Cu、67Cu、47Sc、66Ga、68Ga、90Y、97Ru、99mTc、111h、109Pd、153Sm、177Lu、186Re和188Re。在一些实施方式中，所述分子探针的造影剂包括金属螯合剂或金属富勒烯中的至少一种。在一些实施方式中，所述造影剂可以包括金属富勒烯，例如Gd3N@C80。
在一些实施方式中，所述分子探针可具有下式：
Figure BDA0004113382920000211
其中：
P1为含有选自以下组的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；
L1为任选的间隔物；
L2为所述肽P1的氨基或所述间隔物；以及
M为选自以下组的金属：Gd+3、Eu+3、Tm+3、Dy+3、Yb+3、Mn+2、Fe+3、55Co、64Cu、67Cu、47Sc、66Ga、68Ga、90Y、97Ru、99mTc、111h、109Pd、153Sm、177Lu、186Re和188Re；或它们的盐。
在一些实施方式中，L1可包含以下中的至少一种：聚环氧烷、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙基醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、或聚氰基丙烯酸酯。
在其他实施方式中，所述分子探针可具有下式：
Figure BDA0004113382920000221
其中：
P1为具有选自以下组的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；
L2为所述肽P1的氨基；以及
M为选自以下组的金属：Gd+3、Eu+3、Tm+3、Dy+3、Yb+3、Mn+2、Fe+3、55Co、64Cu、67Cu、47Sc、66Ga、68Ga、90Y、97Ru、99mTc、111h、109Pd、153Sm、177Lu、186Re和188Re；或它们的盐。
在一些实施方式中，为了识别和促进癌细胞的去除，显微术中成像(IOI)技术可以与全身给药或局部给药本文所述的分子探针相结合。向受试者施用后的分子探针可以靶向和检测和/或确定患者器官或身体区域中耐药癌细胞(即与EDB-FN表达相关的癌细胞)的存在、位置和/或分布。在一个实例中，分子探针可以与IOI结合以识别在肿瘤边际已经浸润和/或开始浸润的恶性细胞。该方法可以在手术期间实时执行。该方法可以包括局部或全身给药所述分子探针，所述分子探针包括可检测部分，诸如PET、荧光或MRI对比部分。然后可以使用成像模态来检测并随后收集图像数据。所得图像数据可用于至少部分地确定外科和/或放射治疗。可替换地，该图像数据可以用于至少部分地控制自动手术装置(例如，激光、手术刀、微机械)或辅助手术的手动引导。此外，图像数据可以用于计划和/或控制治疗剂的递送(例如，通过微型电子机器或微型机器)。
监测耐药癌症治疗的方法
一种监测耐药癌症治疗的方法，包括：使接受耐药癌症治疗的受试者的组织与有效量的分子探针接触，检测所述组织中存在的所述分子探针的第一量，使所述受试者的组织与有效量的包含式P-L-C的分子探针第二次接触，检测存在于所述组织中的所述分子探针的第二量，以及比较所述分子探针的所述第一量和所述第二量以监测所述受试者中的耐药癌症治疗。
在某些实施方式中，本文所述的方法和分子探针可用于测量耐药癌症的治疗效果。在该实施方式中，分子探针可以在治疗之前、期间或之后施用给受试者，并且可以对癌细胞的分布进行成像以确定治疗的效果。在一个实例中，所述治疗可以包括转移癌的外科手术切除，并且分子探针可以用于定义手术前和手术后转移癌的分布，以确定外科手术切除的效果。任选地，所述方法和分子探针可用于术中外科手术过程，诸如外科手术肿瘤切除，以在外科手术期间更容易地定义和/或成像癌细胞质量或体积。
治疗还可以包括施用癌症治疗剂或其他类型的癌症治疗。本文所用的“癌症治疗剂”可以包括能够对动物的癌症产生负面影响的任何药剂，例如，通过杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞的生长速率、减少转移的发生率或数量、减少肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展、或增加具有癌症的动物的寿命。癌症治疗可包括，诸如但不限于，化疗、放射治疗、激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗。例如，受试者中癌症体积、生长、迁移和/或扩散的减少可以指示给定治疗的疗效。这可以提供癌症治疗的直接临床疗效终点测量。因此，在另一方面，提供了一种监测癌症治疗剂疗效的方法。更具体地，本申请的实施方式提供了一种监测癌症治疗效果的方法。
所述治疗剂可包括抗增殖剂，其发挥抗肿瘤、化疗、抗病毒、抗有丝分裂、抑肿瘤和/或免疫治疗作用，例如通过细胞抑制或细胞杀伤作用直接在肿瘤细胞上阻止肿瘤细胞的发育、成熟或扩散，而不是通过诸如生物反应修饰的机制间接地阻止。有大量的抗增殖剂可用于商业用途、临床评估和临床前开发。为了便于讨论，抗增殖剂分为以下类别、亚型和种类：ACE抑制剂、烷化剂、血管生成抑制剂、血管抑制素、蒽环类/DNA嵌入剂、抗癌抗生素或抗生素类药物、抗代谢物、抗代谢化合物、天冬酰胺酶、双磷酸盐、cGMP磷酸二酯酶抑制剂、碳酸钙、环氧化酶-2抑制剂、DHA衍生物、DNA拓扑异构酶、内皮抑制素、表鬼臼毒素、金雀异黄素、激素抗癌剂、亲水性胆汁酸(URSO)、免疫调节剂或免疫制剂、整合素拮抗剂、干扰素拮抗剂或制剂、MMP抑制剂、其他抗肿瘤剂、单克隆抗体、亚硝脲、NSAID、鸟氨酸脱羧酶抑制剂、pBATT、放射/化学敏化剂/保护剂、类视黄醇、内皮细胞增殖和迁移的选择性抑制剂、硒、溶基质素抑制剂、紫杉烷、疫苗和长春花生物碱。
可使用特殊方法治疗耐药癌症。治疗耐药癌症的一种方法是使用组合疗法，其中使用具有非重叠作用机制的多种化疗剂。参见Bosl等人,N.Eng.J.Med.,294,405-410(1986)。耐药癌症也可以通过改变剂量强度或使用高剂量化疗来治疗。参见Sternberg等人,J.Clin.Oncol.,19,2638-2646(2001)。其他方法包括使用专门靶向能激活耐药癌症特征的疗法，诸如靶向酪氨酸激酶、核受体或雌激素受体。参见Hanahan D.,Weinberg R.A.,Cell,144,646-674(2011)。免疫学方法，特别是使用单克隆抗体来禁用免疫检查点，也可用于治疗耐药癌症。参见Ribas A.,Wolchok J.D.,Science,359,1350-1355(2018)。
在某些实施方式中，本文所述的方法和分子探针可用于监测具有耐药癌症的受试者的治疗。在该实施方式中，在治疗方案的施用之前、期间或之后，使受试者的组织与有效量的分子探针第一次接触，并且可以将癌细胞的量和/或分布进行成像以确定治疗的效果。然后，在稍后的时间，将受试者的组织与有效量的分子探针第二次接触，并且检测存在于组织中的分子探针的第二量和/或分布。然后比较分子探针的第一量和第二量(和/或其分布)，以监测受试者中耐药癌症的治疗。
施用和配方
本文所述的分子探针可通过例如全身、局部和/或肠外给药方法施用于受试者。这些方法包括例如注射、输注、沉积、植入或局部给药，或任何其他需要分子探针进入组织的施用方法。在一个实例中，分子探针的施用可以通过在受试者中静脉注射分子探针来进行。可以给予探针单次或多次施用。本文所用的“施用”是指以有效标记受试者的癌细胞的量和时间段来提供或递送分子探针。
本文所述的包含靶向肽的分子探针可以以有效量的含有分子探针或其药学上可接受的水溶性盐的药物组合物施用于受试者。
“有效量”是指施用的分子探针的量足以能够检测探针与癌细胞或癌细胞微环境中其他细胞表达的EDB-FN和/或EDA-FN的结合或络合。“成像有效量”是指施用的分子探针的量足以能够对分子探针与癌细胞或癌细胞微环境中的其他细胞的EDB-FN和/或EDA-FN的结合或络合进行成像。
待施用的分子探针的配方将根据所选的施用途径(例如溶液、乳剂、胶囊等)而变化。合适的药学上可接受的载体可以含有不会过度抑制化合物的生物活性的惰性成分。药学上可接受的载体应是生物相容的，例如无毒、非炎性、非免疫原性，并且在施用于受试者时没有其他不期望的反应。可以采用标准的药物制剂技术，诸如Remington'sPharmaceutical Sciences(同上)中所述的。用于肠胃外施用的合适的药物载体包括例如无菌水、生理盐水、抑菌盐水(含约0.9％mg/ml苄醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水、Hank溶液、Ringer乳酸盐等。
含有溶解或分散在其中的活性成分的药物组合物的制备在本领域中是众所周知的。通常，此类组合物以液体溶液或悬浮液的形式作为注射剂制备，然而，也可以在使用前制备适合于液体的溶液或悬液的固体形式。配方将根据所选施用途径(如溶液、乳剂、胶囊)而变化。
任何多肽或化合物也可以以药用盐的形式使用。能够与多肽形成盐的酸包括无机酸，诸如三氟乙酸(TFA)、盐酸(HCl)、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻氨基苯甲酸、肉桂酸、萘磺酸、磺胺酸等。
能够与多肽形成盐的碱包括：无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾等；以及有机碱，诸如单、二和三烷基和芳基胺(例如，三乙胺、二异丙胺、甲胺、二甲胺等)和任选取代的乙醇胺(例如，乙醇胺、二乙醇胺等)。
以下实施例是为了说明的目的而包括的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1：通过结构域外-B纤连蛋白的MR分子成像对耐药结直肠癌进行无创评估 和治疗监测
结直肠癌(CRC)是美国男性和女性癌症死亡的第二大常见原因。2013年CRC病例的5年生存率从I期的88.1％降至IV期的12.6％。多项研究和临床试验已经证明，预防性筛查可显著降低CRC死亡率。虽然在早期阶段可以通过化疗和手术进行高度治疗，但80-90％的转移性CRC在诊断时无法手术，需要新辅助化疗。此外，多药耐药性的发展也导致复发和远处转移，这些都是无法治愈的。CRC治疗监测的现行标准遵循RECIST(实体瘤疗效评价标准)指南(Eisenhauer,E.A.等人,Eur J Cancer,2009.45(2):p.228-47)，由于对肿瘤解剖尺寸的依赖、导致主观意见的病变不规则性以及对治疗响应负面的肿瘤的检测延迟，这些标准受到限制。为了改善化疗或靶向治疗的结果，并为适应性干预做出决策，用于准确检测的无创和重复成像和监测侵入性、耐药肿瘤群体是至关重要的。
临床CRC诊断利用血液标志物，如癌胚抗原(CEA)和愈创木粪便潜血试验(GOBT)，其敏感性和特异性低。测量循环肿瘤DNA(ctDNA)突变负荷的液体活检反映了患者间、肿瘤间和肿瘤内的异质性，并在诊断和预后领域增长势头迅速；然而，它们不能提供关于肿瘤病变的空间信息，从而导致诊断成像必不可少。用于CRC处理监测的常见成像模式是正电子发射断层扫描-计算机断层扫描(PET-CT)，通常使用[18F]-氟-2-脱氧葡萄糖(18F-FDG)放射性示踪剂，其提供功能和代谢数据，但受到辐射暴露和混杂因素如细胞密度、高血糖和分辨率差的限制。造影增强磁共振成像(MRI)采用缩短组织T1的基于Gd(III)的造影剂(GBCA)，并且T1加权成像也通常用于CRC的诊断和监测。Jhaveri,K.S.和H.Hosseini-Nik,AJR Am JRoentgenol,2015.205(1):p.W42-55。当前的临床评估充满了严重挑战，因为临床非靶向GBCA是非特异性的，并且无法区分侵入性耐药肿瘤和敏感肿瘤；GBCA的重复施用与基于Gd的毒性和脑沉积的潜在安全性问题相关。鉴于CRC肿瘤具有广泛的分子和表型可塑性，有必要开发分子成像剂和策略，基于个体肿瘤和肿瘤生态位的关键生物学相关微环境特征的变化，在肿瘤治疗期间准确识别CRC的轨迹。
迄今为止，分子癌症成像学科的研究数量有限，可能是因为缺乏可靠的生物标志物。尽管结肠癌分泌蛋白2(CCSP-2)被用作原发性肿瘤、患者来源的异种移植物和肝转移的近红外荧光成像的分子标志物，但该标志物仅对结肠腺瘤特异。在广泛报道的磁性纳米颗粒(MNP)研究中，基于MRI的靶向人类肿瘤抗原低糖基化粘蛋白1(uMUC1)的氧化铁纳米颗粒的检测，以及促凋亡半胱天冬酶(caspases)特异性探针支架的纳米聚集，已用于监测结肠异种移植物的化疗反应。Zhou,Z.等人,Adv Mater,2019.31(8):p.e1804567。血管体积分数(VVF)、K-Ras突变和EGFR也被用作CRC MRI的替代标记，但成功率有限。然而，用于耐药CRC的无创评估和治疗监测的MR分子成像(MRMI)以前从未进行过。为了应对这一挑战，规避MNP的免疫和转译障碍，并潜在地靶向更广泛的耐药癌症，我们开发了MRMI策略，靶向肿瘤细胞外基质(ECM)中大量表达的癌蛋白结构域外-B纤连蛋白(EDB-FN)。Han,Z.和Z.R.Lu,JMaterChem B,2017.5(4):p.639-654；Lu,Z.R.,Curr Opin Biomed Eng,2017.3:p.67-73。
EDB-FN是一种癌胚型纤连蛋白亚型，在多种癌症中过度表达。Han,Z.等人,Bioconjug Chem,2017.28(4):p.1031-1040；Han,Z.等人,Nat Commun,2017.8(1):p.692。EDB-FN在CRC中也升高，并与血管生成、生长和组织重塑相关。Santimaria,M.等人,ClinCancer Res,2003.9(2):p.571-9。文献研究表明，即使在同一种癌症类型中，与惰性纤连蛋白相比，EDB-FN在侵入性更强的细胞和肿瘤亚型中也优先上调。Han,Z.等人,Magn ResonMed,2018.79(6):p.3135-3143。EDB-FN在恶性肿瘤中的特异性空间和时间表达及其在健康组织中的缺失使其成为分子成像和靶向治疗的有吸引力的靶标。Han,Z.等人,BioconjugChem,2019.30(5):p.1425-1433。我们之前通过将EDB-FN特异性肽ZD2与临床GBCAGadoteriol缀合而设计并开发了EDB-FN靶向的GBCA，ZD2-N3-Gd(HP-DO3A)(MT218)(Han,Z.等人,Bioconjug Chem,2015.26(5):p.830-8)，并证明了其即使在低至20μmol/kg(临床剂量的1/5)的剂量下，也能促进有效的MRMI用于富含EDB-FN的前列腺癌和乳腺癌的风险分层，从而突出了其转化应用和优越的安全性。尽管独立小组进行了这些以及EDB-FN相关的研究，但从未检测过耐药CRC中EDB-FN的表达谱。此外，使用EDB-FN作为评估耐药CRC治疗反应的分子标志物的可行性仍有待探索。
在此，我们首次证明，EDB-FN与MT218的MRMI可促进对EDB-FN水平显著升高的耐药CRC肿瘤的有效无创评估和治疗反应监测。皮下植入的耐药CRC异种移植物显示，与各自的药物敏感对应物相比，40μmol/kg剂量的MT218显示出强大的信号增强。EDB-FN的MRMI也用于成功监测耐药CRC肿瘤对靶向泛-AKT抑制剂MK2206 HCl的阴性反应(Agarwal,E.等人,BMC Cancer,2014.14:p.145)，表明EDB-FN作为治疗预测标志物的潜力。此外，EDB-FN升高与结肠癌患者预后不良相关。迄今为止，这是第一份也是唯一一份报告，为利用耐药介导的EDB-FN上调作为CRC成像和治疗监测的分子标志物提供了令人信服的体内证据。
缩写
COAD：结肠腺癌；CNR：对比噪声比；CRC：结直肠癌；ECM：细胞外基质；EDB-FN：结构域外-B纤连蛋白；EMT：上皮间质转化；GBCA：钆基造影剂；5’-FU：5’-氟尿嘧啶；GTEx：基因型组织表达；MDR1：多药耐药1；MRMI：磁共振分子成像；PET-CT：正电子发射断层扫描-计算机断层扫描；TCGA：癌症基因组图谱。
方法
细胞培养
CRC细胞系DLD-1和RKO购自ATCC(Manassas，VA)。它们各自的耐药衍生物DLD1-DR和RKO-DR是来自Zhenghe Wang(CWRU，Cleveland，OH)实验室的一份厚礼。如前所述，DLD1-DR细胞对5’-氟尿嘧啶(5’-FU)(Millipore-Sigma，St.Louis，MO)产生耐药性，其IC50为210.6μM，而DLD-1细胞的IC50为2.5μM。Zhu,H.等人,Mol Cancer Ther,2005.4(3):p.451-6。RKO-DR细胞对10μM 5’-FU和15μM CB-839(一种谷氨酰胺酶抑制剂，Selleck Chemicals，Houston，TX)的联合治疗产生耐药性。DLD-1和DLD1-DR细胞在McCoy’s 5A培养基(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)中培养。RKO和RKO-DR细胞在RPMI1640培养基(Sigma)中培养。两种培养基均补充有10％胎牛血清和100单位/mL青霉素/链霉素。所有细胞在37℃和5％CO2下生长。
蛋白质印迹
通过用细胞裂解缓冲液(PBS中蛋白酶抑制剂与Laemmli缓冲液的1:1混合物)处理细胞团块，然后在100℃下孵育10分钟，然后在4℃下以15000rpm离心15分钟，来进行总蛋白提取。根据制造商的说明书(Bio-Rad，Hercules，CA)，使用Lowry测定试剂盒测定提取物的蛋白质浓度。将等量的蛋白质提取物(40μg)加载到SDS-PAGE上进行电泳，并转移到硝化纤维膜上。使用以下一级抗体(1:1000稀释，在4℃下孵育过夜)：抗-MDR1、抗-E-钙粘蛋白和抗-β-肌动蛋白(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)和抗-N-钙粘蛋白(1:500稀释，Abcam，Cambridge，MA)。二级抗体孵育(1:2000稀释2小时)后，使用Signal Fire Plus ECL试剂盒(Cell Signaling Technology)开发膜，并在ChemiDocTMXRS+成像仪(Bio-Rad)上成像。使用FIJI和ImageLab(Bio-Rad)软件对带强度进行量化。
qRT PCR
根据制造商的方案，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，Germantown，MD)从CRC细胞中提取总RNA。用miScript II RT试剂盒(Qiagen)通过逆转录产生cDNA，并使用SyBr Green PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)进行qPCR。通过2-ΔΔCt法测定相对基因表达。β-肌动蛋白作为持家基因。
侵袭和迁移测定
进行标准的transwell实验以评估CRC细胞的迁移和侵袭。为了测试迁移，将100000个CRC细胞(饥饿过夜)置于transwell inserts(VWR，Radnor，PA)中。第二天，小室被内部擦拭以去除未迁移的细胞。小室底部的迁移细胞用10％福尔马林(10分钟)固定，然后用0.1％结晶紫染色(20分钟)固定。清洗多余的污渍，并将transwell干燥过夜，然后用10倍物镜在Moticam T2相机上成像。为了测试侵袭，transwell inserts涂有1mg/mLCorningTMMatrigelTM膜基质(Corning，NY)，用于评估CRC细胞侵袭基质凝胶层以及小室多孔膜的能力。将约200000个CRC细胞(饥饿过夜)用于该实验，并如上所述进行处理。使用FIJI(FIJI is Just ImageJ)软件对侵袭和迁移细胞进行定量。
3D培养和ZD2-Cy5.5染色
使用Matrigel培养物测试CRC细胞在3D培养中生长的能力。将约900000个CRC细胞置于涂有一厚层CorningTMMatrigelTM膜基质的4孔微玻片(Ibidi，Fitchburg，WI)中。使用带有10X物镜的Moticam T2相机监测和拍摄肿瘤球状体/类器官形成4天。为了测试EDB-FN表达，将肿瘤球状体用100nM ZD2-Cy5.5和5μg/mL Hoechst-33342孵育30分钟。用PBS洗涤过量染料三次，并在10X和20X物镜的Olympus FV1000共焦显微镜(Japan)上进行荧光成像。使用FIJI进行图像处理。
小鼠模型
从杰克逊实验室(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，MA)购买裸无胸腺小鼠(6周大的nu/nu雌性)，并将其安置在CWRU的动物设施中。所有动物实验均按照CWRU IACUC批准的方案进行。为了评估耐药性，建立了2个耐药和2个非耐药模型。将悬浮在Matrigel-PBS混合物(1:1)中的约3-4x106个DLD-1、RKO、DLD1-DR和RKO-DR细胞皮下注射到裸小鼠的左侧腹(每只小鼠100μL，每组5只小鼠x 4个模型＝20只小鼠)。9天后，当肿瘤达到100-200mm3时，用40μmol/kg剂量的MT218对4个异种移植模型进行MRMI。然后对动物实施安乐死，并收获肿瘤进行尸检组织学和IHC。
为了进行治疗监测，将悬浮在Matrigel-PBS混合物(1:1)中的3-4x106个DLD1-DR细胞皮下注射到10只裸小鼠的左侧腹(每只小鼠100μL，标记为TM1至TM10的小鼠)。使用卡尺每周监测和测量一次肿瘤体积。当平均肿瘤体积达到100mm3时，将小鼠随机分为两组，每组5只：载体组(小鼠#TM1、TM3、TM4、TM5和TM10)和处理组(小鼠#TM 2、TM6、TM7、TM8和TM9)。每周一次，治疗组的小鼠接受MK2206-HCl(100mg/kg)，载体组的小鼠注射等量的DMSO，如前所述。Smith,J.A.,L.J.Stallons和R.G.Schnellmann,Am J Physiol Renal Physiol,2014.307(4):p.F435-44。处理3周后，肿瘤体积增加超过1000mm3，实验终止。然后对动物实施安乐死，并收获肿瘤进行尸检组织学和IHC。肿瘤体积计算为[(宽度)2x长度]/2。
用MT218进行EDB-FN的MRMI
如前所述合成MT218。Ayat,N.R.等人,ACS Med Chem Lett,2018.9(7):p.730-735。简言之，炔基-ZD2和N3-Gd(HP-DO3A)之间的点击反应在室温下在CuSO4和抗坏血酸的存在下进行，随后通过MALDI-TOF质谱(m.w.1443)进行FLASH色谱纯化和MT218验证。为了评估耐药性和治疗监测，在具有小鼠短四线圈(mouse short quad coil)的3TMRS 3000扫描仪(MR Solutions，Surrey，UK)中进行MRMI。用异氟烷麻醉小鼠并设置尾静脉导管。在注射40μmol/kg剂量的MT218[ZD2-N3-Gd(HP-DO3A)]之前(造影前)和25分钟之后(造影后)获得T1-加权MR图像。以下两个序列用于呼吸门控：轴向快速自旋回波(FSE)(TR＝305ms，TE＝11ms，FA＝90°，FOV＝40mm x 40mm，切片厚度＝1mm，切片数＝15，Nav＝2，矩阵＝256x256)和冠状FSE(TR＝305ms，TE＝11ms，FA＝90°，FOV＝90mm x 90mm，切片厚度＝1mm，切片数＝20，Nav＝1，矩阵＝248x512)。为了进行治疗监测，在10只患有DLD1-DR肿瘤的小鼠上，使用40μmol/kg MT218剂量的上述序列进行基线MRMI(第1周)和终点MRMI(4周)。对比噪声比(CNR)计算为(平均肿瘤强度-平均肌肉强度)/噪声标准差。使用FIJI软件进行图像和CNR分析。在整个肿瘤、2-4个肌肉区域和背景周围绘制ROI。CNR分析由2名个体独立进行，一次盲法，以避免偏差。
人和小鼠组织的免疫组织化学
从CWRU的人体组织采购设施(Human Tissue Procurement Facility)获取去识别和去分类的人体组织试样，包括原发性结肠腺癌(n＝6)、肝转移(n＝4)及其相应的正常相邻组织(n＝6+4)。将解剖的小鼠肿瘤组织固定在10％中性缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中，并切成1μm切片。染色和IHC服务由病例综合癌症中心组织资源核心设施(TissueResources Core Facility of the Case Comprehensive Cancer Center)和克利夫兰大学医院(University Hospitals of Cleveland)提供。切片用H&E染色以可视化形态学。如前所述，使用抗EDB-FN抗体G4克隆(1:100稀释；Absolute Antibody，UK)进行免疫组织化学。所有切片均由一名经认证的病理学家检查。IHC图像使用带40X物镜的Bx61VS玻片扫描显微镜(Olympus)获得，并在OlyVIA软件中处理。
基因数据和统计分析
GEPIA2中导出了与EDB-FN表达相关的总生存率(OS)和无增殖生存率(PFS)数据(转录物ID:ENST00000432072.6)的Kaplan-Meier曲线。Tang,Z.等人,Nucleic Acids Res,2017.45(W1):p.W98-W102。该web服务器分别评估TCGA和GTEx数据库中的肿瘤/正常数据和正常组织数据(转录物每百万)，并采用对数秩(Log-rank)或Mantel-Cox检验进行统计生存分析，采用Cox-PH模型进行危险比(HR)计算。
除非另有说明，所有实验均独立重复至少3次(n＝3)。数据表示为平均值±s.e.m。使用GraphPad Prism 7.03版进行统计分析。使用未配对t检验比较两组之间的数据(正态分布)。否则，如相关图例所述，使用非参数测试(Mann-Whitney U测试)。多个细胞系的时间进程MRMI数据通过具有Tukey校正的双向方差分析(ANOVA)进行分析。p<0.05被认为具有统计学意义。
结果
获得性耐药性增强CRC细胞的迁移和侵入
产生了两个独立的耐药性CRC系：DLD-1细胞中通过长期使用5’-FU治疗产生的DLD1-DR和RKO-DR细胞中通过使用5’-FU和CB-839联合治疗产生的RKO-DR，并评估其生物学特性。通过相差显微镜监测在2D和3D培养中生长的细胞的形态。虽然DLD-1细胞在2D培养中显示出规则的上皮形态和在3D培养中显示出多细胞葡萄状簇(图1A)，但DLD1-DR细胞在2D培养中形成列岛状体，在3D培养中形成致密球状体。RKO和RKO-DR细胞的单层培养物没有显示出明显的形态学差异(图1B)。另一方面，在3D培养中，RKO-DR细胞容易形成致密和聚集的肿瘤球状体，而RKO细胞不能形成球状体。这些结果表明，在单层和3D培养中，CRC细胞系之间存在不同的形态学变化。
接下来，通过蛋白质印迹和qRT-PCR分析CRC细胞信号传导通路中耐药性诱导的分子变化。由于药物外排泵和上皮间充质转化(EMT)与耐药性的发生有关，因此测定了多药耐药性蛋白1(MDR1)和EMT标志物(E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白)的蛋白和mRNA表达。在蛋白质水平上，与DLD-1细胞相比，DLD1-DR细胞显示出MDR-1的显著上调和适中的EMT，E-cad水平适度降低，N-cad水平增加(图1C)。在mRNA水平上，DLD1-DR细胞显示MDR-1增加4倍，E-cad和N-cad的mRNA水平没有变化(图1D)。另一方面，与RKO细胞相比，RKO-DR显示出在蛋白质(图1E)和mRNA(图1F)水平上显著升高的MDR1和E-cad。N-cad蛋白表达在RKO-DR细胞中也升高，表明RKO-DR中存在上皮细胞和间充质细胞的混合或部分/杂交E-M表型。
通过测试CRC细胞的迁移潜力，评估获得性耐药在CRC细胞中的功能影响。如图1G-H和图S1B-C所示，DLD1-DR和RKO-DR细胞展现出通过穿过transwell膜的迁移增加，以及通过穿过涂覆在transwell膜上的额外基质凝胶层的侵袭增加。总之，这些结果表明，无论因获得耐药性而引起的明显形态学和分子变化如何，CRC细胞都比其亲本细胞获得了显著的侵袭优势。
获得性耐药性与CRC细胞中EDB-FN表达升高相关
我们先前表明，EDB-FN在耐药、侵入性乳腺癌(Han,Z.等人,Nat Commun,2017.8(1):p.692)和侵袭性前列腺癌中过度表达。Han,Z.等人,Bioconjug Chem,2017.28(4):p.1031-1040。在此，我们分别在2D和3D培养中使用qRT-PCR和EDB-FN特异性肽探针ZD2-Cy5.5(Han,Z.等人,Bioconjug Chem,2015.26(5):p.830-8)评估了耐药性的发展是否上调CRC细胞中EDB-FN的表达。
如图2A所示，DLD-1和DLD1-DR细胞都表达EDB-FN，这在ZD2-Cy5.5结合中很明显。然而，DLD1-DR细胞显示出更亮的荧光信号，表明ZD2-Cy5.5结合更高，这通过DLD-1细胞上EDB-FN mRNA水平的3倍上调得到证实(图2B)。还发现DLD1-DR细胞中总FN1表达随着耐药性而增加(约3倍，图2C)。类似地，尽管RKO和RKO-DR细胞都分泌EDB-FN，但其在后者中的表达明显更高，这反映在明暗度强的ZD2-Cy5.5染色(图2D)中以及EDB-FN mRNA的约为前者的4.5倍的增加(图2E)上。RKO-DR细胞中总FN1仅增加1.5倍(图2F)。这些结果表明CRC细胞中获得性耐药性与EDB-FN过度表达相关。
使用MT218的EDB-FN造影增强的MRMI有助于耐药CRC肿瘤的有效鉴别诊断
为了确定EDB-FN过度表达是否可以用作区分非耐药和耐药CRC肿瘤的分子标志物，使用EDB-FN靶向造影剂MT218在携带皮下异种移植物DLD-1、DLD1-DR、RKO和RKO-DR的无胸腺nu/nu小鼠中进行MRMI。在注射40μmol/kg MT218之前和之后25分钟，获取T1-加权的冠状和轴向图像。我们之前表明，MT218的亚临床剂量与MT218的标准剂量(0.1mmol/kg)和临床造影剂钆特醇一样有效。Ayat,N.R.等人,Front Oncol,2019.9:p.1351。
初步时间进程分析显示，在DLD-1和RKO肿瘤模型中，MT218注射后35分钟，CNR显著增强并增加。由于在20至35分钟之间观察到峰值增强，因此选择25分钟的时间点用于随后的耐药性评估。使用MT218的EDB-FN的MRMI导致非耐药DLD-1和RKO肿瘤的信号增强(图3A-D)，CNR分别比造影前增加1.53倍和1.4倍(图3E-F)。耐药DLD1-DR和RKO-DR肿瘤表现出明显更强的信号增强，反映在CNR比造影前分别高3.3倍和2.6倍(图3A-F)。重要的是，这种信号增强比它们的非耐药对应物更强，导致CNR分别比非耐药DLD-1和RKO肿瘤高2.2倍和1.8倍(即，增加120％和84％)(图3E-H)。成像后处死小鼠，并用G4抗体处理其肿瘤组织用于H&E染色和EDB-FN免疫组织化学(IHC)。如图3I-J所示，H&E染色未显示出耐药和非耐药CRC肿瘤之间的显著差异，两者均显示高等级、低分化和有丝分裂活性的多形性癌细胞。与DLD-1和RKO肿瘤相比，EDB-FN的IHC在DLD1-DR(图3I)和RKO-DR(图3J)肿瘤中显示出更强的染色。EDB-FN染色定位于肿瘤细胞和细长纺锤状散布的癌相关成纤维细胞(CAF)中，分别用红色和黑色箭头表示。该IHC数据与四个模型中观察到的信号增强和CNR相关，表明用减少剂量的MT218的EDB-FN的MRMI可促进CRC模型中耐药性的无创评估。
使用MT218的EDB-FN的MRMI促进耐药CRC肿瘤的治疗反应监测
在对耐药CRC肿瘤进行鉴别诊断后，在用MK2206-HCl(一种泛-AKT抑制剂)治疗的DLD1 DR小鼠中测定EDB-FN的MRMI在无创评估治疗反应中的潜力。图4A显示用于疗效监测的治疗方案和MRMI的时间线的示意图。肿瘤植入后一周，进行基线MRMI，然后将小鼠随机分为载体组(DMSO处理：TM1、TM3、TM4、TM5、TM10)和治疗组(MK2206处理：TM2、TM6、TM7、TM8、TM9)。小鼠每周治疗一次，持续3周，由于肿瘤负荷高，在第4周进行终点MRMI，随后进行尸检组织学检查。每周监测一次肿瘤体积。图4B显示了4周内肿瘤生长的进展。载体组和治疗组的平均肿瘤体积均显著增加，分别从97.7±8.14mm3增加到813.4±259.7mm3和从110.5±11.97mm3增加到1249.7±199.3mm3。尽管在载体组和治疗组的最终平均肿瘤体积之间没有发现显著差异(p＝0.22)，但后组中的单只小鼠显示出明显更严重和更大的肿瘤，表明耐药肿瘤对治疗没有反应。还监测了单只小鼠的肿瘤体积(图4C)，以与终点MRMI信号和EDB-FN表达相关。每只小鼠(从TM1-TM10标记)显示肿瘤体积显著增加，程度或多或少。
使用MT218，通过EDB-FN的终点MRMI监测肿瘤生长。如图5A所示，当进行基线MRMI时，载体组中的每只小鼠与造影前相比显示出信号增强。注射DMSO 3周后，所有5只小鼠在终点MRMI中显示出信号增强；与其他3只小鼠(TM1、TM4和TM10)相比，小鼠#TM3和TM5显示出增加的信号增强和肿瘤大小，图5B。该数据的量化显示出一致的趋势，TM3和TM5小鼠显示出在第1至4周CNR增加，TM1、TM4和TM10小鼠显示出在第1至4周CNR减少(图5C)。MRMI信号也与肿瘤体积的增加相关，其中TM3和TM5小鼠与TM1、TM4和TM10小鼠相比肿瘤体积快速增加(图4C)。从第1周到第4周，载体组的平均CNR之间没有发现显著差异(图5D)。EDB-FN的尸检组织学和IHC在TM3中显示出比TM10中更强的G4染色，表明用MT218的EDB-FN的MRMI与内源性肿瘤EDB-FN表达相关(图5E)。
对于治疗组，在基线MRMI期间，5只小鼠中的每一只都显示出高于造影前的高信号增强(图6A)。尽管进行了3周的治疗，耐药DLD1-DR肿瘤对治疗没有反应，其大小也相对于造影前随着信号增强的增加而增加(图6B)，反映在第1周至第4周个体小鼠的CNR升高(图6C)。在5只小鼠中，小鼠#TM7表现出最高的信号增强和CNR，以及最大的肿瘤体积(图4C)。另一方面，小鼠#TM2、TM6、TM8和TM9显示出在第1至4周CNR和肿瘤体积增加，但未检测到两者之间的相关模式。治疗组的平均肿瘤CNR从第1周增加到第4周(图6D)，证实耐药肿瘤对治疗没有反应，并且表现比载体组差。与TM9(图6E)以及载体治疗的小鼠#TM3和TM10(图5E)相比，EDB-FN的尸检组织学和IHC显示小鼠#TM7的肿瘤的强的G4染色，进一步证实EDB-FN表达与基于MRMI的监测的直接相关性。尽管治疗组第4周的平均CNR高于载体组，但无统计学意义(p＝0.055，图S4)。总之，这些结果表明使用MT218的EDB-FN的MRMI可以促进耐药CRC肿瘤的无创治疗监测。
EDB-FN在人结肠腺癌中过度表达，并与患者生存率低相关
为了评估在CRC患者中使用EDB-FN的MRMI的可行性，在结肠腺癌(COAD)、转移性肝脏及其相应的正常相邻组织的代表性人类试样中分析EDB-FN表达。发现原发性COAD肿瘤在未治疗患者(图7A)和治疗患者(图7B)中均表现出强烈的EDB-FN表达，而在相应的正常相邻组织中表达可忽略不计。另一方面，COAD肝转移显示出不同的EDB-FN水平，未治疗患者中中度染色(图7C)，治疗患者中强染色(图7D)，正常相邻肝脏中无染色。关于该模式，大多数EDB-FN染色在基质的成纤维细胞和癌相关的成纤维细胞(黑色箭头)中观察到，一些在肿瘤细胞(灰色箭头)中，在原发和转移部位观察到。此外，对TCGA和GTEx数据库的RNA-Seq数据的分析表明，EDB-FN水平的增加与COAD患者的总体生存率(OS)差(图7E)和无进展生存率差(图7F)相关，这表明EDB-FN过度表达可能是COAD的预后指标。
讨论
这项工作表明，与非耐药肿瘤相比，侵入性耐药CRC肿瘤过度表达ECM蛋白EDB-FN。对靶向治疗呈阴性反应的耐药CRC肿瘤也上调EDB-FN。这些治疗压力诱导的EDB-FN水平的改变使得即使在MT218的亚临床剂量下，也能够通过MRMI对耐药CRC进行有效的无创评估和治疗反应监测。
CRC的分子多样性前景强调了对可提供诊断、预后或治疗预测价值的稳健肿瘤标志物的需求。在这里，我们首次发现EDB-FN的过度表达与CRC患者的生存率呈负相关。先前的一项研究表明，使用了FDC-6抗体的高oncFN1水平的术后CRC患者预后不佳，该抗体与FN1的另一种癌胚同种型结合。Inufusa,H.等人,Cancer,1995.75(12):p.2802-8。患者试样的免疫组织化学分析显示，在原发性和转移性CRC部位，G4抗体具有强烈的EDB-FN特异性染色。发现EDB-FN位于间质、间质成纤维细胞、腺癌细胞和散布在这些肿瘤细胞周围的成纤维细胞中。这些结果证实最近出现的共识，即肿瘤环境中的多种细胞类型表达EDB-FN(Midulla,M.等人,Cancer Res,2000.60(1):p.164-9)，表明肿瘤微环境的细胞和细胞外成分的多方面相互作用。由正常邻近结肠和肝脏组织中完全不存在G4染色表明EDB-FN的深刻的肿瘤特异性表达，这意味着EDB-FN是CRC的一个有吸引力的候选标记。在肌肉浸润性膀胱癌患者的尿液试样中检测到EDB-FN水平增加超过300％，并且与他们的临床结果呈负相关，这也证明了其作为其他癌症诊断标志物的潜力。Arnold,S.A.等人,Clin Exp Metastasis,2016.33(1):p.29-44。
2D和3D培养均证明耐药CRC细胞的侵入力与其内源性EDB-FN表达之间存在正相关。在两种非耐药模型之间，DLD-1细胞表现出比RKO细胞更高的EDB-FN表达。这与模型的固有生物学特性一致，其中源自Duke C型、p53突变、表达CEA的腺癌的DLD-1细胞比源自p53-、K-Ras-野生型原发癌位点的RKO细胞更具侵入性和迁移性。Gu,C.等人,Cell Death Dis,2018.9(6):p.654。DLD-1细胞对5’-FU和RKO细胞对5’-FU+CB-839的耐药性发展导致动态改变的EMT样DLD1-DR和杂交的E-MRKO-DR细胞，突出了治疗压力诱导的克隆选择后两个细胞系所采取的不同轨迹。这两种药物难治性细胞系都表现出ATP结合盒(ABC)转运体MDR-1的强烈过表达，鉴于细胞外流增强是5’-FU抗性的常见机制，这一点并不令人惊讶。Skarkova,V.等人,Cells,2019.8(3)。很可能是杂合E-M表型诱导的可塑性增强赋予RKO-DR细胞CB-839抗性。先前已在CB-839耐药乳腺癌中观察到增强的可塑性和代谢冗余，尽管CRC中谷氨酰胺酶抑制耐药的确切机制仍不清楚。Reis,L.M.D.等人,J Biol Chem,2019.294(24):p.9342-9357。
无论异质性分子变化和EMT状态如何，这两种耐药细胞系获得侵入性和迁移性都与EDB-FN的显著上调相关。这种上调在耐药的DLD1-DR和RKO-DR异种移植物中得到重现，与各自的非耐药对应物相比，它们在使用EDB-FN靶向造影剂MT218的MRMI中表现出强大的信号增强和明显较高的CNR，这表明EDB-FN作为一种有前途的诊断肿瘤标志物的潜力。我们以前表明EDB-FN在耐药乳腺癌细胞中过度表达。其他组也证明在CRC细胞和肿瘤中EDB-FN的升高。El-Emir,E.等人,Br J Cancer,2007.96(12):p.1862-70。据我们所知，这是第一份证明在药物难治性CRC中EDB-FN过度表达的报告。这些升高的EDB-FN水平可用于ZD2靶向的MRMI介导的肿瘤进展的无创监测，以确定耐药性发展之前的关键事件和阶段。
耐药性是肿瘤治疗和癌症放射治疗的祸根。准确无创地评估这些耐药细胞和肿瘤对肿瘤治疗的反应(在治疗几天内早期)有可能彻底改变当代癌症治疗范式。多种临床证据表明，治疗反应的评估不能仅基于肿瘤大小的变化。因此，我们假设与疾病的侵袭性质相关而与肿瘤大小无关的大量过度表达的EDB-FN的分子成像可以潜在地提供对治疗的准确肿瘤反应。在我们的治疗方案中，高度耐药的DLD1-DR肿瘤对MK2206 HCl治疗的失败反映在其EDB-FN水平的增加，以及随后的MT218摄取的增加，这通过MRMI中强烈的信号增强和CNR的增加来证明。这些肿瘤的大小也增加了，载体肿瘤也是如此；然而，后者没有显示出与经治疗的肿瘤相当的EDB-FN和MT218摄取的增加，表明MRMI基于固有的EDB-FN表达，而不是解剖肿瘤大小。尽管考虑到我们关于磷酸化-AKT信号传导在乳腺癌细胞中的EDB-FN调节中的作用的发现，对MK2206-HCl的消极反应是出乎意料的，但我们推测，药物外排泵MDR-1的可塑性增强和过度表达可能导致DLD1-DR肿瘤对MK2206HCl无反应。之前还显示，在5’-FU治疗的DLD-1细胞中，替代性AKT非依赖性致癌信号传导(例如NF-κβ)的补偿性激活[62]。由于肿瘤负担大，治疗在第4周终止，排除了任何其他适应性干预或成像测试。尽管这项研究仅限于原发性肿瘤的成像，但有希望的结果值得进一步研究，以分析其他参数和成像模式，并监测肿瘤体积，以验证和关联各种治疗的肿瘤反应。
只有两份先前关于使用125I标记的L19-SIP抗体在CRC中进行基于EDB-FN的放射免疫治疗的报告，其证明了CRC异种移植物(El-Emir,E.等人,Br J Cancer,2007.96(12):p.1862-70)和CRC患者(Santimaria,M.等人,Clin Cancer Res,2003.9(2):p.571-9)中的选择性肿瘤摄取和肿瘤生长抑制；然而，以前从未对耐药CRC进行过基于EDB-FN的MRMI评估。我们的初步数据为将EDB-FN靶向的分子成像单独并作为其他筛查模式的辅助手段转化为临床可行的CRC治疗技术奠定了基础。MRI在CRC成像中的挑战之一是准确检测肝CRC转移，这是患者结果的主要预后指标。鉴于我们和独立研究人员在患者转移性肝脏标本中观察到EDB-FN表达升高，准确和及时地检测这些回避小生境可以在治疗方案中提供关键的诊断优势。尽管MRI是直肠癌分期的主要选择，但其在肿瘤治疗后肿瘤复发方面的表现并不一致。因此，在计划手术干预之前，评估用MT218进行的MRMI在确定患者在“等待和观察”期间对新辅助治疗的反应方面的效果将是令人感兴趣的。
尽管造影增强的MRI对诊断仍然至关重要，但累积暴露于造影剂，尤其是线性GBCA，会导致Gd在患者的大脑、骨骼甚至皮肤中沉积和长期积累。MT218是具有高稳定性和良好安全性的临床大环造影剂钆特醇的小肽缀合物。我们最近证明，与乳腺癌模型中0.1mmol/kg的标准临床剂量相比，MT218在40μmol/kg的降低剂量下对MRMI有明显的肿瘤特异性增强。Ayat,N.R.等人,Front Oncol,2019.9:p.1351。用降低剂量的MT218的MRMI的未打折疗效可以最大限度地降低Gd相关和剂量依赖性毒性的潜在风险。该低剂量也足以在本研究中有效评估CRC和耐药CRC肿瘤。由于MT218的高T1弛豫效能(3T时为6.13mM-1s-1)、亚临床剂量下的有效MRMI，以及肿瘤微环境中丰富的EDB-FN易于与MT218结合，我们推测，Gd暴露减少的MRMI有望用于CRC的主动监视和治疗监测。鉴于肿瘤细胞的可塑性在肿瘤进展和治疗反应中产生了广泛的患者间差异，即使在相同的癌症类型中，基于EDB-FN肿瘤水平的用MT218的MRMI可以在化疗期间早期检测耐药性的发展，从而帮助为相关患者量身定制治疗方案，提高肿瘤治疗的成功率。
EDB-FN特异性ZD2肽的独特优势也可用于开发用于多参数分子成像的集成成像系统，如PET/MRI或PET/CT。事实上，PET和SPECT探针已经通过将EDB-FN特异性ZD2肽共轭到放射性示踪剂(如64Cu DOTA、68Ga NOTA和99mTc-HYNIC螯合物)来产生，以分别改善前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌的检测。Han,Z.等人,ACS Omega,2019.4(1):p.1185-1190；Gao,S.等人,AmJ Nucl Med Mol Imaging,2019.9(5):p.216-229。这些系统还可以提供对CRC的几个方面的深入了解，包括原发性肿瘤切除后的转移监测，化疗处理的同基因模型中CRC的成像，以及对免疫疗法的肿瘤反应的评估。除ZD2外，其他EDB-FN靶向配体、抗体和纳米体，包括APT-FN-EDB、L19、BC1和NJB2，也已用于向肿瘤ECM和脉管系统输送治疗剂和成像剂，验证了EDB-FN作为一种有前途的肿瘤标志物的作用。Tijink,B.M.等人,Eur J Nucl Med MolImaging,2009.36(8):p.1235-44；Jailkhani,N.等人,Proc Natl Acad Sci U S A,2019.116(28):p.14181-14190。
总之，我们证明结肠腺癌(COAD)标本中肿瘤特异性EDB-FN的表达，以及EDB-FN水平高的COAD患者预后不良。尽管CRC细胞和肿瘤异种移植物固有地表达EDB-FN，但其表达在耐药对应物中进一步升高。用剂量显著减少的MT218的EDB-FN的MRMI可促进耐药CRC的有效无创评估和治疗监测，突出了MT218介导的EDB-FN靶向MRMI在主动监视和监测耐药肿瘤中的转化潜力。
实施例2：结构域外-B纤连蛋白的过度表达与乳腺癌细胞的侵入力相关
乳腺癌(BCa)是一种毁灭性疾病，在美国每年造成41000人死亡。尽管局部性BCa患者的生存率接近99％，但在远处转移和耐药患者中，生存率急剧下降。该病临床治疗的一个主要障碍是肿瘤异质性，它在BCa进展的动态性质中起作用。全基因组测序和剖析研究表明，同一组织学亚型的乳腺肿瘤在不同阶段的BCa患者中表现出不同的分子画像和离散轨迹。随机突变、基因组不稳定性以及来自遗传、表观遗传、环境和治疗刺激的选择性压力引起的克隆进化导致具有显著生长和侵袭优势的高风险肿瘤群体的出现。原发性和转移性肿瘤中广泛的空间和时间差异直接影响诊断、治疗和预后结果。由于缺乏肿瘤转移和侵袭特性的特异性标志物，目前的成像方式(包括MRI、PET和CT)在检测和区分低风险肿瘤和高风险肿瘤方面能力有限。这些事实强调了需要发现和表征合适的分子标志物，这些标志物可以促进无创检测、风险分层、乳腺肿瘤的积极监测，以及及时评估治疗反应，尽管它们具有动态性。
肿瘤细胞外基质(ECM)通过在肿瘤细胞和肿瘤微环境(TME)之间传递致癌信号以及通过支持生长、凋亡逃逸、迁移、炎症和免疫逃避来在肿瘤进展的各个方面发挥关键作用。纤连蛋白(FN1)是正常ECM和肿瘤ECM的一个必需组分，是一种调节粘附、运动性、生长和发育的重要糖蛋白。然而，它的另一种剪接变体，被称为结构域外-B纤连蛋白(EDB-FN)，已知在恶性转化期间表达，而通常在健康成人组织中不存在。Han,Z.和Lu,Z.R.,J MaterChem B 5,639-654(2017)。多条证据表明，EDB-FN与上皮间充质转化(EMT)、癌细胞干、增殖、血管生成和转移有关，所有这些都反映肿瘤的侵袭性。Han等人,Magn Reson Med 79,3135-3143(2018)。临床研究证明，EDB-FN在肺癌、脑癌、结直肠癌和卵巢癌患者中存在。Santimaria等人,Clin Cancer Res 9,571-579(2003)。EDB-FN的过度表达还与乳腺肿瘤的组织学分级(Loridon-Rosa 等人,Cancer Res 50,1608-1612(1990))和口腔癌患者的生存率差(Lyons等人,Br J Oral Maxillofac Surg 39,471-477(2001))相关，表明其作为多发性肿瘤的标志物的潜在作用。
另一层复杂性是，即使在同一种癌症类型中，EDB-FN表达谱也是不同的，并且对细胞或组织的分子和功能特征具有特异性。例如，使用EDB-FN特异性肽探针ZD2-Cy5.5，我们先前表明，侵入性癌细胞系，例如PC3(前列腺)和MDA-MB-231(激素受体阴性乳腺癌)富含EDB-FN，而侵入性较小的癌细胞系(例如LNCaP(前列腺))和MCF7(激素受体阳性乳腺癌)表现出显著较低的EDB-FN水平。Han等人,Bioconjug Chem 26,830-838(2015)；Han等人,NatCommun 8,692(2017)。EDB-FN的这种差异表达被用于使用EDB-FN靶向的MRI造影剂从无创异种移植物中鉴别诊断侵入性前列腺癌和乳腺癌肿瘤。Ayat等人,ACS Med Chem Lett 9,730-735(2018)。其他独立的研究组也使用EDB-FN作为靶向成像和治疗递送各种癌症的分子靶标。Sun等人,Theranostics 4,845-857(2014)；Ye等人,ACS Omega 2,2459-2468(2017)。
鉴于肿瘤的高度可塑性，很明显，不同的选择压力、环境和实验刺激将引起TME和EDB-FN表达的显著变化，进而影响EDB-FN靶向的成像和治疗干预的临床结果。在这里，我们试图确定在对非侵入性、低EDB-FN表达的乳腺癌细胞施加两种不同的选择压力后EDB-FN的表达模式的变化，以及它们随后演变为侵入性高风险群体。为此，两种乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-468通过用细胞因子TGF-β和化疗药物处理以诱导随机交替和克隆进化而获得了显著的生存优势。所产生的群体也用高度特异性AKT抑制剂处理，以进一步评估EDB-FN水平的变化与高危细胞对靶向治疗的反应的相关性。
结果
乳腺癌中EDB-FN表达显著升高
作为一种关键的ECM成分，FN1在多种癌症类型中过度表达。Han,Z.和Lu,Z.R.(2017),J Mater Chem B 5,639-654。在此，评估了TCGA和GTEx数据库中1084个乳腺肿瘤和291个正常乳腺试样中其癌胚同种型EDB-FN(转录物ID:ENST00000432072.6)的表达。差异EDB-FN表达分析和生存相关性数据来自网络服务器GEPIA228。如图8A所示，与正常乳腺组织(中位数2.410转录物/百万(TPM))相比，乳腺肿瘤证明EDB-FN显著过度表达[中位数36.319TPM]，意味着乳腺癌比正常组织有3.452的极显著的对数(log2)倍增长(调整后的P值＝6.57e-69)。此外，发现EDB-FN的较高表达与乳腺癌患者的总体生存率差显著相关(图8B)，风险比为1.9[p(HR)＝0.022]，证明其预后价值。
为了深入了解临床试样中EDB-FN表达的位置和模式，用EDB-FN特异性G4抗体对乳腺肿瘤标本和正常邻近组织进行染色。如图8C所示，EDB-FN在癌细胞相关成纤维细胞(绿色)、基质和基质成纤维细胞(红色)以及乳腺癌的有丝分裂肿瘤细胞(紫色)中大量表达。此外，与邻近组织相比，EDB-FN在乳腺肿瘤组织中的表达明显更高(图8D)。除原发组织外，EDB-FN也在淋巴结(图8E)、肺和脑转移(图8F)中高度表达，表明癌胚EDB-FN同种型在恶性乳腺表型中高度表达。
接下来，在一组代表乳腺癌多分子亚型的细胞系中测定EDB-FN mRNA的内源性水平与其侵入特性的相关性。如图8G-H所示，最低侵入性激素受体阳性(HR+)MCF7细胞显示出EDB-FN的最低表达。更具侵入性的三阴性(HR-)乳腺癌细胞系显示出EDB-FN水平显著上调，MDA-MB-468和BT549细胞中增加约9-10倍，MDA-MB-231细胞中增加14倍，Hs578T细胞中增加超过700倍。总之，这些结果证明了EDB-FN过度表达作为乳腺癌分子标志物的潜力。
TGF-β治疗和耐药对2D-和3D-培养的乳腺癌细胞生长和形态的改变
为了评估乳腺癌细胞获得显著生存优势时EDB-FN表达水平的变化，选择EDB-FN最低表达和上皮表型的两种细胞系，即MCF7和MDA-MB-468细胞。应用两种选择性压力：1)使用TGF-β(5ng/mL)的长期处理诱导EMT30生成MCF7-TGFβ和MDA-MB-468-TGFβ细胞；2)获得对细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂帕博西尼(Palbociclib)和对抗微管剂紫杉醇的化学抗性，以分别生成MCF7-DR和MDA-MB-468-DR细胞。耐药标志物P-糖蛋白1或多药耐药蛋白(MDR1)在MCF-DR和MDA-MB-468-DR细胞中的显著过度表达证实了耐药性的获得。对亲本和衍生细胞系的形态、分子和功能表型进行表征。
如图9A所示，MCF7细胞在2D培养中表现出典型的上皮形态。用TGF-β的长期处理和对帕博西尼的耐药性的发展导致形态学改变为更具间质表型，这在MCF7-DR细胞中比在MCF7-TGFβ细胞中更明显。另一方面，MDA-MB-468细胞没有表现出在TGF-β处理下的明显形态变化和对紫杉醇的耐性的发展变化。然而，与亲本MDA-MB-468细胞相比，MDA-MB-468-TGFβ显示出增加的增长速率。
除了9D培养外，细胞在基底膜(Matrigel)中生长，以促进建立有利的ECM。如图9B所示，在9D培养中，低风险HR+MCF7细胞显示出可忽略的肿瘤球状体形成，而侵入性更强的MDA-MB-468细胞显示出增殖性网络形成。与亲本MCF7细胞不同，MCF7-TGFβ和MCF7-DR细胞形成肿瘤球状体，而MDA-MB-468-TGFβ和MDA-MB-468-DR细胞与其亲本细胞形成类似的增殖网络。这些结果突出了每种癌细胞类型的不同性质及其对外部有丝分裂刺激的不同反应。
TGF-β处理和耐药性乳腺癌细胞的增加的迁移
接下来，我们分析了TGF-β处理的和耐药乳腺癌细胞的分子和功能变化。TGF-β是EMT的有效诱导因子，是转移起始的关键步骤。类似地，EMT的信号传导程序与耐药性密切相关，其中EMT样分子标记可以对抗乳腺癌的化疗。Huang,J.,Li,H.和Ren,G.(2015),Int JOncol 47,840-848。因此，在衍生细胞系中测试了常见EMT标志物N-钙粘蛋白(N-cad)、E-钙粘蛋白和Slug(侵入标志物)的表达。如图9C所示，MCF-TGFβ和MCF7-DR细胞均显示出E-cad和N-cad表达上调，Slug表达仅中度增加，表明MCF7细胞通过TGF-β处理和耐药性发展获得部分EMT样表型。另一方面，与亲本细胞相比，MDA-MB-468-TGFβ细胞没有显示出E-cad和N-cad的变化，Slug水平中度增加，而MDA-MB-468-DR细胞显示出E-cad、N-cad和Slug表达增加(图9D)。这些结果表明，尽管MDA-MB-468-TGFβ和MDA-MB-468-DR细胞均过度表达迁移蛋白Slug，但前者未经TGF-β处理的EMT，后者可能获得具有耐药性的杂合E-M表型。
分析经处理的细胞群体通过涂在transwell inserts中的基质凝胶层侵袭的能力。如图9E所示，TGF-β处理和耐药性均赋予MCF7和MDA-MB-468细胞显著的侵袭优势，使其比亲本细胞更具活力，如结晶紫染色的迁移细胞数量增加所示。事实上，最近的研究表明，部分或杂合E-M表型归因于肿瘤细胞的可塑性，并且极有利于转移扩散。Saitoh,M.(2018),J Biochem 164,257-264。
TGF-β处理的耐药乳腺癌细胞中增加的EDB-FN表达
然后在TGF-β处理的和耐药MCF7和MDA-MB-468细胞中测定EDB-FN作为乳腺癌细胞侵袭性的分子标志物的潜在作用。使用荧光标记的EDB-FN特异性肽ZD2-Cy5.521分析3D培养细胞中EDB-FN的表达。如图3A-B所示，内源性EDB-FN表达在MDA-MB-468细胞中高于在MCF7细胞中，与图8G中的mRNA水平一致，并且它们的侵袭能力如图8H和9E所示。用TGF-β处理和获得性耐药导致3D培养的MCF7和MDA-MB-468细胞中EDB-FN表达的显著增加，反映在图10A-B中ZD2-Cy5.5结合的增加和图10C-D中Hoechst标准化的ZD2-Cy5.5％像素强度的增加。qRT-PCR分析也证实了肽结合结果，其显示出MCF7-TGFβ和MCF7-DR细胞中EDB-FN的表达增加了17倍和8.5倍(图10E)，在MDA-MB-468-TGFβ和MDA-MB-468-DR细胞中的EDB-FN表达增加超过3倍(图10F)。
通过MDA-MB-468-DR细胞中的EDB-FN敲除实验证实了ZD2-Cy5.5探针的EDB-FN特异性结合，其中ECO/siEDB纳米颗粒处理消除了ZD2-Cy5.5结合(S图9A)，并使EDB-FN mRNA表达沉默超过70％(S图9B)。这些结果表明，无论是否获得杂合E-M样改变，乳腺癌细胞的侵袭性增加都会导致EDB-FN的显著上调。因此，EDB-FN过度表达与侵袭性乳腺癌细胞和从低风险乳腺癌细胞演变而来的乳腺癌细胞有关。
AKT在侵袭性乳腺癌细胞中的治疗性消融减少侵袭和EDB-FN表达
肿瘤对抑癌药物反应的无创治疗监测对于促进决策和及时干预至关重要。为了测试EDB-FN是否为治疗预测标志物以及其表达是否与乳腺癌细胞侵入潜力的变化相关，用MK2206-HCl(一种高度特异的泛-AKT抑制剂)处理TGF-β处理的耐药MCF7和MDA-MB-468细胞被证明可以抑制PI3K/AKT信号传导诱导的肿瘤细胞增殖。PI3K/AKT信号传导是与多种癌症的进展、转移和耐药性相关的主要信号转导级联。
通过对磷酸化AKT(T308和S473)和总AKT水平的测试，首次证实了侵袭性TGF-β处理的耐药MCF7和MDA-MB-468细胞群体中促有丝分裂AKT信号传导轴的上调(图11A)。与各自的亲本细胞相比，TGF-β处理的耐药MCF7和MDA-MB-468细胞中磷酸-AKT-T308和磷酸-AKT-S473水平均显著上调。总AKT也在两种耐药细胞系中上调，在TGF-β处理的细胞中上调程度较小。此外，先前的研究表明磷酸化AKT-SRp40通路在选择性剪接介导的EDB-FN表达调节中的作用。Bordeleau等人,(2015),Proc Natl Acad Sci U S A112,8314-8319。为了确定TGF-β上调EDB-FN的机制和耐药性，我们检测了磷酸化SR蛋白(SRp55和SRp40)的表达。发现侵入性更强的MCF7-TGFβ、MCF7-DR、MDA-MB-468-TGFβ和MDA-MB-468-DR细胞上调SRp55的表达，而与各自的亲本细胞相比，只有MCF7-TGF-β和MDA-MB-468-TGFβ上调SRp40。用MK2206-HCl处理侵入性细胞衍生物导致磷酸化AKT(T308和S473)的强烈抑制，如图4B所示。在MK2206-HCl处理的四个细胞系中，磷酸化SRp55的上调也减弱，表明这些侵入性细胞中的EDB-FN上调可以至少部分通过磷酸化AKT-SRp55信号传导通路来控制(图11B)。
在功能上，MK2206-HCl介导的磷酸化AKT耗竭降低了TGFβ处理的和耐药细胞衍生物的侵入潜力(图11C-D)。这还伴随着EDB-FN在过度表达TGF-β处理的耐药MCF7和MDA-MB-468细胞中的表达显著降低，证据是与相应的DMSO处理的对照相比，mRNA水平显著降低(图11E-F)，3D培养中ZD2-Cy5.5染色强度降低(图11G-H)。具体而言，在MDA-MB-468-DR细胞中，尽管EDB-FN mRNA显示出适度的减少(约10-15％)，但3D球状体表达的原位EDB-FN显著减少，这可能有助于MK2206-HCl处理的侵入显著降低。这些结果证明EDB-FN与乳腺癌细胞系的侵入性呈正相关，并且EDB-FN表达改变与治疗干预反应的潜在相关性。
为了进一步探索SRp55-EDB-FN通路与侵入性之间的联系，将TGF-β处理的耐药MCF7和MDA-MB-468细胞用siEDB-FN或含siSRSF6的纳米颗粒转染，以评估功能丧失对细胞运动的影响。如图12A所示，与NC(siN)相比，siEDB-FN(siE)和siSRSF6(siS)处理分别导致4种衍生细胞系中EDB-FN和SRp55的表达降低。此外，SRp55(siSRSF6)的下调也导致EDB-FN水平的下调，这证实了SRp55在调节EDB-FN表达中的作用。此外，EDB-FN和SRp55的水平降低与TGF-β处理的耐药MCF7和MDA-MB-468细胞的侵入潜力降低相关(图12B-C)，表明EDB-FN在调节乳腺癌细胞侵入模式中发挥直接或间接作用。发现用TGF-β处理经MK2206-HCl处理的MDA-MB-468-DR细胞可以挽救这些细胞中EDB-FN的过度表达(图12D)，这也伴随着侵入的增加(图12E)，表明pAKT介导的MDA-MB-468-DR中的侵入可能至少部分通过EDB-FN发生。另一方面，尽管MK2206-HCl的处理降低了MCF7-DR细胞的EDB-FN表达(图12F)和侵入(图12G)，但TGF-β的添加并未挽救其EDB-FN的表达或侵入潜力。可能的是pAKT缺失改变ER+MCF7-DR细胞对TGF-β的反应，因为TGF-β和AKT信号传导通路在癌症中紧密交织，并且阻断pAKT已被证明可以抑制TGF-β诱导的促肿瘤反应。尽管如此，结果证明EDB-FN表达模式与细胞的侵入潜力之间存在强烈的正相关，表明EDB-FN作为乳腺癌细胞的侵入分子标记物的潜力。
讨论
许多血液生物标志物，包括CA 15.3、癌胚抗原(CEA)、CA125，以及超声、乳房X光检查、MRI、PET和CT等成像方式，通常用于检测原发性乳腺肿瘤疾病和复发，并评估治疗反应。Bayo等人,(2018)Clin Transl Oncol 20,467-475。然而，它们对疾病的鉴别地诊断和风险分层能力有限，假阳性诊断率高，这突出了需要特异性标志物来准确检测高侵入性和转移性乳腺肿瘤，并将其与低风险的惰性肿瘤区分。此外，乳腺肿瘤经常表现出对化疗和靶向药物的内在或后天耐药性。在缺乏合适的分子标志物的情况下，积极监视和监测化疗干预的疗效以及及时检测耐药表型的出现形成患者治疗的另一个障碍。
为了解决这些问题，本研究研究了ECM癌蛋白EDB-FN的动态变化以及乳腺癌细胞侵入潜力的动态变化。我们发现，从低风险癌细胞进化而来的侵入性细胞可以表现出部分E-M表型并过度表达EDB-FN；相反，用靶向药物阻碍这些高风险癌细胞的侵入能力消除了它们的EDB-FN过度表达，证明EDB-FN水平与乳腺癌细胞侵入力之间的直接关系。此外，据我们所知，这是首次报道EDB-FN随着乳腺癌细胞耐药性的发展而上调的研究。
在本研究中使用的两种不同的乳腺癌细胞系之间，尽管两种细胞系均表现出上皮表型，但侵袭性最低的HR+MCF7细胞的内源性EDB-FN水平显著低于侵袭性更强的三阴性MDA-MB-468细胞。诱导耐药性和长期TGF-β处理可能通过不同的信号传导机制导致两种细胞系的分子表型发生明显变化。新出现的侵入群体比其亲本细胞更具攻击性，具有转移前的杂合E-M表型和增加的磷酸化AKT信号传导。事实上，最近的研究表明，E-M谱上不同位置的癌细胞亚群的存在赋予肿瘤深刻的可塑性，从而促进肿瘤的进展、转移和干性。这些细胞系中的每一种都可能通过其他尚未研究的机制获得生存优势。然而，无论信号传导机制如何，所有具有获得性侵入力的细胞都表现出EDB-FN表达的升高。相反，当用靶向治疗处理侵袭性细胞时，其侵入潜力降低，同时EDB-FN表达降低。只有当随后的TGF-β处理上调了MDA-MB-468-DR细胞中而不是MCF7-DR细胞中EDB-FN的表达时，侵入性才得以恢复，表明EDB-FN作为乳腺癌主动监视和监测的治疗预测标志物的作用。
侵入性细胞中EDB-FN上调的确切机制仍然是一个谜。在遗传水平上，EDB-FN由选择性剪接事件产生，导致在FN1转录物中包含EDB外显子，这一过程由剪接调节家族的SR(富含丝氨酸和精氨酸)蛋白控制。由于选择性剪接对于EDB-FN同种型的形成是必不可少的，因此SR蛋白参与这一过程是不可避免的。然而，对于在肿瘤转化期间EDB外显子的优先和差异包含的潜在机制的研究有限。先前的研究表明，组织硬度的增加直接上调PI3K/AKT介导的SRp40磷酸化，从而增强乳腺癌细胞的外显子内含物和EDB-FN分泌。Bordeleau等人,(2015),Proc Natl Acad Sci U S A112,8314-8319。在本研究中，MCF7和MDA-MB-468细胞中的耐药性发展和TGF-β处理持续上调SRp55磷酸化，以及磷酸化-AKT的增加。直接使用RNAi或间接使用MK2206-HCl敲除SRp55可显著降低其EDB-FN表达和侵入潜力。鉴于SRp55通常在乳腺癌和结直肠癌中发生突变，并影响多种肿瘤相关基因(如KIT、CD44和FGFR147)的选择性剪接模式，因此SRp55的缺失减少乳腺癌细胞的侵入并不奇怪。然而，这是首次报道SRp55耗竭导致EDB-FN表达降低的研究。SRp55和其他SR蛋白如何与它们在剪接体中的拮抗性hnRNPs协同作用，调节复杂的选择性剪接过程以响应各种内在和外在刺激，仍有待探索。此外，MK2206-HCl处理显示出磷酸化AKT的高度特异性敲除以及随后以细胞特异性方式下调SRp40/SRp55水平。尽管MK2206-HCl处理显著降低了EDB-FN的表达和侵入，但并没有完全消除它们，表明其他有丝分裂蛋白(如AKT3)或也参与肿瘤发生的EDA-FN同种型的代偿性激活。Han,Z.和Lu,Z.R.(2017),J Mater Chem B 5,639-654。鉴于乳腺恶性肿瘤中的复杂成分和分子信号传导，评估不同药物处理后EDB-FN表达和功能的不同空间和时间变化将是有趣的。
EDB-FN在多种类型的癌症中过度表达，包括乳腺癌、口腔癌、肺癌和前列腺癌。Khan等人,(2005),Exp Lung Res 31,701-711；Albrecht等人,(1999),Histochem CellBiol112,51-61。最初认为EDB-FN仅由癌相关成纤维细胞(CAF)和内皮细胞分泌，现在已知由肿瘤细胞，尤其是侵入性肿瘤细胞大量产生。EDB-FN在胚胎发生期间上调，在伤口愈合、组织修复和血管生成期间暂时被激活，但在健康成人组织中大多缺失。White等人,(2008),J Pathol 216,1-14。事实上，我们的研究中的免疫组织化学分析显示，EDB-FN在有丝分裂乳腺肿瘤细胞中表达强烈，在基质、基质成纤维细胞和癌细胞之间的成纤维细胞中、在原发性肿瘤标本和转移部位中弥漫性染色，正常乳腺组织中的表达可忽略不计，表明EDB-FN在恶性肿瘤进展中的复杂结构和功能作用。在TCGA/GTEx试样中，EDB-FN在乳腺癌中显著过度表达，并且与患者生存率呈负相关。此外，由于其细胞外位置和易接近性，EDB-FN已成为设计新的诊断和治疗方案的一个有吸引力的目标。先前的研究已经证明抗体介导的EDB-FN靶向(使用L19，BC-1)对血管生成、炎症和癌症干细胞治疗的潜力。Mariani等人,(1997),Cancer 80,2378-2384。EDB-FN特异性肽，诸如ZD2和APTEDB，由于其小尺寸、低免疫原性和高组织穿透能力，而有利于致癌ECM靶向。Zahnd等人,(2010),Cancer Res 70,1595-1605。ZD2探针对EDB-FN的特异性和优越的结合具有直接的转化意义。我们已经成功地使用ZD2靶向的MRI造影剂在小鼠模型中对无创和有创乳腺癌和前列腺癌异种移植物进行了鉴别诊断。Han等人,(2017),Bioconjug Chem 28,1031-1040。这项研究的结果为确定EDB-FN作为分子生物标志物用于基于分子成像的检测、风险分层、主动监视和监测乳腺癌，以及跟踪其在化疗和未化疗的情况下的疾病进展的潜力开辟了新的途径。
总之，这项研究表明EDB-FN的表达与高侵入性乳腺癌以及演变为高风险细胞的低风险细胞有关。尽管癌细胞具有可塑性，但这种相关性仍然成立，并且乳腺癌细胞的侵入特性的动态变化导致EDB-FN表达水平的相应变化。除了首次证明获得性耐药性上调EDB-FN外，我们还表明这种增强的表达部分通过磷酸化AKT-SRp55信号传导通路发生。这些观察结果表明，EDB-FN在诊断成像和治疗干预的背景下，是监测乳腺癌进展的一个有前途的分子标志物。
材料和方法
细胞系和培养
MCF7、MDA-MB-231、BT549和Hs578T细胞购自ATCC(Manassas，VA)。MCF7-DR细胞(耐500nM帕博西尼)、MDA-MB-468和MDA-MB-468-DR(耐100nM紫杉醇)是Ruth Keri博士(CWRU，Cleveland，OH)赠送的礼物。MCF7-TGF-β和MDA-MB-468-TGF-β细胞通过用5ng/mL TGF-β(RnD Systems，Minneapolis，MN)处理亲本系至少7-10天获得。乳腺癌细胞系在补充有10％胎牛血清(FBS)和100单位/mL青霉素/链霉素(P/s)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。MCF7、MCF7-DR和Hs578T细胞另外补充有0.01mg/mL人胰岛素(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。所有细胞在37℃和5％CO2下生长。使用MycAlertTM支原体检测试剂盒(Lonza，Allendale，NJ)测试细胞系是否无支原体。细胞系也通过了Genetica DNA实验室(Burlington，NC)的鉴定。
MK2206-HCl处理
用MK2206-HCl(一种泛-AKT抑制剂，购自SelleckChem(Boston，MA))处理侵入性TGF-β处理的耐药MCF7和MDA-MB-468群体。对于该处理，将8×105个细胞置于6孔板上。附着24小时后，用MK2206-HCl处理细胞2天(MCF7细胞2μM剂量，MDA-MB-468细胞4μM剂量)。用等体积的DMSO处理的细胞用作对照。处理后，如相关章节所述，对细胞进行计数，并在Matrigel上和transwell inserts中放置相同数量的细胞，以进行侵入和3D生长测定。对经处理的和未处理的细胞进行类似的计数，并收获蛋白质和RNA提取分别用于蛋白质印迹和qRT-PCR。
基因数据分析
基因表达分析和生存曲线数据来自网络服务器GEPIA228，该服务器提供TCGA(肿瘤和正常)和GTEx(正常)数据库(1084个BRCA和291个正常组织试样)中EDB-FN转录物(ENST00000432072.6)的乳腺肿瘤正常比较和总体生存曲线。首先对表达数据进行log2(TPM+1)变换以进行差异分析，log2FC被定义为中值(肿瘤)-中值(正常)。GEPIA2使用对数秩检验或Mantel-Cox检验进行生存分析的假设检验；Cox PH模型用于危险比计算，ANOVA或LIMMA用于差异基因表达分析。
人体组织标本和IHC
从凯斯西储大学(CWRU)的人体组织采购机构(Human Tissue ProcurementFacility)获得人体组织标本(乳腺原发性肿瘤、正常邻近组织和肺、淋巴结和脑的转移)。所有试样都被去识别和去分类。组织切片和IHC服务由CWRU综合癌症中心组织资源核心设施(Tissue Resources Core Facility of the Comprehensive Cancer Center)和克利夫兰大学医院(University Hospitals of Cleveland)提供(P30 CA43703拨款)。在短暂的抗原修复步骤(在柠檬酸盐缓冲液中125℃下30秒)后，使用1:100稀释的抗EDB-FN抗体G4克隆(Absolute antibody，UK)进行EDB-FN的IHC。载玻片由经认证的病理学家审查。图像在Bx61VS玻片扫描显微镜(Olympus，Waltham，MA)上用40X物镜采集，并在OlyVIA软件中处理。
qRT-PCR
根据制造商的说明，使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen，Germantown，MD)从细胞和组织中提取总RNA。使用miScript II RT试剂盒(Qiagen)测定RNA浓度，并使用1ug RNA建立逆转录，使用SyBr Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，CA)进行qPCR。以18S或β-肌动蛋白表达为对照，通过2-ΔΔCt方法分析基因表达。
3D肿瘤球状体生长和ZD2-Cy5.5染色
对于Matrigel生长测定，将5×105个乳腺癌细胞悬浮在含5％ Matrigel的培养基中，并铺在CorningTMMatrigelTM膜基质的厚层上。使用带有10X物镜的Moticam T2相机监测并拍摄细胞在3D矩阵中形成肿瘤球状体的能力，时间长达5天。2-4天后，在37℃下用Hoechst-33342(5μg/mL)和ZD2-Cy5.5(100nM)对细胞染色30分钟。用PBS冲洗3次后，加入新鲜培养基，并在Olympus FV1000共焦激光扫描显微镜(10X物镜)上对细胞成像，以获得Z-堆叠图像。用FIJI软件进行图像分析，ZD2肽与EDB-FN的结合被量化为ZD2-Cy5.5的像素强度与Hoechst 33342的像素强度之比。
蛋白质印迹
如前所述提取总细胞蛋白。Vaidya等人,(2019)Bioconjug Chem 30,907-919。通过Lowry测定法测定蛋白质浓度，将等浓度的蛋白质提取物(40μg)加载到SDS-PAGE凝胶上，转移到硝化纤维膜上，并用一级抗体免疫印迹过夜。抗EDB-FN抗体(G4克隆)以1:1000稀释使用。以下一级抗体(1:1000稀释)购自Cell Signaling Technology(Danvers，MA)：抗E-钙粘蛋白(Cat#3195)、抗-Slug(Cat#9585)、抗-磷酸化-T308-AKT(Cat#13038)、抗-磷酸化-S473-AKT(Cat#4060)、抗-泛-AKT(Cat#4691)、抗-MDR1(Cat#12683S)；抗-组蛋白H3(Cat#4499)和抗-β-肌动蛋白(Cat#4970)作为负载对照。抗-磷酸表位(Phosphoepitope)SR蛋白(Cat#MABE50；克隆1H4)和抗-SRp40(Cat#06-1365)抗体购自Millipore Sigma(Temecula，CA)并以1:500稀释度使用。抗-N-钙粘蛋白抗体(Cat#76057)购自Abcam(Cambridge，MA)并以1:500稀释度使用。
Transwell测定
对于侵入测定，将乳腺癌细胞在血清缺失的培养基中饥饿过夜。第二天，将1-2×105个细胞置于涂有0.3mg/mL CorningTM MatrigelTM膜基质(Corning，NY)的transwellinserts(VWR，Radnor，PA)中。1-2天后，用Q-棉签擦拭小室以去除铺上的细胞。小室底部的侵入细胞用4％多聚甲醛固定，然后用0.1％结晶紫染色20分钟。多余的染色剂在自来水下洗涤，并使用带有10X物镜的Moticam T2相机拍摄紫色迁移细胞的图像。
基因敲除测定
如前所述配制ECO/siRNA纳米颗粒。Gujrati等人,(2016),Adv Healthc Mater 5,2882-2895。简而言之，将氨基脂质ECO(乙醇中的5mM原液)与siLuc(作为阴性对照NC)或siEDB-FN或siSRSF6以100nM的最终siRNA浓度和N/P＝10混合30分钟，以分别实现ECO/siNC、ECO/siEDB或ECO/siSRSF6纳米颗粒的自组装形成。对于转染，将纳米颗粒配方与培养基混合并添加到细胞中。24-48小时后，收集细胞进行transwell实验，或将其加入Matrigel中，如上所述用ZD2-Cy5.5染色。siRNA双链体购自Dharmacon(Lafayette，CO)。
统计分析
除非另有说明，所有实验均独立进行三次(n＝3)。条形图表示为平均值±s.e.m，单个点表示重复。使用Graphpad Prism 7.03版进行统计分析。使用未配对学生t-检验和Mann-Whitney U检验比较两组之间的数据。使用Kruskal-Wallis试验分析乳腺癌细胞系之间的EDB-FN mRNA数据。p<0.05被认为具有统计学意义。
实施例3：结构域外-B纤连蛋白的磁共振分子成像对口腔癌检测和表征的有效性 的临床前评估
口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔最常见的恶性肿瘤，占口腔恶性肿瘤的超过90％。尽管治疗方案有所改善，OSCC患者的5年生存率仍保持在50％左右，几乎没有改善。这种不良预后源于晚期诊断、局部侵入和转移、切除后复发以及缺乏用于早期和准确检测的靶向生物标志物。超过60％的患者被诊断为晚期肿瘤，其总生存率降至20％。传统的组织学分级方案不能可靠地预测患者的预后，因此需要开发增强的OSCC诊断方法来改善临床预后。
OSCC患者的常规检查包括体检和诊断成像，以更好地描绘疾病边界。大多数患者患有难以诊断的局部或地域侵袭性疾病，局部淋巴结的微转移与不良结果高度相关。虽然可以对口腔进行物理检查，但常规检查并不能一致地识别所有与生物学相关的前体病变，并且辅助筛查技术缺乏适当的敏感性和特异性来证明广泛使用的合理性。OSCC的常见诊断成像方法包括计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)。尽管两者都提供有价值的诊断信息，但MRI提供了优越的软组织对比，能够更精确地描绘原发肿瘤边界、局部侵入和转移检测。因此，MRI通常用于规划手术切除的范围、随后的组织重建以及治疗效果和复发的治疗监测。Paasz等人,(2017),Pol J Radiol 82:193-202。最常用的MRI造影剂是钆基造影剂(GBCA)。然而，目前的GBCA是非靶向的，提供非特异性造影增强，无法进行疾病表征。ZhouZ,Lu ZR(2013),Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol 5:1-18。因此，临床对开发能实现OSCC的精确成像的靶向GBCA用于准确检测、描绘和表征以增强诊断并指导及时的精确治疗的需求未得到满足。
肿瘤细胞外基质(ECM)蛋白与肿瘤细胞密切相互作用，并介导与肿瘤进展相关的许多生物学过程。上调的ECM纤连蛋白与肿瘤侵入、转移和治疗耐性有关。结构域外-B纤连蛋白(EDB-FN)是一种参与新生血管形成的纤连蛋白剪接变体，在许多侵袭性癌症中也上调，包括胰腺癌、乳腺癌和口腔癌，在正常成人组织中几乎没有表达。Han Z,Lu ZR(2017),JMater Chem B 5:639-654。上皮肿瘤细胞中EDB-FN的存在表明其与基质细胞产生的EDB-FN结合产生蛋白质的固有能力。最近的研究表明，EDB-FN在前列腺癌和乳腺癌中的差异表达与肿瘤的侵袭性呈正相关。Ayat等人(2018),ACS Med Chem Lett 9:730-735；Ayat等人(2019),Front Oncol 9:1351。在OSCC中，EDB-FN在超过100％的原发性肿瘤和63-96％的宫颈转移中表现出可变表达，表明其在侵袭性OSCC的诊断成像中具有潜力。Birchler等人(2003),Laryngoscope 113:1231-1237。
我们开发了一种小肽ZD2，以选择性靶向肿瘤微环境中的EDB-FN。Han等人,(2015),Bioconjug Chem 26:830-838。ZD2与临床GBCA钆特醇的结合产生了一种新的EDB-FN靶向造影剂ZD2-Gd(HP-DO3A)，其能够对肿瘤微环境进行磁共振分子成像(MRMI)。Han等人,(2017),Bioconjug Chem 28:1031-1040。ZD2-Gd(HP-DO3A)的进一步优化产生了更有效的靶向造影剂ZD2-N3-Gd(HP-DO3A)(MT218)，具有改善的T1弛豫性。具有靶向药物的MRMI显著增强前列腺癌和三阴性乳腺癌的侵袭性。一项剂量研究证明，MT218即使在用于Gd(HP-DO3A)或钆特醇的推荐临床剂量(0.1mmol/kg)的20％时，也能在三阴性乳腺癌中提供相当的造影增强(如果不是更大的话)。15.Ayat等人,(2018),ACS Med Chem Lett 9:730-735。在这里，我们证明了降低剂量的MT218在使用MRMI对表达EDB-FN的侵袭性OSCC进行诊断成像时的有效性。
方法
细胞培养
人OSCC细胞系CAL27和SCC4购自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC，Manassas，VA，USA)。OSCC细胞系HSC3经由Sekisui XenoTech(Kansas City，KS，USA)购自日本生物资源研究中心细胞库(Japanese Collection ofResearch Bioresources Cell Bank，Ibaraki City，Japan)CAL27和HSC3在补充有10％胎牛血清(FBS，Corning Inc.，Corning，NY，USA)和1％青霉素-链霉素(PS，Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，ATCC)中培养。SCC4在补充有10％FBS、1％PS和400ng/mL氢化可的松(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的DMEM中培养。通过用CMV-Luciferas-2A-GFP慢病毒(Amsbio，Cambridge，MA，USA)转染细胞，然后对GFP表达进行荧光活化细胞分选，产生稳定的绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶表达细胞系。CAL27-GFP、SCC4-GFP和HSC3-GFP细胞系在各自亲本细胞系的完整培养基中培养。所有细胞在37℃下于5％ CO2中孵育。
半定量实时PCR
使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)从细胞团块中提取RNA。使用miScript II逆转录试剂盒(Qiagen)将RNA样品逆转录成cDNA。根据制造商的建议，使用SYBR Green Master Mix(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)进行半定量实时PCR。使用标准2-ΔΔCT方法计算相对mRNA水平，以18S表达为对照基因。用BioRad CFX Connect实时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)进行cDNA合成和qRT-PCR。引物购自Integrated DNA Technologies(IDT，Coralville，IA，USA)。
蛋白质印迹
根据制造商的建议，用2x Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad Laboratories)和蛋白酶抑制剂混合物(Roche Holding AG，Basel，Switzerland)由细胞团块制备细胞裂解物。将裂解物煮沸，并在4℃和15000rpm下离心15分钟。收集上清液，并通过Lowry测定法(Bio-RadLaboratories)测量蛋白质浓度。使用SDS-PAGE解析蛋白质提取物(50μg)，并在冰下转移到硝化纤维素膜(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)上。使用Bio-Rad Mini-PROTAN Tetra系统(Bio-Rad Laboratories)进行SDS-PAGE和转移。用5％牛奶封闭膜，洗涤，并在冰上与抗-EDB-FN(G4，Absolute Antibody，Oxford，UK)和抗-β-肌动蛋白(CST)一级抗体(1:2000)在5％牛血清白蛋白(BSA，Sigma Aldrich)中孵育过夜。将膜洗涤并在室温下与辣根过氧化物酶缀合的抗-小鼠和抗-兔IgG二级抗体(1:1000，CST)在5％BSA中孵育1小时。洗涤后，用SignalFire Plus ECL试剂(CST)活化膜，并用BioRad Molecular ImagerChemiDoc XRS+系统(Bio-Rad Laboratories)成像。
球状体形成和肽结合研究
盖板(4-孔，Ibidi GmbH，Martinsried，Germany)涂有Cultrex基底膜基质(350μL，Trevigen，Gaithersburg，MA，USA)。为了形成球状体，将2x105个OSCC细胞接种到准备好的孔中，孵育2天，并用Moticam T2相机(Motic，Hong Kong，China)拍照。对于肽结合，将1x105个细胞接种到制备好的孔中并孵育2天。球状体用如上所述合成的ZD2-Cy5.5(125nM)和Hoechst(1:2000稀释)(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)染料染色15分钟，用DPBS(ThermoFisher Scientific)洗涤3次，并使用Olympus FV1000系统(OlympusLife Science，Tokyo，Japan)用共焦激光扫描显微镜成像。
使用FIJI分析共聚焦荧光图像。为了量化，对图像进行阈值处理以生成两种染色剂的ROI。对于球状体尺寸，计算Hoechst ROI的平均尺寸。对于染色强度，计算ZD2-Cy5.5和Hoechst ROI的平均信号强度，以及平均强度之间的比率。
Transwell迁移和侵入测定
将OSCC细胞饥饿过夜，在无血清培养基(1x105个细胞)中接种到TranswellThinCert小室(Greiner Bio One，Kremsmünster，Austria)中，该小室涂有(侵入)或不涂(迁移)100μL 1.0mg/mL Matrigel(Corning)，并置于完全培养基上方。用于迁移和侵入的小室分别孵育1天和2天。小室下侧的细胞用10％福尔马林固定，用0.1％结晶紫染色，并用Moticam T2相机成像。
动物模型
动物实验根据凯斯西储大学(CWRU，Cleveland，OH，USA)动物保护和利用委员会(IACUC)批准的动物方案进行。从Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME，USA)购买的雌性4周大无胸腺裸鼠被安置在CWRU的动物核心实验室中。麻醉后的小鼠在右腹皮下接种4x106GFP/荧光素酶表达的OSCC细胞(每个细胞系n＝5)，这些细胞在100μL Matrigel HC(Corning)和DPBS的1:1混合物中。用卡尺测量监测肿瘤大小。经过4周的生长，肿瘤大到足以进行MRI实验。
MR分子成像
使用3T MRS-3000系统(MR Solutions，Surrey，UK)进行MRI实验。在注射靶向造影剂MT218(Molecular Theranotics，LLC，Cleveland，OH，USA)之前和之后10、20和30分钟，对荷瘤小鼠进行成像，剂量为0.04mmol/kg，使用带有呼吸门控的T1加权快速自旋回波轴向序列(TR＝305ms，TE＝11ms，FOV＝40x40mm，切片厚度＝1mm，切片数量＝15，Nav＝2，矩阵＝256x248)。2天后，使用临床剂量为0.10mmol/kg的非靶向临床药物钆特醇在相同的小鼠上重复该方案。
图像以DICOM格式导出，并使用FIJI进行分析。每个时间点的对比-噪声比(CNR)被计算为平均肿瘤强度和平均肌肉强度之差除以噪声的标准差。
异种移植组织学分析
根据IACUC指南对小鼠进行安乐死。异种移植肿瘤在10％福尔马林中固定，石蜡包埋，并在盖玻片上切成5μm的切片。组织采用1:100稀释的EDB-FN特异性抗体G4进行组织形态学常规H&E染色和免疫组织化学染色。在免疫疫组织化学之前，使用柠檬酸盐缓冲液在125℃的压力锅中进行30秒的抗原修复。组织制备和染色由CWRU组织资源中心进行。
人体组织采集和组织学分析
从CWRU的人体组织采购设施(Human Tissue Procurement Facility)获得5μm切片的人类正常舌和OSCC试样。根据CWRU的机构审查委员会(Institutional Review Board)批准的非人类受试者研究方案，对组织试样进行了完全鉴定。如前所述，EDB-FN的免疫组织化学染色由组织资源中心进行。
统计分析
除非另有说明，所有实验均独立复制三次。使用未配对T检验计算两组之间的统计显著性。分别使用单因素方差分析和双向方差分析计算多于两组与一个和两个独立变量的组之间的统计显著性，然后进行Fisher最小显著性差异事后检验。P值小于0.05被认为具有统计学意义。所有数据均以平均值±标准误差表示。
结果
人体组织中EDB-FN的表达
为了评估靶向EDB-FN对患者的OSCC的临床相关性，使用EDB-FN特异性G4单克隆抗体通过免疫组织化学评估人体组织试样中EDB-FN的表达。虽然正常舌组织显示出EDB-FN的弱点状染色主要在间质中，但未经处理的原发性OSCC和转移性试样证明恶性上皮细胞和周围间质的强染色(图13a-c)。这些结果与先前报道的人OSCC中EDB-FN表达的结果一致。有趣的是，与未经治疗的肿瘤相比，新辅助化疗后切除的肿瘤展示出染色减少，这可能表明处理后EDB-FN下调(图13d)。这些结果强调探索EDB-FN作为原发性和转移性OSCC分子成像的癌蛋白靶标的潜力。
OSCC细胞系的表征
使用三种人OSCC细胞系评估EDB-FN的MRMI对OSCC诊断成像的有效性。CAL27和SCC4分别在治疗之前和之后从舌头的主要部位分离。CAL27保持着上皮、鹅卵石样的细胞布局，而SCC4充满了多倍体巨细胞(图14a)。有趣的是，多倍体巨细胞通常表示由于处理压力导致的形态学变化，并与肿瘤复发、耐药性和异质性相关。另一方面，HSC3从颈部淋巴结转移中分离出来，在肿瘤模型中具有很高的转移潜力。
当在基底膜提取物上培养以形成球状体时，CAL27形成许多小的点状球状体，而HSC3和SCC4形成大的密集网络，遍布整个凝胶(图14a)。此外，使用和不使用Matrigel涂层进行transwell测定，以分别表征细胞系的侵入和迁移能力。在两个实验中，CAL27显示出有限的迁移或侵入能力，而HSC3和SCC4显示出显著的侵入潜力(图14b)。这些数据表明，转移性HSC3和处理后SCC4代表侵袭性的高风险OSCC，而CAL27代表侵袭性的低风险OSCC。
EDB-FN是一种与高风险OSCC相关的靶向癌蛋白
分析EDB-FN表达以确定其与OSCC侵袭性的相关性。qRT-PCR分析显示，与非侵入性CAL27相比，EDB-FN mRNA在侵入性HSC3(21倍)和SCC4(234倍)细胞中显著上调(图15a)。此外，SCC4表现出比HSC3高11倍的EDB-FN mRNA上调。这一结果在蛋白质水平上通过蛋白质印迹得到证实，证明EDB-FN在侵入性OSCC中差异表达和上调(图15b)。
用EDB-FN特异性荧光探针ZD2-Cy5.5对球状体进行染色，以评估OSCC分子成像的靶向EDB-FN。与CAL27相比，侵袭性HSC3和SCC4细胞形成了更大的球状体，ZD2-Cy5.5染色明显更强(图15c-d)。染色强度的量化也显示SCC4的染色强度比HSC3强约2倍，与EDB-FN表达分析一致(图15e)。该数据证明，ZD2肽可以有效靶向差异表达的EDB-FN，用于OSCC的分子成像。
MT218差异增强MRMI中表达EDB-FN的OSCC
在小鼠侧腹异种移植模型中确定MT218在亚临床剂量下对OSCC中EDB-FN的MRMI的有效性与肿瘤侵袭性的相关性，使用临床药物钆特醇作为非靶向对照。低风险、低EDB-FNCAL27肿瘤在0.04mmol/kg的MT218下表现出中等程度的增强，在注射后30分钟消失。0.1mmol/kg钆特醇的增强作用在CAL27肿瘤中似乎略大于MT218，因为其剂量较高(图16a)。高风险、中度EDB-FN HSC3肿瘤在注射MT218后10分钟显示出强烈增强，30分钟后显著减少。尽管MT218的剂量减少，但在HSC3肿瘤中钆特醇的增强作用似乎略小于MT218，但总体上与MT218相当(图16b)。高风险、高EDB-FN SCC4肿瘤在所有时间点均表现出MT218的显著增强。SCC4肿瘤中钆特醇的增强作用远弱于MT218(图16c)。这些图像表明，MT218在亚临床剂量下根据EDB-FN的表达差异性地增强高风险OSCC肿瘤，这是临床造影剂无法实现的特性。
造影增强的半定量分析
计算肿瘤中的对比噪声比(CNR)，用于MT218和钆特醇对肿瘤增强的半定量分析。MT218根据其EDB-FN表达在所有时间点对三种肿瘤模型进行差异增强，而钆特醇在任何时间点均未显示出差异增强(图17a-b)。除注射后10分钟外，低风险、低EDB-FN CAL27肿瘤的MT218增强明显低于钆特醇(图17c)。高风险、中度EDB-FN HSC3肿瘤在注射后10分钟时，MT218的增强明显高于钆特醇，并且在剩余时间点呈上升趋势(图17d)。高风险、高EDB-FNSCC4肿瘤在所有时间点，MT218的CNR增强明显高于钆特醇(图17e)。CAL27的MT218和钆特醇的平均最大增强值明显低于临界值(CNRMT218＝1.80±0.17，CNRgad＝2.27±0.18，p＝0.0957)，HSC3的明显高于临界值(CN RMT218＝2.61±0.17、CNRgad＝2.18±0.07，p＝0.0639)，SCC4的显著高于临界值，CNRMT218＝3.81±0.25，CNgad＝2.57±0.28，p＝0.0170)(图17f-h)。根据EDB-FN的表达，MT218的平均最大增强在三种肿瘤模型之间显著不同，而钆特醇没有显著差异(图17i)。这些数据验证MT218在亚临床剂量下差异增强MRMI中表达EDB-FN的高风险OSCC肿瘤的独特能力。
异种移植瘤的组织学分析
成像后使肿瘤离体进行组织学和免疫组织化学分析。低风险、中度分化的CAL27肿瘤在上皮区域表现出弱EDB-FN染色，在肿瘤边界附近基质染色增加(图18)。高风险、低分化HSC3肿瘤表现出比CAL27肿瘤中相应区域更强的EDB-FN染色，几乎没有基质可供解释(图18)。高风险、分化良好的SCC4肿瘤显示出上皮区域内和周围的EDB-FN膜性染色，这是三种肿瘤模型中最强的，而大的角化基质区域几乎没有染色(图18)。上皮肿瘤区域的EDB-FN染色强度与体外EDB-FN表达分析和MRMI数据的CNR分析一致，表明OSCC的用MT218的MRMI中的造影增强随着EDB-FN表达的增加而增加，并且可以用于区分侵袭性和非侵袭性OSCC。
讨论
MRI通常用于OSCC的诊断，提供无与伦比的软组织对比和高分辨率，可描绘原发性和转移性疾病并有助于治疗规划。此外，MRI不会使患者暴露于有害辐射，并且临床剂量的GBCA通常比碘基CT造影剂的肾毒性更小。在这项研究中，用靶向造影剂MT218的MRMI在高风险OSCC肿瘤中仅以临床剂量的40％提供了强有力的增强。在仅为临床剂量20％的侵袭性三阴性乳腺癌中也观察到了类似的结果。Ayat等人(2019),Front Oncol 9:1351。增强的增加主要来源于MT218与肿瘤ECM中EDB-FN的选择性结合，从而允许MT218在肿瘤中积聚和保留。亚临床剂量MT218对侵袭性肿瘤的有效MRMI将显著提高GBCA的临床安全性，减轻与钆给药相关的潜在剂量依赖性副作用。
淋巴结转移是OSCC最重要的预后指标之一，20-40％的颈部临床和放射学阴性患者出现隐匿性转移。识别区域转移的标准实践包括体检和诊断成像，但许多转移因其尺寸非常小而经常被忽视或无法识别。虽然选择性颈部解剖可去除潜在受影响的淋巴结，但随后的组织学检查显示许多不必要的解剖。我们先前证明，高度特异性的靶向GBCA能够检测微转移性乳腺癌。Zhou等人,(2015),Nat Commun 6:7984。我们还观察到转移性OSCC试样和细胞中强烈的EDB-FN表达，与之前的研究一致。因此，采用EDB-FN靶向造影剂MT218的MRMI为更准确地检测和诊断OSCC转移以提高疾病的精确管理和个性化治疗提供了一种有前途的新策略。
抗癌治疗可直接影响ECM蛋白表达，产生介导肿瘤的起始、进展和治疗效果的动态ECM。Harisi R,Jeney A(2015),Onco Targets Ther 8:1387-1398。化疗耐药性有规律地与增加的AKT信号传导和下游纤连蛋白和EDB-FN表达有关。我们观察到长期暴露于治疗后，新辅助OSCC标本中EDB-FN表达减少，OSCC细胞中表达增加。此外，超过20％的头颈部鳞状细胞癌患者出现局部肿瘤复发，此后5年生存率降至30％。采用MT218的MRMI有可能关联和可视化治疗反应和EDB-FN表达的变化，为医生提供获取高风险特征(如耐药性)的洞察力，以改善及时和个性化治疗，并监测肿瘤切除后复发，以精确管理疾病。
该临床前研究有几个局限性。EDB-FN在癌症生物学中的作用在很大程度上尚不清楚，需要在分子、临床前和临床水平上进行进一步研究。还需要进一步的研究来全面评估作为侵袭性OSCC的可行生物标志物的EDB-FN。虽然本研究中使用的MRI技术是半定量的，但在定量MRI技术例如MR指纹识别中使用MT218，可以提供与肿瘤侵袭性和治疗反应相关的OSCC中EDB-FN表达的更准确测量。未来的工作将集中于验证EDB-FN作为OSCC的可成像生物标志物以及用MT218进行的MRMI的临床转译，以实现OSCC的精确成像。
结论
我们展示了EDB-FN表达与人OSCC细胞的侵袭性、肿瘤模型和患者标本之间的初步相关性。采用MT218的EDB-FN的MRMI在OSCC肿瘤模型中提供了实质性和差异性的造影增强，与它们固有的EDB-FN表达和亚临床剂量下的侵袭性相关。同时，钆特醇在临床剂量下提供适度的未分化增强。结果表明，使用EDB-FN靶向造影剂MT218的MRMI有可能在OSCC的临床管理中提供准确的诊断、风险评估、描绘和治疗效果监测。
实施例4：通过靶向ECM癌蛋白来利用MR分子成像早期检测胰腺癌来克服基质屏障
胰腺癌(PaCa)是导致大量且快速增长的癌症死亡的原因。PaCa预后仍然不佳，五年生存率仅为9％。患者通常表现为晚期PaCa，已转移或无法手术切除。对手术后结果的分析表明，早期疾病的检测和清除产生显著提高的生存率或疾病治愈率。然而，目前的PaCa诊断策略对早期疾病并不敏感。造影增强计算机断层扫描(CE-CT)是PaCa成像最常用的方法，但在诊断小而可能治愈的肿瘤、淋巴结转移和肝转移方面存在困难。造影增强磁共振成像显示出优越的软组织对比和优异的空间分辨率，并越来越多地用于PaCa诊断。然而，现有的临床造影剂不是肿瘤特异性的，并且在检测小肿瘤时敏感性较差。肿瘤特异性造影剂的开发将改善肿瘤内造影剂的积累，并最大限度地发挥MRI在准确检测和描绘早期PaCa方面的优势。对于能够检测早期PaCa的安全有效的靶向MRI造影剂的需求尚未得到满足。
胰腺癌具有致密的肿瘤基质，其阻碍靶向细胞表面分子的分子成像剂的结合，并为有效的分子成像和癌症检测提供了极大的阻碍。然而，其独特的细胞外基质(ECM)分子特征可用于生成图像对比，用于精确分子成像和小肿瘤检测。结构域外B纤连蛋白(EDB-FN)是纤连蛋白的癌胚剪接变体，在恶性肿瘤中重建，但在大多数正常组织中缺失。Han等人Bioconjugate Chemistry 26,830-838(2015)。肿瘤ECM中的EDB-FN对于特异性结合显像剂用于PaCa肿瘤的有效分子成像是容易获得的。其在侵袭性肿瘤中的丰富性允许充分的靶向造影剂的快速结合，以在磁共振分子成像(MRMI)中产生强大的信号增强。因此，EDB-FN是一种有前途的靶分子成像和早期检测PaCa与MRMI的方法。
我们之前开发了一种寡肽TVRTSAD(ZD2)，其与EDB-FN17具有高特异性结合。ZD2靶向MRI造影剂已经开发并测试了侵袭性乳腺癌和前列腺癌模型中EDB-FN的MRMI。Han等人Nature Communications 8,692(2017)。靶向造影剂ZD2-N3-Gd(HP-DO3A)(MT218)是通过将ZD2肽与临床大环造影剂Gd(HP-DO3A)17,21缀合而开发的。MT218具有比Gd(HP-DO3A)更高的T1弛豫性，并在侵袭性乳腺癌和前列腺癌中表现出优异的造影增强。Ayat等人,ACSMedicinal Chemistry Letters,9(7):730-735(2018)。MT218与PaCa肿瘤ECM中丰富的EDB-FN的结合有可能克服致密肿瘤间质的屏障，以产生强烈的造影增强，从而改善用MRMI的PaCa成像。
材料和方法
细胞和试剂
ZD2-N3-Gd(HP-DO3A)从Molecular Theranotics(Cleveland，OH)获得。
Figure BDA0004113382920000571
Gd(HP-DO3A)购自Bracco Diagnostics(Monroe Township,NJ)。如前所述合成ZD2-Cy5.5。Han等人,Nature Communications 8,692(2017)。在推荐的培养基和条件下培养Capan-1、BxPC3和PANC-1(ATCC，Manassas，VA)人PaCa细胞。用慢病毒载体(Amsbio，Cambridge，MA)转导BxPC3和PANC-1细胞，以表达绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶。
弛豫性测量
MT218和Gd(HP-DO3A)溶液的T1和T2值使用3T MRS 3000扫描仪(MR solutions，Guildford，UK)测定。在DPBS缓冲液(Gibco，Gaithersburg，MD)中制备浓度为0、0.25、0.5、1和2mM的MT218溶液。使用反转恢复快速低角度拍摄(IR-FLASH)序列测量T1值(τ＝10ms，TE＝4ms，FA＝8°，回波/帧＝128，FOV＝40mm x 40mm，切片厚度＝2mm，平均数＝1，时间延迟＝4000ms，采样周期＝200，矩阵＝256x128)。使用多回波多层切片(MEMS)序列获得T2值(TE＝15ms，重复时间＝15ms，回波＝10，FOV：40mm x 40mm，切片厚度＝1mm，平均数＝1，矩阵＝256x192)。r1和r2弛豫性分别根据1/T1和1/T2与Gd浓度图的斜率计算。
结合亲和力测量
MT218的结合亲和力通过使用NanotemperTMMonolith NT.115仪器(NanoTemperTechnologies，Munich，Germany)用微尺度热泳(MST)测定。FN的EDB片段在大肠杆菌(E.coli)中表达，纯化，并用胺活性染料NT-647标记。将MT218溶解于测定缓冲液(50mM PBSw/0.05％吐温-20)中。使用测定缓冲液进一步稀释该溶液，得到一系列MT218工作溶液。然后将每个MT218工作溶液与固定浓度的荧光标记EDB片段混合。然后将MT218和EDB的混合物加载到标准毛细管中，并在25℃下使用20-80％的发光二极管功率和40％的红外激光功率在不同浓度的MT218下进行MST测量。
动物模型
对于侧腹异种移植模型，将悬浮在100μL 6mg/mL Matrigel(Corning，Corning，NY)溶液中的4x106个Capan-1细胞皮下注射到八周龄雌性nu/nu小鼠的侧腹。在肿瘤体积超过300mm3后，对荷瘤小鼠进行成像。对于原位胰腺内模型，手术暴露4周龄雌性nu/nu小鼠的胰腺，将悬浮在100μL Matrigel溶液(6mg/mL)中的1x106个BxPC3-GFP-Luc或PANC-1-GFP-Luc细胞注射到胰腺组织中。在成像之前，通过IVIS Spectrum系统(Perkin-Elmer，Waltham，MA)的腹腔注射d-荧光素的生物发光成像来验证肿瘤的生长。
人体组织的ZD2-Cy5.5染色
将PaCa患者(综合癌症中心(Case Comprehensive Cancer Center)Cleveland，OH)的组织切片用二甲苯、乙醇脱蜡，并用水洗涤。用10％山羊血清的PBS溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)和0.1％吐温20(PBS-T)进行封闭30分钟，并在37℃下用500nM ZD2-Cy5.5的PBS-T溶液孵育1小时。用PBS-T清洗三次后，使用Fluoroshield安装介质(Abcam，Cambridge，UK)安装切片。使用预先编程的Cy5.5(激发：635nm；发射：693nm)和DAPI(激发：405nm，发射：461nm)的发射和激发滤光片，使用10X物镜，在FV1000(Olympus，Waltham，MA)共焦显微镜上采集图像。所有组织试样在相同的激光功率和传感器增益下成像。使用FIJI软件由单通道灰度图像生成图像。
细胞和组织的蛋白质印迹分析
在补充有cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合液(Roche，Basel，Switzerland)的RIPA缓冲液中裂解Capan-1、BxPC3和PANC-1细胞和组织。用转子-定子匀浆器(IKA，Wilmington，NC)进一步匀浆组织样品。将裂解物离心，并使用BCA蛋白质测定法(Thermo FisherScientific，Waltham，MA)测定上清液的总蛋白质浓度。将总蛋白(30μg)在Laemli缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA)中混合并煮沸5分钟。样品通过SDS-PAGE(5-20％)分离并转移到硝化纤维素膜(Cell Signaling Technologies，Danvers，MA)上。所用的一级抗体是用于细胞裂解物的在5％牛血清白蛋白中稀释的抗-EDB-FN抗体BC-1(1:500；Abcam，Cambridge，MA)和在5％牛奶中稀释的抗-β-肌动蛋白抗体(1:1000；Cell Signaling Technologies，Danvers，MA)。将5％牛血清白蛋白中的G4抗体(1:1000；Absolute Absolute，Boston，MA)和5％牛奶中的抗GAPDH抗体(1:10000；Cell Signaling Technologies，Danvers，MA)用于组织裂解物。进行一级抗体孵育过夜。将二级抗-小鼠HRP(1:1000；Cell SignalingTechnologies，Danvers，MA)和抗-兔HRP(1:1000；Cell Signaling Technologies，Danvers，MA)抗体在室温下在5％牛奶的TBS-T溶液中摇动孵育1小时。用SignalFire PlusECL试剂盒(Cell Signaling Technologies，Danvers，MA)开发染色膜，并使用ChemiDocXRS+系统(Bio-Rad，Hercules，CA)成像。使用FIJI软件进行密度测量。
小鼠肿瘤组织的免疫组织化学染色和组织化学染色
从安乐死小鼠中收集PaCa肿瘤组织和正常胰腺组织，并用10％缓冲福尔马林固定24小时。将样品嵌入石蜡块中，使用RM2235切片机(Leica，Buffalo Grove，IL)切割成5μm切片。在标准条件下进行苏木精/伊红染色。抗原修复在pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中于125℃下进行30s，然后进行3％ H2O2过氧化物酶阻断(8分钟)和啮齿类动物的块M(Rodent BlockM，20分钟)(Biocare Medical，Pacheco，CA)。将抗-EDB-FN G4单克隆抗体(1:100)与组织切片在RT下摇动孵育1小时。使用HRP聚合物检测溶液(Biocare Medical，Pacheco，CA)进行检测。用3,3'-二氨基联苯胺进行可视化5分钟，用苏木精复染5秒。用Bx61VS(Olympus，Waltham，MA)玻片扫描仪采集图像，并在OlyVIA软件中进行处理。组织学解释由委员会认证的病理学家进行。
为了评估ZD2肽的结合特异性，从安乐死的荷瘤小鼠中采集肿瘤和正常组织的快速冷冻样品，并将其嵌入到最佳切割温度培养基中。然后将嵌入的样品浸入液氮中5分钟，并在冷冻切片前转移至-80℃储存。将组织切片在含有0.05％吐温-20和10％正常山羊血清(Gibco，Gaithersburg，MD)的PBS中阻断1小时，然后分别在4℃下用BC-1一级单克隆抗体(1:400)或ZD2-Cy5.5(500nM)染色过夜或室温孵育2.5小时，然后用PBS-T缓冲液洗涤。将二级Alexa Fluor 594抗-兔与BC-1处理的切片在室温(1:1000)下孵育1小时。对于阻断实验，首先将组织切片与过量的BC1抗体在4℃下孵育过夜，然后用PBS-T洗涤三次。然后将切片与ZD2-Cy5.5在室温下孵育2.5小时。用PBS-T缓冲液洗涤染色的切片，并使用Cy5.5(激发：635nm；发射：693nm)和DAPI(激发：405nm；发光：461nm)的预编程发射和激发滤光片在Olympus FV1000(Waltham，MA)共焦显微镜上采集图像，使用10X物镜。
造影增强的MRI
麻醉侧腹荷瘤小鼠并插入尾静脉导管。MR图像采集在带有体积射频线圈的7TBiospin(Bruker，Billerica，MA)临床前小型动物扫描仪上进行。使用多自旋多回波(MSME)MRI序列获得轴向图像(500ms TR，8.1ms TE，90°FA，4.50cm x 4.50cm FOV，1.50mm切片厚度，16个切片，2个平均值，200x200矩阵，0.0225x0.0225cm/像素分辨率)。通过尾静脉导管以0.1mmol/kg(100μL)的剂量注射造影剂，然后进行盐水冲洗。在造影剂前和造影剂给药后的不同时间点采集肿瘤图像。Gd(HP-DO3A)用作对照。
将携带胰腺内肿瘤的小鼠麻醉并插入尾静脉导管。在带有小鼠射频线圈的MRSolutions 3T MRS 3000扫描仪上进行图像采集。使用快速自旋回波(FSE)MRI序列(305msTR，11ms TE，90°FA，4cm x 4cm FOV，1mm切片厚度，10个切片，回波列长度＝4，回波间隔＝11ms，4个平均值，256x256矩阵，0.0156x0.156cm/像素分辨率)和呼吸门控获得轴向图像。在造影剂前和以0.1mmol/kg(100μL)的剂量注射造影剂后的不同时间点采集图像。对于竞争性结合实验，以0.1mmol MT218/kg(100μL)的剂量将摩尔比5:1的游离ZD2肽与MT218注射到携带胰腺内BxPC3肿瘤异种移植物的小鼠中(n＝3)。使用提供的Surscalereader.exe(MRSolutions，Guildford，UK)程序在MR Solutions 3T扫描仪上获得的图像进行归一化。
图像文件在Horus软件中导出和分析。在肿瘤、肝脏、肾脏和肌肉中绘制ROI。肌肉ROI取自肌肉，其他结构(肝脏、肾脏、肿瘤)在与已发表的图像进行比较并与解剖标志物或生物发光成像进行比较后确定。为图像分析绘制的ROI的大小总结在补充表S1中。肿瘤的对比噪声比(CNR)使用以下公式计算，其中σ_噪声是来自小鼠体外绘制的ROI强度的标准偏差：
Figure BDA0004113382920000611
肝脏对比噪声比(CNR)使用以下公式计算：
Figure BDA0004113382920000612
在FIJI开源软件中，对调整到相同窗口和水平的图像进行图像减影。使用RGB彩虹颜色查找表显示图像相减的结果。
统计分析
使用倍数增强＝CNRpost/CNRpre，图像对比度报告为造影后的图像与造影前的图像的对比噪声比的倍数增强。在Minitab Express(Minitab Inc，State College，PA)中进行CNR的统计分析。进行单因素方差分析和Fisher个体均值差异检验，以确定两个以上均值之间的统计显著性(p<0.05)。学生T检验用于确定两种均值之间的统计显著性(p<0.05)。
结果
MT218的结合亲和力和弛豫性
图19显示靶向造影剂MT218的化学结构、结合亲和力和弛豫性。MT218是ZD2肽与大环临床MRI造影剂Gd(HP-DO3A)的小分子缀合物。MT218与EDB-FN的结合亲和力为3.2±0.2μM。在3T时，MT218的T1和T2弛豫性分别为6.07±1.13s-1mM-1和8.20±0.18s-1mM-1。
EDB-FN在人PaCa中的表达
图20示出用靶向荧光探针ZD2-Cy5.5在人PaCa、胰腺上皮内瘤变(PanIN)和正常胰腺组织标本中ZD2肽与EDB-FN的结合。ZD2-Cy5.5结合在人PaCa组织中高，在癌前PanIN组织中中等，在正常胰腺组织中低。ZD2-Cy5.5结合在恶性组织和癌前组织中的分布是不均匀的。在PaCa标本中组织不良的导管结构中可见强荧光强度，而在PanIN组织中观察到中间染色，染色集中在没有管腔结构的细胞簇中。不同人类胰腺组织中ZD2-Cy5.5结合的荧光强度表明EDB-FN在恶性PaCa组织中高表达，在癌前PanIN中中等表达，在正常胰腺中低表达。
EDB-FN在小鼠PaCa模型中的表达
也评估了EDB-FN在Capan-1、BxPC3-GFP-Luc和PANC-1-GFP-Luc人PaCa细胞和源自这些细胞的肿瘤异种移植物中的表达。用EDB-FN特异性G4抗体的蛋白质印迹揭示，在所有三个PaCa系中，两条220+kDa带的表达与EDB-FN蛋白的大小一致(图21A)。来自携带PaCa异种移植物的小鼠的肝脏、胰腺和肿瘤蛋白提取物的蛋白质印迹也显示出所有三种PaCa模型中的220+kDa带，而在正常肝脏和胰腺组织中没有，表明肿瘤中EDB-FN表达升高，而正常组织和器官中没有表达(图21B)。胰腺肿瘤异种移植物的苏木精和伊红染色切片揭示与PaCa外观一致的低分化癌大结节(图21C)。所有肿瘤均表现出密集的细胞，胞质与细胞核比率低。G4抗-EDB-FN抗体的免疫组织化学染色在所有三种PaCa模型的组织切片中显示出强烈的染色，而没有抗体时没有观察到染色(图21C)。用EDB-FN特异性单克隆抗体BC-1或ZD2-Cy5.5对快速冷冻组织切片进行染色揭示，BxPC3、Capan-1和PANC-1组织中EDB-FN的染色模式相似。在正常胰腺和肌肉组织中未发现染色，表明EDB-FN未表达。ZD2-Cy5.5结合在抗-EDB-FN抗体的存在下被阻断。结果表明，EDB-FN在人胰腺癌细胞及其小鼠肿瘤异种移植物中过度表达，而在正常组织中没有表达。
胰腺癌侧腹异种移植物的MRMI
采用靶向造影剂MT218的EDB-FN的MRMI在检测PaCa中的有效性首先在携带皮下Capan-1侧腹肿瘤异种移植物的小鼠中进行了评估。相同剂量(0.1mmol/kg)的临床试剂Gd(HP-DO3A)用作对照。与Gd(HP-DO3A)相比，注射MT218 5分钟后，在肿瘤周围观察到更强的造影增强(图22)。然后，在注射MT218的小鼠中，肿瘤核心的对比度增强逐渐增加(图22)。给药Gd(HP-DO3A)的小鼠没有表现出显著的肿瘤核心增强。从同一小鼠不同时间点的造影后图像中减去造影前图像表明，在MT218施用后的早期时间点(造影后5-15分钟)，肿瘤周围出现了强烈的初始增强，随后在后期时间点(造影后25-35分钟)，整个肿瘤都出现了稳健的肿瘤造影增强(图22)。相比之下，给药Gd(HP-DO3A)的小鼠的减影图像在注射后的早期时间点产生适度的外周造影增强，在所有时间点几乎没有肿瘤内对比。结果表明，MT218有效地在整个肿瘤中产生稳健的信号增强，用于有效的分子成像和利用MRMI检测PaCa。
胰腺内肿瘤异种移植物的MRMI
在携带胰腺内人PaCa肿瘤异种移植物的小鼠中进一步研究了采用MT218的MRMI的有效性。生物发光成像证实在植入肿瘤细胞的三只小鼠的左上腹部存在荧光素酶标记的BxPC3-GFP-Luc肿瘤异种移植物(图23A)。在MT218给药10分钟内，荷瘤小鼠的MT218 MRMI清晰地描绘出具有强烈造影增强的小病灶(图23B)。肿瘤造影增强随后在20分钟时降低，并在注射MT218后30分钟恢复到背景水平。临床药物Gd(HP-DO3A)在注射后10分钟时在肿瘤中产生中度的造影增强，并且在注射Gd(HP-DO3A)后20分钟信号增强降低到背景水平(图23B)。从造影后图像中减去造影前图像进一步证明，在T1加权MR图像中，在注射后10分钟，靶向造影剂对胰腺内肿瘤的强烈增强和清晰描绘，而Gd(HP-DO3A)产生较少的肿瘤内信号增强(图23B)。为了进一步证明MT218对PaCa的MRMI的特异性，在携带胰腺内BxPC3异种移植物的小鼠中进行了竞争性结合实验，其中施用过量5倍的游离ZD2肽和MT218。过量游离肽的共注射阻断了MT218与肿瘤的结合，导致与注射有游离ZD2肽的MT218的荷瘤小鼠相比，肿瘤图像中的造影增强显著降低。
为了确定用MT218改善的MRMI造影增强是否可重现，在另一个源自PANC-1-GFP-Luc细胞的胰腺内PaCa模型中测试了MT218 MRMI。携带PANC-1-GFP-Luc胰腺内异种移植物的小鼠的生物发光图像揭示，癌细胞接种的左上腹部区域存在大量荧光素酶信号，表明肿瘤存在(图24A)。荷瘤小鼠的MT218 MRMI在肿瘤组织中产生了显著的造影增强，并在注射后10分钟清晰地描绘了肿瘤。相比之下，Gd(HP-DO3A)没有产生显著的肿瘤造影增强，并且不能清楚地识别肿瘤(图24B)。从造影后图像中减去造影前图像的图像揭示用MT218的肿瘤中的显著信号增强，而Gd(HP-DO3A)施用后几乎没有观察到变化(图24B)。
ZD2 MRMI的定量分析
分析MT218的MRMI肿瘤信号增强与临床药物的对比。还分析了肝脏中的信号增强，以确定正常组织中MT218的潜在非特异性增强。MT218在注射后15分钟在Capan-1侧腹肿瘤异种移植物中产生了4.84倍的对比噪声比(CNR)增加，维持至少35分钟(图25A)。临床药物Gd(HP-DO3A)在实验期间使肿瘤内CNR增加1.77倍，显著低于MT218(p<0.01)。两种造影剂在所有受试小鼠的肝脏(图25A)、肾脏和脾脏中观察到CNR无显著差异(p>0.05)。
在注射后10分钟时，MT218使BxPC3-GFP-Luc胰腺内肿瘤的CNR最大增加5.3倍，而Gd(HP-DO3A)在10分钟时产生约2.5倍的肿瘤CNR增加，显著低于MT218(p<0.01)(图24B)。两种药物的肿瘤CNR随后都衰减。同样，注射后10分钟，MT218在PANC-1-GFP-Luc胰腺内肿瘤异种移植物中产生约3.85倍的肿瘤内CNR增加，而Gd(HP-DO3A)产生2.35倍的瘤内CNR(图25C)。两种造影剂在所有受试小鼠的肝脏(图25B、C)和肾脏中未观察到CNR的差异(p>0.05)。
过量游离ZD2肽与MT218的共注射导致BxPC3-GFP-Luc胰腺内模型中CNR增加约2.5倍，这与Gd(HP-DO3A)的CNR增加相似(图25B)。MT218在5倍游离肽存在下的CNR增加显著低于MT218在不含游离肽时的CNR(约4.5倍，p<0.05)。游离ZD2肽的共注射抑制了MT218的结合，并将肿瘤CNR降低到与Gd(HP-DO3A)类似的药物非特异性积聚水平。结果表明MT218与PaCa肿瘤的特异性结合。
讨论
磁共振分子成像(MRMI)的临床应用是精确癌症成像的理想选择，因为它结合了MRI的高软组织对比度和良好的空间分辨率，具有成像和表征肿瘤内分子变化的能力。临床MRMI的一个主要挑战是克服基质屏障，使靶向造影剂充分结合以产生可检测的造影增强。胰腺癌(PaCa)是高度纤维化的，具有密集的ECM，这限制了造影剂进入肿瘤内部组织。许多分子成像剂体积庞大，与难以到达的细胞表面靶标结合。通过利用肿瘤ECM中结构域外B纤连蛋白(EDB-FN)的肿瘤特异性表达作为MRMI的靶标，我们发现可以显著改善PaCa的成像。
我们发现，用EDB-FN特异性荧光探针ZD2-Cy5.5可在人PaCa和癌前组织中检测到EDB-FN的表达，这表明MT218 MRMI也可用于表征初癌和恶性肿瘤。EDB-FN在PaCa和初癌中的表达与其他组的观察结果一致。Jailkhani等人Proceedings of the National Academyof Sciences,116,14181(2019)。使用分子成像剂ZD2-N3-Gd(HP-DO3A)(MT218)在PaCa小鼠模型中证明了EDB-FN MRMI检测PaCa的有效性。MT218以微摩尔亲和力结合EDB-FN，与先前报道一致。Han等人,Bioconjugate Chemistry 28,1031-1040,(2017)。此外，MT218的弛豫性高于Gd(HP-DO3A)。MT218与临床药物Gd(HP-DO3A)相比，在Capan-1侧腹(对照组273％CNR，p<0.05)、BxPC3-GFP-Luc(对照组212％ CNR，p<0.01)和PANC-1-GFP-Luc胰腺内(对照164％ CNR，p<0.05)PaCa小鼠模型中产生了显著更大的图像对比噪声比(CNR)，这是由于其特异性肿瘤结合和高T1弛豫性。MT218与富含EDB-FN的PaCa的特异性结合通过在胰腺内模型中过量的游离ZD2肽破坏MT218结合而降低的肿瘤CNR来验证。时间进程MRMI图像揭示MT218能够与肿瘤核心深处的EDB-FN结合，这在使用非靶向临床造影剂Gd(HP-DO3A)的成像研究中没有观察到。此外，MT218的小尺寸(1442Da)、中等结合亲和力和亲水性有助于其在肿瘤核心内扩散和结合的移动性，同时保持低背景噪声。MT218可以更好地显示面积小至6.13mm2的肿瘤结节，这表明MT218具有准确早期检测PaCa的潜力，这可以改善早期检测，从而启动及时治疗，提高患者生存率。这与其他ZD2靶向成像剂的性能一致，后者能够使用MRMI28检测小转移。这对于及时开始治疗和改善治疗结果至关重要。据报道，检测和手术去除大小小于10mm的PaCa肿瘤将大大提高PaCa患者的长期生存率和生活质量。Tsunoda等人,Journal of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery 5,128-132,(1998)。
癌症中EDB-FN的分子成像之前已经用PET成像用放射性同位素标记的抗体进行了研究。用125I标记抗-EDN-FN抗体BC-1，并在携带U87脑肿瘤和SKMel28黑色素瘤异种移植物的小鼠中进行测试。Mariani等人,Cancer 80,2378-2384(1997)。尽管该抗体对EDB-FN高度特异，并被发现与富含EDB-FN的肿瘤结合，但由于其大尺寸而在循环中的长期滞留会产生显著的背景噪声，并影响特定肿瘤成像的质量。最近开发了尺寸更小的纳米体，用于各种类型的肿瘤模型中EDB-FN的分子成像。64Cu标记的纳米体探针(64Cu-NJB2)证明在使用PET/CT26的小鼠模型中特异性摄取和有效检测PaCa和癌前病变。ZD2肽也用68Ga标记，作为EDB-FN分子成像的PET探针。ZD2靶向探针提供了PaCa中EDB-FN的灵敏和特异性分子成像。Gao等人,Am J Nucl Med Mol Imaging 9,216-229(2019)。与PET相比，MRMI有利于以高分辨率和软组织对比描绘小PaCa，这对治疗规划有价值。PET/MRI的临床实施为PaCa的分子成像提供了一种用PET探针和MRI造影剂靶向EDB-FN的独特方法。
EDB-FN MRMI的其他方法也正在研究中。基于葡聚糖的化学交换饱和转移(CEST)MRI也利用ZD2肽对PaCa进行成像。Han等人,Bioconjugate Chemistry 30,1425-1433(2019)。葡聚糖-ZD2缀合物在45分钟内在PaCa的侧腹模型中产生可检测的肿瘤内信号，这支持EDB-FN的MRMI提供诊断价值的假设。然而，CEST在转译方面面临一些挑战，包括在临床场强下的信噪比较低、灵敏度低和高剂量。迄今为止，钆基造影剂，特别是大环造影剂，被认为是临床癌症MRI的安全有效的造影剂。
尽管我们给出在PaCa成像中EDB-FN的MRMI前景，但这项研究存在局限性。需要对大量人类PaCa群体中EDB-FN表达进行全面研究，以验证其作为PaCa的生物标志物。EDB-FN在人PaCa中的表达可能有很大差异。然而，我们的结果与另一项人PaCa中EDB-FN表达的小规模研究之间的高度相关性表明，情况不太可能如此。由于nu/nu小鼠的免疫功能受损，本研究所用的模型可能无法完全重现人PaCa的肿瘤微环境。MT218的进一步研究目前正在PaCa的免疫适应性和自发模型中进行。还需要对相关风险因素进行进一步的流行病学调查和与MRMI合作的筛查工具，以检测早期胰腺癌。MRMI可以提高早期PaCa的检测，特别是对于高危人群，但不是普通人群的理想筛查工具。我们相信，用ZD2-N3-Gd(HP-DO3A)对MRMI进行临床转译将有助于快速开发能识别可能受益于早期PaCa MRMI检测的高危患者的通用人群筛查工具。
总之，本研究研究了人PanIN、PaCa标本和PaCa小鼠模型中EDB-FN的过度表达，并证明了用小分子靶向MRI造影剂MT218进行的EDB-FN的MRMI的有效性。使用MT218的MRMI产生良好的造影增强，并清晰地描绘出小PaCa肿瘤。在肝组织中观察到最小的非特异性信号增强。使用MT218的MRMI具有监视胰腺癌前病变以及精确检测和描绘小胰腺癌的潜力。使用MT218的MRMI的临床转译有望解决对检测早期胰腺癌的高度特异性成像技术的未满足的临床需求，并影响胰腺癌临床管理的各个方面，包括筛查高危人群、诊断、治疗决策以及治疗后监测。
实施例5：使用MT218的EDB-FN的造影增强MRMI有助于前列腺癌的无创监测和主动 监视
EDB-FN作为使用MT218的MRMI的分子标志物的潜在作用在多种不同侵袭性程度的前列腺癌模型中被确定。
对低风险、低EDB-FN表达的前列腺癌LNCaP细胞系进行修饰，以产生更具侵入性的前列腺癌细胞。例如，LNCaP-CXCR2细胞被设计为稳定地过度表达促炎和促致瘤IL8受体CXCR2。C4-2细胞从去势小鼠的LNCaP细胞皮下异种移植瘤中分离。然后通过对20μM恩杂鲁胺(Enzalutamide，一种雄激素受体拮抗剂)的获得性耐药性来产生C4-2-DR细胞。
在标准transwell测定法中，与低风险惰性LNCaP细胞相比，LNCaP-CXCR2、C4-2和C4-2-DR细胞显示出通过基质凝胶涂覆的小室的侵入增加(图26A)和EMT标志物N-钙粘蛋白增加(图26B)。在3D培养中，与LNCaP球状体相比，侵入性前列腺细胞显示出增殖性肿瘤球状体，EDB-FN分泌显著增加，ZD2-Cy5.5染色证明了这一点(图26C)。这些结果表明，EDB-FN在发展为侵入性肿瘤的低风险肿瘤中强烈上调。
通过在无胸腺的nu/nu小鼠中皮下注射4种前列腺癌细胞建立异种移植模型，并使用0.04mmol Gd/kg的MT218进行MRMI测试。肿瘤的差异造影增强MRMI显示，与低级别LNCaP肿瘤相比，MT218在侵入性LNCaP-CXCR2、C4-2和C4-2-DR肿瘤中导致更强的信号增强(图27A)。这反映在注射后20分钟，LNCaP-CXCR2和C4-2肿瘤的CNR增加了近3倍，C4-2-DR肿瘤增加了6倍，而低级别LNCaP肿瘤的CNC增加可忽略不计(图27B)。
有趣的是，另一种模型PC3及其耐药对应物PC3-DR显示出不同的趋势。与PC3细胞相比，通过对200nM紫杉醇的获得性耐性而由PC3细胞产生的PC3-DR细胞显示出通过Matrigel涂覆的小室的侵入减少(图28A)，以及3D培养中EDB-FN分泌减少，这通过ZD2-Cy5.5染色的较低强度观察到的(图28B)。
这些结果也在用MT218的MRMI中进行了重现。如图28C-D所示，尽管PC3肿瘤显示出强烈的信号增强且CNR比造影前高5倍，但PC3-DR肿瘤仅显示出中度增强的信号增强和相比于造影前1.6倍的CNR(p＝0.07)。重要的是，侵入性PC3肿瘤比侵入性较小的PC3-DR肿瘤显示出显著更高的CNR(图28D)，表明EDB-FN上调仅与侵入性耐药前列腺癌相关。
还在2个月进程内对前列腺肿瘤的主动监视进行了初步研究。在第21天和然后第60天进行使用MT218的MRMI，以监测侵入性C4-2肿瘤的进展。在注射0.04mmol Gd/kg MT218之前和之后20分钟，对两只小鼠进行成像，并获得T1加权轴向图像。如图29所示，C4-2肿瘤在第2个月的进展伴随着信号增强增加(图29A-B)，反映为从第21天到第60天CNR的稳定增加(图29C-D)。
实施例6：通过MR分子成像无创测定靶向ECO/miR-200c纳米颗粒治疗对调节肿瘤 微环境和治疗三阴性乳腺癌的疗效
本实施例描述了MRMI对靶向miR-200c治疗的肿瘤反应的无创评估的有效性以及RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒在小鼠TNBC模型中的治疗效果的研究。靶向RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒通过miR-200c双链体与多功能氨基脂质载体ECO和具有PEG间隔物的环状RGD肽的自组装来开发的，用于TNBC细胞中miR-200c的特异性递送和上调。本发明人先前使用ECO，即(1-氨基乙基)亚氨基双[N-油酰基半胱氨酰-1-氨基乙基)丙酰胺]进行的研究表明，治疗性siRNA的体内系统递送具有优异的效率，并对TNBC治疗的各种致癌mRNA和长非编码RNA进行有效调节。Parvani等人,Bioconjugate Chem.,30,907(2019)。由于miR-200c直接调节纤连蛋白表达，我们首先研究了RGD-PEG-ECO/miR-200c治疗后TNBC癌细胞中其癌胚亚型EDB-FN以及其他下游基因靶标(包括ZEB1、BMI1和FN1)的下调。在体外评估RGD-PEG-ECO/miR-200c对TNBC癌细胞球状体形成、侵入性和迁移的影响。在两个原位人TNBC小鼠模型中，通过使用MT218的MRMI的EDB-FN的无创成像，研究RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒系统给药的治疗效果和肿瘤反应，并通过死后免疫组织化学进一步验证。
结果
靶向的RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒
如前所述，通过RGD-PEG-MAL和ECO与未修饰的miR-200c双链体(N/P＝8)的自组装来制备环状RGD肽靶向的RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒。Parvani等人,BioconjugateChem.,30,907(2019)。使用miR-200c双链体是因为天然单链miR-200c序列稳定性差，无法与ECO形成稳定的纳米颗粒。类似地制备非特异性siRNA双链体的RGD-PEG-ECO/siNS纳米颗粒作为对照。RGD-PEG-ECO/miR-200c和RGD-PEG-ECO/siNS纳米颗粒具有均匀的尺寸和电荷分布，流体动力学直径分别为174.0±25.4nm和149.6±5.4nm，如通过动态光散射测量的，ζ电位分别为25.3±4.4mV和17.7±2.4mV(图30A)。标准凝胶延迟测定显示两种纳米颗粒的有效RNA包封和可忽略的游离RNA带，表明高RNA装载效率和包封(图30B)。
使用RGD-PEG-ECO/miR-Cy5.5纳米颗粒评估miR-200c的细胞内化，该纳米颗粒在侵入性间充质miR-200c-低MDA-MB-231TNBC细胞中具有用Cy5.5标记的miR-200c双链。如图30C所示，共聚焦荧光显微镜显示转染后4小时细胞核周围的Cy5.5荧光强度很强，表明纳米颗粒的胞浆递送效率很高。流式细胞术进一步证实了RGD-PEG-ECO/miR-Cy5.5纳米颗粒转染的高效性，与未转染细胞相比，转染后4小时的荧光强度增加了360倍(图30D)。这些结果表明，靶向的RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒可以有效地介导TNBC细胞中miR-200c的有效胞内递送。
RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒促进TNBC细胞中延长的miR-200c上调和下游基 因靶标的有效调节
在MDA-MB-231和Hs578T人TNBC细胞中研究了RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒对细胞内过度表达和下游基因调控的有效性。RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒介导MDA-MB-231细胞中miR-200c在转染后长达14天的延长上调，如qRT-PCR所测定，图31A。与RGD-PEG-ECO/siNS相比，RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒在转染后的第一个24小时内诱导miR-200c表达增加近1000倍，并在第7天显著降低至80倍之前维持了4天的高水平。直到第14天，仍观察到miR-200c显著上调30倍。miR-200c上调介导MDA-MB-231细胞中ZEB1的mRNA表达的显著下调，ZEB1是一种EMT标志物，也是miR-200c的直接靶标。如图31B所示，与RGD-PEG-ECO/siNS相比，RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒转染后长达1周，观察到ZEB1下调20-40％。类似地，用RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒处理MDA-MB-231和Hs578T细胞，与转染后48小时的各自对照siNS对应物相比，导致miR-200c上调50倍和100倍，如图31C、I所示。miR-200c表达的差异可归因于转染期间细胞的数量和增殖率。因此，在MDA-MB-231和Hs578T中，其直接下游靶标，包括ZEB1、BMI1和生存素，的表达在mRNA水平上分别显著降低：对于ZEB1为57％和40％(图31D、J)，对于BMI1为15％和35％(图31E、K)以及对于生存素为25％和64％(图31F、L)。通过蛋白质印迹，在蛋白质水平上也观察到这些基因靶标的显著下调(图31O、P)。
我们接下来研究了RGD-PEG-ECO/miR-200c处理对细胞外基质蛋白纤连蛋白(FN1)表达的影响，纤连蛋白也参与EMT，是miR-200c的通过3’-UTR结合介导的基因表达抑制的直接靶标。RGD-PEG-ECO/miR-200c处理导致MDA-MB-231和Hs578T细胞中FN1 mRNA水平降低约20％(图31G，M)。还研究了miR-200c上调对FN1癌胚同种型EDB-FN表达的影响，以评估使用EDB-FN作为miR-200c治疗肿瘤反应的无创成像标志物的潜力。尽管两种细胞系都显示出强烈的内源性EDB-FN表达，但在Hs578T细胞中比在MDA-MB-231细胞中高得多(图31O、P)。在MDA-MB-231和Hs578T细胞中分别观察到EDB-FN mRNA水平降低了约80％和40％(图31H、N)，经由蛋白质印迹，通过与RGD-PEG-ECO/miR-200c相比，RGD-PEG-ECO/miR200c处理后的蛋白质表达降低证实(图31O、P)，表明EDB-FN是miR-200c的下游靶标。总之，这些结果表明RGD-PEG-ECO/miR-200c的强大和延长的细胞内递送miR-200c可以有效地调节TNBC细胞中miR-200c的多个下游靶基因。
RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒抑制TNBC细胞的侵入和3D生长
RGD-PEG-ECO/miR-200c介导的miR-200c上调抑制TNBC细胞侵袭性的影响通过使用迁移、侵入和肿瘤球状体形成的标准功能测定来确定。与RGD-PEG-ECO/siNS相比，用RGD-PEG-ECO/miR-200c转染MDA-MB-231和Hs578T细胞减少了两种细胞系的迁移(图32A)。与RGD-PEG-ECO/siNS相比，用RGD-PEG-ECO/miR-200c处理24小时显著降低了它们通过基质凝胶涂覆的多孔膜侵入的能力，图32B，其中侵入的细胞被结晶紫染成紫色。与RGD-PEG-ECO/siNS对照相比，RGD-PEG-ECO/miR-200c显著降低在3D基质凝胶培养中TNBC细胞形成肿瘤球状体的倾向(图32C)。这些结果证明，用RGD-PEG-ECO/miR-200c处理抑制TNBC细胞的迁移、侵入和3D球状体形成。
RGD-PEG-ECO/miR-200c抑制体内TNBC增殖
在携带原位GFP荧光素酶标记的MDA-MB-231和Hs578T异种移植物的无胸腺裸小鼠中评估RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒在体内治疗TNBC的效力。RGD-PEG-ECO/miR-200c和RGD-PEG-ECO/siNS(N/P＝8)纳米颗粒在水溶液中用5％蔗糖配制，每周以1.0mg/kg RNA的剂量静脉施用持续6周(图33A)。在治疗之前和结束时，每周使用卡尺测量和全身生物发光成像(BLI)以及MRMI监测肿瘤生长。在两种肿瘤模型中，与RGD-PEG-ECO/siNS相比，用RGD-PEG-ECO/miR-200c的处理导致肿瘤进展的显著抑制。RGD-PEG-ECO/siNS处理的小鼠在第6周与处理前(第1周)相比，显示出显著增加的生物发光强度，表明对照组中肿瘤快速生长。相比之下，miR-200c处理的肿瘤显示出在第6周时信号强度的增加明显低于对照组，图33B-E。用RGD-PEG-ECO/miR-200c处理的MDA-MB-231肿瘤抑制肿瘤的进展，从第1周到第6周，肿瘤体积没有显著增加(76.1±15.2至111.4±22.1mm3，p>0.05)，而对照处理的肿瘤体积增加了近3倍(57.7±32.0至172.2±17.8mm3(p<0.005)，图33F。在Hs578T肿瘤的情况下，RGD-PEG-ECO/miR-200c处理显示肿瘤体积显著减少，从51.48±3.37降至10.54±5.45mm3(p<0.005)，从第1周至第6周减少约79％，而RGD-PEG-ECO/siNS处理的Hs578T肿瘤的肿瘤体积增加2.2倍(49.5±4.7至111.1±11.3mm3，p<0.005)，图33G。然而，一只接受RGD-PEG-ECO/miR-200c处理的小鼠死于与治疗或肿瘤负担无关的未知病例。结果表明，用肿瘤靶向RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒系统递送miR-200c在动物模型中介导了TNBC的有效治疗。
MRMI证明在用RGD-PEG-ECO/miR-200c处理后TME中EDB-FN表达改变
鉴于miR-200c的上调显著下调了体外TNBC细胞中EDB-FN的表达，并抑制了体内肿瘤的增殖，我们试图使用MT218的高分辨率MRMI评估基于EDB-FN表达的RGD-PEG-ECO/miR-200c处理对肿瘤的反应。图34显示用RGD-PEG-ECO/miR-200c和RGD-PEG-ECO/siNS纳米颗粒处理前后TNBC肿瘤的T1加权轴向MR图像。与造影前肿瘤图像相比，在注射剂量为0.1mmol/kg的MT218后的前30分钟，在所有预处理MDA-MB-231和Hs578T肿瘤中观察到强烈的信号增强，这表明EDB-FN在两种肿瘤模型的ECM中都有高表达，因为MT218是细胞外造影剂。在处理6周后，接受对照RGD-PEG-ECO/siNS的MDA-MB-231和Hs578T肿瘤的造影后MR图像中仍有强的信号增强。用MT218的MRMI清楚地描绘了对照组中两种肿瘤异种移植物的显著生长。相比之下，与预处理肿瘤和对照处理肿瘤相比，用RGD-PEG-ECO/miR-200c处理的2个肿瘤模型的造影后MR图像中未发现明显的信号增强，表明miR-200c处理导致TNBC肿瘤中EDB-FN的显著减少。与图34中的观察结果相似，与各自的对照处理的肿瘤相比，MRMI揭示用RGD-PEG-ECO/miR-200c处理后MDA-MB-231肿瘤增殖的抑制和Hs578T肿瘤的消退。这些结果表明RGD-PEG-ECO/miR-200c处理降低肿瘤ECM中EDB-FN的表达，并改变TNBC肿瘤的TME，如用MT218的无创MRMI所示。
肿瘤MR图像中对比噪声比(CNR)的定量分析揭示，静脉注射MT218后，在用两种纳米颗粒处理之前(基线)，MDA-MB-231和Hs578T肿瘤中的CNR都很高，表明EDB-FN表达很高，图34A。Hs578T肿瘤的造影后CNR显著高于MDA-MB-231肿瘤，表明前者的EDB-FN表达更高，与细胞中EDB-FN的蛋白质印迹一致(图31O，P)。用RGD-PEG-ECO/miR-200c处理显著降低了MDA-MB-231和Hs578T肿瘤中的CNR，表明EDB-FN表达降低，而用RGD-PEG-ECO/siNS处理的肿瘤与同一组小鼠中的预处理肿瘤具有相同的高CNR。经miR-200c处理的MDA-MB-231肿瘤的造影后CNR没有显示出比造影前背景水平显著增加，而经处理的Hs578T肿瘤的CNR略高于背景水平(图34B)。该观察结果表明，miR-200c处理后，Hs578T肿瘤中的EDB-FN残留量高于MDA-MB-231肿瘤，这也与miR-200c处理的细胞中EDB-FN的蛋白质印迹结果一致(图31O、P)。总之，这些结果表明，用MT218的MRMI基于EDB-FN表达提供了对RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒处理的肿瘤反应无创和准确的可视化，并有效评估了miR-200c治疗的疗效。
RGD-PEG-ECO/miR-200c治疗提高TNBC肿瘤中miR-200c水平并抑制下游靶基因
RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒的全身给药导致TNBC肿瘤中miR-200c的强烈上调，如手术切除的原发肿瘤的qRT-PCR分析所示。与用RGD-PEG-ECO/siNS处理的肿瘤相比，用RGD-PEG-ECO/miR-200c处理的MDA-MB-231和Hs578T肿瘤的miR-200c水平分别增加约7.6倍和3.4倍，图35A、D。重要的是，这种miR-200c上调导致ZEB1和EDB-FN在mRNA水平上显著下调，图35B、C、E、F。免疫组织化学也证实了RGD-PEG-ECO/miR-200c处理的肿瘤中EBF-FN的下调。在RGD-PEG-ECO/siNS处理的MDA-MB-231和Hs578T肿瘤的组织切片中观察到强烈的EDB-FN染色，如抗-EDB-FN抗体染色，而用RGD-PEG-ECO/miR-200c处理的肿瘤显示出EDB-FN染色显著减少(图35G)，与无创MRMI的观察一致。总之，这些结果表明，用RGD-PEG-ECO/miR-200c系统处理TNBC肿瘤可以有效上调其miR-200c表达，并因此在体内下调下游致癌基因ZEB1和EDB-FN。动物模型肿瘤中miR-200c及其相关下游基因水平的改变与体外实验中获得的数据一致，并强烈证实了RGD-PEG-ECO/miR-200c处理的肿瘤反应。
RGD-PEG-ECO/miR-200c不对小鼠造成明显的毒性副作用
通过监测处理期间小鼠的体重，评估重复全身给药RGD-PEG-ECO/miR-200c-和RGD-PEG-ECO/siNS纳米颗粒的安全性。在重复注射纳米颗粒的6周期间，在任何小鼠队列中都没有观察到体重的显著变化，图36A。参与纳米颗粒清除的肝脏、脾脏和肾脏的H&E染色组织病理学分析证明，在用两种纳米颗粒处理的小鼠中，组织学正常，没有任何明显的组织损伤。这些结果表明全身给药RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒用于TNBC的靶向治疗具有极好的安全性。
讨论
这项工作首次证明了TNBC TME中EDB-FN的MR分子成像对靶向miR-200c治疗的肿瘤反应的无创成像。纤连蛋白(FN1)被认为是EMT标志物之一，是癌组织中重要的ECM蛋白。然而，它也存在于正常组织的ECM中，这妨碍了它作为合适的肿瘤标志物的临床价值。其癌胚同种型EDB-FN在侵袭性肿瘤中特异性过度表达，而在正常组织中不表达，因此它成为癌症成像和治疗的理想靶标。Kumra,D.P.Reinhardt,Advanced Drug Delivery Reviews,97,101(2016)。MDA-MB-231和Hs578T TNBC细胞都具有低miR-200c表达和高EDB-FN表达。RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒介导的miR-200c上调导致两种细胞系中EDB-FN的显著下调，与体外抑制其侵入相关。类似地，与非特异性对照RGD-PEG-ECO/siNS相比，每周在小鼠体内系统注射RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒显著抑制体内MDA-MB-231和Hs578T TNBC肿瘤的增殖。在使用MT218的处理前MRMI扫描中，两种肿瘤模型都显示出强烈的信号增强，这在miR-200c处理的肿瘤的扫描中都显著减少，但在对照处理的肿瘤图像中没有减少。这些观察表明，miR-200c直接或间接影响EDB-FN表达，治疗诱导的EDB-FN水平变化的MRMI可以有效地提供RGD-PEG-ECO/miR-200c处理的肿瘤反应的无创评估。
用MT218的MRMI还首次证明了用RGD-PEG-ECO/miR-200c靶向递送miR-200c有效地改变TNBC的肿瘤微环境。FN1和EDB-FN是ECM蛋白，它们通过促进癌细胞的迁移和侵入以及介导它们与基质的相互作用而发挥重要作用。Vaidya等人,Cells,9,1826(2020)。MRMI无创地提供miR-200c处理前后整个肿瘤EDB-FN表达水平的三维、高分辨率图像。用RGD-PEG-ECO/miR-200c处理的肿瘤图像中MRMI信号的降低表明EDB-FN的下调，通过肿瘤切片的死后免疫组织化学证实。这些结果表明，miR-200c的上调可以通过调节癌蛋白EDB-FN和随后的肿瘤ECM重塑来改变两种TNBC肿瘤模型中的TME。miR-200c表达对TME的其他几个组成部分(包括胶原蛋白、层粘连蛋白和免疫回路)之间的相互作用以及它们对治疗结果的调节的影响需要进一步的详细研究。
关于miR-200c治疗，尽管两种TNBC肿瘤模型在MRMI揭示的EDB-FN表达方面表现出相似的生物学反应，但它们也显示出与RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒的模型特异性差异。MDA-MB-231肿瘤在处理期间变得静止，没有显著的大小变化，而在处理6周后，在Hs578T肿瘤中观察到显著的消退。处理后分析显示，在两种处理的肿瘤模型中，miR-200c显著上调，ZEB1和EDB-FN显著下调。由于miR-200c靶向许多其他调节促癌途径的致癌基因，包括Notch、Hedgehog和Wnt，两种经处理的肿瘤模型之间肿瘤大小的差异可以部分地由迄今尚未测试的直接受miR-200c上调影响的分子途径所解释。需要进一步的全面调查，以了解多种TNBC模型中基于肿瘤大小的生物反应和治疗结果之间的此类和其他差异。尽管如此，RGD-PEG-ECO/miR-200c直接调控多种致癌基因的能力表明，miR-200c是一种有效处理异质性TNBC肿瘤的有希望的疗法。这项工作提供了强有力的证据，即miR-200c可能是通过靶向RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒的系统递送安全治疗侵袭性TNBC肿瘤的有前途的治疗靶标。用MT218的MRMI与RGD-PEG-ECO/miR-200c治疗的组合可以允许对肿瘤反应进行无创和纵向评估，以实现癌症患者的精确医疗保健。
总之，我们已经证明了EDB-FN的MRMI对RGD-PEG-ECO/miR-200c纳米颗粒治疗的肿瘤反应的无创评估的有效性。每周以相对低的剂量施用RGD-PEG-ECO/miR-200c导致小鼠模型中TNBC肿瘤的抑制和消退，而没有明显的毒性副作用。用MT218的MRMI证明miR-200c上调后肿瘤特异性EDB-FN水平的下调和肿瘤微环境的改变，是一种有前途的无创评估对癌症处理的肿瘤反应的分子成像模式。这项研究将分子成像和miRNA水平的系统调节相结合，为TNBC患者的个性化处理开辟新的精准医学途径。
实验部分
细胞和细胞培养
三阴性乳腺癌系MDA-MB-231和Hs578T购自ATCC(Manassas，VA)。MDA-MB-231保持在补充有10％胎牛血清(FBS，Gibco)和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Gibco)中。Hs578T细胞在补充有10％FBS、1％青霉素/链霉素和来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)的0.01mg/mL重组人胰岛素的DMEM中培养。所有细胞都在37℃和5％ CO2的加湿培养箱中培养。用来自Amsbio(Cambridge，MA)的慢病毒CMV荧光素酶(萤火虫)-2A-GFP(Neo)对细胞系进行工程设计，以表达萤火虫荧光素素酶和GFP，并使用流式细胞术进行分选。
纳米颗粒制剂
合成了氨基脂质ECO(MW＝1023)和靶向配体RGD-PEG-MAL(PEG，3.4k，CreativePEGworks，Durham，NC)。将miR-200c双链和阴性对照siRNA(siNS)溶解在无核酸酶的水中至浓度为25μmol/L。将新鲜RGD-PEG-MAL溶解在NF水中至物料浓度为0.625mmol/L。将ECO溶解在100％乙醇中至物料浓度为5和50mM，用于体外和体内实验。通过首先将RGD-PEG-MAL(2.5mol％)与ECO在无核酸酶的水中混合30分钟并进行龙胆搅拌来制备靶向纳米颗粒制剂。随后与miR-200c或siNS双链体络合，以形成相应的靶向ECO/miR-200c或ECO/siNS纳米颗粒，N/P＝8。对于体内实验，将纳米颗粒制剂与5％蔗糖混合，快速冷冻并储存在-80℃。
纳米颗粒表征
在25℃下，使用Anton Paar GmbH(Graz，Austria)的Litesizer 500在NF水中稀释(1:20)后测量纳米颗粒直径和ζ电位。通过将纳米颗粒(20μL)加载到涂覆有薄碳膜(20nm)的铜栅格上，并用3μL的2％乙酸铀酰溶液染色来进行透射电子显微镜(TEM)。干燥后通过TEM对样品进行成像。使用琼脂糖凝胶电泳评估RNA货物的封装，其中20μL纳米颗粒与来自Roche(Basel，Switzerland)的4μL负载染料混合，并负载到含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上。电泳在100V下进行30分钟，并使用ChemiDocTMXRS+成像仪(BioRad，Hercules，CA)对条带进行可视化。
ECO/miRNA纳米颗粒的细胞摄取
使用活细胞荧光显微镜评估RGD-PEG-ECO/miRNA纳米颗粒的细胞摄取的定性评估。将MDA-MB-231细胞(100000个细胞)接种到玻璃底微孔培养皿上，使其粘附过夜，然后用RGD-PEG-ECO/miRNA-Cy5.5(Dharmacon，Lafayette，CO)以N/P＝8和[miRNA]＝40nM处理。4小时后，用含有5μg/mL Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)的培养基替换转染培养基30分钟。随后用DPBS洗涤细胞并使用Olympus FV1000共焦显微镜成像。类似地，使用流式细胞术定量评估细胞摄取。用含0.26mmol/L EDTA的0.25％胰蛋白酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)收获转染细胞，以12000rpm离心5分钟，并固定在5％多聚甲醛的DPBS(500μL)中。通过35μm细胞过滤器(BD Biosciences，San Jose，CA)过滤后，通过使用BD FACSCalibur流式细胞仪测量Cy5.5的荧光强度来定量细胞摄取。
半定量RT-PCR分析
进行半定量实时PCR。简而言之，根据制造商的说明，使用Qiagen(Germantown，MD)的RNeasy Plus Mini Kit从细胞和组织中提取总RNA，包括miRNA。使用miScript II RT试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)进行逆转录，然后使用miScript SYBR Green PCR试剂盒(Qagen)进行qPCR，该试剂盒包含人RNU6B(RNU6-2)miScript引物测定和miScript通用引物。miRNA和mRNA表达水平分别标准化为U6(Qiagen)和18S对照。
免疫印迹分析
通过裂解细胞团块(1:1于PBS中的蛋白酶抑制剂和Laemmli缓冲液)提取总蛋白。裂解物在100℃下孵育10分钟，并在4℃下以13200rpm离心15分钟。根据制造商的方案(Bio-Rad)，使用Lowry分析试剂盒测定蛋白质浓度。用SDS-PAGE分离等量的蛋白质提取物(40μg)，然后转移到硝化纤维膜上。在TBST中用5％ BSA封闭膜1小时。使用以下抗体(1:1000稀释，在4℃下孵育过夜)：抗-ZEB1、抗-BMI1、抗-生存素、抗-波形蛋白和抗β-肌动蛋白单克隆抗体(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)以及抗-EDB-FN G4克隆(AbsoluteAntibody，UK)。二级抗体孵育(1:2000稀释1小时)后，用Signal Fire Plus ECL试剂盒(Cell Signaling Technology)显影膜，并在ChemiDocTM XRS+成像仪(Bio-Rad)上成像。
划痕试验
进行了划痕。简言之，将1x106个乳腺癌细胞置于6孔板上24小时。使用10μL移液管尖端在板的中心形成一道划痕。用DPBS洗涤细胞，用[RNA]＝100nM的RGD-PEG-ECO/miR-200c或RGD-PEG-ECO/siNS纳米颗粒转染细胞，并监测24小时直到伤口闭合。使用MotiramT2相机(Motic，Xiamen，China)拍摄图像。
Transwell迁移测定
进行Transwell迁移测定。用靶向的ECO/miR-200c和ECO/siNS纳米颗粒以[RNA]＝100nM转染TNBC细胞48小时。将血清饥饿的细胞接种到Transwell inserts(50000个细胞/小室)(VWR，Radnor，PA)上，该小室涂有0.28mg/mL Corning基底膜基质(Corning MatrigelMembrane Matrix，Corning，NY)。24小时后，擦拭小室以去除非迁移细胞。Transwellinserts底部的迁移细胞固定在10％福尔马林中(10分钟)，并用0.1％结晶紫染色(20分钟)。使用Moticam T2相机获得图像。
3D肿瘤球状体形成生长测定
进行基质凝胶生长试验。用100nM RNA的REG-PEG-ECO/miR-200c或RGD-PEG-ECO/siNS纳米颗粒处理TNBC细胞48小时。然后将细胞以100000个细胞/孔的密度接种到Corning基底膜基质涂覆的μ-玻片(8孔，Ibidi，
Figure BDA0004113382920000761
Germany)上。对肿瘤球状体进行长达48小时的评估，并使用Moticam T2相机进行成像。
动物模型
从Jackson实验室(Bar Harbor，Maine)购买4至6周大的雌性裸小鼠(无胸腺nu/nu背景)，并在Case Western Reserve University(Cleveland，OH)的动物核心设施(AnimalCore Facility)中进行护理。所有动物实验均按照CWRU IACUC批准的方案进行。用悬浮在基质凝胶PBS混合物中的2x106个GFP-Luc标记的MDA-MB-231或4x106个Hs578T细胞注射小鼠的乳房脂肪垫。每周使用卡尺和生物发光成像(BLI)监测肿瘤体积。将平均肿瘤体积达到50mm3的小鼠随机分为对照组和处理组(MDA-MB-231的n＝5/队列，Hs578T的n＝4/队列，2只小鼠未出现肿瘤)。
体内纳米颗粒治疗
用RGD-PEG-ECO/miR-200c或RGD-PEG-ECO/siNS纳米颗粒(1mg/kg，5％w/v蔗糖)的体内制剂静脉注射到携带原位MDA-MB-231和Hs578T肿瘤的小鼠，每周注射一次，持续6周(1mg/kg、5％w/v蔗糖)。每周一次通过卡尺测量和BLI监测原发性肿瘤生长。6周后，手术切除原发性肿瘤，并分析组织学、RNA表达和IHC。此外，提取脾脏、肝脏和肾脏进行组织学检查。将一部分肿瘤固定在10％中性缓冲福尔马林(Sigma-Aldrich)中，然后进行石蜡包埋、切片和H&E染色。使用抗-EDB-FN G4抗体进行IHC。染色服务由CWRU组织资源核心设施提供。必须处死一只RGD-PEG-ECO/miR-200c处理的Hs578T荷瘤小鼠，但通过组织学分析肿瘤转移之前的死亡原因和治疗毒性，均未发现。
MRMI介导的治疗反应监测
靶向MRI造影剂ZD2-N3-Gd(HP-DO3A)(MT218)由Molecular Theranotics(Cleveland，OH)提供并合成。携带MDA-MB-231或Hs578T肿瘤的小鼠的MR图像在3T MRS3000扫描仪(MRS Solutions，Surrey，UK)上用小鼠短四线圈采集。在静脉注射剂量为0.1mmol/kg的MT218后，使用快速自旋回波(FSE)轴向序列和呼吸门控(TR＝305ms，TE＝11ms，FA＝90°，FOV＝40x40mm，切片厚度＝1mm，切片数量＝15，Nav＝2，矩阵＝256x256)采集T1加权图像。在注射MT218之前和之后10、20和30分钟采集图像。在处理之前，然后在MDA-MB-231和Hs578T肿瘤的纳米颗粒处理后的第6周进行MRMI。MRI数据和图像处理使用FIJI(FIJI只是ImageJ)软件进行。肿瘤的对比噪声比(CNR)计算为平均肿瘤强度和平均肌肉强度之差除以噪声的标准差。
统计分析
所有实验均独立进行至少3次(n＝3)。使用GraphPad软件(v8.4.3)进行统计分析，p<0.05被认为具有统计学意义。使用未配对t检验比较两组之间的数据。将2组以上的数据与单因素方差分析进行比较。数据表示为平均值±s.e.m。点表示图图例中所示的单个小鼠或技术复制品。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及电子可用材料的完整披露通过引用并入本文。以上详细描述和示例仅为清楚理解而给出。由此不必理解任何不必要的限制。本发明不限于所示和所描述的确切细节，因为本领域技术人员显而易见的变化将包括在权利要求限定的本发明内。
序列表
<110> 凯斯西储大学（Case Western Reserve University）
<120> 使用结构域外-B纤连蛋白靶向探针的诊断和监测
<130> FP225169US
<150> US 60/034520
<151> 2020-06-04
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Thr Val Arg Thr Ser Ala Asp
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Asn Trp Gly Asp Arg Ile Leu
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Asn Trp Gly Lys Pro Ile Lys
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Ser Gly Val Lys Ser Ala Phe
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Gly Val Lys Ser Tyr Asn Glu
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Ile Gly Lys Thr Asn Thr Leu
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Ile Gly Asn Ser Asn Thr Leu
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Ile Gly Asn Thr Ile Pro Val
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Leu Tyr Ala Asn Ser Pro Phe
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Cys Thr Val Arg Thr Ser Ala Asp Cys
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Cys Asn Trp Gly Asp Arg Ile Leu Cys
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Cys Asn Trp Gly Lys Pro Ile Lys Cys
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Cys Ser Gly Val Lys Ser Ala Phe Cys
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Cys Gly Val Lys Ser Tyr Asn Glu Cys
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Cys Ile Gly Lys Thr Asn Thr Leu Cys
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Cys Ile Gly Asn Ser Asn Thr Leu Cys
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Cys Ile Gly Asn Thr Ile Pro Val Cys
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Cys Leu Tyr Ala Asn Ser Pro Phe Cys
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Trp Asn Tyr Pro Phe Arg Leu
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Ser Asn Thr Ser Tyr Val Asn
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Ser Phe Ser Tyr Thr Ser Gly
1 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Trp Ser Pro Ala Pro Met Ser
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Thr Arg Glu His Pro Ala Gln
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Ala Arg Ile Ile Asp Asn Ala
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Cys Trp Asn Tyr Pro Phe Arg Leu Cys
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Cys Ser Asn Thr Ser Tyr Val Asn Cys
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Cys Ser Phe Ser Tyr Thr Ser Gly Cys
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Cys Trp Ser Pro Ala Pro Met Ser Cys
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
Cys Thr Arg Glu His Pro Ala Gln Cys
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Cys Ala Arg Ile Ile Asp Asn Ala Cys
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 31
Cys Thr Val Arg Thr Ser Ala Asp
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 32
Cys Asn Trp Gly Asp Arg Ile Leu
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 33
Cys Asn Trp Gly Lys Pro Ile Lys
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 34
Cys Ser Gly Val Lys Ser Ala Phe
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 35
Cys Gly Val Lys Ser Tyr Asn Glu
1 5
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 36
Cys Ile Gly Lys Thr Asn Thr Leu
1 5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 37
Cys Ile Gly Asn Ser Asn Thr Leu
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 38
Cys Ile Gly Asn Thr Ile Pro Val
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 39
Cys Leu Tyr Ala Asn Ser Pro Phe
1 5
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 40
Cys Thr Val Arg Thr Ser Ala Asp
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 41
Cys Asn Trp Gly Asp Arg Ile Leu
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 42
Cys Asn Trp Gly Lys Pro Ile Lys
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 43
Cys Ser Gly Val Lys Ser Ala Phe
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 44
Cys Gly Val Lys Ser Tyr Asn Glu
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 45
Cys Ile Gly Lys Thr Asn Thr Leu
1 5
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 46
Cys Ile Gly Asn Ser Asn Thr Leu
1 5
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 47
Cys Ile Gly Asn Thr Ile Pro Val
1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成结构
<400> 48
Cys Leu Tyr Ala Asn Ser Pro Phe
1 5

Claims (22)

1.一种检测受试者中耐药癌症的方法，包括：
使受试者的组织与有效量的包含式P-L-C的分子探针接触，其中：P为包含选自以下组的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；
C为造影剂；和
L为将所述肽共价连接到所述造影剂的非肽接头，所述接头包括与所述肽的胺形成甲酰胺的羧酸、或与所述肽的半胱氨酸残基形成硫酯键的马来酰亚胺、或与所述肽的半胱氨酸残基形成硫酯的马来酰亚胺；
检测所述组织中存在的所述分子探针的量；
将检测到的所述分子探针的量与对照值进行比较；以及
如果所述组织中存在的所述分子探针的量高于所述对照值，则检测到所述受试者中的耐药癌症。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症为乳腺癌、口腔癌、胰腺癌或前列腺癌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分子探针为磁共振成像剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在体内接触所述组织。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分子探针被全身给药于患有或疑似患有癌症的受试者。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分子探针的非肽接头为非肽脂族或杂脂族接头。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分子探针的非肽接头在共价连接所述肽和所述造影剂时包括亚烷基二甲酰胺。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分子探针的造影剂包括金属螯合剂或金属富勒烯中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分子探针的所述造影剂包括含有以下中的至少一种的金属螯合剂：二乙烯三胺五乙酸盐(DTPA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷四乙酸盐(DOTA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7-三乙酸盐(DO3A)及其衍生物、乙二胺四乙酸盐(EDTA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂环十三烷四乙酸(TRITA)及其衍生物、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷四甲基乙酸盐(DOTMA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7-三甲基乙酸盐(DO3MA)及其衍生物、N,N',N”,N”'-四磷酰基甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DOTP)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基甲基膦酸)(DOTMP)及其衍生物、1,4,7,10-四氧杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基苯基膦酸)及其衍生物、或N,N'-亚乙基二-L-半胱氨酸及其衍生物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分子探针具有下式：
Figure FDA0004113382910000021
其中：P1为具有选自以下组的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9；
L1为任选的间隔物；
L2为所述肽P1的氨基或所述间隔物；以及
M为选自以下组的金属：Gd+3、Eu+3、Tm+3、Dy+3、Yb+3、Mn+2、Fe+3、55Co、64Cu、67Cu、47Sc、66Ga、68Ga、90Y、97Ru、99mTc、111h、109Pd、153Sm、177Lu、186Re和188Re；或它们的盐。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，L1包含以下中的至少一种：聚环氧烷、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙基醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、或聚氰基丙烯酸酯。
12.一种监测耐药癌症治疗的方法，包括：
使接受耐药癌症治疗的受试者的组织第一次与有效量的包含式P-L-C的分子探针接触，其中：
P为包含选自以下组的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；
C为造影剂；以及
L为将所述肽共价连接到所述造影剂的非肽接头，所述接头包括与所述肽的胺形成甲酰胺的羧酸、或与所述肽的半胱氨酸残基形成硫酯键的马来酰亚胺、或与所述肽的半胱氨酸残基形成硫酯的马来酰亚胺；
检测所述组织中存在的所述分子探针的第一量；
使所述受试者的组织第二次与有效量的包含式P-L-C的分子探针接触；
检测所述组织中存在的所述分子探针的第二量；以及
比较所述分子探针的所述第一量和所述第二量以监测所述受试者的耐药癌症治疗。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述癌症为乳腺癌、口腔癌、胰腺癌或前列腺癌。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述分子探针为磁共振成像剂。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，在体内接触所述组织。
16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述耐药癌症正在用化疗剂进行治疗。
17.根据权利要求12所述的方法，其中，所述分子探针的非肽接头为非肽脂族或杂脂族接头。
18.根据权利要求12所述的方法，其中，所述分子探针的非肽接头在共价连接所述肽和所述造影剂时包括亚烷基二甲酰胺。
19.根据权利要求12所述的方法，其中，所述分子探针的造影剂包括金属螯合剂或金属富勒烯中的至少一种。
20.根据权利要求12所述的方法，其中，所述分子探针的所述造影剂包括含有以下中的至少一种的金属螯合剂：二乙烯三胺五乙酸盐(DTPA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷四乙酸盐(DOTA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7-三乙酸盐(DO3A)及其衍生物、乙二胺四乙酸盐(EDTA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂环十三烷四乙酸(TRITA)及其衍生物、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷四甲基乙酸盐(DOTMA)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7-三甲基乙酸盐(DO3MA)及其衍生物、N,N',N”,N”'-四磷酰基甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DOTP)及其衍生物、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基甲基膦酸)(DOTMP)及其衍生物、1,4,7,10-四氧杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基苯基膦酸)及其衍生物、或N,N'-亚乙基二-L-半胱氨酸及其衍生物。
21.根据权利要求12所述的方法，其中，所述分子探针具有下式：
Figure FDA0004113382910000041
其中：P1为具有选自以下组的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9；
L1为任选的间隔物；
L2为所述肽P1的氨基或所述间隔物；以及
M为选自以下组的金属：Gd+3、Eu+3、Tm+3、Dy+3、Yb+3、Mn+2、Fe+3、55Co、64Cu、67Cu、47Sc、66Ga、68Ga、90Y、97Ru、99mTc、111h、109Pd、153Sm、177Lu、186Re和188Re；或它们的盐。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，L1包含以下中的至少一种：聚环氧烷、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙基醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯或聚氰基丙烯酸酯。
CN202180056784.8A 2020-06-04 2021-06-04 使用结构域外-b纤连蛋白靶向探针的诊断和监测 Pending CN116157159A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063034520P 2020-06-04 2020-06-04
US63/034,520 2020-06-04
US202163170746P 2021-04-05 2021-04-05
US63/170,746 2021-04-05
PCT/US2021/035852 WO2021247967A2 (en) 2020-06-04 2021-06-04 Diagnosis and monitoring using extradomain-b fibronectin targeted probes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116157159A true CN116157159A (zh) 2023-05-23

Family

ID=78831716

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180056784.8A Pending CN116157159A (zh) 2020-06-04 2021-06-04 使用结构域外-b纤连蛋白靶向探针的诊断和监测

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4161584A2 (zh)
JP (1) JP2023529660A (zh)
CN (1) CN116157159A (zh)
WO (1) WO2021247967A2 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115819502B (zh) * 2022-10-12 2023-09-26 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种edb-fn靶向多肽及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107001417A (zh) * 2014-08-04 2017-08-01 卡斯西部储备大学 靶向肽及其使用方法
US20180110886A1 (en) * 2014-08-04 2018-04-26 Case Western Reserve University Molecular probes and methods of use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107001417A (zh) * 2014-08-04 2017-08-01 卡斯西部储备大学 靶向肽及其使用方法
US20170224848A1 (en) * 2014-08-04 2017-08-10 Case Western Reserve University Targeting peptides and methods of use
US20180110886A1 (en) * 2014-08-04 2018-04-26 Case Western Reserve University Molecular probes and methods of use

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMITA VAIDYA等: "Noninvasive assessment and therapeutic monitoring of drug-resistant colorectal cancer by MR molecular imaging of extradomain-B fibronectin", 《THERANOSTICS》, vol. 10, no. 24, 8 September 2020 (2020-09-08), pages 11127 - 11143 *
PHEI ER SAW等: "A drug-delivery strategy for overcoming drug resistance in breast cancer through targeting of oncofetal fibronectin", 《NANOMEDICINE》, vol. 13, no. 2, 28 February 2017 (2017-02-28), pages 713 - 722, XP055893661, DOI: 10.1016/j.nano.2016.10.005 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021247967A3 (en) 2022-01-13
EP4161584A2 (en) 2023-04-12
WO2021247967A2 (en) 2021-12-09
JP2023529660A (ja) 2023-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. Molecular imaging of the tumor microenvironment
Medarova et al. In vivo imaging of tumor response to therapy using a dual‐modality imaging strategy
US11738099B2 (en) Molecular probes and methods of use
JP6793122B2 (ja) 術中イメージング
Wayua et al. Evaluation of a cholecystokinin 2 receptor-targeted near-infrared dye for fluorescence-guided surgery of cancer
Deng et al. Targeted and multifunctional technology for identification between hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis
Feng et al. Identification of an integrin α6‐targeted peptide for nasopharyngeal carcinoma‐specific nanotherapeutics
Chen et al. Emerging insights into the molecular biology of brain metastases
Weitsman et al. Detecting intratumoral heterogeneity of EGFR activity by liposome-based in vivo transfection of a fluorescent biosensor
Vaidya et al. Noninvasive assessment and therapeutic monitoring of drug-resistant colorectal cancer by MR molecular imaging of extradomain-B fibronectin
Li et al. Glutamate from nerve cells promotes perineural invasion in pancreatic cancer by regulating tumor glycolysis through HK2 mRNA-m6A modification
Yu et al. Accurate detection and delineation boundary of renal cell carcinoma based on dual-targeted magnetic-fluorescent carbon dots
Huang et al. A rationally designed ICAM1 antibody drug conjugate for pancreatic cancer
WO2013148984A1 (en) Dual function markers for diagnostics and therapeutics for upper gastrointestinal tract precancer
Wang et al. Survivin-targeted nanoparticles for pancreatic tumor imaging in mouse model
Qiao et al. Magnetic resonance molecular imaging of extradomain B fibronectin enables detection of pancreatic ductal adenocarcinoma metastasis
Matsubara et al. Potential for HER-2/neu molecular targeted therapy for invasive bladder carcinoma: comparative study of immunohistochemistry and fluorescent in situ hybridization
CN116157159A (zh) 使用结构域外-b纤连蛋白靶向探针的诊断和监测
Zhu et al. Development of a rare earth nanoprobe enables in vivo real-time detection of sentinel lymph node metastasis of breast cancer using NIR-IIb imaging
Xu et al. Visual Investigation of Tumor‐Promoting Fibronectin Potentiated by Obesity in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Using an MR/NIRF Dual‐Modality Dendrimer Nanoprobe
Kim et al. Current and future roles of neoadjuvant chemotherapy in operable breast cancer
Dmochowska et al. Nanoparticles Targeted to Fibroblast Activation Protein Outperform PSMA for MRI Delineation of Primary Prostate Tumors
Wu et al. Vascular endothelial growth factor antisense oligodeoxynucleotides with lipiodol in arterial embolization of liver cancer in rats
Ceauşu et al. CD105/Ki67 double immunostaining expression in liver metastasis from colon carcinoma
Sobczuk et al. Angiotensin-(1-7) can promote cell migration and tumor growth of clear cell renal cell carcinoma.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination