CN116130099A - 一种用于检测肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用 - Google Patents

一种用于检测肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，涉及基因诊断领域，具体涉及一种用于检测肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用。本发明提供了一种用于检测肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用，该检测模型是用于单细胞和组织水平下早期直观地观察肿瘤的印记(迹)基因的变化从而判断肿瘤的良恶性程度。同时，可以通过印迹基因与非印迹基因表达变化相结合，能够更准确的判断癌症种类和良恶性程度。

Description

一种用于检测肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用
优先权信息
本申请请求2021年11月12日向中国国家知识产权局提交的专利申请202111342507.1的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及基因诊断领域，涉及一种用于检测肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的主要因素之一，世界范围内每年新增癌症患者1400万，同时有820万患者死于癌症。无限增殖和转移是癌细胞的主要特性，大部分癌症患者都是由于癌细胞的广泛快速转移，引起脏器衰竭等并发症而最终死亡。早期癌症病灶小，手术创伤小，同时进入循环系统的癌细胞数量较少，不能形成稳定的转移灶，因此在早期及时进行有效治疗对预防复发和延长生命具有重要意义。目前的癌症诊断标准是肿瘤的细胞和组织形态，但是形态学观察对于病理医生的经验要求非常高，同时早期癌症还没有发生很典型的形态学变化，很容易造成漏诊。由于癌症发生过程中表观遗传学和遗传学等分子生物学层面的变化早于形态学变化，能够更敏感地检测到早期癌症，因此分子标志物对癌症早期诊断具有重要的意义。
基因组印记是表观遗传学中基因调控的一种方式，其特点是通过甲基化来自特定亲代的等位基因，使某个基因只有一个等位基因表达，而另一个陷入基因沉默状态。该种类的基因，被称为印迹(记)基因。印迹缺失是印迹基因去甲基化导致沉默状态的等位基因被激活并且开始基因表达的一种表观遗传改变。大量研究表明，印迹缺失普遍存在于各类癌症中，并且发生时间早于细胞和组织形态改变。与此同时，在健康细胞中，印迹缺失的比例极低，与癌细胞成鲜明对比。所以，印迹基因的甲基化状态可以作为病理标记，通过特定的分子检测技术，对细胞异常状态进行分析。
由于印迹基因的功能涵盖细胞信号传递、细胞周期调控、细胞内外物质运输、细胞外基质形成等多个方面，所以在不同的癌症中印迹基因所表现的作用有所不同，表达量也相差巨大，故而形成了不同的敏感性和特异性，对肿瘤发生发展中的浸润和转移及预后起到了巨大的作用。同时，不同印记基因的组合也可以对肿瘤的类型进行区分。
基于上述原因，目前的肿瘤早期诊断没有高度敏感的诊断标志物，需要开发新的诊断标志物、诊断模型和诊断装置，基于患者活检样本，解析肿瘤在细胞层面上存在的分子标记物变化，以此提供更精确的预诊和诊断信息，并为治疗方案的选择作出指导。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供了一种用于检测肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用，该检测模型是用于单细胞和组织水平下早期直观地观察肿瘤的印记(迹)基因的变化从而判断肿瘤的良恶性程度。同时，可以通过印迹基因与非印迹基因表达变化相结合，能够更准确的判断肿瘤良恶性程度并进一步区分癌症种类。
印迹基因在癌症最早期即会出现DNA去甲基化、组蛋白乙酰化等表观遗传变化，导致印迹基因的一对等位基因中正常情况下沉默的基因被重新激活，出现两个等位基因的表达，称为印迹缺失。在癌症发展过程中，一些印迹基因和非印迹基因还会出现基因的扩增，出现三个或更多的基因拷贝，称为拷贝数异常。利用印迹基因的印迹缺失和印迹基因及非印迹基因的拷贝数异常现象，可以用于癌症的早期分子诊断。
为此，本发明第一方面提供一种用于肿瘤的基因表达状态分级模型。根据本发明的实施方案，所述模型包括通过计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量在肿瘤中的变化，对印迹基因的表达状态进行分级；
其中，所述印迹基因包括Z16、Z19和Z21，所述印迹基因Z16为SNRPN/SNURF，所述印迹基因Z19为HM13，所述印迹基因Z21为NHP2L1。
根据本发明的实施方案，所述印迹基因还包括Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28中的任意一个或多个，
其中，所述印迹基因Z1为GNAS，所述印迹基因Z3为PEG10，所述印迹基因Z5为MEST，所述印迹基因Z6为PLAGL1，所述印迹基因Z8为DCN，所述印迹基因Z9为DLK1，所述印迹基因Z10为GATM，所述印迹基因Z11为GRB10，所述印迹基因Z12为PEG3，所述印迹基因Z13为SGCE，所述印迹基因Z14为SLC38A4，所述印迹基因Z18为GATA3，所述印迹基因Z20为KCNQ1，所述印迹基因Z22为PON2，所述印迹基因Z28为ZIC1。
根据本发明的实施方案，所述计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量的公式如下：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)；
单等位基因表达量＝b/(b+c+d)；
双等位基因表达量＝c/(b+c+d)；
多等位基因表达量＝d/(b+c+d)；
其中，所述a为细胞核内不存在标记，印迹基因没有表达的细胞数；所述b为细胞核内存在一个印迹基因标记的细胞数，c为细胞核内存在两个印迹基因标记的细胞数，d为细胞核内存在两个以上印迹基因标记的细胞数。
根据本发明的实施方案，针对印迹基因Z16的双等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量小于15％；
I级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量为15-20％；
II级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量为20-26％；
III级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量为26-30％；
IV级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量大于30％。
针对印迹基因Z16的多等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量小于1.4％；
I级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量为1.4-3.4％；
II级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量为3.4-5.5％；
III级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量为5.5-9％；
IV级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量大于9％。
针对印迹基因Z16的总表达量划分的两个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z16的总表达量小于17％；
I级：所述印迹基因Z16的总表达量大于或等于17％。
根据本发明的实施方案，针对印迹基因Z19的双等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量小于12％；
I级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量为12-20％；
II级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量为20-26％；
III级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量为26-30％；
IV级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量大于30％。
针对印迹基因Z19的多等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量小于1.4％；
I级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量为1.4-3.4％；
II级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量为3.4-6.3％；
III级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量为6.3-9％；
IV级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量大于9％。
针对印迹基因Z19的总表达量划分的两个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z19的总表达量小于11％；
I级：所述印迹基因Z19的总表达量大于或等于11％。
根据本发明的实施方案，针对印迹基因Z21的双等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量小于12％；
I级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量为12-16％；
II级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量为16-20％；
III级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量为20-25％；
IV级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量大于25％。
针对印迹基因Z21的多等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量小于1.3％；
I级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量为1.3-3.2％；
II级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量为3.4-4.9％；
III级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量为4.9-6.2％；
IV级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量大于6.2％。
针对印迹基因Z21的总表达量划分的两个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z21的总表达量小于14％；
I级：所述印迹基因Z21的总表达量大于或等于14％。
根据本发明的实施方案，印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度分为阴性、阳性潜能、低度阳性、中度阳性和高度阳性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为0级，或印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量均为0级，则为印迹基因阴性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量中至少有一个为I级且均达不到II级，则为印迹基因阳性潜能；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量中至少有一个为II级且均达不到III级，则为印迹基因低度阳性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量中至少有一个为III级且均达不到IV级，则为印迹基因中度阳性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量中至少有一个为IV级，则为印迹基因高度阳性；
其中，印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度是独立的。
根据本发明的实施方案，判断肿瘤的良恶性程度分为良性肿瘤、癌潜能、早期癌症、中期癌症和晚期癌症；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度均为阴性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中不超过一个印迹基因的阳性程度为阳性潜能，则为良性肿瘤；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为阳性潜能，或不超过一个印迹基因的阳性程度为低度阳性，则为癌潜能；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为低度阳性，或不超过一个印迹基因的阳性程度为中度阳性，则为早期癌症；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为中度阳性，或不超过一个印迹基因的阳性程度为高度阳性，则为中期癌症；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为高度阳性，则为晚期癌症。
在临床应用中，肿瘤的良恶性判断为良性肿瘤或癌潜能的样本，可认为是良性样本；肿瘤的良恶性判断为早期癌症、中期癌症或晚期癌症的样，可认为是恶性样本。
印迹基因Z16、Z19和Z21的组合还可以和印迹基因Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28进一步组合，提高肿瘤良恶性判断的准确率。
根据本发明的实施方案，判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度均为阴性或阳性潜能，或印迹基因Z16、Z19和Z21中不超过一个印迹基因的阳性程度为低度阳性且Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28的阳性程度均为阴性，肿瘤的良恶性程度判断结果为良性肿瘤；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中不超过一个印迹基因的阳性程度为低度阳性且Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28中至少有一个基因的阳性程度为阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个基因的阳性程度为低度阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有一个基因的阳性程度为中度阳性，肿瘤的良恶性程度判断结果为恶性肿瘤。
根据本发明的实施方案，所述肿瘤选自甲状腺癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、乳腺癌、宫颈癌、肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌。
根据本发明的实施方案，所述模型进一步包括通过计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量在肿瘤中的变化，以及非印迹基因BRAF和/或MYC的表达量，对印迹基因和非印迹基因的表达状态进行分级。
当印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度都为阳性潜能或以下，或印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因BRAF和MYC都为阴性，肿瘤良恶性判断结果为良性肿瘤；
当印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因BRAF和MYC中至少有一个基因为阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上时，肿瘤良恶性判断结果为恶性肿瘤。
其中，所述非印迹基因BRAF和MYC为阴性是指待测样本中所述非印迹基因BRAF和MYC的表达量与正常样本中非印迹基因BRAF和MYC的表达量无差异，
所述非印迹基因BRAF和MYC为阳性是指待测样本中所述非印迹基因BRAF和MYC的表达量相比正常样本中非印迹基因BRAF和MYC的表达量升高。
在印迹基因组合的基础上增加非印迹基因BRAF和/或MYC，可以提高模型的检测准确率，在本文实施例中，印迹基因Z16、Z19和Z21的组合对于甲状腺肿瘤的判断的灵敏度为96％，特异性为91％。
根据本发明的实施方案，所述模型进一步包括通过计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量在肿瘤中的变化，以及非印迹基因HER2和/或MYC的表达量，对印迹基因和非印迹基因的表达状态进行分级。
当印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度都为阳性潜能或以下，或印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因HER2和MYC都为阴性，肿瘤良恶性判断结果为良性肿瘤；
当印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因HER2和MYC中至少有一个基因为阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上时，肿瘤良恶性判断结果为恶性肿瘤。
其中，所述非印迹基因HER2和MYC为阴性是指待测样本中所述非印迹基因HER2和MYC的表达量与正常样本中非印迹基因HER2和MYC的表达量无差异，
所述非印迹基因HER2和MYC为阳性是指待测样本中所述非印迹基因HER2和MYC的表达量相比正常样本中非印迹基因HER2和MYC的表达量升高。
在印迹基因组合的基础上增加非印迹基因HER2和/或MYC，可以提高模型的检测准确率，在本文实施例中，印迹基因Z16、Z19和Z21的组合对于肺肿瘤的判断灵敏度为98％，特异性为95％。
根据本发明的实施方案，所述模型进一步包括通过计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量在肿瘤中的变化，以及非印迹基因GRP和/或SYP的表达量，对印迹基因和非印迹基因的表达状态进行分级。
当印迹基因Z16、Z19和Z21的组合判断肿瘤良恶性的结果为早期癌症以上且非印迹基因GRP和SYP中至少一个为阳性时，肿瘤类型的判断结果为小细胞肺癌；
当印迹基因Z16、Z19和Z21的组合判断肿瘤良恶性的结果为早期癌症以上且非印迹基因GRP和SYP都为阴性时，肿瘤类型的判断结果为非小细胞肺癌。
其中，所述非印迹基因GRP和SYP为阴性是指待测样本中所述非印迹基因GRP和SYP的表达量与正常样本中非印迹基因GRP和SYP的表达量无差异，
所述非印迹基因GRP和SYP为阳性是指待测样本中所述非印迹基因GRP和SYP的表达量相比正常样本中非印迹基因GRP和SYP的表达量升高。
在印迹基因组合的基础上增加非印迹基因GRP和/或SYP，可以在判断肿瘤为恶性肿瘤时进一步对肿瘤的类型进行鉴别，在本文实施例中，在印迹基因Z16、Z19和Z21的组合判断肿瘤良恶性的结果为早期癌症以上时，进一步增加非印迹基因GRP和SYP，对于小细胞肺癌和非小细胞肺癌的鉴别准确率为100％。
根据本发明的实施方案，所述模型进一步包括通过计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量在肿瘤中的变化，以及非印迹基因CDKN2A和/或MYC的表达量，对印迹基因和非印迹基因的表达状态进行分级。
当印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度都为阳性潜能或以下，或印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因CDKN2A和MYC都为阴性，肿瘤良恶性判断结果为良性肿瘤；
当印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因CDKN2A和MYC中至少有一个基因为阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上时，肿瘤良恶性判断结果为恶性肿瘤。
其中，所述非印迹基因CDKN2A和MYC为阴性是指待测样本中所述非印迹基因CDKN2A和MYC的表达量与正常样本中非印迹基因CDKN2A和MYC的表达量无差异，
所述非印迹基因CDKN2A和MYC为阳性是指待测样本中所述非印迹基因CDKN2A和MYC的表达量相比正常样本中非印迹基因CDKN2A和MYC的表达量升高。
在印迹基因组合的基础上增加非印迹基因CDKN2A和/或MYC，可以提高模型的检测准确率，在本文实施例中，印迹基因Z16、Z19和Z21的组合对于膀胱肿瘤的判断灵敏度为96％，特异性为97％。
根据本发明的实施方案，所述模型进一步包括通过计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量在肿瘤中的变化，以及非印迹基因HER2和/或BRAF的表达量，对印迹基因和非印迹基因的表达状态进行分级。
当印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度都为阳性潜能或以下，或印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因HER2和BRAF的都为阴性，肿瘤良恶性判断结果为良性肿瘤；
当印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因HER2和BRAF中至少有一个基因为阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上时，肿瘤良恶性判断结果为恶性肿瘤。
其中，所述非印迹基因HER2和BRAF为阴性是指待测样本中所述非印迹基因HER2和BRAF的表达量与正常样本中非印迹基因HER2和BRAF的表达量无差异，
所述非印迹基因HER2和BRAF为阳性是指待测样本中所述非印迹基因HER2和BRAF的表达量相比正常样本中非印迹基因HER2和BRAF的表达量升高。
在印迹基因组合的基础上增加非印迹基因HER2和/或BRAF，可以提高模型的检测准确率，在本文实施例中，印迹基因Z16、Z19和Z21的组合对于乳腺肿瘤的判断灵敏度为94％，特异性为96％。
本发明第二方面提供一种如第一方面所述的分级模型在肿瘤检测和/或治疗中的用途。
本发明第三方面提供一种肿瘤检测方法，所述方法包括利用第一方面所述的分级模型，对待测样本进行肿瘤类型和/或肿瘤良恶性判断。
根据本发明的实施方案，所述待测样本来源于患有或疑似患有以下癌症种类的患者：甲状腺癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、乳腺癌、宫颈癌、肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌。
本发明第四方面提供一种肿瘤监测方法，所述方法包括利用第一方面所述的分级模型，对患者用药前后的肿瘤良恶性程度进行判断，以便监测患者肿瘤发展情况。
在本发明中，“印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上”是指Z16、Z19和Z21中三者中的任意的一个印迹基因的阳性程度为低度阳性、中度阳性或高度阳性，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能。例如印迹基因Z16的阳性程度为低度阳性、中度阳性或高度阳性，印迹基因Z19和Z21的阳性程度为为阴性或阳性潜能。
在本发明中，“阳性潜能或以下”是指阴性和阳性潜能。
在本发明中，印迹基因Z21为SNU13，同时也称为“NHP2L1”，二者可等同。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了肺组织切片中印迹基因四种不同表达状态的细胞核，其中a为细胞核内不存在标记，印迹基因没有表达的细胞核；所述b为细胞核内存在一个印迹基因标记的细胞核，c为细胞核内存在两个印迹基因标记的细胞核，d为细胞核内存在两个以上印迹基因标记的细胞核。
图2显示了良性和恶性肺肿瘤中印迹基因Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z16、Z18、Z19、Z20、Z21、Z22、Z28的BAE、MAE和TE表达状态，其中图2(a)显示了印迹基因Z1在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(b)显示了印迹基因Z3在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(c)显示了印迹基因Z5在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(d)显示了印迹基因Z6在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(e)显示了印迹基因Z8在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(f)显示了印迹基因Z9在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(g)显示了印迹基因Z10在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(h)显示了印迹基因Z11在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(i)显示了印迹基因Z12在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(j)显示了印迹基因Z13在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(k)显示了印迹基因Z14在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(l)显示了印迹基因Z16在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(m)显示了印迹基因Z18在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(n)显示了印迹基因Z19在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(o)显示了印迹基因Z20在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(p)显示了印迹基因Z21在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(q)显示了印迹基因Z22在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(r)显示了印迹基因Z28在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(s)显示了印迹基因Z2在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(t)显示了印迹基因Z4在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(u)显示了印迹基因Z15在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(v)显示了印迹基因Z17在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(w)显示了印迹基因Z23在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(x)显示了印迹基因Z24在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(y)显示了印迹基因Z25在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(z)显示了印迹基因Z26在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态，图2(aa)显示了印迹基因Z27在良性和恶性肺肿瘤中BAE、MAE和TE的表达状态。
图3是印迹基因在十二种肿瘤中的ROC曲线图，其中图3(a)显示了印迹基因Z1的ROC曲线，图3(b)显示了印迹基因Z11的ROC曲线，图3(c)显示了印迹基因Z16的ROC曲线，图3(d)显示了印迹基因Z19的ROC曲线，图3(e)显示了印迹基因Z21的ROC曲线，图3(f)显示了印迹基因Z3的ROC曲线，图3(g)显示了印迹基因Z5的ROC曲线，图3(h)显示了印迹基因Z6的ROC曲线，图3(i)显示了印迹基因Z8的ROC曲线，图3(j)显示了印迹基因Z9的ROC曲线，图3(k)显示了印迹基因Z10的ROC曲线，图3(l)显示了印迹基因Z12的ROC曲线，图3(m)显示了印迹基因Z13的ROC曲线，图3(n)显示了印迹基因Z14的ROC曲线，图3(o)显示了印迹基因Z18的ROC曲线，图3(p)显示了印迹基因Z20的ROC曲线，图3(q)显示了印迹基因Z22的ROC曲线，图3(r)显示了印迹基因Z28的ROC曲线，图3(s)显示了印迹基因Z2的ROC曲线，图3(t)显示了印迹基因Z4的ROC曲线，图3(u)显示了印迹基因Z15的ROC曲线，图3(v)显示了印迹基因Z17的ROC曲线，图3(w)显示了印迹基因Z23的ROC曲线，图3(x)显示了印迹基因Z24的ROC曲线，图3(y)显示了印迹基因Z25的ROC曲线，图3(z)显示了印迹基因Z26的ROC曲线，图3(aa)显示了印迹基因Z27的ROC曲线。
图4是印迹基因分级方法的示意图，其中图4(a)显示了每个印迹基因的BAE、MAE和TE的分级方法，图4(b)显示了印迹基因阳性程度的分级方法，图4(c)显示了通过多个基因组合预测肿瘤良恶性的方法。
图5显示了印迹基因Z1、Z8、Z11、Z13、Z16、Z19、Z21在无淋巴结转移和有淋巴结转移的乳腺癌前哨淋巴结样本中的BAE、MAE和TE表达状态，其中图5(a)显示了印迹基因Z1在无淋巴结转移和有淋巴结转移的乳腺癌前哨淋巴结样本中的BAE、MAE和TE表达状态，图5(b)显示了印迹基因Z8在无淋巴结转移和有淋巴结转移的乳腺癌前哨淋巴结样本中的BAE、MAE和TE表达状态，图5(c)显示了印迹基因Z11在无淋巴结转移和有淋巴结转移的乳腺癌前哨淋巴结样本中的BAE、MAE和TE表达状态，图5(d)显示了印迹基因Z13在无淋巴结转移和有淋巴结转移的乳腺癌前哨淋巴结样本中的BAE、MAE和TE表达状态，图5(e)显示了印迹基因Z16在无淋巴结转移和有淋巴结转移的乳腺癌前哨淋巴结样本中的BAE、MAE和TE表达状态，图5(f)显示了印迹基因Z19在无淋巴结转移和有淋巴结转移的乳腺癌前哨淋巴结样本中的BAE、MAE和TE表达状态，图5(g)显示了印迹基因Z21在无淋巴结转移和有淋巴结转移的乳腺癌前哨淋巴结样本中的BAE、MAE和TE表达状态。
图6显示了甲状腺良性和恶性肿瘤中BRAF基因的多等位基因表达量、MYC基因的多等位基因表达量和BRAF基因突变阳性细胞的比例。
图7显示了肺良性和恶性肿瘤中CDKN2A、HER2和MYC基因的多等位基因表达量状态。
图8显示了非小细胞肺癌和小细胞肺癌中GRP和SYP基因阳性细胞的比例。
图9显示了膀胱良性和恶性肿瘤中CDKN2A、和MYC基因的多等位基因表达量状态。
图10显示了乳腺良性和恶性肿瘤中HER2和BRAF基因的多等位基因表达量状态。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
根据本发明的一个实施方案，印迹基因的表达状态通过原位杂交进行检测，设计针对印迹基因内含子序列的探针，与印迹基因表达的nascent RNA杂交，显示细胞核内印迹基因表达的等位基因数量。由于基因转录过程中首先形成包含外显子和内含子的pre-RNA或nascent RNA，随后内含子被剪切并快速降解，因此使用针对内含子的探针只能检测到pre-RNA或nascent RNA，而不会检测到只含有外显子的mRNA。因为pre-RNA或nascent RNA的内含子剪切是在转录的同时进行的，pre-RNA或nascent RNA的信号标记实际上显示了细胞核内正在转录的印迹基因的空间位点，而没有进行转录的印迹基因的空间位点因为不产生pre-RNA或nascent RNA所以不会被检测到。利用RNA原位杂交方法，印迹基因在正常情况下不表达或仅有一个等位基因表达时，可以检测到细胞核中没有标记或仅有一个标记，癌症中印迹基因出现两个或两个以上等位基因表达的异常状态时，可以检测到细胞核中有两个或两个以上的标记。因此，根据肿瘤样本中表达印迹基因的细胞比例、印迹基因表达状态异常的细胞比例，可以对肿瘤的良恶性进行分级。类似的，癌症中非印迹基因出现拷贝数异常时，本发明的特殊RNA原位杂交方法可以检测到三个或更多的标记。根据肿瘤样本中非印迹基因表达状态异常的细胞比例，也可以辅助印迹基因对肿瘤的良恶性进行判断。印迹基因和非印迹基因的表达状态检测方法包括但不限于上述方法，本领域可用的其他方法也包含在本发明范围内。
根据本发明的一个实施方案，所述原位杂交采用RNAscope原位杂交方法；
根据本发明的一个实施方案，所述RNAscope原位杂交方法使用单通道或多通道的呈色试剂盒或者单通道或多通道的荧光试剂盒，优选为单通道红色/棕色呈色试剂盒或多通道的荧光试剂盒。
根据本发明的一个实施方案，根据细胞核内印迹基因表达的等位基因数量，印迹基因的表达状态分为印迹基因不表达、印迹基因单等位基因表达、印迹基因双等位基因表达或印迹基因多等位基因表达；
所述印迹基因不表达为样本中细胞核内不存在印迹基因标记；
所述印迹基因单等位基因表达为样本中细胞核内存在一个印迹基因标记；
所述印迹基因双等位基因表达为样本中细胞核内存在两个印迹基因标记；
所述印迹基因多等位基因表达为样本中细胞核内存在两个以上印迹基因标记。
根据本发明的一个实施方案，总表达量(Total Expression，TE)、单等位基因表达量(Single-allelic Expression，SAE)、双等位基因表达量(Bi-allelic，BAE)和多等位基因表达量(Multi-allelic，MAE)通过以下公式计算：
TE＝(b+c+d)/(a+b+c+d)；
SAE＝b/(b+c+d)；
BAE＝c/(b+c+d)；
MAE＝d/(b+c+d)；
其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印迹基因没有表达的细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印迹基因仅有一条等位基因表达的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印迹基因有两个等位基因表达的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印迹基因有两个以上等位基因表达的细胞核。
根据本发明的一个实施方案，印迹基因Z16、Z19、Z21的组合用于检测肿瘤是否发生淋巴转移。
在印迹基因Z16、Z19、Z21的组合基础上增加Z3基因用于检测早期小细胞癌，包括小细胞肺癌、膀胱小细胞癌、宫颈小细胞癌。
根据本发明的一个实施方案，在印迹基因Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28中的任意一个或多个与Z16、Z19、Z21组合的基础上，还可以增加非印迹基因BRAF和/或MYC用于甲状腺癌的诊断；
其中BRAF和MYC通过原位杂交的方法进行检测，设计针对BRAF和MYC基因内含子的探针，与基因表达的nascent RNA杂交，显示细胞核内基因表达的等位基因数量；
对于BRAF基因，还可以设计针对V600E突变位点的探针，与mRNA杂交，显示突变基因的mRNA表达水平。
根据本发明的一个实施方案，在印迹基因Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28中的任意一个或多个与Z16、Z19、Z21组合的基础上，，还可以增加非印迹基因HER2和/或MYC用于肺癌的诊断；
其中HER2和MYC通过原位杂交的方法进行检测，设计针对HER2和MYC基因内含子的探针，与基因表达的nascent RNA杂交，显示细胞核内基因表达的等位基因数量。
根据本发明的一个实施方案，在印迹基因Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28中的任意一个或多个与Z16、Z19、Z21组合的基础上，，还可以增加非印迹基因GRP和/或SYP用于小细胞肺癌的诊断；
其中GRP和SYP通过原位杂交的方法进行检测，设计针对GRP和SYP基因mRNA的探针，与mRNA杂交，显示基因的mRNA表达水平。
根据本发明的一个实施方案，在印迹基因Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28中的任意一个或多个与Z16、Z19、Z21组合的基础上，还可以增加非印迹基因CDKN2A和MYC用于膀胱癌的诊断，其中CDKN2A和MYC通过原位杂交的方法进行检测，设计针对CDKN2A和MYC基因内含子的探针，与基因表达的nascent RNA杂交，显示细胞核内基因表达的等位基因数量。
根据本发明的一个实施方案，在印迹基因Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28中的任意一个或多个与Z16、Z19、Z21组合的基础上，还可以增加非印迹基因HER2和/或BRAF用于乳腺癌的诊断；
其中HER2和BRAF通过原位杂交的方法进行检测，设计针对HER2和BRAF基因内含子的探针，与基因表达的nascent RNA杂交，显示细胞核内基因表达的等位基因数量。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1肺良性和恶性肿瘤组织切片的印迹基因表达状态分析
(1)获取肺良性肿瘤组织10例、恶性肿瘤组织的20例，，放入10％中性福尔马林溶液中进行固定，以防RNA降解，固定时间为24小时。将组织用石蜡包埋后切成厚度为10μm的切片，粘附到玻片上，所述玻片用正电荷防脱载玻片，所述切片在40℃烤箱烘烤3h以上；
(2)按照RNAscope的样品处理方法进行脱蜡处理，封闭样本中内源性过氧化物酶活性，增强通透性并暴露出RNA分子；
(3)设计探针：根据印迹基因Z1(GNAS)、Z3(PEG10)、Z5(MEST)、Z6(PLAGL1)、Z8(DCN)、Z9(DLK1)、Z10(GATM)、Z11(GRB10)、Z12(PEG3)、Z13(SGCE)、Z14(SLC38A4)、Z16(SNRPN/SNURF)、Z18(GATA3)、Z19(HM13)、Z20(KCNQ1)、Z21(SNU13)、Z22(PON2)、Z28(ZIC1)、Z2(IGF2)、Z4(IGF2R)、Z15(DIRAS3)、Z17(ALDH1L1)、Z23(RASGRF1)、Z24(RB1)、Z25(TFPI2)、Z26(TRAPPC9)和Z27(UBE3A)的内含子序列设计特异性探针；
(4)将步骤(3)的探针与样本通过试剂盒进行RNAscope原位杂交；
(5)信号扩增和苏木精染色，用显微镜成像分析印迹基因的表达情况。
本实施例中，印迹基因表达情况包括印迹基因不表达、印迹基因单等位基因表达、印迹基因双等位基因表达或印迹基因多等位基因表达，其中，印迹基因不表达为样本中细胞核内不存在印迹基因标记，印迹基因单等位基因表达为样本中细胞核内存在一个印迹基因标记，印迹基因双等位基因表达为样本中细胞核内存在两个印迹基因标记，印迹基因多等位基因表达为样本中细胞核内存在两个以上印迹基因标记。
在显微镜下观察原位杂交结果，如图1所示，对1200-2000个细胞进行计数，按照以下公式计算总表达量(Total Expression，TE)、单等位基因表达量(Single-allelicExpression，SAE)、双等位基因表达量(Bi-allelic，BAE)和多等位基因表达量(Multi-allelic，MAE)：
TE＝(b+c+d)/(a+b+c+d)；
SAE＝b/(b+c+d)；
BAE＝c/(b+c+d)；
MAE＝d/(b+c+d)；
其中a为细胞核内不存在印迹基因标记的细胞数，b为细胞核内存在一个印迹基因标记的细胞数，c为细胞核内存在两个印迹基因标记的细胞数，d为细胞核内存在两个以上印迹基因标记的细胞数。
定量结果如图2(图2(a)-(aa))所示，印迹基因Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z16、Z18、Z19、Z20、Z21、Z22和Z28的TE、BAE和MAE在肺良恶性肿瘤中有显著差异，而印迹基因Z2、Z4、Z15、Z17、Z23、Z24、Z25、Z26和Z27的TE、BAE和MAE在肺良恶性肿瘤中差异较小。
实施例2十二种肿瘤组织切片中27印迹基因的表达状态分析和良恶性分级模型建立
获取甲状腺、膀胱、前列腺、皮肤、乳腺、宫颈、肠、胃、食道、胰腺、肝的良性肿瘤组织各10例、恶性肿瘤组织各20例，按实施例1相同的方法进行固定、包埋、切片，并进行RNAscope原位杂交。
按实施例1的方法对印迹基因的BAE、MAE和TE进行定量，将本实施例的十一种肿瘤的定量数据和实施例1中肺肿瘤组织样本的数据合并，根据每个基因120例良性肿瘤样本、240例恶性肿瘤样本的BAE、MAE和TE数据作ROC曲线，分析每个基因对良恶性肿瘤的区分能力，结果如图3(图3(a)-(aa))所示，各基因的BAE、MAE和TE的曲线下面积(AUC)如表1所示。
表1
Figure BDA0003939846980000091
Figure BDA0003939846980000101
Z1、Z11、Z16、Z19和Z21五个基因的BAE、MAE和TE的AUC均大于0.7，说明Z1、Z11、Z16、Z19和Z21具有较好的区分良恶性肿瘤的能力；Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22和Z28十三个基因的BAE、MAE和TE的AUC在0.6-0.7之间，说明这些基因有一定的良恶性肿瘤区分能力；Z2、Z4、Z15、Z17、Z23、Z24、Z25、Z26和Z27九个基因的BAE、MAE和TE的AUC均低于0.6，说明这些基因几乎不能区分良恶性肿瘤。
首先选择有较好的区分良恶性肿瘤能力的Z1、Z11、Z16、Z19和Z21五个基因，构建肿瘤良恶性鉴别模型。在ROC曲线上选择四个点作为阈值threshold_1到threshold_4，将每个基因的BAE和MAE分为5个等级，具体分级方法如下：
0级：BAE或MAE小于threshold_1；
I级：BAE或MAE大于或等于threshold_1，且小于threshold_2；
II级：BAE或MAE大于或等于threshold_2，且小于threshold_3；
III级：BAE或MAE大于或等于threshold_3，且小于threshold_4；
IV级：BAE或MAE大于或等于threshold_4。
将每个基因的TE分为0、I两个等级，具体分级方法如下：
0级：TE小于threshold_1；
I级：TE大于或等于threshold_1。
Z1、Z11、Z16、Z19和Z21五个基因的阈值具体选择方法如下：
对Z1、Z11、Z16、Z19和Z21五个基因的BAE，在ROC曲线上选择敏感度为90％、60％、30％和10％时对应的阈值，分别作为threshold_1、threshold_2、threshold_3和threshold_4；
对Z1、Z11、Z16、Z19和Z21五个基因的MAE，在ROC曲线上选择敏感度为95％、80％、70％和50％时对应的阈值，分别作为threshold_1、threshold_2、threshold_3和threshold_4；
对Z1、Z11、Z16、Z19和Z21五个基因的TE的，在ROC曲线上选择敏感度为99％时对应的阈值作为threshold_1。
Z1、Z11、Z16、Z19和Z21五个基因的阈值如表2所示。
表2
Figure BDA0003939846980000111
综合每个基因的BAE、MAE和TE的等级，将每个基因的阳性程度分为阴性、阳性潜能、低度阳性、中度阳性和高度阳性共5个等级，具体分级方法如下：
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的TE为0级，或印迹基因的TE为I级且BAE和MAE均为0级，则为印迹基因阴性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的TE为I级且BAE和MAE中至少有一个为I级且均达不到II级，则为印迹基因阳性潜能；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的TE为I级且BAE和MAE中至少有一个为II级且均达不到III级，则为印迹基因低度阳性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的TE为I级且BAE和MAE中至少有一个为III级且均达不到IV级，则为印迹基因中度阳性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的TE为I级且BAE和MAE中至少有一个为IV级，则为印迹基因高度阳性。
在Z1、Z11、Z16、Z19和Z21五个基因中任意选择两个或多个基因进行组合，根据不同基因的阳性程度将肿瘤分为良性肿瘤、癌潜能、早期癌症、中期癌症和晚期癌症五个等级。具体组合方式为：
判断肿瘤的良恶性程度的结果为组合中所有印迹基因的阳性程度均为阴性，或组合中不超过一个印迹基因的阳性程度为阳性潜能，则为良性肿瘤；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为组合中至少有两个印迹基因的阳性程度为阳性潜能，或不超过一个印迹基因的阳性程度为低度阳性，则为癌潜能；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为组合中至少有两个印迹基因的阳性程度为低度阳性，或不超过一个印迹基因的阳性程度为中度阳性，则为早期癌症；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为组合中至少有两个印迹基因的阳性程度为中度阳性，或不超过一个印迹基因的阳性程度为高度阳性，则为中期癌症；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为组合中至少有两个印迹基因的阳性程度为高度阳性，则为晚期癌症。
基因的BAE、MAE和TE的分级方法、基因阳性程度的分级方法和基因组合的方法如图4(图4(a)-4(c))所示。
在Z1、Z11、Z16、Z19和Z21五个基因中任意选择两个或多个基因进行组合，根据上述模型将120例良性肿瘤样本、240例恶性肿瘤样本分为五个等级，其中良性肿瘤和癌潜能预测为良性，早期癌症、中期癌症和晚期癌症预测为恶性，评估单个基因和不同基因组合的敏感性和特异性，结果如表3所示。
表3
基因或基因组合 敏感性 特异性
Z1 80.4％ 70.8％
Z11 81.7％ 60.8％
Z16 82.1％ 80.0％
Z19 88.3％ 90.0％
Z21 82.9％ 74.2％
Z1+Z11 92.1％ 63.3％
Z1+Z16 93.8％ 75.8％
Z1+Z19 92.5％ 83.3％
Z1+Z21 92.5％ 76.7％
Z11+Z16 92.9％ 65.0％
Z11+Z19 90.8％ 68.3％
Z11+Z21 90.4％ 67.5％
Z16+Z19 94.6％ 90.0％
Z16+Z21 94.6％ 90.0％
Z19+Z21 88.3％ 92.5％
Z1+Z11+Z16 98.3％ 59.2％
Z1+Z11+Z19 98.8％ 61.7％
Z1+Z11+Z21 97.5％ 59.2％
Z1+Z16+Z19 98.8％ 75.8％
Z1+Z16+Z21 98.8％ 73.3％
Z1+Z19+Z21 96.3％ 75.8％
Z11+Z16+Z19 98.8％ 64.2％
Z11+Z16+Z21 98.3％ 64.2％
Z11+Z19+Z21 95.0％ 66.7％
Z16+Z19+Z21 98.3％ 90.0％
Z1+Z11+Z16+Z19 100.0％ 58.3％
Z1+Z11+Z16+Z21 99.2％ 56.7％
Z1+Z11+Z19+Z21 99.2％ 58.3％
Z1+Z16+Z19+Z21 99.6％ 73.3％
Z11+Z16+Z19+Z21 99.6％ 63.3％
Z1+Z11+Z16+Z19+Z21 100.0％ 55.8％
从表3中可以发现：
在Z1、Z11、Z16、Z19和Z21五个基因中仅使用一个基因时，敏感性均不高于90％；
使用两个基因的组合时，敏感性升高，其中Z16和Z19的组合、Z16和Z21的组合敏感性最高，达到94.6％，Z19和Z21的组合特异性最高，达到92.5％；
使用三个基因的组合时，敏感性继续升高，其中Z1+Z11+Z19的组合、Z1+Z16+Z19的组合、Z1+Z16+Z21的组合、Z11+Z16+Z19的组合敏感性最高，达到98.8％，但特异性较低，仅有61.7％-75.8％，Z16+Z19+Z21的组合敏感性稍低，达到98.3％，特异性最高，达到90.0％；
使用四个基因或五个基因的组合时，特异性明显下降，均低于75％。
因此，综合考虑敏感度和特异性，Z16、Z19和Z21三个基因的组合能够达到最好地区分良恶性肿瘤的效果。
除Z1、Z11、Z16、Z19和Z21五个基因以外，ROC曲线显示Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22和Z28十三个基因也有一定的肿瘤良恶性区分能力，在Z1、Z11、Z16、Z19和Z21五个基因的基础上，增加这十三个基因中的一个或多个，可以进一步提高敏感性，避免漏诊。此外，如调整Z1和Z11的分级模型，适当提高特异性，作为Z16、Z19和Z21基因组合的辅助，也可起到提高敏感性的作用。
在Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22和Z28的ROC曲线上分别选择一个点作为阈值threshold_1，将这十五个基因的BAE、MAE和TE各分为两个等级，具体分级方法如下：
0级：BAE或MAE或TE小于threshold_1；
I级：BAE或MAE或TE大于或等于threshold_1。
综合Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22和Z28每个基因的BAE、MAE和TE的等级，将每个基因的阳性程度分为阴性和阳性两个等级，具体分级方法如下：
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的TE或BAE或MAE中至少一个为0级，则为印迹基因阴性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的TE、BAE和MAE均为I级，则为印迹基因阳性。
因为Z16、Z19和Z21三个基因的组合已经达到很高的敏感性，为避免过于增加敏感性而导致特异性下降，从每个基因的BAE和MAE的ROC曲线上选择95％特异性时对应的阈值作为threshold_1，从每个基因的TE的ROC曲线上选择90％敏感性时对应的阈值作为threshold_1。
Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22和Z28每个基因的BAE、MAE和TE的阈值如表4所示。
表4
印迹基因 BAE MAE TE
Z1 25％ 11.6％ 17％
Z3 13％ 6.0％ 5％
Z5 19％ 4.7％ 5％
Z6 19％ 5.6％ 7％
Z8 28％ 19.8％ 6％
Z9 13％ 7.2％ 5％
Z10 23％ 16.8％ 6％
Z11 25％ 11.8％ 12％
Z12 15％ 3.1％ 6％
Z13 16％ 7.4％ 7％
Z14 22％ 6.1％ 6％
Z18 26％ 18.6％ 8％
Z20 29％ 21.7％ 10％
Z22 21％ 14.0％ 6％
Z28 17％ 14.1％ 5％
在Z16、Z19和Z21三个基因组合的基础上，结合Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22和Z28的阳性程度，进一步将肿瘤的良恶性分成两个等级，具体分级方法如下：
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度均为阴性或阳性潜能，或印迹基因Z16、Z19和Z21中不超过一个印迹基因的阳性程度为低度阳性且Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28的阳性程度均为阴性，肿瘤的良恶性程度判断结果为良性肿瘤；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中不超过一个印迹基因的阳性程度为低度阳性且Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28中至少有一个基因的阳性程度为阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个基因的阳性程度为低度阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有一个基因的阳性程度为中度阳性，肿瘤的良恶性程度判断结果为恶性肿瘤。
将Z16、Z19和Z21三个基因的组合与Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22和Z28中任意一个基因进一步组合，对肿瘤诊断的敏感性和特异性如表5所示。
表5
印迹基因组合 灵敏度 特异性
Z16+Z19+Z21 98.3％ 90.0％
Z16+Z19+Z21+Z1 100.0％ 86.7％
Z16+Z19+Z21+Z3 99.2％ 89.2％
Z16+Z19+Z21+Z5 99.2％ 88.3％
Z16+Z19+Z21+Z6 98.8％ 90.0％
Z16+Z19+Z21+Z8 98.8％ 90.0％
Z16+Z19+Z21+Z9 100.0％ 86.7％
Z16+Z19+Z21+Z10 99.2％ 88.3％
Z16+Z19+Z21+Z11 100.0％ 86.7％
Z16+Z19+Z21+Z12 98.8％ 89.2％
Z16+Z19+Z21+Z13 99.6％ 90.0％
Z16+Z19+Z21+Z14 99.2％ 86.7％
Z16+Z19+Z21+Z18 98.8％ 87.5％
Z16+Z19+Z21+Z20 98.8％ 88.3％
Z16+Z19+Z21+Z22 98.8％ 87.5％
Z16+Z19+Z21+Z28 99.2％ 87.5％
从表5中发现，印迹基因Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22和Z28中每个基因均能增加对肿瘤诊断的敏感性，对特异性的影响不大。
从ROC曲线上可以看到印迹基因Z2、Z4、Z15、Z17、Z23、Z24、Z25、Z26和Z27对肿瘤的良恶性几乎没有区分能力，因此在模型中不使用这些基因。
实施例3甲状腺良性和恶性肿瘤细针穿刺活检样本中印迹基因良恶性鉴别模型的验证
获取甲状腺良性和恶性肿瘤的细针穿刺样本各100例，放入10％中性福尔马林溶液中进行固定，24小时后粘附到正电荷载玻片上，其余步骤同实施例1。
根据样本中印迹基因的双等位表达量、多等位表达量和总表达量，通过实施例2中构建的模型对肿瘤的良恶性进行分级。
针对印迹基因Z16的双等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量小于15％；
I级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量为15-20％；
II级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量为20-26％；
III级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量为26-30％；
IV级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量大于30％。
针对印迹基因Z16的多等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量小于1.4％；
I级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量为1.4-3.4％；
II级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量为3.4-5.5％；
III级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量为5.5-9％；
IV级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量大于9％。
针对印迹基因Z16的总表达量划分的两个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z16的总表达量小于17％；
I级：所述印迹基因Z16的总表达量大于或等于17％。
根据本发明的实施方案，针对印迹基因Z19的双等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量小于12％；
I级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量为12-20％；
II级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量为20-26％；
III级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量为26-30％；
IV级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量大于30％。
针对印迹基因Z19的多等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量小于1.4％；
I级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量为1.4-3.4％；
II级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量为3.4-6.3％；
III级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量为6.3-9％；
IV级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量大于9％。
针对印迹基因Z19的总表达量划分的两个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z19的总表达量小于11％；
I级：所述印迹基因Z19的总表达量大于或等于11％。
根据本发明的实施方案，针对印迹基因Z21的双等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量小于12％；
I级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量为12-16％；
II级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量为16-20％；
III级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量为20-25％；
IV级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量大于25％。
针对印迹基因Z21的多等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量小于1.3％；
I级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量为1.3-3.2％；
II级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量为3.4-4.9％；
III级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量为4.9-6.2％；
IV级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量大于6.2％。
针对印迹基因Z21的总表达量划分的两个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z21的总表达量小于14％；
I级：所述印迹基因Z21的总表达量大于或等于14％。
印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度分为阴性、阳性潜能、低度阳性、中度阳性和高度阳性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为0级，或印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量均为0级，则为印迹基因阴性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量中至少有一个为I级且均达不到II级，则为印迹基因阳性潜能；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量中至少有一个为II级且均达不到III级，则为印迹基因低度阳性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量中至少有一个为III级且均达不到IV级，则为印迹基因中度阳性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量中至少有一个为IV级，则为印迹基因高度阳性。
判断肿瘤的良恶性程度分为良性肿瘤、癌潜能、早期癌症、中期癌症和晚期癌症；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度均为阴性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中不超过一个印迹基因的阳性程度为阳性潜能，则为良性肿瘤；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为阳性潜能，或不超过一个印迹基因的阳性程度为低度阳性，则为癌潜能；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为低度阳性，或不超过一个印迹基因的阳性程度为中度阳性，则为早期癌症；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为中度阳性，或不超过一个印迹基因的阳性程度为高度阳性，则为中期癌症；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为高度阳性，则为晚期癌症。
将肿瘤良恶性程度判断结果为良性肿瘤和癌潜能的样本记为良性，将肿瘤良恶性程度判断结果为早期癌症、中期癌症和晚期癌症的样本记为恶性，与样本术后病理诊断的良恶性进行比较，评估模型的灵敏度和特异性。
表6显示了印迹基因Z16、Z19、Z21的组合和印迹基因Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、
Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28分别与Z16、Z19、Z21组合的模型对甲状腺肿瘤良恶性的检测灵敏度和特异性。
表6
印迹基因组合 灵敏度 特异性
Z16+Z19+Z21 96％ 91％
Z16+Z19+Z21+Z1 100％ 82％
Z16+Z19+Z21+Z3 98％ 87％
Z16+Z19+Z21+Z5 97％ 89％
Z16+Z19+Z21+Z6 98％ 89％
Z16+Z19+Z21+Z8 97％ 91％
Z16+Z19+Z21+Z9 97％ 90％
Z16+Z19+Z21+Z10 98％ 89％
Z16+Z19+Z21+Z11 100％ 88％
Z16+Z19+Z21+Z12 97％ 91％
Z16+Z19+Z21+Z13 99％ 90％
Z16+Z19+Z21+Z14 97％ 91％
Z16+Z19+Z21+Z18 99％ 89％
Z16+Z19+Z21+Z20 98％ 87％
Z16+Z19+Z21+Z22 97％ 89％
Z16+Z19+Z21+Z28 100％ 85％
如表6所示，仅检测Z16、Z19、Z21三个印迹基因时，模型对甲状腺肿瘤的灵敏度为96％，特异性为91％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z1时，模型的灵敏度为100％，特异性为82％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z3时，模型的灵敏度为98％，特异性为87％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z5时，模型的灵敏度为97％，特异性为89％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z6时，模型的灵敏度为98％，特异性为89％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z8时，模型的灵敏度为97％，特异性为91％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z9时，模型的灵敏度为97％，特异性为90％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z10时，模型的灵敏度为98％，特异性为89％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z11时，模型的灵敏度为100％，特异性为88％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z12时，模型的灵敏度为97％，特异性为91％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z13时，模型的灵敏度为99％，特异性为90％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z14时，模型的灵敏度为97％，特异性为91％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z18时，模型的灵敏度为99％，特异性为91％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z20时，模型的灵敏度为98％，特异性为87％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z22时，模型的灵敏度为97％，特异性为89％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z28时，模型的灵敏度为100％，特异性为85％。
实施例4肺良性和恶性肿瘤活检样本中印迹基因良恶性鉴别模型的验证
获取肺良性和恶性肿瘤的细针穿刺样本各100例，处理方法同实施例3，通过实施例2中构建的模型对肿瘤的良恶性进行分级，将肿瘤良恶性程度判断结果为良性肿瘤和癌潜能的样本记为良性，将肿瘤良恶性程度判断结果为早期癌症、中期癌症和晚期癌症的样本记为恶性，与病理诊断的良恶性进行比较，评估模型的灵敏度和特异性。
表7显示了印迹基因Z16、Z19、Z21的组合和印迹基因Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28分别与Z16、Z19、Z21组合的模型对肺肿瘤良恶性的检测灵敏度和特异性。
表7
印迹基因组合 灵敏度 特异性
Z16+Z19+Z21 98％ 95％
Z16+Z19+Z21+Z1 100％ 91％
Z16+Z19+Z21+Z3 100％ 94％
Z16+Z19+Z21+Z5 100％ 93％
Z16+Z19+Z21+Z6 99％ 94％
Z16+Z19+Z21+Z8 99％ 95％
Z16+Z19+Z21+Z9 99％ 94％
Z16+Z19+Z21+Z10 99％ 93％
Z16+Z19+Z21+Z11 100％ 95％
Z16+Z19+Z21+Z12 99％ 94％
Z16+Z19+Z21+Z13 100％ 93％
Z16+Z19+Z21+Z14 99％ 95％
Z16+Z19+Z21+Z18 100％ 92％
Z16+Z19+Z21+Z20 100％ 93％
Z16+Z19+Z21+Z22 100％ 92％
Z16+Z19+Z21+Z28 100％ 90％
如表7所示，仅检测Z16、Z19、Z21三个印迹基因时，模型对肺肿瘤的灵敏度为98％，特异性为95％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z1时，模型的灵敏度为100％，特异性为91％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z3时，模型的灵敏度为100％，特异性为94％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z5时，模型的灵敏度为100％，特异性为93％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z6时，模型的灵敏度为99％，特异性为94％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z8时，模型的灵敏度为99％，特异性为95％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z9时，模型的灵敏度为99％，特异性为94％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z10时，模型的灵敏度为99％，特异性为93％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z11时，模型的灵敏度为100％，特异性为95％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z12时，模型的灵敏度为99％，特异性为94％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z13时，模型的灵敏度为100％，特异性为93％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z14时，模型的灵敏度为99％，特异性为95％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z18时，模型的灵敏度为100％，特异性为92％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z20时，模型的灵敏度为100％，特异性为93％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z22时，模型的灵敏度为100％，特异性为92％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z28时，模型的灵敏度为100％，特异性为90％。
实施例5膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、肠肿瘤、胃肿瘤、食道肿瘤、胰腺肿瘤、肝肿瘤中印迹基因良恶性鉴别模型的验证
获取膀胱肿瘤的膀胱镜活检样本、前列腺肿瘤的穿刺活检样本、皮肤肿瘤的活检样本、乳腺肿瘤的穿刺活检样本、宫颈肿瘤的阴道镜活检样本、肠肿瘤的肠镜活检样本、胃肿瘤的胃镜活检样本、食道肿瘤的胃镜活检样本、胰腺肿瘤的穿刺活检样本、肝肿瘤的穿刺活检样本良恶性各100例，处理方法同实施例3，检测印迹基因Z16、Z19、Z21、Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22和Z28的表达状态，并对每个基因的TE、BAE和MAE进行定量。
通过实施例2中构建的模型对肿瘤的良恶性进行分级，将肿瘤良恶性程度判断结果为良性肿瘤和癌潜能的样本记为良性，将肿瘤良恶性程度判断结果为早期癌症、中期癌症和晚期癌症的样本记为恶性，与病理诊断的良恶性进行比较，评估模型的灵敏度和特异性
表8和表9显示了印迹基因Z16、Z19、Z21的组合和印迹基因Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28分别与Z16、Z19、Z21组合的模型对膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、肠肿瘤、胃肿瘤、食道肿瘤、胰腺肿瘤和肝肿瘤的检测灵敏度和特异性。
表8
Figure BDA0003939846980000181
表9
Figure BDA0003939846980000182
如表8和9所示，检测Z16、Z19、Z21三个印迹基因时，模型对膀胱癌的检测灵敏度为96％，特异性为97％、对前列腺癌的检测灵敏度为94％，特异性为97％、对皮肤癌的检测灵敏度为93％，特异性为92％、对乳腺癌的检测灵敏度为94％，特异性为96％、对宫颈癌的检测灵敏度为97％，特异性为93％、对肠癌的检测灵敏度为94％，特异性为94％、对胃癌的检测灵敏度为96％，特异性为92％、对食道癌的检测灵敏度为96％，特异性为94％、对胰腺癌的检测灵敏度为98％，特异性为92％、对肝癌的检测灵敏度为97％，特异性为90％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z1时，对膀胱肿瘤的灵敏度提高到98％，特异性为92％、对前列腺癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为93％、对皮肤癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为89％、对乳腺癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为93％、对宫颈癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为90％、对肠癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为91％、对胃癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为89％、对食道癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为91％、对胰腺癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为90％、对肝癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为86％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z3时，对膀胱肿瘤的灵敏度提高到100％，特异性为96％、对前列腺癌的检测灵敏度提高到96％，特异性为94％、对皮肤癌的检测灵敏度提高到95％，特异性为90％、对乳腺癌的检测灵敏度提高到97％，特异性为94％、对宫颈癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为91％、对肠癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为92％、对胃癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为90％、对食道癌的检测灵敏度提高到97％，特异性为92％、对胰腺癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为91％、对肝癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为88％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z8时，对膀胱肿瘤的灵敏度提高到97％，特异性为95％、对前列腺癌的检测灵敏度提高到96％，特异性为94％、对皮肤癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为89％、对乳腺癌的检测灵敏度提高到95％，特异性为94％、对宫颈癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为90％、对肠癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为92％、对胃癌的检测灵敏度提高到97％，特异性为90％、对食道癌的检测灵敏度提高到97％，特异性为93％、对胰腺癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为91％、对肝癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为87％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z10时，对膀胱肿瘤的灵敏度提高到98％，特异性为94％、对前列腺癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为94％、对皮肤癌的检测灵敏度提高到94％，特异性为89％、对乳腺癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为94％、对宫颈癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为91％、对肠癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为92％、对胃癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为90％、对食道癌的检测灵敏度提高到97％，特异性为91％、对胰腺癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为90％、对肝癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为87％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z11时，对膀胱肿瘤的灵敏度提高到98％，特异性为96％、对前列腺癌的检测灵敏度提高到97％，特异性为95％、对皮肤癌的检测灵敏度提高到97％，特异性为90％、对乳腺癌的检测灵敏度提高到96％，特异性为93％、对宫颈癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为91％、对肠癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为93％、对胃癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为91％、对食道癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为92％、对胰腺癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为92％、对肝癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为89％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z13时，对膀胱肿瘤的灵敏度提高到99％，特异性为94％、对前列腺癌的检测灵敏度提高到96％，特异性为95％、对皮肤癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为90％、对乳腺癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为93％、对宫颈癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为91％、对肠癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为92％、对胃癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为91％、对食道癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为92％、对胰腺癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为89％、对肝癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为87％。
在3个基因的基础上增加印迹基因Z28时，对膀胱肿瘤的灵敏度提高到98％，特异性为94％、对前列腺癌的检测灵敏度提高到96％，特异性为93％、对皮肤癌的检测灵敏度提高到95％，特异性为89％、对乳腺癌的检测灵敏度提高到97％，特异性为92％、对宫颈癌的检测灵敏度提高到100％，特异性为90％、对肠癌的检测灵敏度提高到97％，特异性为90％、对胃癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为89％、对食道癌的检测灵敏度提高到98％，特异性为90％、对胰腺癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为90％、对肝癌的检测灵敏度提高到99％，特异性为86％。
实施例6肿瘤淋巴转移的分析
获取转移和非转移的乳腺癌前哨淋巴结的细针穿刺样本，处理方法同实施例2，检测印迹基因Z1、Z8、Z11、Z13、Z16、Z19和Z21的表达状态，并对每个基因的TE、BAE和MAE进行定量。
定量结果如图5(图5(a)-(g))所示，印迹基因Z1、Z8、Z11、Z13、Z16、Z19和Z21的TE、BAE和MAE在肿瘤转移和肿瘤未转移的淋巴结中有显著差异。
实施例7甲状腺良恶性肿瘤中BRAF和MYC基因表达状态的分析
获取甲状腺良性和恶性肿瘤的细针穿刺样本，处理方法同实施例2，检测非印迹基因BRAF和MYC的表达。使用内含子探针检测的BRAF和MYC基因的定量方式与印迹基因相同。使用mRNA探针检测的BRAF基因突变通过以下方式定量：有3个以上信号点的细胞为阳性细胞，计数1200-2000个细胞，计算阳性细胞的比例。
定量结果如图6所示，BRAF和MYC基因的多等位基因表达量(MAE)、BRAF突变阳性细胞比例在甲状腺良恶性肿瘤中有显著差异。
实施例8肺良恶性肿瘤中CDKN2A，HER2和MYC基因表达状态的分析
获取肺良性和恶性肿瘤的细针穿刺样本，处理方法同实施例2，检测非印迹基因EGFR，HER2和MYC的表达。EGFR，HER2和MYC基因的定量方式与印迹基因相同。
定量结果如图7所示，EGFR，HER2和MYC基因的多等位基因表达量(MAE)在肺良恶性肿瘤中有显著差异。
实施例9小细胞肺癌和非小细胞肺癌中GRP和SYP基因表达状态的分析
获取小细胞肺癌和非小细胞肺癌的细针穿刺样本，处理方法同实施例2，检测非印迹基因GRP和SYP的表达。GRP和SYP通过以下方式定量：有2个以上信号点的细胞为阳性细胞，计数1200-2000个细胞，计算阳性细胞的比例。
定量结果如图8所示，GRP和SYP阳性细胞比例在小细胞肺癌和非小细胞肺癌中有显著差异。因此，在检测印迹基因表达状态的基础上增加GRP和SYP基因，可以在实现肺癌早期诊断的同时对肺癌进行分型，有助于精准治疗。
实施例10膀胱癌中CDKN2A和MYC基因表达状态的分析
获取膀胱良性和恶性肿瘤的活检样本，处理方法同实施例2，检测非印迹基因CDKN2A和MYC的表达。CDKN2A和MYC基因的定量方式与印迹基因相同。
定量结果如图9所示，CDKN2A和MYC基因的多等位基因表达量(MAE)在膀胱良恶性肿瘤中有显著差异。
实施例11乳腺癌中HER2和BRAF基因表达状态的分析
获取乳腺良性和恶性肿瘤的活检样本，处理方法同实施例2，检测非印迹基因HER2和BRAF的表达。HER2和BRAF基因的定量方式与印迹基因相同。
定量结果如图10所示，HER2和BRAF基因的多等位基因表达量(MAE)在乳腺良恶性肿瘤中有显著差异。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (15)

1.一种用于肿瘤的基因表达状态分级模型，其特征在于，所述模型包括通过计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量在肿瘤中的变化，对印迹基因的表达状态进行分级；
其中，所述印迹基因包括Z16、Z19和Z21，所述印迹基因Z16为SNRPN/SNURF，所述印迹基因Z19为HM13，所述印迹基因Z21为SNU13。
2.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，所述印迹基因还包括Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28中的任意一个或多个，
其中，所述印迹基因Z1为GNAS，所述印迹基因Z3为PEG10，所述印迹基因Z5为MEST，所述印迹基因Z6为PLAGL1，所述印迹基因Z8为DCN，所述印迹基因Z9为DLK1，所述印迹基因Z10为GATM，所述印迹基因Z11为GRB10，所述印迹基因Z12为PEG3，所述印迹基因Z13为SGCE，所述印迹基因Z14为SLC38A4，所述印迹基因Z18为GATA3，所述印迹基因Z20为KCNQ1，所述印迹基因Z22为PON2，所述印迹基因Z28为ZIC1。
3.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，所述计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量的公式如下：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)；
单等位基因表达量＝b/(b+c+d)；
双等位基因表达量＝c/(b+c+d)；
多等位基因表达量＝d/(b+c+d)；
其中，a为细胞核内不存在标记，印迹基因没有表达的细胞数；b为细胞核内存在一个印迹基因标记的细胞数，c为细胞核内存在两个印迹基因标记的细胞数，d为细胞核内存在两个以上印迹基因标记的细胞数。
4.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，
针对印迹基因Z16的双等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量小于15％；
I级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量为15-20％；
II级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量为20-26％；
III级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量为26-30％；
IV级：所述印迹基因Z16的双等位基因表达量大于30％；
针对印迹基因Z16的多等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量小于1.4％；
I级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量为1.4-3.4％；
II级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量为3.4-5.5％；
III级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量为5.5-9％；
IV级：所述印迹基因Z16的多等位基因表达量大于9％；
针对印迹基因Z16的总表达量划分的两个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z16的总表达量小于17％；
I级：所述印迹基因Z16的总表达量大于或等于17％。
5.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，
针对印迹基因Z19的双等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量小于12％；
I级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量为12-20％；
II级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量为20-26％；
III级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量为26-30％；
IV级：所述印迹基因Z19的双等位基因表达量大于30％；
针对印迹基因Z19的多等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量小于1.4％；
I级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量为1.4-3.4％；
II级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量为3.4-6.3％；
III级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量为6.3-9％；
IV级：所述印迹基因Z19的多等位基因表达量大于9％；
针对印迹基因Z19的总表达量划分的两个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z19的总表达量小于11％；
I级：所述印迹基因Z19的总表达量大于或等于11％。
6.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，
针对印迹基因Z21的双等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量小于12％；
I级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量为12-16％；
II级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量为16-20％；
III级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量为20-25％；
IV级：所述印迹基因Z21的双等位基因表达量大于25％；
针对印迹基因Z21的多等位基因表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量小于1.3％；
I级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量为1.3-3.2％；
II级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量为3.4-4.9％；
III级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量为4.9-6.2％；
IV级：所述印迹基因Z21的多等位基因表达量大于6.2％；
针对印迹基因Z21的总表达量划分的两个不同的等级为：
0级：所述印迹基因Z21的总表达量小于14％；
I级：所述印迹基因Z21的总表达量大于或等于14％。
7.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，
印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度分为阴性、阳性潜能、低度阳性、中度阳性和高度阳性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为0级，或印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量均为0级，则为印迹基因阴性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量中至少有一个为I级且均达不到II级，则为印迹基因阳性潜能；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量中至少有一个为II级且均达不到III级，则为印迹基因低度阳性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量中至少有一个为III级且均达不到IV级，则为印迹基因中度阳性；
判断印迹基因阳性程度的结果为印迹基因的总表达量为I级且双等位表达量和多等位表达量中至少有一个为IV级，则为印迹基因高度阳性；
其中，印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度是独立的。
8.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，
判断肿瘤的良恶性程度分为良性肿瘤、癌潜能、早期癌症、中期癌症和晚期癌症；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度均为阴性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中不超过一个印迹基因的阳性程度为阳性潜能，则为良性肿瘤；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为阳性潜能，或不超过一个印迹基因的阳性程度为低度阳性，则为癌潜能；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为低度阳性，或不超过一个印迹基因的阳性程度为中度阳性，则为早期癌症；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为中度阳性，或不超过一个印迹基因的阳性程度为高度阳性，则为中期癌症；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为高度阳性，则为晚期癌症。
9.根据权利要求2所述的分级模型，其特征在于，
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度均为阴性或阳性潜能，或印迹基因Z16、Z19和Z21中不超过一个印迹基因的阳性程度为低度阳性且Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28的阳性程度均为阴性，肿瘤的良恶性程度判断结果为良性肿瘤；
判断肿瘤的良恶性程度的结果为印迹基因Z16、Z19和Z21中不超过一个印迹基因的阳性程度为低度阳性且Z1、Z3、Z5、Z6、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z18、Z20、Z22、Z28中至少有一个基因的阳性程度为阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个基因的阳性程度为低度阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有一个基因的阳性程度为中度阳性，肿瘤的良恶性程度判断结果为恶性肿瘤。
10.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，所述肿瘤选自甲状腺癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、乳腺癌、宫颈癌、肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌。
11.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，所述模型进一步包括通过计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量在肿瘤中的变化，以及非印迹基因BRAF和/或MYC的表达量，对印迹基因和非印迹基因的表达状态进行分级，
其中，当印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度都为阳性潜能或以下，或印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因BRAF和MYC都为阴性，肿瘤良恶性判断结果为良性肿瘤；
当印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因BRAF和MYC中至少有一个基因为阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上时，肿瘤良恶性判断结果为恶性肿瘤，
其中，所述非印迹基因BRAF和MYC为阴性是指待测样本中所述非印迹基因BRAF和MYC的表达量与正常样本中非印迹基因BRAF和MYC的表达量无差异，
所述非印迹基因BRAF和MYC为阳性是指待测样本中所述非印迹基因BRAF和MYC的表达量相比正常样本中非印迹基因BRAF和MYC的表达量升高。
12.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，所述模型进一步包括通过计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量在肿瘤中的变化，以及非印迹基因HER2和/或MYC的表达量，对印迹基因和非印迹基因的表达状态进行分级，
其中，当印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度都为阳性潜能或以下，或印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因HER2和MYC都为阴性，肿瘤良恶性判断结果为良性肿瘤；
当印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因HER2和MYC中至少有一个基因为阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上时，肿瘤良恶性判断结果为恶性肿瘤；
其中，所述非印迹基因HER2和MYC为阴性是指待测样本中所述非印迹基因HER2和MYC的表达量与正常样本中非印迹基因HER2和MYC的表达量无差异，
所述非印迹基因HER2和MYC为阳性是指待测样本中所述非印迹基因HER2和MYC的表达量相比正常样本中非印迹基因HER2和MYC的表达量升高。
13.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，所述模型进一步包括通过计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量在肿瘤中的变化，以及非印迹基因GRP和/或SYP的表达量，对印迹基因和非印迹基因的表达状态进行分级，
其中，当印迹基因Z16、Z19和Z21的组合判断肿瘤良恶性的结果为早期癌症以上且非印迹基因GRP和SYP中至少一个为阳性时，肿瘤类型的判断结果为小细胞癌；
当印迹基因Z16、Z19和Z21的组合判断肿瘤良恶性的结果为早期癌症以上且非印迹基因GRP和SYP都为阴性时，肿瘤类型的判断结果为非小细胞癌；
其中，所述非印迹基因GRP和SYP为阴性是指待测样本中所述非印迹基因GRP和SYP的表达量与正常样本中非印迹基因GRP和SYP的表达量无差异，
所述非印迹基因GRP和SYP为阳性是指待测样本中所述非印迹基因GRP和SYP的表达量相比正常样本中非印迹基因GRP和SYP的表达量升高。
14.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，所述模型进一步包括通过计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量在肿瘤中的变化，以及非印迹基因CDKN2A和/或MYC的表达量，对印迹基因和非印迹基因的表达状态进行分级，
其中，当印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度都为阳性潜能或以下，或印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因CDKN2A和MYC都为阴性，肿瘤良恶性判断结果为良性肿瘤；
当印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因CDKN2A和MYC中至少有一个基因为阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上时，肿瘤良恶性判断结果为恶性肿瘤，
其中，所述非印迹基因CDKN2A和MYC为阴性是指待测样本中所述非印迹基因CDKN2A和MYC的表达量与正常样本中非印迹基因CDKN2A和MYC的表达量无差异，
所述非印迹基因CDKN2A和MYC为阳性是指待测样本中所述非印迹基因CDKN2A和MYC的表达量相比正常样本中非印迹基因CDKN2A和MYC的表达量升高。
15.根据权利要求1所述的分级模型，其特征在于，所述模型进一步包括通过计算印迹基因的总表达量、单等位基因表达量、双等位基因表达量和多等位基因表达量在肿瘤中的变化，以及非印迹基因HER2和/或BRAF的表达量，对印迹基因和非印迹基因的表达状态进行分级，
其中，当印迹基因Z16、Z19和Z21的阳性程度都为阳性潜能或以下，或印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因HER2和BRAF都为阴性，肿瘤良恶性判断结果为良性肿瘤；
当印迹基因Z16、Z19和Z21中仅有一个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上，其他两个印迹基因的阳性程度为阴性或阳性潜能，且非印迹基因HER2和BRAF中至少有一个基因为阳性，或印迹基因Z16、Z19和Z21中至少有两个印迹基因的阳性程度为低度阳性或以上时，肿瘤良恶性判断结果为恶性肿瘤，
其中，所述非印迹基因HER2和BRAF为阴性是指待测样本中所述非印迹基因HER2和BRAF的表达量与正常样本中非印迹基因HER2和BRAF的表达量无差异，
所述非印迹基因HER2和BRAF为阳性是指待测样本中所述非印迹基因HER2和BRAF的表达量相比正常样本中非印迹基因HER2和BRAF的表达量升高。
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