CN116129991A - 一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法，其特征在于，包括如下步骤：数据预处理、实验数据质量评估、代谢物基本统计分析、单变量统计分析、多元统计分析、差异分析、差异代谢物通路富集分析、分析结果整理。本发明的有益效果在于：分析内容丰富，涵盖市场所需绝大部分分析内容；操作简便，根据配置文件，自动整合各步骤的数据分析、可视化以及结果整理，继而快速生成报告，分析效率高，可同时进行多批数据的分析。

Description

一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法

技术领域

本发明涉及生物信息技术领域，更具体地说，它涉及一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法。

背景技术

代谢组学指利用质谱等技术，对生物样本中所有低分子量的代谢产物进行定性和定量，并寻找代谢物与生理病理变化的相关关系的一门科学，是转录组学和蛋白质组学的延伸，能够更直接、更准确地反映生物体的生理状态。目前代谢组学广泛应用于各研究领域，在疾病诊断、药靶筛选、营养与健康管理、个性化药物治疗、植物生长发育与抗逆等各个研究方向受到越来越多的关注，其中，非靶向代谢组能够对样本中的各类代谢物进行无偏向、大规模、系统性的检测，最大程度反映生物体内的代谢水平扰动情况，相关的数据分析需求也日益增加，因此开发一套相应的自动化分析方法非常重要，而现有的分析工具存在如下几点不足：

（1）目前已有代谢组自动化分析工具MeataboAnalyst在对代谢组数据进行整套分析时，需要人工完成对结果的整理以及每步工作的衔接，操作步骤相对较多，比较浪费人工和时间。

（2）代谢物通路富集的映射物种选择有限，往往只针对模式生物或特定物种，对于特殊样本的映射物种选择范围窄；

（3）无法同时进行多批数据的分析。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法，旨在解决上述技术问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法，包括以下步骤：

步骤一，准备并读取config文件，config文件中包括：正负离子模式下代谢物定性定量数据、样本名对应关系文件、分组名对应关系文件、比较组文件、差异代谢物筛选参数设定、任务名称、分析结果保存路径；

步骤二，数据预处理：包括对预先准备的原始数据中目标代谢物在半数及半数以上样本中的表达量进行检查，再对表达量为缺失值和异常值时的情形进行处理并调整数据格式；

步骤三，数据质量评估：从总体样本主成分分析、QC样本相关性、QC样本离子峰丰度的相对标准偏差这三个方面评估预处理后的数据质量；

步骤四，代谢物基本统计分析：通过代谢物基本统计分析对代谢物的分类和表达量进行统计分析与可视化；

步骤五，单变量统计分析：计算对照组和处理组之间代谢物的差异倍数，并使用t检验计算差异显著性pvalue值；

步骤六，多元统计分析：借助R语言的ropls软件包，用多元统计的方法如正交偏最小二乘判别分析对代谢组数据进行降维和归类分析，从中挖掘提炼信息，该信息包括VIP值；

步骤七，差异分析：默认使用结合单变量统计分析得到的差异倍数、pvalue值以及多元统计分析计算出的VIP值作为标准，筛选出差异代谢物；

步骤八，差异代谢物通路富集分析：对筛选得到的差异代谢物，结合原始数据中的代谢物注释数据，使用脚本根据超几何检验得到差异代谢物显著富集的通路；

步骤九，结果整理：对用于生成非靶向代谢组数据分析结果报告的统计分析结果进行整理。

作为本发明进一步的方案：所述步骤二中对原始数据的检查方式如下：首先，若数据中某代谢物在半数及半数以上样本中的表达量都是缺失值时，删除此代谢物；若数据中某代谢物在半数及半数以上样本中的表达量不都是缺失值时，将缺失值替换为数值9；然后，将小于或等于0的异常值，替换为0-1之间符合均匀分布的随机数；其次，再对经过处理后的缺失值和异常值的数据进行转置，最后，保存处理后的数据，用于后续分析。

作为本发明进一步的方案：所述步骤四中通过制作代谢物分类饼图、密度图、样本相关性图、层次聚类树图、小提琴图和总代谢物热图来对代谢物的分类和表达量进行统计分析和可视化。

作为本发明进一步的方案：所述步骤五中的计算方法为对代谢物在对照组样本和处理组样本中的表达量分别求均值，然后用处理组的均值除以对照组的均值，即可得到差异倍数，再使用R语言中t.test函数计算得到差异显著性pvalue值，根据计算得出的差异显著性pvalue值绘制火山图。

作为本发明进一步的方案：所述步骤六中多元统计的方法包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。

作为本发明进一步的方案：所述步骤七中默认筛选的标准为：当VIP>1且差异倍数>1且pvalue<0.05时的代谢物为上调的代谢物；当VIP>1且差异倍数<1且pvalue<0.05时的代谢物为下调的代谢物；其余的则为非差异代谢物。

与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

分析内容全面多层次，涵盖了市场所需绝大部分分析内容，分析时，对正离子模式、负离子模式下的代谢物数据分别进行分析，此外每种模式下分析的代谢物又分为两类，所有代谢物和有KEGG COMPOUND注释信息的代谢物；

自动化程度高，操作简便，自动整理所有分析结果，完成各个部分分析之后，自动对结果进行统计，可视化，以及归类整理，使结果排布尽然有序，直接用于报告生成；

差异代谢物通路富集分析不受物种限制，结果呈现多样，提供表格、图片、网页等多种形式的结果，可同时进行多批数据分析。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。

图1为一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法的流程示意图；

图2为表示步骤三中QC样本相关性的图；

图3为表示步骤三中QC样本离子峰丰度的相对标准偏差的图；

图4为步骤五中的火山图；

图5为表示步骤六中模型概况的图；

图6为表示步骤六中显著性诊断的图；

图7为表示步骤六中载荷图的图；

图8为实例中以表达分析为例的结果示意图；

图9为实例中以差异分析为例的结果示意图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

参照图1至图9对本发明一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法实施例做进一步说明。

一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法，包括以下步骤：

步骤一，准备并读取config文件，config文件中包括：正负离子模式下代谢物定性定量数据、样本名对应关系文件、分组名对应关系文件、比较组文件、差异代谢物筛选参数设定、任务名称、分析结果保存路径；

步骤二，数据预处理：包括对预先准备的原始数据中目标代谢物在半数及半数以上样本中的表达量进行检查，再对表达量为缺失值和异常值时的情形进行处理并调整数据格式；检查方式如下，首先，若数据中某代谢物在半数及半数以上样本中的表达量都是缺失值时，删除此代谢物；若数据中某代谢物在半数及半数以上样本中的表达量不都是缺失值时，将缺失值替换为数值9；然后，将小于或等于0的异常值，替换为0-1之间符合均匀分布的随机数；其次，再对经过处理后的缺失值和异常值的数据进行转置，最后，保存处理后的数据，用于后续分析；

请参照图2-图3，步骤三，数据质量评估：从总体样本主成分分析、QC样本相关性、QC样本离子峰丰度的相对标准偏差这三个方面评估预处理后的数据质量；其中，在主成分分析中，QC样本聚在一起，则说明实验的重复性好；在QC样本相关性分析中，一般相关性系数大于0.9表明相关性较好，反映出实验重复性较好；在QC样本离子峰丰度的相对标准偏差越小，表明仪器的稳定性越好，数据质量越好；

表1为总体样本主成分分析数据表格，如下所示（其中P1代表主成分1，P2代表主成分2）：

表1：

表2为QC样本相关性数据表格，如下所示：

表2：

表3为QC样本离子峰丰度的相对标准偏差数据表格，如下所示：

表3：

步骤四，代谢物基本统计分析：通过代谢物基本统计分析对代谢物的分类和表达量进行统计分析与可视化，可以通过制作代谢物分类饼图、密度图、样本相关性图、层次聚类树图、小提琴图和总代谢物热图来对代谢物的分类和表达量进行统计分析和可视化；

其中表4为分类饼数据表格，如下所示：

表4：

请参照图4，步骤五，单变量统计分析：计算对照组和处理组之间代谢物的差异倍数，并使用t检验计算差异显著性pvalue值；对代谢物在对照组样本和处理组样本中的表达量分别求均值，然后用处理组的均值除以对照组的均值，即可得到差异倍数，再使用R语言中t.test函数计算得到差异显著性pvalue值，根据计算得出的差异显著性pvalue值绘制火山图，见附图4，火山图中的横坐标为差异倍数的log2的对数值，纵坐标为显著性pvalue值的-log10的对数值，满足Fold Change>1，pvalue值<0.05的代谢物用深灰色表示，满足FC<1，pvalue值<0.05的代谢物用黑色来表示，其余代谢物用浅灰色表示；

请参照图5-图7，步骤六，多元统计分析：借助R语言的ropls软件包，用多元统计的方法主成分分析、偏最小二乘判别分析和正交偏最小二乘判别分析对代谢组数据进行降维和归类分析，从中挖掘提炼信息，该信息包括VIP值；

以正交偏最小二乘判别分析为例，制作模型概况图（见附图5，其中，横坐标p1代表主成分1，o1代表主成分2，R2Y表示所建模型对Y矩阵的解释率，Q2Y表示所建模型的预测能力，它们的值越接近于1表明所建模型的拟合度越好）、显著性诊断图（见附图6，其中，原模型和模拟模型的R2Y和Q2Y值经随机排列后的散点图，模型R2Y和Q2Y(散点)大于真实值时(横线)，表明产生过拟合）、载荷图（见附图7，其中，横坐标表示主成分1，纵坐标表示主成分2，附图7中所有的点均表示代谢物，灰色的点表示常规代谢物，黑色的点表示贡献度大的代谢物），部分数据表格如下：

表5为模型概况图的数据表格，如下所示：

表5：

表6为显著性诊断图的数据表格，如下所示：

表6：

表7为OPLS-DA得分图的数据表格，如下所示：

表7：

步骤七，差异分析：默认使用结合单变量统计分析得到的差异倍数、pvalue值以及多元统计分析OPLS-DA计算出的VIP值作为标准，筛选出差异代谢物；默认筛选的标准为：当VIP>1且差异倍数>1且pvalue<0.05时的代谢物为上调的代谢物；当VIP>1且差异倍数<1且pvalue<0.05时的代谢物为下调的代谢物；其余的则为非差异代谢物，对每个比较组鉴定到的差异代谢物绘制热图和相关性图。

步骤八，差异代谢物通路富集分析：对筛选得到的差异代谢物，结合原始数据中的代谢物注释数据，将根据超几何检验得到差异代谢物显著富集的通路使用脚本进行富集分析，该脚本为自主研发的脚本，通过富集分析得到表格、图片、网页多种形式的结果，此富集分析不受物种限制；

步骤九，结果整理：对用于生成非靶向代谢组数据分析结果报告的统计分析结果进行整理。

作为实例的，对正离子模式、负离子模式下的代谢物数据分别进行上述步骤一至步骤九的分析，并且在表达、差异分析步骤中，将每种模式下分析的代谢物分为两类，一类为所有代谢物，另一类为有KEGG COMPOUND注释信息的代谢物，表达、差异分析相关结果按所有代谢物和有KEGG COMPOUND注释信息的代谢物(Named_Metabolites)单独存放。进行了多层次且全面的分析，以表达、差异分析为例，结果请参考说明书附图8-9。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，准备并读取config文件，config文件中包括：正负离子模式下代谢物定性定量数据、样本名对应关系文件、分组名对应关系文件、比较组文件、差异代谢物筛选参数设定、任务名称、分析结果保存路径；

步骤二，数据预处理：包括对预先准备的原始数据中目标代谢物在半数及半数以上样本中的表达量进行检查，再对表达量为缺失值和异常值时的情形进行处理并调整数据格式；

步骤三，数据质量评估：从总体样本主成分分析、QC样本相关性、QC样本离子峰丰度的相对标准偏差这三个方面评估预处理后的数据质量；

步骤四，代谢物基本统计分析：通过代谢物基本统计分析对代谢物的分类和表达量进行统计分析与可视化；

步骤五，单变量统计分析：计算对照组和处理组之间代谢物的差异倍数，并使用t检验计算差异显著性pvalue值；

步骤六，多元统计分析：借助R语言的ropls软件包，用多元统计的方法对代谢组数据进行降维和归类分析，从中挖掘提炼信息，该信息包括VIP值；

步骤七，差异分析：默认使用结合单变量统计分析得到的差异倍数、pvalue值以及多元统计分析计算出的VIP值作为标准，筛选出差异代谢物；

步骤八，差异代谢物通路富集分析：对筛选得到的差异代谢物，结合原始数据中的代谢物注释数据，使用脚本根据超几何检验得到差异代谢物显著富集的通路；

步骤九，结果整理：对用于生成非靶向代谢组数据分析结果报告的统计分析结果进行整理。

2.根据权利要求1所述的一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法，其特征在于，所述步骤二中对原始数据的检查方式如下：首先，若数据中某代谢物在半数及半数以上样本中的表达量都是缺失值时，删除此代谢物；若数据中某代谢物在半数及半数以上样本中的表达量不都是缺失值时，将缺失值替换为数值9；然后，将小于或等于0的异常值，替换为0-1之间符合均匀分布的随机数；其次，再对经过处理后的缺失值和异常值的数据进行转置，最后，保存处理后的数据，用于后续分析。

3.根据权利要求2所述的一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法，其特征在于，所述步骤四中通过制作代谢物分类饼图、密度图、样本相关性图、层次聚类树图、小提琴图和总代谢物热图来对代谢物的分类和表达量进行统计分析和可视化。

4.根据权利要求3所述的一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法，其特征在于，所述步骤五中的计算方法为对代谢物在对照组样本和处理组样本中的表达量分别求均值，然后用处理组的均值除以对照组的均值，即可得到差异倍数，再使用R语言中t.test函数计算得到差异显著性pvalue值，根据计算得出的差异显著性pvalue值绘制火山图。

5.根据权利要求4所述的一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法，其特征在于，所述步骤六中多元统计的方法包括主成分分析、偏最小二乘判别分析和正交偏最小二乘判别分析。

6.根据权利要求5所述的一种基于代谢物定性定量数据的非靶向代谢组分析方法，其特征在于，所述步骤七中默认筛选的标准为：当VIP>1且差异倍数>1且pvalue<0.05时的代谢物为上调的代谢物；当VIP>1且差异倍数<1且pvalue<0.05时的代谢物为下调的代谢物；其余的则为非差异代谢物。

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