CN116115614A - 石杉碱甲在制备防治糖尿病视网膜病变药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了石杉碱甲在制备防治糖尿病视网膜病变药物中的应用，基于网络药理学分析，石杉碱甲治疗糖尿病视网膜病变的新见解可能通过关键靶点HSP27和凋亡相关途径。视网膜作为中枢神经系统的一部分，石杉碱甲在糖尿病视网膜中的保护作用主要通过石杉碱甲和HSP27之间的相互作用、HSP27的磷酸化和激活抗凋亡信号通路来调节。研究结果为石杉碱甲治疗糖尿病视网膜病变提供了理论依据和临床见解。

Description

石杉碱甲在制备防治糖尿病视网膜病变药物中的应用
技术领域
本发明属于医药用途领域，涉及石杉碱甲在制备防治糖尿病视网膜病变药物中的应用，具体为保护视网膜神经元，预防和治疗糖尿病视网膜病变(DR)提供了新治疗方案。
背景技术
随着生活方式的改变，糖尿病(DM)的全球发病率正在迅速增加，预计2045年全球人口将达到6.93亿。糖尿病视网膜病变(DR)作为DM最常见的并发症，是成年工作人群致盲的主要原因之一。作为一种慢性神经血管变性，DR的主要病理特征包括微血管异常、神经元凋亡以及胶质细胞活化增殖。目前玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子药物和激光光凝并非对所有DR患者有效，这表明其他因素可能在疾病发生发展中发挥重要作用。多个研究报道视网膜出现肉眼可见的血管病变之前，即出现了视网膜神经结构和功能异常。人类供体眼睛和实验动物模型都进一步证明了糖尿病神经病变先于糖尿病微血管病变。近年学者也指出视网膜中的神经血管单元作为一个整体共同参与疾病发生发展。因此，保护视网膜神经元有望成为预防和治疗DR的潜在策略。
石杉碱甲(Hup A)系由广泛使用的传统亚洲药物(蛇足石杉)中提取的一种生物碱，是一强效、可逆的胆碱酯酶抑制剂，其作用特点与新斯的明相似，但作用维持时间比后者为长。与他克林、多奈哌齐等相比，Hup A具有更好的血脑屏障渗透性、更高的生物利用度和更长的乙酰胆碱酯酶抑制作用时间。Hup A已作为神经保护药物广泛用于阿尔兹海默症等各类神经退行性疾病。Hup A对真性胆碱酯酶具有选择性的抑制，抑制强度是假性胆碱酯酶的数千倍；抑制方式为竞争性和非竞争性的混合型抑制，与单纯竞争性抑制剂有显著不同；易通过血脑屏障进入中枢，兼具有中枢及外周治疗作用；有效时间长；从胃肠道吸收良好，分布广泛，消除速度适中；安全指数大，外周胆碱能副作用小；稳定性好。Hup A除乙酰胆碱酯酶抑制外，神经保护机制主要包括抗炎、线粒体保护、减轻细胞凋亡、促进神经营养因子分泌和抗氧化活性等。Hup A在缺血再灌注动物模型中通过激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路发挥神经保护作用。Hup A还通过相同的信号通路促进小鼠胚胎神经干细胞和成年小鼠新生成细胞的增殖。研究还表明Hup A通过激活AKT、p38和ERK信号通路有效地缓解了X射线辐射引起的损伤。然而，它在视网膜中的神经保护作用以前从未被研究过。作为中枢神经系统的一部分，视网膜是从胚胎期的神经管发育而来，与大脑具有相似的神经和血管解剖结构。我们推测神经保护剂Hup A对DR视网膜神经元具有类似的保护作用。
网络药理学(NP)作为传统药理学、生物化学和系统生物学的交叉学科，旨在于系统描述药物作用和与多个关键靶点的相互作用。此外，分子对接可以预测配体与关键靶点之间的结合模式和稳定性。结合以上两种有效的方法可解释配体与靶点之间相互作用机制。在这项研究中，我们将利用网络药理学和分子对接来筛选Hup A和DR的共同靶点为HupA的DR治疗提供理论基础和临床见解。
发明内容
本发明的目的是提供一种石杉碱甲(Hup A)在制备防治糖尿病视网膜病变(DR)药物中的应用，具体研究了石杉碱甲作为神经保护药物在糖尿病视网膜病变中的减轻组织结构损伤及缓解凋亡作用。以STZ诱导的糖尿病大鼠模型，观察提前肌肉注射给与石杉碱甲对糖尿病视网膜病变的影响，明确了石杉碱甲连续给药15周后可明显减轻糖尿病诱导的视网膜损伤，即石杉碱甲对糖尿病视网膜病变有缓解作用，可保护视网膜神经元。
为了明确石杉碱甲可能作用于糖尿病的潜在靶点，本发明首先结合网络药理学和分子对接分析发现Hup A可作用于热休克分子伴侣蛋白27(HSP27)，并可能通过凋亡相关途径在DR模型中发挥神经保护作用。提供的石杉碱甲(Hup A)的结构如式I所示：
Figure BDA0004126755090000021
Hup A结构式。
上述石杉碱甲(Hup A)，分子式为C15H18N2O(Pubchem CID:449069)，化学名为：(5R,9R,11E)-5-氨基-11亚乙基-5,8,9,10-四氢-7-甲基-5,9-亚甲基环辛四烯并[b]吡啶-2(1H)-酮。
本发明采用的技术方案是：基于网络药理学和分子对接结果进一步进行生物实验，观察视网膜组织中HSP27及其磷酸化状态，凋亡相关蛋白的表达。生物实验进一步证实了石杉碱甲在减轻糖尿病视网膜病变中的用途，石杉碱甲通过靶向作用于HSP27，并通过凋亡相关途径在DR模型中发挥视网膜神经元保护作用。本发明为糖尿病视网膜病变提供了新的预防思路和治疗药物。
附图说明
图1：石杉碱甲对STZ造模糖尿病大鼠模型的影响及动物实验设计示意图。其中(A)动物实验设计和时间表示意图。(B)空腹血糖表明STZ诱导糖尿病大鼠造模成功(C)石杉碱甲对大鼠体重的影响。(D)石杉碱甲给药第50天和第100天炎症因子。SD大鼠、Sprague-Dawley大鼠；STZ、链脲佐菌素；IP，肌肉注射；IM，腹腔注射；Hup A、石杉碱甲；OCT，光学相干断层扫描；H&E染色：苏木精和伊红染色。PCR:聚合酶链反应。(与糖尿病组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001)。
图2：石杉碱甲对糖尿病大鼠视网膜的影响。图中(A)光学相干断层扫描(OCT)显示糖尿病组弥漫性视网膜高反射沉积物(红色箭头)。(B)H&E染色。有显著差异的神经结构和血管区域被放大，并进一步用红色箭头指出。GCL，神经节细胞层；IPL，内丛状层；INL，内核层；OPL，外丛状层；ONL，外核层；PRL、感光细胞层。
(C)视网膜中胶质纤维酸性蛋白(GFAP，绿色)的免疫染色。(D)定量PCR分析促血管生成因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGF-R)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和细胞间粘附分子1(ICAM-1)。(与糖尿病组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001)。
图3：石杉碱甲对糖尿病视网膜病变交叉靶点的筛选和网络图的构建。图中(A)石杉碱甲靶标的筛选。(B)糖尿病视网膜病变DR相关靶点的筛选。(C)Venn图显示了DR和石杉碱碱甲的共同靶点。(D)药物-疾病交叉靶点的PPI网络分析。
(E)通过CytoHubba建立的网络模型的拓扑分析。(F)基于以上11种算法的前十个最常见目标基因的频率。(G-I)GO在“生物过程”(BP)、“分子功能”(MF)和“细胞成分”(CC)中的富集分析。(J)关键目标的KEGG通路富集分析(p值<0.05)。每个图标的颜色和大小反映了共同目标的节点程度。关键目标和路径用红色圆圈和矩形标记。
图4：石杉碱甲与HSP27的Autodock分子对接。图中(A-B)石杉碱甲锚定在受体HSP27蛋白的活性口袋中。受体HSP27展现为疏水表面，配体石杉碱甲展示为彩色棍棒结构。(C-D)Hupzine A(棍棒形式)和HSP27(紫色卡通形式)之间的分子间氢键用黄色虚线表示。
图5：视网膜中HSP27和磷酸化HSP27的免疫印迹分析和定量。图中(A)SDS-PAGE上共上样了20μg蛋白质。(B)以GAPDH为内参进行标准化，对HSP27进行定量分析。(C)Hsp27结构和三个丝氨酸磷酸化位点的示意图。(与糖尿病组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001)。
图6：石杉碱甲对STZ诱导糖尿病大鼠视网膜MAPK和凋亡信号通路的影响。图中(A)p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38蛋白的免疫印迹分析。(B)通过GAPDH标准化对蛋白质进行定量。(C-D)凋亡相关蛋白的免疫印迹分析和定量。(与糖尿病组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作出详细说明。
试剂和仪器：
表1
Figure BDA0004126755090000041
动物：大鼠，180–200g，成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，购自上海实验动物中心(SLAC)，实验动物被饲养在无细菌的环境中，并能自由获得食物和水。室温保持在22±1℃，12小时光/12h暗周期循环。在本研究中，所有实验操作均符合中国实验室协会的规定和一般建议，并完全遵守浙江大学机构动物护理和使用委员会的规定。
实施例1石杉碱甲在预防和治疗糖尿病视网膜病变中的作用
1.建立大鼠的糖尿病模型
体重180–200g的成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠购自上海实验动物中心(SLAC)。实验动物被饲养在无细菌的环境中，并能自由获得食物和水。室温保持在22±1℃，12小时光/12小时暗周期循环。在本研究中，所有实验操作均符合中国实验室协会的规定和一般建议，并完全遵守浙江大学机构动物护理和使用委员会的规定。
适应性饲养一周后，将大鼠随机分为3组，即对照组、糖尿病组和糖尿病+Hup A组，每组大鼠数量为5只。糖尿病组和糖尿病+Hup A组的大鼠用高糖和高脂肪饮食(包括20％kcal蛋白质、60％kcal脂肪和20％kcal碳水化合物，#D12492；美国新泽西州新不伦瑞克研究饮食)喂养4周。对照组采用正常饮食。第5周，大鼠禁食16小时，然后腹腔注射单剂量链脲佐菌素(40mg/kg，STZ溶于0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 4.4)以诱导糖尿病模型。对照组大鼠接受等量柠檬酸钠缓冲液。注射后72小时尾静脉采血，使用血糖分析仪估计大鼠的空腹血糖。血糖水平高于16.7mmol/L的大鼠视为糖尿病造模成功，并被纳入进行下一步研究，血糖水平<16.7mmol/L的鼠则被排除本实验。
2.石杉碱甲干预实验
从本研究的第6周到第15周，模型+Hup A组给予大腿外侧肌肉注射0.3mg/kg的石杉碱甲治疗。对照组和HFD组每两天用生理盐水治疗一次。
在第15周，在评估各组体重后，处死大鼠，采集血液和眼球组织进行进一步研究。如生化指标检测：。根据定量实时PCR(qRT-PCR)方法提取建模第50天和第100天的血液样本以检测炎症水平。Trizol法提取总RNA，NanoDrop测量RNA浓度。通过热循环仪进行逆转录反应，并使用带有特异性引物的SYBR绿色母料混合物用cDNA模板进行三次实时PCR(AppliedBiosystemsTM，QuantStudio 5)。
表2研究中使用的引物及其序列列表
Figure BDA0004126755090000051
Figure BDA0004126755090000061
据报道，12周的建模时间将形成包括微血管渗漏、神经元细胞死亡增加、星形胶质细胞损伤和小胶质细胞活化等糖尿病视网膜病变。
实验结果记录：记录体重、造模后空腹血糖(FBG)和炎症，如图1所示。注射STZ后，与对照组(5.92±0.41mmol-1)相比，糖尿病组FGB(22.76±5.75mmol-1)和糖尿病+Hup A组(20.78±3.35mmol-1)水平显著升高)(图1B)。糖尿病组的体重(368.7±34.51g)低于对照组(403.14±7.48g)(图1C)。记录了炎性细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α和TGF-β)的水平，HupA在第50天(图1D)和第100天(图1E)显示出更好的抗炎活性。
3.石杉碱甲减轻了糖尿病大鼠的视网膜病变
建模结束前一天进行活体光学相干断层扫描(OCT)成像(Phoenix，Micron IV)。目的是观察DR是否合并囊样水肿或视网膜内高反射沉积物。处死后的眼球随机处理如下，部分FAS溶液固定后分别H&E和免疫荧光染色。将8μm冰冻切片在4℃下与一抗(抗胶质纤维酸性蛋白，GFAP)孵育过夜，以评估小胶质细胞和星形胶质细胞的活化程度。二抗是与GFAP(Invitrogen)偶联的Alexa Fluor 488。细胞核用DAPI染色。使用共聚焦显微镜系统(Zeiss，LSM900)采集图像。
移除晶状体和玻璃体后，在显微镜下仔细收集视网膜组织。视网膜在含有PMSF和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中通过超声仪进行冰上匀浆。在4℃下12000g离心后，用BCA试剂定量蛋白质浓度。将20μg蛋白质进行12％SDS-PAGE并转移到硝化纤维素膜上。用无蛋白快速阻断缓冲液(EpiZyme，PS108)阻断非特异性结合。与一级和二级抗体孵育后，通过ECL检测试剂盒进行曝光进一步，并通过图像分析仪记录数字图像。使用ImageJ软件来量化条带强度。
实验结果如图2所示，从不同角度评估建立的大鼠DR模型的视网膜病变。在糖尿病组中检测到高反射斑点(图2A)。如图2B所示，非糖尿病大鼠视网膜正常，细胞层排列整齐。糖尿病组发现明显的视网膜水肿和新生血管。在Hup A组中，炎症浸润减弱，神经层排列整齐(图2B)。糖尿病组胶质细胞标志物GFAP(绿色)的染色强度更大，Hup A治疗能够显著逆转GFAP的增加(图2C)。此外，对接受和未接受Hup A治疗的糖尿病大鼠的视网膜组织进行血管生成因子测定。糖尿病视网膜中的表达显著上调，并被Hup A显著抑制(图2D)。
4.网络药理筛选靶标
(1)石杉碱甲靶标的筛选：分别在ChEMBL、CTD、Genecard和STITCH数据库中筛选药物活性成分的目标信息，并使用UniProtKB数据库将目标蛋白和基因名称转换为标准目标名称。对四个数据库中的目标进行交叉，并删除重复的目标，以获得药物作用的相关目标。
(2)糖尿病视网膜病变相关靶点的筛选：在DisGeNET、DrugBank、GeneCards和治疗目标数据库(TTD)中搜索关键词“糖尿病视网膜病变”以收集相关目标。Uniprot数据库用于疾病靶标的基因符号转换。然后对四个数据库进行交叉并删除重复项以获得疾病靶标信息。
实验结果如图3所示，在去除重复后，我们从ChEMBL、CTD、Genecard和STITCH数据库中收集了Hup A中的90个活性靶标(图3A)。通过DisGeNET、DrugBank、GeneCards和TTD数据库检索了680个DR潜在目标(图3B)。使用Venn图分析Hup A和DR的共同靶标，共找到20个常见目标并用于进一步分析(图3C)。
(3)蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络和核心靶标分析：STRING为DR和石杉碱甲的共同目标建立了PPI网络(https://string-db.org/).进一步使用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化和分析。蛋白质类型设置为智人，置信度设置为中等(0.400)。使用Cytoscape软件的CytoHubba功能分析所建立网络模型的拓扑特性。关键节点的网络拓扑分析是基于11种算法(MCC、DMNC、MNC、Degree、EPC、BottleNecknt、EcCentricity、Closeness、Radiality、Stress、Clustering)计算前十个最常见目标基因的分布。
Hup A和DR相关目标与STRING平台相交，以获得候选目标。STRING分析结果由总共20个节点和61条边组成(图3D)。结果表明，HSPB1(热休克蛋白27HSP27)和凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase3)可能是DR的潜在靶点。基于11种算法的关键节点网络拓扑分析进一步证实了上述关键靶点。
(4)GO和KEGG富集分析：基因本体(GO)是一个国际标准化的基因功能分类系统，它提供了动态更新的标准词汇，以全面描述基因的特性：生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)。我们使用ChiPlot平台分析了DR靶点的GO基因功能，并获得了石杉碱甲在糖尿病视网膜病变中CC、MF和BP的相关过程。字符串数据库和ChiPlot平台用于分析石杉碱甲作用于DR的靶点的京都基因和基因组百科全书(KEGG)路径富集。前15条路径和筛选的关键靶点数据被导入Cytoscape软件，用于可视化和构建靶点路径网络图。
ChiPlot平台用于分析主动Hup A-DR的常见目标。可视化结果表明，潜在靶功能与生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)有关(图3G-3I)。显著丰富的BP-GO术语还包括凋亡信号通路的负调节和缺乏配体的外源性凋亡信号通路。主要的MFs是死亡域结合、外源蛋白结合和蛋白酶结合。CC为膜微区、膜牵伸和孔复合体。此外，KEGG途径富集结果(图3J)显示，15条途径富集，包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、凋亡通路等，表明HupA在治疗DR中的可能参与和潜在机制。
(5)石杉碱甲靶蛋白分子对接：根据上述来自计算机和生物实验的分析，关键蛋白质为HSP27。其3D结构从RCSB PDB网站下载(https://www.rcsb.org/).通过使用PyMOL构建基于二十四聚体(PDB ID:6DV5)的六聚体蛋白受体模型，进行了进一步的对接。石杉碱甲的3D结构从Pubchem下载(Pubchem CID:449069)。然后通过OpenBabel软件将HupA的sdf格式转换为pdb格式。石杉碱甲与关键蛋白的对接由Autodock(v.1.5.7)软件提供。分子对接结果通过PyMOL可视化，并展示氢键。潜在靶标和配体的详细信息列于表S1中。
实验结果如图4所示，筛选与受体HSP27具有高亲和力的配体Hup A以进行可视化(图4)。在HSP27的聚合物袋中观察到Hup A的多个结合位点，并且与HSP27的多个氨基酸位点形成稳定的氢键。Hup A与HSP27残基的详细结合模式和亲和力大小列于表S1中。
表3S1 HSP27与Hup A的分子对接信息
Figure BDA0004126755090000081
Figure BDA0004126755090000091
Figure BDA0004126755090000101
根据网络药理学和分子对接的结果，生物实验进一步验证了结果。Hup A可能通过HSP27和凋亡相关蛋白减轻DR。在糖尿病模型中，HSP27的蛋白表达水平及其磷酸化显著下调，并在给予Hup A后得到补偿。Hup A组视网膜中的S82-HSP27含量显著高于糖尿病组(图5)。结果表明，HSP27可能是DR药物治疗机制中的主要调节因子。
作为糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路的下游和磷酸化HSP27的上游，MAPKs信号通路也参与细胞凋亡。此外，Hup A也被报道通过激活MAPKs信号通路在病理条件下表现出神经保护作用。在此，我们研究了Hup A治疗是否会激活DR模型中的MAPKs通路。糖尿病显著降低ERK、JNK和p38磷酸化水平，并且在Hup A组中显著增加(图6A-B)。凋亡启动子Bax和凋亡抑制剂Bcl-2组内差异也与Hup A治疗DR的神经保护功能相一致(图6C-D)。

Claims (2)

1.石杉碱甲在制备防治糖尿病视网膜病变药物中的应用，石杉碱甲的结构如式I所示：
Figure FDA0004126755080000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，石杉碱甲通过靶向作用于热休克分子伴侣蛋白27，并通过凋亡相关途径在DR模型中发挥视网膜神经元保护作用。
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