CN116113821A - 光谱学设备 - Google Patents

Abstract

提供了一种用于测量来自光合对象的荧光信号的光谱学设备。所述光谱学设备包括：一个或多个光激发源(26、28)，所述一个或多个光激发源可操作以实行来自所述光合对象的所述荧光的时变激发；以及一个或多个荧光敏感检测通道(36、38、44、46)，所述一个或多个荧光敏感检测通道被配置成响应于由所述光激发源或每个光激发源(26、28)对来自所述光合对象的所述荧光的所述激发，以微秒至毫秒的时间分辨率同时记录作为时间的函数的所述荧光，并以10nm或更好的波长分辨率记录作为波长的函数的所述荧光。

Description

光谱学设备

技术领域

本发明涉及一种光谱学设备、一种使用光谱学设备测量来自光合对象(例如，光合藻类或细菌的完整细胞、完整植物叶片、植物的一个或多个部分或全部、冠层的一个或多个部分或全部)的叶绿素和/或其他色素荧光的方法、一种标识光合对象的状况的计算机实施的方法以及一种计算机程序。

背景技术

众所周知，测量来自光合对象的荧光信号，以研究变化的环境状况对光合生物的影响，并了解它们的生理状态、健康状态、其非生物/生物胁迫状态、以及用于执行与光合对象的表型和基因分型相关的研究。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种用于测量来自光合对象的荧光信号的光谱学设备，该光谱学设备包括：

一个或多个光激发源，该一个或多个光激发源可操作以实行来自光合对象的荧光的时变激发；以及

一个或多个荧光敏感检测通道，该一个或多个荧光敏感检测通道被配置成响应于由该光激发源或每个光激发源对来自光合对象的荧光的激发，以微秒至毫秒的时间分辨率同时记录作为时间的函数的荧光，并以10nm或更好的波长分辨率记录作为波长的函数的荧光。

荧光信号可以包含由光合对象发射的叶绿素荧光和/或由光合对象的另一色素发射的荧光。光合对象可以包含但不限于光合生物的部分或全部、植物的部分或全部、藻类的部分或全部、光合细菌的部分或全部、光合细胞的悬浮物、完整的叶片、冠层的部分或全部、或光合细胞组件(诸如珊瑚和光合垫(mat))等。

光合对象可以包含在或固定在光谱学设备内。替代性地，光合对象可以保持与光谱学设备分离，使得荧光信号可以由光谱学设备远程测量。本发明可以用于测量由多个光合对象同时发射的荧光信号。

可选地，该一个或多个光激发源可以可操作来以多个激发波长实行来自光合对象的荧光的时变激发。

可选地，一个或多个荧光敏感检测通道可以包含一个或多个荧光敏感检测单元或装置。在本发明的优选实施例中，所记录的荧光信息的波长分辨率是在整个荧光光谱上连续实现的，或者是使用三个或更多个不同的窄波长带实现的，或者它们的组合。

发明人已经发现，本发明以高分辨率同时获得时间分辨和波长分辨荧光信号的能力使得能够以提高从荧光信号中提取的信息的数量和质量的方式组合荧光的时间和光谱信息。特别地，本发明的配置使得能够可靠地检测光谱和动力学分辨的荧光变化，以快速表征各种光合对象的较宽范围的范状况，并且还使得能够分离和标识引起荧光变化的不同潜在生理过程的荧光贡献和影响。这是特别重要的，因为被光照射的光合对象发射包含各种荧光成分的荧光，这些荧光成分根据光合对象的生理状态、其健康状态、其非生物/生物胁迫状态等在其时间和光谱特性方面表现出明显的差异。这些荧光成分在光谱和时间方面的分离还允许与先进的数据分析方法进行结合，以实施各种敏感的植物表型和基因分型方法。

本发明不仅可以在实验室环境中使用，而且可以容易地被配置为现场就绪的光谱学设备，该光谱学设备足够紧凑和轻便，以便是便携式的和/或手持的和/或机载的，例如通过无人驾驶飞机或另一飞行器飞行，以便从某个距离(例如，光谱学设备和光合对象之间几厘米到10米的范围内的距离)开始执行测量。

应用于光合对象的、不同时使用高时间和波长分辨率的目前可获得的常规荧光测量技术不能提供与本发明相同数量和质量的信息。

本发明的配置使得能够测量来自光合对象的荧光信号的不同分量(优选地包含叶绿素荧光，但是替代性地或附加地包含一种或多种其他类型的荧光信号)，其非限制性实例如下阐述。

在第一实例中，所记录的荧光信息可以包含荧光诱导(fluorescence induction，FI)信息。这可以包含快速荧光诱导信息。

在第二实例中，所记录的荧光信息可以包含非光化学猝灭(non-photochemicalquenching，NPQ)信息。

所记录的荧光信息可以包含FI信息和/或NPQ信息。附加地或替代性地，所记录的荧光信息可以涉及或覆盖关于另一类型的荧光表征或测量模式的信息。

本发明的配置使得能够光谱和动力学分辨地分离和标识对FI和NPQ有贡献的成分和/或过程，从而提供关于光合对象及其内部过程和机制的更有意义和可靠的信息。

光激发源的非限制性实例和部件包含发光二极管、激光器(例如，脉冲激光器、调制激光器)、灯及其两种或多种的组合，从而允许一种或多种波长的激发光。

该荧光敏感检测通道或每个荧光敏感检测通道的非限制性实例和部件包含使用一个或多个光学透镜、一个或多个光纤、一个或多个光学反射器、光谱仪、采用电荷耦合器件(charge-coupled device，CCD)或光电二极管阵列作为检测单元的光谱仪、多元件阵列检测器、一个或多个光电二极管和一个或多个滤光器，以及前述实例和部件中的两个或更多个的组合。

来自光合对象的荧光的时变激发可以以不同的方式实行，以便于以高分辨率进行荧光的同时时间分辨和波长分辨测量。

在本发明的实施例中，时变激发可以是呈重复脉冲激发的形式。这可能涉及实行时变激发，以提供来自光合对象的荧光的连续脉冲激发之间的时间间隔。重复脉冲激发的单脉冲激发可以以任何大小的间隔重复任何次数。重复脉冲激发优选地具有0.1kHz或更高的激发频率，更优选地1kHz至100kHz的激发频率。重复脉冲激发可以是重复单脉冲激发或重复脉冲串脉冲激发。单脉冲激发可以具有微秒至毫秒的脉冲持续时间。重复单脉冲激发的总持续时间可以在1微秒至数百微秒的范围内(例如，至少1微秒且小于1毫秒)。用于重复脉冲串脉冲激发的总持续时间可以在几十微秒到几分钟的范围内、具有由持续从1微秒到小于1毫秒的可编程单个激发脉冲和持续0.1毫秒到高达几分钟的可编程间隔组成的脉冲串。重复脉冲串脉冲激发可以包含每脉冲串数十到数百个脉冲(例如，每脉冲串至少10个脉冲，以及每脉冲串低于1000个脉冲)。

在本发明中，时变激发可以包含单个翻转脉冲或单个翻转脉冲的脉冲串。翻转脉冲可以用来可靠地关闭光合反应中心。

在本发明的另外的实施例中，时变激发可以是呈周期性调制激发的形式。周期性调制的激发可以基于任何形状的周期性波形(正弦曲线、非正弦曲线或具有或不具有固定或可变背景的任何其他形状)。优选地，周期性调制的激发具有在1mHz到100kHz的范围内的激发频率。更优选地，周期性调制的激发具有在1mHz到几十kHz的范围内的激发频率(例如，至少1mHz且小于100kHz)。

在本发明中，时变激发可以包含重复脉冲激发和重复调频激发的组合。

荧光的同时时间分辨和波长分辨测量的时间和波长分辨率以及脉冲激发的选择、激发波长和脉冲激发序列的选择可以根据光合对象的特性、预期应用和期望信息而变化。光谱学设备可以被配置成包含控制器，该控制器被编程为在不同的脉冲激发序列之间快速切换，以便提供测量灵活性。

优选地，时间分辨率在0.5微秒到10毫秒的范围内。更优选地，时间分辨率在0.5微秒至几十微秒的范围内(例如，至少10微秒且小于100微秒)。甚至更优选地，时间分辨率在0.5微秒到10微秒的范围内。

优选地，波长分辨率在1nm到10nm的范围内。更优选地，波长分辨率在1nm到5nm的范围内。

优选地，本发明的光谱学设备的每个功能(例如脉冲激发或脉冲激发序列的应用和荧光信号的记录)完全通过计算机控制下的自由可编程自动操作来控制。每个测量周期的结果可以与所有过程参数一起自动存储在计算机存储介质上，用于以后的(自动或手动)分析。

在以高分辨率同时以时间分辨和波长分辨模式记录荧光信号之后可以是对所记录的荧光信息的自动/用户定义/用户控制的分析，优选地通过运行专用计算机程序的硬件，该专用计算机程序使得能够使用各种先进的数据分析方法对荧光信息进行分析和表征，在整个说明书中描述了这些方法的非限制性实例。根据应用，这种分析可以用于分离在其光谱和动力学性质中的各种荧光贡献和成分，以便了解光合反应序列的机制、光合对象的生理状态、光合对象的健康和胁迫状况，和/或用于将机器学习和人工智能方法应用于所记录的荧光信息，以便以自动方式表征光合对象，例如，在其健康和胁迫状况方面或根据表型或基因分型标准。

在本发明的另外的实施例中，电子电路可以包含处理器和包含计算机程序代码的存储器，存储器和计算机程序代码被配置成与处理器一起使得电子电路至少能够分析来自光合对象的所记录的荧光信息，以便标识或表征光合对象的状况。在这样的实施例中，存储器和计算机程序代码可以被配置成与处理器一起使得电子电路至少能够分析来自光合对象的所记录的荧光信息的经修改的导函数，以便标识或表征光合对象的状况。例如，存储器和计算机程序代码可以被配置成与处理器一起使得电子电路至少能够在对数时间尺度上分析来自光合对象的所记录的荧光信息的经修改的导函数，以便标识或表征光合对象的状况。

以这种方式配置电子电路提供了对所记录的荧光信息的自动分析以及对光合对象的状况的自动标识或表征，这有益地为用户提供了关于光合对象的有用信息，而不需要专业人员的干预来实行分析。这对于部署该设备用于在田间应用中使用特别有用。

可以直接对所记录的荧光信息实行分析，或者对所记录的荧光信息的经修改的函数(例如对数时间标度上的经修改的导函数，或者其他数学定义的导函数)实行分析。

可选地，存储器和计算机程序代码可以被配置成与处理器一起使得电子电路至少能够分析来自光合对象的所记录的荧光信息，以通过将所记录的荧光信息作为输入提供给机器学习算法或模型来标识或表征光合对象的状况，并基于机器学习算法或模型的输出来标识或表征光合对象的状况。在这样的实施例中，机器学习算法或模型可以是或可以包含但不限于长短期记忆(long short-term memory，LSTM)算法或神经网络。

以这种方式配置电子电路为光谱学设备提供了机器学习的选择性，以便于所记录的荧光信息的自动分析和光合对象的状况的自动标识或表征。机器学习算法或模型可以用于创建自学习系统，该自学习系统通知用户关于光合对象的状况，并提供所推荐的动作来补救光合对象的状况。自学系统可以被设计成通过使用预定义的查找表或通过由并入专家系统或数据库的不断增加的数据集进行训练来提供所推荐的动作，以自动改进和提高其预测和建议能力。这对于部署该设备用于在田间应用中使用特别有用，特别是对于测试早期胁迫状况或植物表型，以及特别地在不是这种信息的应用和分析方面的专家的操作者的情况下。

基于机器学习算法或模型的输出来标识或表征光合对象的状况的步骤可以包含分析与光合对象的胁迫状况相关联的胁迫现象。

基于机器学习算法或模型的输出来标识或表征光合对象的状况的步骤可以包含植物表型或基因分型。

可以实行计算机实施的方法来标识或表征农业区域或温室中的光合对象的状况，以便针对光合对象的最佳生长状况或其偏差来监控农业区域或温室中的光合对象。

可以实行计算机实施的方法来标识或表征生态系统中的光合对象的状况，以便监控生态系统并告知生态系统的生理健康或胁迫状况。

机器学习算法或模型可以应用于但不限于所记录的荧光信息，或者应用于所记录的荧光信息的数学定义的导函数，例如对数时间尺度上的经修正的导函数。

光合对象的状况可以包含但不限于以下中的至少一项：光合对象的生理状况；光合对象的健康状况；以及光合对象的胁迫状况(例如，非生物或生物胁迫状况)。在整个说明书中描述了光合对象的生理、健康和胁迫状况的非限制性实例。

监控作物和能源植物的健康和胁迫水平对于优化各种领域(诸如农业(用于生物燃料的能源作物和藻类生长)、林业(在最佳水和营养供应方面))的生长和质量状况、以及检测一般环境胁迫状况(例如全球变暖对诸如森林、珊瑚礁等生态系统的影响)至关重要。特别地，叶绿素荧光是对光合作用对象的各种类型的非生物胁迫(例如，热胁迫、水胁迫、污染胁迫、营养胁迫)和生物胁迫(例如，杂草、病原体)的非常敏感的早期报告者，这些胁迫不利地影响它们的最佳生长状况(诸如肥料使用和灌溉途径)和生理状态。

本发明以高分辨率同时获得荧光的时间分辨和波长分辨测量的能力使得能够从荧光信号中提取关于光合对象的生理、健康和胁迫状况的大量高质量信息。

光合对象的胁迫状况可以包含但不限于以下中的至少一项：光合对象的胁迫状况的类型(例如，干旱胁迫、温度胁迫、光胁迫、营养胁迫等)；以及光合对象的胁迫状况的水平。在整个说明书中描述了光合对象的胁迫状况的类型和水平的非限制性实例。

本发明准确标识和表征光合对象的不同胁迫因素的类型和程度的能力允许为光合对象创建最佳生长和质量状况。通过本发明在高分辨率和优化的测量状况下(例如，在所施加的脉冲序列等方面)同时获得荧光的时间分辨和波长分辨测量以便从荧光信号中提取大量高质量的信息的能力使这成为可能。

根据本发明的第二方面，提供了一种使用根据本发明的第一方面及其实施例中的任一项的光谱学设备测量来自光合对象的荧光信号的方法，该方法包括以下步骤：

通过该光激发源或每个光激发源实行来自光合对象的荧光的时变激发；以及

通过该荧光敏感检测通道或每个荧光敏感检测通道，响应于由该光激发源或每个光激发源对来自光合对象的荧光的激发，以微秒至毫秒的时间分辨率同时记录作为时间的函数的荧光，并以10nm或更好的波长分辨率记录作为波长的函数的荧光。

本发明的第一方面及其实施例的特征和优点在加以必要的修正后适用于本发明的第二方面及其实施例的特征和优点。

在本发明的方法中，所记录的荧光信息的波长分辨率可以在整个所记录的荧光光谱上连续实现。

在本发明的方法中，所记录的荧光信息的波长分辨率可以使用三个或更多个不同的窄波长带来实现。

在本发明的方法中，所记录的荧光信息的波长分辨率可以在整个所记录的荧光光谱上连续实现，或者替代性地结合使用三个或更多个不同的窄波长带来实现。

根据本发明的第三方面，提供了一种标识或表征光合对象的状况的计算机实施的方法，该方法包括以下步骤：

通过实行根据本发明的第二方面及其实施例中的任一项的方法来记录来自光合对象的荧光信息；以及

分析来自光合对象的所记录的荧光信息，以便标识或表征光合对象的状况。

根据本发明的第四方面，提供了一种标识或表征光合对象的状况的计算机实施的方法，该方法包括以下步骤：

通过实行根据本发明的第二方面及其实施例中的任一项的方法来收集一组数据，其中所收集的一组数据包含来自光合对象的所记录的荧光信息；

创建包含所收集的一组数据的训练集；

使用训练集训练机器学习算法或模型；以及

基于机器学习算法或模型的输出来标识或表征光合对象的状况。

本发明的第一和第二方面及其实施例的特征和优点在加以必要的修正后适用于本发明的第三和第四方面及其实施例的特征和优点。

在本发明的第四方面的实施例中，机器学习算法或模型可以是或可以包含长短期记忆(LSTM)算法、神经网络和/或一些其他机器学习或基于AI的算法或方法。

所记录的荧光信息的分析可以包含全局动力学和光谱分析，该全局动力学和光谱分析结合了由荧光测量导致的许多光谱和动力学数据集的分析和/或应用了光合对象的内部过程、调节机制、光响应和其他环境响应的特定模型的全局动力学和光谱目标分析。

在本发明的计算机实施的方法的实施例中，光合对象的状况可以包含以下中的至少一项：光合对象的生理状况；光合对象的健康状况；以及光合对象的胁迫状况。在这样的实施例中，光合对象的胁迫状况可以包含以下中的至少一个：光合对象的胁迫状况的类型；以及光合对象的胁迫状况的水平。

根据本发明的第五方面，提供了一种包括计算机代码的计算机程序，该计算机代码被配置成执行本发明的第三方面、本发明的第四方面及其实施例中的任何一项的方法。

本发明的第一、第二、第三和第四方面及其实施例的特征和优点在加以必要的修正后适用于本发明的第五方面及其实施例的特征和优点。

在本发明的实施例中，电子电路可以是、可以包含、可以与电子装置、便携式电子装置、便携式电信装置、微处理器、移动电话、个人数字助理、平板电脑、平板手机、台式计算机、膝上型计算机、服务器、云计算网络、智能手机、智能手表、智能眼镜以及用于上述中的一个或多个的模块中的一个或多个通信或者可以形成其一部分。

本发明的示例性应用包含或涉及但不限于：

·农业，诸如作物生长控制和监测；

·最佳温室培养；

·精准农业；

·能源生产，诸如通过植物或藻类进行的生物燃料生产；

·对生态系统(诸如森林、珊瑚礁、海洋、红树林等)的环境监控和保护；

·食品生产；

·森林管理；

·植物育种；

·植物表型；

·植物基因分型；

·基础植物生理学和光合研究。

本发明可以用于示例性的位置和场所，这些位置和场所可以包含或涉及但不限于：

·森林、丛林、树林等；

·田间；

·花园和温室；

·海洋生态系统，诸如珊瑚礁；

·水体，诸如池塘、湖泊、河流、海洋。

在现代农业和食品生产中，目标是提高生产率、改善质量和安全性，并最小化减环境有害的影响。这需要优化所有可获得的生长参数，并避免对产生食物和能量的植物和藻类的不利的胁迫现象。与最佳生长状况的任何偏离(诸如营养供应不足或供应过多、灌溉途径方面的变化和不利的温度影响)可能导致对这些光合生物的光合机制的胁迫，这进而导致食物和能量输出和质量方面的降低。

在环境方面，气候变化和全球变暖诱导关键生态系统(诸如寒带森林、热带森林、亚热带雨林、红树林和珊瑚礁)中光合生物的光合机制方面的严重胁迫。因此，非常期望监控和分析这些关键生态系统中的光合生物的状况，优选地在早期阶段——即在可见或其他损害或泪花发生之前，以便能够在为时已晚之前实行适当的补救动作。

当光合对象保持与光谱学设备分离时，光谱学设备被配置成具有相对于光合对象的临时位置(例如，保持临时位置持续几百毫秒)或永久位置。光谱学设备可以保持在光谱学设备和光合对象之间几厘米到10米的范围内的距离处。这在田间应用、植物表型分析和植物育种中特别有用。替代性地，可以通过使用无人驾驶飞机或另一飞行机器在光合对象上方、包含光合对象的农田上方或包含光合对象的生态系统(例如，森林、珊瑚礁或另一生态系统)上方飞行光谱学设备来实现类似的测量状况。

应当理解的是，在本专利说明书中使用术语“第一”和“第二”等仅仅是为了帮助在相似的特征之间进行区分，而不是旨在指示一个特征相对于另一特征的相对重要性，除非另有说明。

在本申请的范围内，明确地意图是，在前述段落和权利要求和/或以下描述和附图中阐述的各个方面、实施例、实例和替代方案、并且特别是其各个特征可独立地或以任何组合来采用。也就是说，所有实施例和任何实施例的所有特征可以任何方式和/或组合来组合，除非此类特征是不兼容的。申请人保留对改变任何最初申请的权利要求或相应地申请任何新权利要求的权利，包含能够修正任何最初申请的附属权利要求和/或并入任何其他权利要求(虽然最初不以所述方式主张)的任何特征的权利。

附图说明

现在将参考附图，通过非限制性实例来描述本发明的优选实施例，在附图中：

图1示出了根据本发明实施例的光谱学设备；

图2示出了用于来自光合对象的荧光信号的同时时间分辨和波长分辨测量的重复脉冲串脉冲激发模式；以及

图3至图10示出了从来自植物的荧光的同时时间分辨和波长分辨测量获得的数据。

附图不一定按比例绘制，并且为了清楚和简明起见，附图的某些特征和某些视图可以按比例或以示意形式放大示出。

具体实施方式

参考作为植物健康和胁迫监控系统(特别地用于早期生物和非生物胁迫检测和分析以及用于优化植物生长状况)的本发明的配置描述了本发明的以下实施例。应当理解的是，本发明的以下实施例在加以必要的修正后适用于与光合对象和由光合对象发射的其他类型的荧光相关的其他应用，其非限制性实例在整个说明书中进行了描述。

叶绿素荧光是许多不同种类的植物胁迫的敏感指标，因为在所有绿色植物中光合机构以敏感的方式响应于各种环境参数及其变化(诸如光、水、营养、温度等)。叶绿素荧光测量允许提取关于植物的状态的信息，并且独立于土壤干扰、叶片面积或生物量状态受到水分胁迫、氮、温度、叶绿素和类黄酮、pH水平、光合状态和其他生理参数影响。在由胁迫造成的损害变得可见或可检测之前，叶绿素荧光往往会变化。因此，叶绿素荧光可以作为胁迫的早期警告来检测植物的不利状况。

发明人已经发现，叶绿素荧光在作为同时记录的时间分辨和波长分辨信息的组合来测量并且以根据本发明的上文和下文描述的模式来测量时，特别适合于提供胁迫的早期警告和/或检测植物和其他光合组织的任何其他不利状况。

图1中示出了根据本发明的实施例的光谱学设备。光谱学设备包括外壳20、电子电路22、样品保持器24、光激发源和荧光敏感检测通道。外壳20被配置成阻挡外部光进入其内部，以便创建黑暗的外壳20，优选地不透光的外壳。

在使用中，样品保持器24被容纳在黑暗的外壳20(优选地不透光的外壳)内并保持光合对象。在所示的实施例中，光合对象是植物叶片。在其他实施例中可以使用其他光合对象。

光激发源包含由各自的电源30供电的至少一对发光二极管(LED)26、28。可以使用两个以上的LED。LED中的第一LED是具有620或650nm的中心波长的红色LED 26，而LED中的第二LED是具有420或475nm的中心波长的蓝色LED 28。LED 26、28中的每一个可以提供以下中的任一项：低强度光化背景照明或高强度(≥50,000微爱因斯坦/秒/平方米)单脉冲或脉冲串脉冲、或重复调制激发、或其组合。因此，LED 26、28中的每一个可以用作光化源、高功率激发源或其组合。具有其他中心波长的单色LED也是可能的。两个LED 26、28是完全可编程的，以提供连续的背景光激发或重复的脉冲光激发，其可以呈单脉冲激发或脉冲串脉冲激发的形式。这通过控制每个电源30向相对应的LED 26、28提供连续功率(用于光化背景照明)或脉冲功率来实现。重复脉冲激发优选地具有微秒脉冲持续时间(优选地10微秒至1毫秒)和0.1kHz至100kHz的激发频率(取决于针对特定脉冲持续时间可实现的内容，从而允许0.1至10毫秒长度的合适间隔)。应当理解的是，LED 26、28中的每一个的波长或颜色的选择可以根据特定光合对象的光激发特性的所需性质而变化。

设想的是在本发明的其他实施例中，可以使用周期性调制的光激发来代替重复的脉冲光激发(单脉冲或脉冲串脉冲)。周期性调制的光激发优选地基于正弦或任何非正弦的不规则但周期性重复的波形——具有或没有背景偏置电平——具有在1mHz到100kHz的范围内的激发频率。

还可以设想的是，在本发明的其他实施例中，可以使用不同类型的光激发源和/或可以使用不同数量的发光二极管(例如，一个、三个或更多)。

在使用中，LED 26、28被定位在黑暗的外壳20(优选地不透光的外壳)内，以将它们发射的光引导朝向样品保持器24上的光合样品或对象(例如，叶片)。光学透镜32定位在LED26、28的前面，以将由LED 26、28发射的光聚焦到光合样品(例如，叶片)上。短通滤波器34定位在光学透镜32和样品保持器24之间，以去除长波长发射。

荧光敏感检测通道包含光纤36和光谱仪38。光谱仪38被配置成接收来自光纤26的信号。

在使用中，光纤36和相关联的输入光学器件被定位在黑暗的外壳20(优选地不透光的黑暗的外壳)内部，以接收来自光合样品或对象(例如，叶片)的荧光发射。光学透镜40被定位在光纤36和样品保持器24之间，以将荧光发射聚焦到光纤36上。长通滤光器42被定位在光纤36和光学透镜40之间，以过滤所散射的激发光。

电子电路22包含处理器和包含计算机程序代码的存储器。存储器和计算机程序代码被配置成与处理器一起使得电子电路22能够执行各种处理功能。在所示的实施例中，电子电路22形成连接到光谱仪38的专用微处理器的一部分，使得电子电路22可以用于记录作为时间的函数的所接收到的荧光光谱，并分析和显示所接收到的荧光光谱。微处理器依次由用于输入/输出操作和显示的台式或笔记本电脑控制。在其他实施例中，电子电路可以是、可以包含电子装置、便携式电子装置、便携式电信装置、移动电话、个人数字助理、平板电脑、平板手机、膝上型计算机、服务器、云计算网络、智能手机、智能手表、智能眼镜以及用于上述一个或多个的模块中的一个或多个，或可以形成其一部分。应当理解的是，对存储器或处理器的引用可以涵括多个存储器或处理器。

参考图2至图10，本发明的光谱学设备的用于测量来自叶片的各种荧光信号的用途描述如下。

以下的同时时间分辨和波长分辨测量参照暗适应样品进行描述。在本发明的其他实施例中，下面的同时时间分辨和波长分辨测量可以在加以必要的修正后适用于光适应样品。在暗适应在技术上是困难的或不可能的情况下，对光适应样品的测量特别相关，例如从某个距离进行测量。

最初，叶片被留在黑暗的外壳20中持续足以使得叶片能够进入所期望的暗适应或放松状态的一段时间。同时，由光谱仪38记录零背景信号，用于使所有信号参照零。

然后，可以控制LED 26、28中的一个来提供所期望的强度的连续弱光化性光(其替代性地可以具有零强度)，以引发光合过程，该光合过程可以是但不限于FI和NPQ。控制相同或另一LED 26、28，以在0.1kHz至100kHz的激发频率下提供重复的脉冲激发(单脉冲或脉冲串脉冲)，以引起从叶片发射荧光。重复脉冲激发的每个脉冲具有10微秒到数百微秒量级的脉冲持续时间。光纤36捕获来自叶片的荧光发射。以这样的方式，在高强度LED 26、28的每个脉冲上，由光谱仪38在非常短的时间内(通常为10微秒到几十微秒的间隔内)记录完整的荧光光谱。重复脉冲激发的脉冲的触发信号可以由光谱仪38提供，使得脉冲生成可以与荧光检测同步，或者可以由另一控制器供应。光谱仪38的测量时间窗被定位在单个激发脉冲的开始(对于Fo'测量)处或结束(对于Fm')处，或者激发脉冲之后的任何其他时间延迟处。

以这样的方式，本发明的光谱学设备能够以高分辨率(通常以10微秒的间隔)获得叶片的荧光的同时时间分辨和波长分辨测量。

参考光电二极管45可以用于以高时间分辨率(通常0.3至0.5微秒分辨率)监控来自LED 26、28的所散射的高激发光，以便允许针测量光脉冲在脉冲长度上和连续脉冲之间的小强度变化来校正所测量的荧光信号。

可选地，或者在相同设备中并行地，取决于期望的应用，荧光敏感检测通道可以包含配备有不同的窄带滤光器的多个光电二极管44(优选地三个或更多个)。每个光电二极管44可以连接到提供亚微秒分辨率(通常0.3至0.5微秒)的几个相应的测量通道46，使得每个光电二极管44被配置成在来自叶片的总荧光发射的窄波长窗口的荧光的脉冲激发时产生时间信号。

图2示出了说明重复脉冲串脉冲激发模式的示意图。由LED 26、28中的一个以重复脉冲串脉冲激发模式向光合对象施加处于高强度(≥50,000微爱因斯坦/秒/平方米)的N个脉冲(通常每个脉冲串脉冲高达几百个脉冲)。每个单独的脉冲具有10到100微秒的持续时间，其中脉冲串脉冲由0.1至10毫秒的间隔分离。在每个脉冲串的高强度激发脉冲的数量N等于1的特定情况下，重复脉冲激发默认为单脉冲激发模式。在脉冲串脉冲的每个单独脉冲期间，由光谱仪38和/或特定波长光电二极管44记录的荧光信号以时间分辨和波长分辨的方式以0.5至10微秒的范围内的时间分辨率同时测量。根据测量的目的(包含但不限于FI、NPQ或其他测量模式)，可以使用任何间隔和任何总数的脉冲串来自动重复这种脉冲串脉冲。整个脉冲序列、测量程序和数据记录可以在参照图1所述的可编程专用微处理器的控制下进行。如果需要，可以在专用微处理器的控制下，由LED 26、28或由作为光化源的分离的LED施加弱光化背景辐射。

图3A示出了使用低强度(例如，600微爱因斯坦/秒/平方米)光化背景照明来自植物叶片的典型3D时间分辨和波长分辨的叶绿素荧光发射光谱。图3B示出了由全球动力学分析产生的标准化时间分辨衰变相关联的叶绿素荧光发射光谱。图3C示出了由光化和LED脉冲激发诱导的各种中间荧光物质的标准化衰变相关联的由全局动力学/光谱目标模型分析产生的光谱。图3D示出了这些中间发展和衰减的发荧光物质的、由对针对已经经历温和热处理(温和热胁迫)的植物情况的全局动力学/光谱目标模型分析产生的相对应的时间相关浓度。图3E示出了与图3D相同的数据，除了图3E中的数据对应于没有施加任何胁迫的正常生长的对照植物。FI和NPQ信息两者可以从这些数据导出。从图3A到3C可以看出，由本发明的光谱学设备对叶片的叶绿素荧光的同时时间分辨和波长分辨测量的高分辨率使得能够光谱和动力学分辨地分离和标识对FI、NPQ和由光化光在光合对象中引发的其他过程有贡献的成分。从图3D和图3E可以看出，来自热胁迫叶和对照植物的中间发荧光物质的动力学方面存在显著差异，并且从图3C可以看出，这些物质之间存在显著的光谱差异。这些差异可以被进一步定性和定量地分析以标识，尤其是但不限于，胁迫的类型和水平，以便确定光合对象的胁迫状况、一般生理状态、其一般健康状态，或者根据表型和/或基因分型标准执行光合对象的表征。

图4示出了对于从脉冲串脉冲获取的单个高强度脉冲(100微秒的脉冲持续时间)，对于三个所选择的波长范围(685nm、700nm和730nm，每个波长范围具有5至10nm的光谱宽度)来自植物叶片的示例性时间分辨测量荧光信号。

图5示出了对于选择从相同脉冲串脉冲中获取的高强度脉冲(130微秒的脉冲持续时间)，对于一个所选择的波长范围(685nm，具有10nm的光谱宽度)，来自植物叶片的示例性时间分辨测量荧光信号。在每个脉冲期间，以0.5至10微秒的时间分辨率测量时间分辨和波长分辨荧光信号。

图6示出了由脉冲串脉冲产生的对于Fo'函数(空心符号，表示在每个单脉冲开始时的荧光信号)和Fm'函数(实心符号，表示在每个单脉冲结束时的荧光信号)的半对数时间轴上的测量FI信号。样品是轻度干旱胁迫烟叶。信号被双标准化为Fm'信号，并且为了清楚起见，示出了整个所记录的光谱中的一个特定波长范围(685nm，具有10nm的光谱宽度)。相同的符号类型用于在对数时间空间中显示FI信号的相对应的导函数。然后通过机器学习算法以全局方式(所组合的三个或更多个/所有波长范围)对这些信号进行分类。

图7示出了来自轻度缺氮(营养胁迫)玉米植物的FI信号。具有10nm的光谱宽度的685nm波长范围被示出在对数时间轴上。

图8比较了不同胁迫(“营养胁迫”指轻度氮缺乏；“干旱胁迫”是指对植物的早期轻度干旱胁迫；“正常生长”意味着没有对植物的胁迫)对玉米叶片(顶行)的FI函数及其对数导数(底行)的典型影响。这些信号随后经受通过机器学习(AI)算法进行的分类。所示的荧光信号针对具有10nm的光谱宽度的700nm的波长范围。

图9示出了对于四个不同波长范围(从上到下：686nm、700nm、720nm和738nm，各自具有5至10nm的光谱宽度，选自从650nm延伸至850nm的整个光谱范围)对正常生长的大麦植物的叶片的光谱和时间分辨的NPQ实验。图9中示出了诱导阶段(600微爱因斯坦/秒/每平方米)、放松阶段和第二诱导阶段的光谱相关效应。

图10示出了在半对数时间轴上显示的对于Fm'函数(实心符号)和Fo'函数(空心符号)对于三个所选择的波长范围(685nm、700nm和730nm)的对大麦叶片的标准化FI测量。相同的符号类型用于在对数时间空间中显示FI信号的相对应的导函数。

发明人还发现，在对数时间尺度上分析FI(图6、图7、图8和图10)和NPQ(图9)的导数导致在提供使得能够准确辨别叶片的状况的附加细节方面的显著改进。由于函数的导数测量了函数的输出相对于函数的输入方面变化的灵敏度，该分析技术允许精确跟踪描述了对不同胁迫不同地相应的叶片的光合状态的FI和NPQ方面的变化。已经发现，应用这种类型的数学推导的函数(例如，基于原始测量信号的导函数、对数导函数或其他数学函数)对于机器学习算法(AI)在胁迫现象的分类和区分中的应用以及它们在表型和基因分型应用的应用特别有用。

所记录的FI和NPQ信息以及它们的对数时间标度导数或基础原始函数的其他导出的数学函数可以用于创建训练集。然后，该训练集用于随着时间训练机器学习算法或模型。可以基于机器学习算法或模型的输出来标识和分类叶片的状况。本发明人已经将长短期记忆(LSTM)算法标识为在基于叶绿素荧光测量标识不同类型和水平的胁迫方面特别可靠。具体而言，使用所记录的FI和NPQ信息及其对数时间标度导数与LSTM机器学习算法相结合在具有少量数据的情况下产生大约70％的分类准确度。已经发现使用更大的训练集分类精度方面的进一步提高(90％及以上的精度)是可能的。这部分是由于LSTM机器学习算法在识别时间序列数据(诸如FI和NPQ数据)中的模式方面的鲁棒性。这种方法也可用于根据表型和基因分型标准表征光合对象。

本发明的光谱学设备至少提供以下益处：

i)本发明的光谱分辨测量提供了用于分析和表征胁迫现象的更广泛的数据库，其允许提取关于植物或光合对象的健康和胁迫状况的更可靠和精确的信息。这，尤其但不限于此与生态系统(诸如森林、珊瑚礁等)的有效自动监控及其对气候变化和其他环境变化和因素的响应相关。

ii)本发明的光谱分辨测量提供了更广泛的数据库，用于分析和表征由光合作用对象内的所有外部因素触发的内部过程，不限于但特别是光诱导的光合过程，因此使得能够更详细和更准确地表征和分离光合反应、光合调节机制和光合对象的响应。这对于基础光合和植物生理学研究以及对于旨在更高作物产量、更高气候变化抗性的植物育种、选择更有效的光合驱动的能源生产植物或能源生产微生物以将太阳能转化为生物燃料两者具有高度相关性。

iii)对于集中于植物监控、生长优化和早期胁迫检测的田间应用，本发明提供了现场就绪且用户友好的仪器，其能够实行必要的荧光测量和分析。

iv)在本发明中引入机器学习模型来执行自动分析并提供专家建议使得非专业用户更容易获得可靠的信息并针对胁迫状况采取适当的对策。

v)可以由最终用户训练机器学习模型来改进和优化关于植物的胁迫状况的信息，从而专门为某些植物和应用定制光谱学设备。

应当理解的是，上述数值仅仅是为了帮助说明本发明的工作，并且可以根据光谱学设备和光合对象的要求而变化。

在本说明书中列出或讨论明显在先公开的文件或明显在先公开的信息不一定被认为是承认该文件或信息是现有技术的一部分或者是公知常识。

除非上下文另有说明，否则对于本发明的给定方面、特征或参数的偏好和选项应该被视为已经结合对于本发明的所有其他方面、特征和参数的任何和所有偏好和选项进行了公开。

Claims (34)

1.一种用于测量来自光合对象的荧光信号的光谱学设备，所述光谱学设备包括：

一个或多个光激发源，所述一个或多个光激发源能够操作以实行来自所述光合对象的所述荧光的时变激发；以及

一个或多个荧光敏感检测通道，所述一个或多个荧光敏感检测通道被配置成响应于由所述光激发源或每个光激发源对来自所述光合对象的所述荧光的所述激发，以微秒至毫秒的时间分辨率同时记录作为时间的函数的所述荧光，并以10nm或更好的波长分辨率记录作为波长的函数的所述荧光。

2.根据权利要求1所述的光谱学设备，其中所述一个或多个荧光敏感检测通道包含一个或多个荧光敏感检测单元或装置。

3.根据前述权利要求中任一项所述的光谱学设备，其中所记录的荧光信息的所述波长分辨率是在整个所记录的荧光光谱上连续实现的。

4.根据前述权利要求中任一项所述的光谱学设备，其中所记录的荧光信息的所述波长分辨率是使用三个或更多个不同的窄波长带实现的。

5.根据前述权利要求中任一项所述的光谱学设备，其中所记录的荧光信息包含荧光诱导信息。

6.根据前述权利要求中任一项所述的光谱学设备，其中所记录的荧光信息包含非光化学猝灭信息。

7.根据前述权利要求中任一项所述的光谱学设备，其中所述时变激发呈重复脉冲激发的形式。

8.根据权利要求7所述的光谱学设备，其中所述重复脉冲激发具有0.1kHz或更高的激发频率。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的光谱学设备，其中所述重复脉冲激发具有微秒至毫秒的脉冲持续时间。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的光谱学设备，其中所述重复脉冲激发呈重复单脉冲激发或重复脉冲串脉冲激发的形式。

11.根据权利要求1至6中任一项所述的光谱学设备，其中所述时变激发呈周期性调制激发的形式。

12.根据权利要求11所述的光谱学设备，其中所述周期性调制激发具有在1mHz至100kHz的范围内的激发频率。

13.根据前述权利要求中任一项所述的光谱学设备，其中所述时间分辨率在0.5微秒至10毫秒的范围内。

14.根据前述权利要求中任一项所述的光谱学设备，其中所述波长分辨率在1nm至10nm的范围内。

15.根据前述权利要求中任一项所述的光谱学设备，其中电子电路包含处理器和包含计算机程序代码的存储器，所述存储器和计算机程序代码被配置成与所述处理器一起使得所述电子电路至少能够分析来自所述光合对象的所记录的荧光信息，以便标识或表征所述光合对象的状况。

16.根据权利要求15所述的光谱学设备，其中所述存储器和计算机程序代码被配置成与所述处理器一起使得所述电子电路至少能够分析来自所述光合对象的所记录的荧光信息的经修改的导函数，以便标识或表征所述光合对象的状况。

17.根据权利要求16所述的光谱学设备，其中所述存储器和计算机程序代码被配置成与所述处理器一起使得所述电子电路至少能够在对数时间尺度上分析来自所述光合对象的所记录的荧光信息的经修改的导函数，以便标识或表征所述光合对象的状况。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的光谱学设备，其中所述存储器和计算机程序代码被配置成与所述处理器一起使得所述电子电路至少能够分析来自所述光合对象的所记录的荧光信息，以通过将所记录的荧光信息作为输入提供给机器学习算法或模型来标识或表征所述光合对象的所述状况，并基于所述机器学习算法或模型的输出来标识或表征所述光合对象的所述状况。

19.根据权利要求18所述的光谱学设备，其中所述机器学习算法或模型包含长短期记忆算法或神经网络。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的光谱学设备，其中所述光合对象的所述状况包含以下中的至少一项：所述光合对象的生理状况；所述光合对象的健康状况；以及所述光合对象的胁迫状况。

21.根据权利要求20所述的光谱学设备，其中所述光合对象的所述胁迫状况包含以下中的至少一项：所述光合对象的所述胁迫状况的类型；

以及所述光合对象的所述胁迫状况的水平。

22.一种使用根据前述权利要求中任一项所述的光谱学设备测量来自光合对象的荧光信号的方法，所述方法包括以下步骤：

通过所述光激发源或每个光激发源实行来自所述光合对象的所述荧光的时变激发；以及

通过所述荧光敏感检测通道或每个荧光敏感检测通道，响应于由所述光激发源或每个光激发源对来自所述光合对象的所述荧光的所述激发，以微秒至毫秒的时间分辨率同时记录作为时间的函数的所述荧光，并以10nm或更好的波长分辨率记录作为波长的函数的所述荧光。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所记录的荧光信息的所述波长分辨率是在整个所记录的荧光光谱上连续实现的。

24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所记录的荧光信息的所述波长分辨率是使用三个或更多个不同的窄波长带实现的。

25.一种标识或表征光合对象的状况的计算机实施的方法，所述方法包括以下步骤：

通过实行根据权利要求22至24中任一项所述的方法来记录来自所述光合对象的荧光信息；以及

分析来自所述光合对象的所记录的荧光信息，以便标识或表征所述光合对象的状况。

26.一种标识或表征光合对象的状况的计算机实施的方法，所述方法包括以下步骤：

通过实行根据权利要求22至24中任一项所述的方法来收集一组数据，其中所收集的一组数据包含来自所述光合对象的所记录的荧光信息；

创建包含所收集的一组数据的训练集；

使用所述训练集训练机器学习算法或模型；以及

基于所述机器学习算法或模型的输出来标识或表征所述光合对象的所述状况。

27.根据权利要求26所述的计算机实施的方法，其中所述机器学习算法或模型包含长短期记忆算法或神经网络。

28.根据权利要求26或权利要求27所述的计算机实施的方法，其中基于所述机器学习算法或模型的输出来标识或表征所述光合对象的所述状况的步骤包含分析与所述光合对象的胁迫状况相关联的胁迫现象。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的计算机实施的方法，其中基于所述机器学习算法或模型的输出来标识或表征所述光合对象的所述状况的步骤包含植物表型或基因分型。

30.根据权利要求25至29中任一项所述的计算机实施的方法，其中实行所述计算机实施的方法以标识或表征农业区域或温室中的所述光合对象的所述状况，以便监控所述农业区域或温室中的所述光合对象。

31.根据权利要求25至30中任一项所述的计算机实施的方法，其中实行所述计算机实施的方法以标识或表征生态系统中的所述光合对象的所述状况，以便监控所述生态系统。

32.根据权利要求25至31中任一项所述的计算机实施的方法，其中所述光合对象的所述状况包含以下中的至少一项：所述光合对象的生理状况；所述光合对象的健康状况；以及所述光合对象的胁迫状况。

33.根据权利要求32所述的计算机实施的方法，其中所述光合对象的所述胁迫状况包含所述光合对象的所述胁迫状况的类型和/或所述光合对象的所述胁迫状况的水平。

34.一种计算机程序，其包括被配置成执行根据权利要求25至33中任一项所述的方法的计算机代码。

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