CN116099012A - 一种白介素2突变体放射性药物的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种白介素2突变体放射性药物的制备方法及应用，具体涉及属于分子生物学药物领域；所述放射性药物包含所述白介素2突变体（sum IL‑2）、放射性核素和螯合剂，放射性核素为通过GGGGK‑HYNIC标记，在Sortase A酶的作用下连接到sIL‑2的LPETG标签上；本发明是基于白介素2突变体所制备的放射性药物，通过蛋白序列突变，形成的突变体sIL‑2的毒性低于白介素2（IL‑2），受体亲和力高于IL‑2，这更利于T细胞体内显像，使用Sortase A酶和蛋白结构碳端残留半胱氨酸介导的放射性核素定点标记，制备的放射性药物性质均一。此外，以HYNIC作为双功能螯合剂，同时使用TPPTS和tricine作为协同配体从而使“99mTc‑HYNIC核”具有更加良好的体内外稳定性。

Description

一种白介素2突变体放射性药物的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种白介素2突变体放射性药物的制备方法及应用，具体涉及属于分子生物学药物领域。
背景技术
过去十年，随着多种免疫检查点靶向抗体和T细胞介导的细胞免疫疗法在临床批准上市，肿瘤免疫疗法得到迅速发展。肿瘤免疫疗法在临床实践中显示出良好的应用前景，以至彻底改变了某些癌症的临床治疗方法，例如黑色素瘤，非小细胞肺癌，晚期淋巴瘤和液体B细胞肿瘤等。尽管免疫疗法得到快速发展，但仍有大部分患者免疫治疗无效（如免疫检验点靶向抗体治疗20-30%的病人有效），还有许多病人产生了副作用，如接受CTLA-4抗体Yervoy治疗的患者60%会发生免疫相关不良事件，其中10-30%属于严重（3-4级）。这些副作用主要是由于T细胞过度活化造成的。肿瘤内大量的T淋巴细胞的浸润是治疗良好预后的表现，而体内正常非免疫的器官或组织中T淋巴细胞的聚集就会因免疫过度产生副反应。因此监控T细胞在肿瘤微环境和体内正常器官的动态分布、可视化免疫反应，在治疗过程中更早的对患者进行分选和及时停止无效免疫疗法，从而尽早终止其导致的严重副反应和无意义的经济消耗显得尤为重要。
目前，监测肿瘤免疫应答通常是测量血液样本中循环淋巴细胞，细胞因子和免疫球蛋白的水平，或通过肿瘤组织，脾脏和淋巴结的活检进行评估。但这些方法都是侵入性的，而且不能提供肿瘤微环境和肿瘤转移等方面信息，对有关异质性肿瘤中T细胞的动态和空间信息也无法提供，从而导致获取的数据可靠性差，无法正确地反映肿瘤免疫疗法的结果。此外，在实体瘤治疗中使用的形态学评估方法往往是只看影像学上的肿瘤体积，在评估肿瘤免疫治疗早期反应时得到的结果是不可靠的，因为早期免疫治疗敏感病人的肿瘤大小可能是不变的甚至会变大。因此，开发靶向T细胞的成像探针，无创地监测治疗期间的全身和肿瘤微环境内免疫反应的变化具有重要的临床意义，其可以指导免疫治疗、提高治疗的效率以及优化治疗策略。
白介素2（IL-2）是一类功能性蛋白，在免疫系统中发挥刺激和调节功能，是免疫稳态的关键。IL-2通过与白介素2受体（IL-2R）结合而介导其作用。IL-2R有IL-2Rα，IL-2Rβ和IL-2Rγ组成的三聚体形式以及IL-2Rβ和IL-2Rγ组成的二聚体形式。两种形式的受体都能够传导IL-2信号。但是，IL-2与三聚体αβγ IL-2R的亲和力大约是二聚体βγ IL-2R的10-100倍，这表明IL-2Rα只是增强三聚体αβγ IL-2R与IL-2的结合，但对于信号转导并不重要。这两种受体在不同T细胞亚群上的分布也不一样，例如Treg细胞上高表达三聚体受体，Memory CD8+ T细胞和NK细胞多表达二聚体受体。此外，活化的CD4+和CD8+ T淋巴细胞表面也高表达IL-2R。因此，使用放射性核素标记IL-2构建分子探针，对T细胞表面的IL-2R进行成像，可以无创地监测治疗期间的全身和肿瘤微环境内T细胞的变化，进而对肿瘤的免疫治疗进行指导。放射性核素氟-19（18F）标记的白介素2（18F-FB-IL-2）被设计成PET成像探针用于T细胞成像。18F-FB-IL-2可以准确定量淋巴细胞浸润程度。在放疗或放疗联合免疫治疗后肺癌小鼠模型中，18F-FB-IL-2的摄取比未接受治疗的肺癌小鼠分别高出10倍和27倍，这表明该探针可作为显像剂监测免疫治疗后肿瘤微环境内的活性T淋巴细胞。18F-FB-IL-2目前正在进行临床一期实验。
IL-2在临床上也被用于黑色素瘤和转移性肾细胞癌的治疗，但是常常引起严重的副反应，主要是血管渗漏综合征导致的肺水肿，原因是肺内皮细胞表达一定水平的三聚体αβγ IL-2R。所以目前IL-2研究的重点之一是降低IL-2的毒性。IL-2突变体IL-2v是其中的一种。通过突变，IL-2v不再和IL-2Rα的结合，因此降低了毒性，而且相比于IL-2延长了血液半衰期。所以IL-2v可能更适合作为T细胞的成像探针配体。但是IL-2v因为突变降低了和三聚体受体αβγ IL-2R的亲和力，这也导致其和活化T细胞（主要表达三聚体αβγ IL-2R）的结合减弱，这一点可能不利于显像。super IL-2是通过噬菌体筛选的具有高受体亲和力的IL-2突变体，其通过突变，增强了与IL-2Rβ的结合力。在super IL-2基础上引入F42A的突变（super IL-2-F42A，sIL-2），可以进一步降低其与IL-2Rα的作用，从而降低毒性。但是sIL-2对三聚体受体，以及二聚体受体的亲和力均高于IL-2v。因此，相比于IL-2v，sIL-2可能更适合作为T细胞的显像配体来开发分子探针。使用放射性核素标记sIL-2构建的分子显像探针，会具有更高的靶点/背景比，更低的毒性，更适合用于体内T细胞成像。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白介素2突变体放射性药物。1998年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了IL-2，一种典型的细胞因子，能特异性结合和增殖T细胞，用于治疗IV期(转移性)黑色素瘤患者。IL-2受体(IL-2Rs)有三个亚基，IL-2Rα (CD25)， IL-2β (CD122)和IL-2γ (CD132)，它们在T细胞表面高度表达。IL-2Rs有两种形式，IL-2Rαβγ(三聚体)和IL-2Rβγ(二聚体)。调节性T细胞（Treg）高度表达三聚体受体IL-2Rαβγ， 天然 CD8+ T细胞、CD4+/CD8+ T细胞和NK细胞高度表达二聚体受体IL-2Rβγ。而野生型IL-2对IL-2Rαβγ的结合亲和力高于IL-2Rβγ (Kd值为10-11 vs 10-9 M)，因此，IL-2优先结合免疫抑制的Treg细胞而不是肿瘤杀伤的CD8+ T细胞。Sum IL-2是通过噬菌体筛选的IL-2的人工突变体（简写为sIL-2），有6个突变，其中L80F、R81D、L85V、I86V和I92F突变增强了与IL-2Rβ的结合亲和力，F42A突变减少了与IL-2Rα的相互作用。因此，与野生的IL-2优先结合免疫抑制性细胞不同，sIL-2能优先结合肿瘤浸润的起主要杀伤作用的效应性T细胞，基于sIL-2的显像也更能反映肿瘤的免疫活性指导肿瘤免疫治疗。有报道表明，18F标记的野生IL-2用于接受免疫检查点抑制治疗患者CD25+ (IL-2Rα)的激活T细胞的无创PET成像，但由于肿瘤组织中检测到CD25的低表达，其在肿瘤中的吸收相对较低。并且，它不能可靠地反映治疗相关的免疫反应，因为免疫检查点抑制治疗后T细胞上IL-2Rα的上调是短暂的，肿瘤中IL-2Rα的表达主要局限于免疫抑制的Treg细胞，而不是激活的CD8 T细胞。放射性核素标记的sIL-2，在体内通过sIL-2的靶向作用，优先结合肿瘤微环境浸润的效应性CD8+ T细胞，利用核医学的单光子断层显像（SPECT）技术或正电子发射计算机断层显像（PET）技术，显像评价肿瘤浸润的杀伤性效应T细胞，这比野生型IL2的显像更能代表肿瘤的免疫活性，在肿瘤的摄取也相对更高，能更有效地筛选适合免疫治疗的患者，也能在免疫检查点抑制治疗后更可靠地评估疗效。此外，之前文献中，18F或99mTc标记的野生型IL-2均采用非特异性位点标记方法制备，其标记样品的均一性和重现性难以控制。并且，非特异性位点标记可能影响IL-2与T细胞的结合。我们在sIL-2的C端设计了一个灵活的GGGGS链连接LPETG基序，该基序可以通过SortaseA在远离sum IL-2与IL-2R结合位点的地方与放射标记的GGGGK-HYNIC-99mTc进行定点偶联，以避免影响99mTc-sIL-2与IL-2R的结合亲和力。本发明的定点标记方法能获得均一的可重复性的标记样品，并且标记位点在C端远离活性区域，不影响标记物活性。并且相对于文献报道的非特异性标记的IL-2，定点标记的99mTc-sIL-2显示出较低的肝脏背景比，获得更好的显像对比度。此外，不同的标记方法以及不同的核素也会影响标记物的体内行为。在SPECT核素方面，99mTc的半衰期是6 h，比较适合我们的sIL-2的显像评价，我们也开发了99mTc-GH 标记sIL-2的方法，是针对在sIL-2的C端直接表达GGGC序列的定点标记方法。在PET核素方面，与之前报道的18F不同，我们主要用68Ga标记，68Ga通过发生器更容易获得，标记过程更简单。
本发明的目的是通过如下技术方案实现：一种白介素2突变体放射性药物。包括白介素2突变体sIL-2和放射性核素，所述sIL-2为白介素2突变体；所述放射性核素标记通过双功能螯合剂标记所述白介素2突变体；所述放射性核素为99mTc，68Ga，64Cu，111In，90Y和177Lu中任意一种，所述双功能螯合剂为HYNIC、GGGC，NOTA，NODAGA，DOTA和DTPA中任意一种。
进一步的，所述放射性核素为99mTc时，（1）通过将99mTc标记的GGGGK-HYNIC-99mTc在Sortase A酶的作用下连接到sIL-2的LPETG标签上；（2）通过将99mTc标记的葡庚糖酸钠99mTc-GH偶联到sIL-2的GGGC标签上，形成所述基于白介素2突变体的放射性药物。
进一步的，所述放射性核素为68Ga，64Cu，111In，90Y和177Lu时，68Ga，64Cu，111In，90Y和177Lu是通过双功能螯合剂NOTA，NODAGA，DOTA或DTPA标记sIL-2形成所述基于白介素2突变体的放射性药物。
一种白介素2突变体放射性药物的制备方法及应用，放射性核素99mTc通过将99mTc标记的GGGGK-HYNIC-99mTc在Sortase A酶的作用下连接到sIL-2的LPETG标签上，形成所述基于白介素2突变体的放射性药物，所述方法包括以下步骤：
a、带LPETG标签sIL-2的制备
将sIL-2基因构建到载体上，在蛋白N端构建了信号肽以促进蛋白分泌到细胞外，蛋白C端融合表达了LPETG基序用于核素标记和10个连续组氨酸标签（His tag）以用于纯化。通过表达系统表达得到含sIL-2蛋白的上清液后，通过镍柱和分子筛纯化后得到目标蛋白。经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示纯化后蛋白纯度大于95%后，以备用于进一步的生物学分析与体内应用。
b、GGGGK-HYNIC-99mTc的制备
配制含三苯基膦三磺酸钠（TPPTS）、三羟甲基甘氨酸（tricine）、琥珀酸二钠、琥珀酸和GGGGK-HYNIC的混合液1 mL，混合液中上述各物质的质量比为：4-6：6-7：38-39：12-13：0.01。将混合液冻干待用。在冻干粉末中加入1 mL Na99mTcO4 溶液，100 °C水浴加热反应20-25分钟，待反应结束后室温冷却，制成GGGGK-HYNIC-99mTc。经HPLC分析备用；
c、sIL-2-HYNIC-99mTc的制备
用2M NaOH溶液将GGGGK-HYNIC-99mTc溶液的pH值调节至7.4-7.8。将带有LPETG标签的sIL-2、GGGGK-HYNIC-99mTc、Sortase A酶、1M CaCl2溶液混合，并用2 M NaOH溶液重新调节pH值至7.4-7.8。室温反应30分钟，经放射性薄层层析色谱（ITLC）分析标记效率。利用SuperoseTM 75排阻柱进行纯化，收集目标物的馏分，制成白介素2突变体99mTc标记的放射性药物sIL-2-HYNIC-99mTc。再次经放射性ITLC分析，验证sIL-2-HYNIC-99mTc的放射化学纯度后备用。
一种白介素2突变体的放射性药物的制备方法及应用，放射性核素99mTc通过将99mTc标记的葡庚糖酸钠99mTc-GH偶联到sIL-2的GGGC标签上，形成所述基于白介素2突变体的放射性药物，所述方法包括以下步骤：
a、带GGGC标签sIL-2的制备
将sIL-2基因构建到载体上，在蛋白N端构建了信号肽以促进蛋白分泌到细胞外，蛋白C端融合表达了GGGC基序以用于偶联和核素标记。通过表达系统表达得到含sIL-2蛋白的上清液后，通过分子筛纯化后得到目标蛋白。经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示纯化后蛋白纯度大于95%后，以备用于进一步的生物学分析与体内应用。
b、99mTc-GH的制备
在葡庚糖酸钠（GH）药盒中加入1 mL Na99mTcO4溶液，室温放置10分钟，制成99mTc标记的葡庚糖酸钠99mTc-GH。经放射性ITLC分析备用。
c、sIL-2-GGGC-99mTc的制备
将sIL-2-GGGC、99mTc-GH、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）溶液混合，使用0.5 M琥珀酸缓冲液调节混合液pH值至4.5-5.0。37 °C水浴反应1.0小时，制成白介素2突变体99mTc标记的放射性药物sIL-2-GGGC-99mTc。经放射性ITLC分析后备用。
一种白介素2突变体的放射性药物的制备方法及应用，放射性核素68Ga通过双功能螯合剂NOTA或NODAGA标记sIL-2上，形成所述基于白介素2突变体的放射性药物，所述方法包括以下步骤：
a、NOTA-sIL-2的制备
将带有GGGC标签的sIL-2、Mal-NOTA混合，并用溶液调节混合液pH值至7.4-7.8。4°C反应过夜。利用SuperoseTM 75排阻柱进行纯化，收集目标物的馏分。合并收集液，获得目标产物sIL-2-NOTA。NODAGA，DOTA和DTPA偶联的sIL-2制备方法同上。
b、sIL-2-NOTA-68Ga的制备
从锗-镓发生器新鲜淋洗68GaCl3，用2.5M NH4OAc调节pH值至3.5-4.0。加入sIL-2-NOTA，室温反应20分钟。制成白介素2突变体68Ga标记的放射性药物sIL-2-NOTA-68Ga。经放射性ITLC分析后备用。sIL-2-NODAGA-68Ga制备过程如上一样。64Cu，111In，90Y和177Lu标记方法同68Ga。
所述HPLC方法为使用Agilent 1260 HPLC系统配备YMC-Pack ODS-A C18分析柱（250×4.6 mm, I.D. S-5 μm，12 nm），梯度淋洗20分钟，其中流动A相为去离子水（含0.05%TFA），流动B相为乙腈（含0.05% TFA）。流速1 mL/min，淋洗梯度为初始时90% A和10% B，17.5分钟时60% A和40% B，20分钟时90% A和10% B。
所述排阻柱纯化方法为使用Agilent 1260 HPLC系统配备SuperoseTM 75排阻柱，淋洗50分钟，流速0.8 mL/min，流动相为0.1% PBST。
所述放射性ITLC方法为使用瞬时薄层层析纸条或聚酰胺纸条，生理盐水或1%EDTA-2Na水溶液为展开剂。
所述白介素2突变体放射性药物用于T细胞的显像。
本发明的有益效果：
1、本发明是基于白介素2突变体所制备的放射性药物，通过蛋白序列突变，形成的突变体sIL-2的毒性低于白介素2（IL-2），受体亲和力高于IL-2，这更利于T细胞体内显像。
2、本发明中使用Sortase A酶和蛋白结构碳端残留半胱氨酸介导的放射性核素定点标记，制备的放射性药物性质均一。此外，以HYNIC作为双功能螯合剂，同时使用TPPTS和tricine作为协同配体从而使“99mTc-HYNIC核”具有更加良好的体内外稳定性。
3、本发明的白介素2突变体放射性药物，是一种全新的白介素2受体靶向的分子影像探针，可以应用于T细胞的核医学分子成像，无创地监测肿瘤免疫治疗期间的全身和肿瘤微环境内浸润的T细胞变化，进而可以对肿瘤免疫治疗进行指导，以及用于预后评价。
附图说明
图1. (A) sIL-2-LPETG-His tag，(C) sIL-2-GGGC，(D) sIL-2-NOTA，(E) sIL-2-NODAGA的结构示意图。
图2. IL-2和sIL-2与不同T细胞结合强弱的比较图。
图3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳验证sIL-2-LPETG-His tag的纯度图。
图4. (A) sIL-2-HYNIC-99mTc，(B)sIL-2-GGGC-99mTc，(C) sIL-2-NOTA-68Ga，(D)sIL-2-NODAGA-68Ga放射性药物的结构示意图。
图5. (A) sIL-2-HYNIC-99mTc的标记率；(B) 纯化后，sIL-2-HYNIC-99mTc的放射化学纯度。
图6. 在MC38肿瘤模型中注射sIL-2-HYNIC-99mTc (A) 0.5 h后的SPECT/CT显像图；(B) 0.5 h未标记蛋白阻断组的SPECT/CT显像图。
图7. 注射sIL-2-HYNIC-99mTc 0.5 h后，在MC38肿瘤模型中未阻断和阻断实验中的体内生物分布结果对比。
图8. (A) 在MC38肿瘤模型中注射sIL-2-HYNIC-99mTc和IL-2-HYNIC-99mTc 0.5 h后的SPECT/CT显像图；(B)在MC38肿瘤模型中注射sIL-2-HYNIC-99mTc和IL-2-HYNIC-99mTc0.5 h后的体内生物分布结果对比。
图9. (A) 在MC38肿瘤模型中抗PD-L1抗体治疗前和治疗后，注射sIL-2-HYNIC-99mTc 0.5 h后的SPECT/CT显像图； (B) 在MC38肿瘤模型中抗PD-L1抗体治疗组和未治疗组，注射sIL-2-HYNIC-99mTc 0.5 h后的体内生物分布结果对比。
图10. 在MC38-Ova和MC38肿瘤模型中过继性T细胞治疗（ACT）前和治疗后，(A) 注射sIL-2-HYNIC-99mTc 0.5 h后的SPECT/CT显像图；(B) 注射sIL-2-HYNIC-99mTc 0.5 h后的体内生物分布结果对比。
图11. (A) 99mTc-GH的标记率；(B) sIL-2-GGGC-99mTc的标记率。
图12. 纯化后，(A) sIL-2-NOTA-68Ga和(B) sIL-2-NODAGA-68Ga的放射化学纯度。
具体实施方式
本发明实施例中所采用的材料：
琥珀酸，琥珀酸二钠，三苯基膦三磺酸钠（TPPTS），三羟甲基甘氨酸（tricine） 均购自美国Sigma-Aldrich公司。HYNIC-KGGGG购自上海吉尔生化有限公司。Mal-NOTA，Mal-NODAGA，Mal-DOTA和Mal-DTPA购自西安瑞禧生物科技有限公司。Sortase A酶购自南京德泰生物科技有限公司。Na99mTcO4洗脱液，锗-镓发生器购自北京原子高科股份有限公司和中国同辐股份有限公司。
实施例1：
本实施例以白介素2（IL-2）和白介素2突变体（sIL-2）与不同T细胞的结合强弱比较为例。
通过流式细胞术检测IL-2，sIL-2与不同T细胞的结合强弱。如图2所示，sIL-2与Memory CD8+ T细胞的结合高于IL-2；相反的，IL-2与Treg细胞的结合高于sIL-2。由于Memory CD8+ T细胞对肿瘤免疫治疗是有用的，Treg细胞对免疫治疗是不利的，所以以白介素2突变体sIL-2构建放射性药物的体内显像更有利于预测肿瘤免疫治疗的有效性。
实施例2:
本实施例以sIL-2-HYNIC-99mTc放射性药物的制备方法及其应用为例。
sIL-2-HYNIC-99mTc中，sIL-2为白介素2突变体，放射性核素99mTc是通过将99mTc标记的GGGGK-HYNIC-99mTc在Sortase A酶的作用下连接到sIL-2的LPETG标签上，所述白介素2突变体放射性药物为sIL-2-HYNIC-99mTc，所述白介素2突变体放射性药物sIL-2-HYNIC-99mTc为无色透明液体针剂。
sIL-2-HYNIC-99mTc制备方法如下：
sIL-2的制备：将sIL-2基因构建到载体上，在蛋白N端构建了信号肽以促进蛋白分泌到细胞外，蛋白C端融合表达了LPETG基序用于核素标记和10个连续组氨酸标签（Histag）以用于纯化（图1A）。通过表达系统表达得到含sIL-2蛋白的上清液后，通过镍柱和分子筛纯化后得到目标蛋白。经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示纯化后蛋白纯度大于95%（图3）。
GGGGK-HYNIC-99mTc的制备：配制含TPPTS 5.0 mg，tricine 6.5 mg，琥珀酸二钠38.5 mg，琥珀酸12.7 mg和10 μg 的GGGGK-HYNIC的混合液1 mL于10 mL西林瓶中，将混合液冻干。在冻干粉末中加入1 mL Na99mTcO4 溶液（10-35 mCi），100 °C水浴加热西林瓶反应20-25分钟，待反应结束后室温冷却，制成GGGGK-HYNIC-99mTc标记物。
sIL-2-HYNIC-99mTc（或IL-2-HYNIC-99mTc）的制备：用2 M NaOH溶液（约50 μL）调节GGGGK-HYNIC-99mTc溶液的pH值至7.4-7.8，分成三份。取一份GGGGK-HYNIC-99mTc溶液，加入100 μg 带有LPETG标签的白介素2突变体sIL-2、100 μg Sortase A酶、10 μL 1 M CaCl2，用2 M NaOH溶液（约5 μL）重新调节混合液pH值至7.4-7.8。充分混匀，室温反应30分钟，使用瞬时薄层纸层析纸条，以生理盐水为展开剂进行展开，用放射性薄层层析扫描仪分析标记效率。利用SuperoseTM 75排阻柱纯化，收集目标馏分，制成白介素2突变体99mTc标记的放射性药物sIL-2-HYNIC-99mTc（图4A）。再次使用瞬时薄层纸层析纸条，以生理盐水为展开剂进行展开，用放射性薄层层析扫描仪分析sIL-2-HYNIC-99mTc的放射化学纯度。如图5所示，经过Sortase A 酶介导反应后得到的sIL-2-HYNIC-99mTc产物标记率约为40-50%（图5A）。纯化后，sIL-2-HYNIC-99mTc的放射化学纯度大于95%（图5B）。放射性核素99mTc标记的白介素2（IL-2-HYNIC-99mTc）通过相同的方法制成。
sIL-2-HYNIC-99mTc在荷瘤鼠中的SPECT/CT显像：在MC38结直肠癌肿瘤模型中，sIL-2-HYNIC-99mTc在给药后0.5小时可以对肿瘤浸润的T细胞进行清晰的SPECT成像（图6A）。除了在肾脏有较高摄取外，其它脏器背景较低。探针在肿瘤部位滞留时间较长。在阻断实验组中，肿瘤摄取明显降低（图6B），说明sIL-2-HYNIC-99mTc与肿瘤浸润的T细胞是特异性结合的。
sIL-2-HYNIC-99mTc在荷瘤鼠中的生物分布：将MC38结直肠癌肿瘤模型分为2组，每组4只。其中一组小鼠经尾静脉注射100 μL（~74 kBq）sIL-2-HYNIC-99mTc，于注射后0.5小时处死；另外一组小鼠经尾静脉共注射100 μL（~74 kBq）sIL-2-HYNIC-99mTc和100 μg sIL-2，于注射后0.5 h处死；取血及主要脏器，称重并测量放射性计数，经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率（%ID/g）。实验结果验证了显像结果并显示了探针在各个组织器官中的分布（图7）。sIL-2-HYNIC-99mTc在MC38肿瘤中有较好的摄取。在阻断实验中，过量未标记的sIL-2可以显著降低sIL-2-HYNIC-99mTc在脾脏、淋巴结和MC38肿瘤中的摄取（ P < 0.05），这说明sIL-2-HYNIC-99mTc与T细胞的结合是具有特异性。
sIL-2-HYNIC-99mTc和IL-2-HYNIC-99mTc在MC38结直肠癌肿瘤模型中的SPECT/CT显像和生物分布比较：SPECT/CT显像结果显示给药后0.5 h，sIL-2-HYNIC-99mTc和IL-2-HYNIC-99mTc在肿瘤都有摄取（图8A）。两个探针除了在肾脏有较高摄取外，其它脏器背景较低。生物分布结果显示sIL-2-HYNIC-99mTc在MC38肿瘤、脾脏和淋巴结中的摄取显著高于IL-2-HYNIC-99mTc（ P < 0.01）（图8B），这是由于sIL-2与T细胞的结合亲和力高于IL-2。
sIL-2-HYNIC-99mTc在MC38结直肠癌模型中抗PD-L1抗体治疗前和治疗后的SPECT/CT显像和生物分布比较：SPECT/CT显像和生物分布结果显示抗PD-L1抗体治疗后，sIL-2-HYNIC-99mTc在MC38肿瘤的摄取显著升高（ P < 0.01）（图9），这是因为抗PD-L1抗体治疗后，MC38肿瘤浸润的T细胞显著增加，从而导致探针的摄取增加。
sIL-2-HYNIC-99mTc在过继性T细胞治疗（ACT）模型中的SPECT/CT显像和生物分布：SPECT/CT显像和生物分布结果显示（图10），在ACT之前，sIL-2-HYNIC-99mTc在MC38-Ova和MC38肿瘤的摄取类似。在Ova特异性CD8+ T细胞ACT之后，sIL-2-HYNIC-99mTc在MC38-Ova肿瘤的摄取显著高于ACT前（ P < 0.01），并且探针在MC38-Ova肿瘤的摄取也显著高于MC38肿瘤（ P < 0.05）。此外，sIL-2-HYNIC-99mTc在MC38-Ova肿瘤引流淋巴结（TdLNs）的摄取显著高于ACT前（ P < 0.001）。这说明sIL-2-HYNIC-99mTc可以对过继性T细胞进行体内SPECT/CT显像示踪。
实施例3：
本实施例以sIL-2-GGGC-99mTc放射性药物的制备方法为例。
sIL-2-GGGC的制备：将sIL-2基因构建到载体上，在蛋白N端构建了信号肽以促进蛋白分泌到细胞外，蛋白C端融合表达了GGGC基序以用于偶联和核素标记（图1B）。通过表达系统表达得到含sIL-2蛋白的上清液后，通过分子筛纯化后得到目标蛋白。经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示纯化后蛋白纯度大于95%。
99mTc-GH的制备：在葡庚糖酸钠（GH）药盒中加入1 mL Na99mTcO4溶液（10-35 mCi），室温放置10分钟，制成99mTc标记的葡庚糖酸钠99mTc-GH。使用瞬时薄层纸层析纸条，以生理盐水为展开剂进行展开，放射性薄层层析扫描仪分析。如图11A所示，99mTc-GH的标记率大于95%。
sIL-2-GGGC-99mTc的制备：将99mTc-GH溶液分成三份。取一份99mTc-GH溶液，加入100μg sIL-2-GGGC、10 μL乙二胺四乙酸二钠溶液（1 mg/mL）混合，使用0.5 M琥珀酸缓冲液调节混合液pH值至4.5-5.0。37 °C水浴反应1.0小时，制成白介素2突变体99mTc标记的放射性药物sIL-2-GGGC-99mTc（图4B）。使用瞬时薄层纸层析纸条，以生理盐水为展开剂进行展开，放射性薄层层析扫描仪分析。如图11B所示，sIL-2-GGGC-99mTc的标记率大于95%。
实施例4：
本实施例以sIL-2-NOTA-68Ga或sIL-2-NODAGA-68Ga放射性药物的制备方法为例。
sIL-2-NOTA的制备：将1 mg带有GGGC标签的白介素2突变体sIL-2-GGGC、100 μgMal-NOTA 溶解在PB缓冲溶液（pH = 7.4）中。充分混匀，4 °C反应过夜。利用SuperoseTM 75排阻柱进行纯化，收集目标物的馏分。合并收集液，获得目标产物sIL-2-NOTA（图1C）。
sIL-2-NODAGA的制备：将1 mg带有GGGC标签的白介素2突变体sIL-2-GGGC、100 μgMal-NODAGA溶解在PB缓冲溶液（pH = 7.4）中。充分混匀，4 °C反应过夜。利用SuperoseTM 75排阻柱进行纯化，收集目标物的馏分。合并收集液，获得目标产物sIL-2-NODAGA（图1D）。
sIL-2-NOTA-68Ga或sIL-2-NODAGA-68Ga的制备：从锗-镓发生器新鲜淋洗68GaCl3，用2.5M NH4OAc调节pH值至3.5-4.0。取1-2 mL 68GaCl3溶液（10-20 mCi），加入100 μg sIL-2-NOTA或sIL-2-NODAGA，室温反应20分钟。制成白介素2突变体68Ga标记的放射性药物sIL-2-NOTA-68Ga（图4C）或sIL-2-NODAGA-68Ga（图4D）。使用瞬时薄层纸层析纸条，1% EDTA-2Na水溶液为展开剂进行, 放射性薄层层析扫描仪分析。如图12所示，sIL-2-NOTA-68Ga或sIL-2-NODAGA-68Ga的放射化学纯度均大于95%。

Claims (10)

1.一种白介素2突变体放射性药物，其特征在于：所述放射性药物包含所述白介素2突变体（sum IL-2）、放射性核素和螯合剂。
2.如权利要求1所述的白介素2突变体放射性药物，其特征在于：所述放射性核素为通过GGGGK-HYNIC标记，在Sortase A酶的作用下连接到sIL-2的LPETG标签上。
3.如权利要求1或2所述的白介素2突变体放射性药物，其特征在于：放射性核素为99mTc或者为68Ga，64Cu，111In，90Y和177Lu中任意一种。
4.如权利要求1或2所述的白介素2突变体放射性药物，，其特征在于：双功能螯合剂为HYNIC，GGGC或者为NOTA，NODAGA，DOTA和DTPA。
5.一种白介素2突变体放射性药物的制备方法，其特征在于：包括白介素2突变体sIL-2、放射性核素和双功能螯合剂，所述sIL-2为6位点突变的白介素2突变体（sum IL-2）；所述放射性核素标记通过双功能螯合剂标记所述白介素2突变体；所述放射性核素通过GGGGK-HYNIC标记，得到GGGGK-HYNIC-放射性核素在Sortase A酶的作用下连接到sIL-2的LPETG标签上；所述放射性核素通过将放射性核素标记的葡庚糖酸钠99mTc-GH偶联到sIL-2的GGGC标签上；所述放射性核素选自68Ga，64Cu，111In，90Y或177Lu中的任意一种；所述双功能螯合剂选自NOTA，NODAGA，DOTA或DTPA中的任意一种；所述白介素2突变体放射性药物为无色透明液体针剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a、带LPETG标签sIL-2的制备
将sIL-2基因构建到载体上，在蛋白N端构建了信号肽以促进蛋白分泌到细胞外，蛋白C端融合表达了LPETG基序用于核素标记和10个连续组氨酸标签（His tag）以用于纯化；通过表达系统表达得到含sIL-2蛋白的上清液后，通过镍柱和分子筛纯化后得到目标蛋白；经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示纯化后蛋白纯度大于95%后，以备用于进一步的生物学分析与体内应用；
b、GGGGK-HYNIC-放射性核素的制备
配制含三苯基膦三磺酸钠、三羟甲基甘氨酸、琥珀酸二钠、琥珀酸和GGGGK-HYNIC的混合液1 mL，混合液中上述各物质的质量比为：4-6：6-7：38-39：12-13：0.01；将混合液冻干待用；在冻干粉末中加入1 mL Na99mTcO4 溶液，100 °C水浴加热反应20-25分钟，待反应结束后室温冷却，制成GGGGK-HYNIC-放射性核素；经HPLC分析备用；
c、sIL-2-HYNIC-放射性核素的制备
用2M NaOH溶液将GGGGK-HYNIC-放射性核素溶液的pH值调节至7.4-7.8；将带有LPETG标签的sIL-2、GGGGK-HYNIC-放射性核素、Sortase A酶、1M CaCl2溶液混合，并用2M NaOH溶液重新调节pH值至7.4-7.8；室温反应30分钟，经薄层层析色谱（ITLC）分析标记效率；利用SuperoseTM 75排阻柱进行纯化，收集目标物的馏分，制成白介素2突变体放射性核素标记的放射性药物sIL-2-HYNIC-放射性核素；再次经ITLC分析，验证sIL-2-HYNIC-放射性核素的放射化学纯度后备用；
d、带GGGC标签sIL-2的制备
将sIL-2基因构建到载体上，在蛋白N端构建了信号肽以促进蛋白分泌到细胞外，蛋白C端融合表达了GGGC基序以用于偶联和核素标记；通过表达系统表达得到含sIL-2蛋白的上清液后，通过分子筛纯化后得到目标蛋白；经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示纯化后蛋白纯度大于95%后，以备用于进一步的生物学分析与体内应用；
e、99mTc -GH的制备
在葡庚糖酸钠（GH）药盒中加入1 mL Na99mTcO4溶液，室温放置10分钟，制成99mTc标记的葡庚糖酸钠99mTc-GH；经放射性ITLC分析备用；
f、sIL-2-GGGC-99mTc的制备
将sIL-2-GGGC、99mTc-GH、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）溶液混合，使用0.5M琥珀酸缓冲液调节混合液pH值至4.5-5.0；37 °C水浴反应1.5小时，制成白介素2突变体99mTc标记的放射性药物sIL-2-GGGC-99mTc；经放射性ITLC分析后备用；
g、NOTA-sIL-2的制备
将带有GGGC标签的sIL-2、Mal-NOTA混合，并用溶液调节混合液pH值至7.4-7.8;4 °C反应过夜,利用SuperoseTM 75排阻柱进行纯化，收集目标物的馏分;合并收集液，获得目标产物sIL-2-NOTA;
sIL-2-NOTA-68Ga的制备
从锗-镓发生器新鲜淋洗68GaCl3，用2.5M NH4OAc调节pH值至3.5-4.0;加入sIL-2-NOTA，室温反应10分钟;利用PD-10柱进行纯化，收集目标物的馏分，制成白介素2突变体68Ga标记的放射性药物sIL-2-NOTA-68Ga;经放射性ITLC分析后备用。
7.根据权利要求6所述的白介素2突变体放射性药物的制备方法，其特征在于：所述HPLC方法为使用Agilent 1260 HPLC系统配备YMC-Pack ODS-A C18分析柱（250×4.6 mm,I.D. S-5 μm，12 nm），梯度淋洗20分钟， 其中流动A相为去离子水（含0.05% TFA），流动B相为乙腈（含0.05% TFA）；流速1 mL/min，淋洗梯度为初始时 90% A和10% B，17.5分钟时60%A和40% B，20分钟时90% A和10% B。
8.根据权利要求6所述的白介素2突变体放射性药物的制备方法，其特征在于：所述排阻柱纯化方法为使用Agilent 1260 HPLC系统配备SuperoseTM 75排阻柱，淋洗50分钟，流速0.8 mL/min，流动相为0.1% PBST。
9.根据权利要求6所述的白介素2突变体放射性药物的制备方法，其特征在于：所述放射性ITLC方法为使用瞬时薄层层析纸条或聚酰胺纸条，生理盐水或1% EDTA-2Na水溶液为展开剂。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的白介素2突变体放射性药物的应用，其特征在于：所述白介素2突变体放射性药物可用于制备体内T细胞核医学显像的放射性药物。
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