CN116098856A - 光固化水凝胶复合核酸传递系统及治疗脊髓损伤的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种光固化水凝胶复合核酸传递系统及治疗脊髓损伤的药物。本发明要解决的技术问题是目前缺乏有效的缓释治疗脊髓损伤的药物。本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种光催化可注射阳离子脂质体复合明胶‑甲基丙烯酰纳米水凝胶递送系统。其可递送siRNA纳米复合物，实现缓释治疗脊髓损伤的目的。本发明递送系统可同时递送两种用阳离子纳米粒包裹的siRNA纳米复合物达到有效治疗脊髓损伤的目的，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种光固化水凝胶复合核酸传递系统及治疗脊髓损伤的药物。
背景技术
水凝胶是由聚合物、蛋白质、小分子或胶体制成的水溶胀三维网络。由于它们能够封装和保护药物并提供持续和/或远程可编程的空间和时间释放，因此它们构成了药物输送的多功能平台，因此产生了大量关于小活性化合物或生物药物输送的研究。常规药物递送涉及重复施用活性化合物以维持体内治疗水平；这会损害患者的依从性和疗效，并可能因高剂量而导致副作用。因此，药物输送的研究集中在使用纳米结构系统(如脂质体、纳米颗粒、细胞膜和水凝胶)实现受控和局部药物输送。脂质体是具有由磷脂组成的双层结构的球形囊泡。磷脂的结构包含一个由磷酸盐基团和一个季铵盐基团组成的亲水性头部，以及一个由两个较长的烃基组成的亲油性尾部。脂质体具有良好的生物相容性，广泛应用于药物递送系统中，其中聚乙二醇修饰的脂质体获得了FDA的批准。水凝胶主要由水组成，提供类似于天然组织的环境，与软组织和硬组织相匹配的可调机械性能，以及包封药物的能力，减缓或防止它们的降解、聚集、延长它们的寿命，同时提供持续释放，由扩散控制基质的降解，或由外部/内源性触发器远程控制控制基质的降解。明胶(Gelatin)是以动物皮、骨内的蛋白质，亦即胶原蛋白制成。明胶的主要成分为蛋白质，带浅黄色透明，是一种无味的胶质。甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)由甲基丙烯酸酐(MA)与明胶(Gelatin)制备获得，是一种光敏性的生物水凝胶材料。该材料具有优异的生物相容性，且可由紫外光或可见光激发固化反应，形成适于细胞生长与分化且有一定强度的三维结构。其生物相容性远优于基质胶、纤维蛋白胶，而与胶原性能相近；同时成形性能远优于胶原，是替代这类材料的最佳选择。
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)分两大类：脊髓全横断及脊髓挫伤，两者的主要区别是挫伤的脊髓中尚存有联接其上、下脊髓的神经纤维。挫伤严重时，损伤部残存神经纤维的信息传递功能受损致损伤以下丧失感觉及运动功能。脊髓挫伤的基本病理变化是从原发性损伤区有一些有害物质渗出，在其周围造成主要由坏死组织构成的继发性损伤。继发性损伤的范围不断扩大，直至几周后最终形成一个许多倍于原发性损伤区的大腔。这种损伤会导致机体运动、感觉等功能受到极大的破坏。
磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)在调节神经元细胞的轴突再生能力方面发挥重要作用。在PTEN缺失的神经元细胞中观察到促进轴突生长和激活的mTOR通路。此外,在脊髓损伤的继发阶段，巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)在小胶质细胞和巨噬细胞中均增加。通过与CD74受体结合，MIF可诱导多种抗再生活动，如神经元凋亡、星形胶质细胞增殖和炎症增加。因此，通过基因沉默的方式来调节相关基因的表达，以达到促进脊髓恢复的目的。更重要的是，可以通过基于siRNA的基因治疗策略实现同时靶向多个目标基因的目的。
近年来，基因治疗的方法为脊髓轴突再生和抑制神经炎症提供了策略。但目前没有能局部给药达到缓释治疗脊髓损伤的目的。
发明内容
本发明要结局的技术问题是目前缺乏有效的缓释治疗脊髓损伤的药物。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种纳米药物递送系统。该药物递送系统可递送伤siRNA纳米复合物，实现缓释治疗脊髓损伤的目的。
本发明药物传递系统是由阳离子脂质体负载于可光固化的水凝胶材料中制得；所述的可光固化的水凝胶材料为甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)。
其中，上述甲基丙烯酸酐化明胶中的甲基丙烯酸酐(MA)与明胶(Gelatin)质量比为：1︰20～100。
其中，上述的明胶工作浓度范围为5％～30％(w/v)。
其中，上述药物传递系统中所述的明胶为A型猪皮明胶。明胶的凝胶强度可为90～300g。优选的，明胶的凝胶强度为100～200g。
其中，上述药物传递系统中所述的可光固化的水凝胶材料能在405nm的蓝光照射下交联得到GelMA光固化水凝胶。
其中，上述药物传递系统中所述的阳离子脂质体为阳离子脂质DOPTAP和辅助脂质胆固醇制成的脂质体纳米颗粒。
进一步的，所述阳离子脂质材料和辅助脂质之间的配比为摩尔比1︰1。
其中，上述药物传递系统中所述的阳离子脂质体与可光固化的水凝胶材料的用量配比为每100ul水凝胶材料中装载35μ～160μg阳离子脂质体。
其中，所述的阳离子脂质体中还负载有多肽或核酸作为活性成分；进一步的，所述的核酸为DNA或RNA中的至少一种。
其中，所述的RNA为siRNA、shRNA、sgRNA、microRNA、lncRNA或mRNA中的至少一种。
其中，所述的siRNA为10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因PTEN的siRNA或噬细胞迁移抑制因子MIF的siRNA中的至少一种。
进一步的，所述10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因PTEN的siRNA的核苷酸序列为：
正义链(SEQ ID No.1)：5’-CAGUAGAAAUUGUCCUACA-3’,
反义链(SEQ ID No.2)：5’-UGUAGGACAAUUUCUACUG-3’。
所述的噬细胞迁移抑制因子MIF的siRNA的核苷酸序列为：
正义链(SEQ ID No.3)：5’-CCGCAACUACAGUAAGCUG-3’,
反义链(SEQ ID No.4)：5’-CAGCUUACUGUAGUUGCGG-3’。
进一步的，当所述的siRNA为10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因PTEN的siRNA和噬细胞迁移抑制因子MIF的siRNA同时使用时，前者与后者的质量比为1︰0.5～1。
其中，其中，上述药物传递系统中所述的阳离子脂质体与活性物质的用量配比为按质量比为：2～10︰1～5。
进一步的，上述的药物传递系统是由以下方法制备的：
a、制备负载活性成分的纳米颗粒；
b、将a制得的负载活性成分的纳米颗粒分散于可光固化的水凝胶材料中；
进一步的，上述方法还包括步骤C:在405nm的蓝光照射下交联使水凝胶材料固化。
上述的药物传递系统的制备方法中，步骤b将负载活性成分的纳米颗粒分散于可光固化的水凝胶材料后，还可采用渗透压调节剂调节体系达到生理渗透压。
本发明还提供了上述的药物传递系统在制备药物中的用途。
本发明也提供了上述的药物传递系统在制备治疗脊髓损伤的药物中的用途。
本发明还提供了一种上述siRNAs/CLP/GM复合物在治疗脊髓损伤中的用途。
本发明的有益效果为：本发明通过光催化制备了一种光固化的水凝胶纳米递送系统：CLP/GM复合物，该复合物可通过非共价结合siRNA，可有效的将相关siRNA导入对应的靶细胞中，具有调节神经元、促进运动恢复，促进髓鞘再生以及减少神经炎症的特点。光固化水凝胶可介导基因等活性成分发挥疗效，如GelMA介导多种siRNA可以在体外和体内有效促进神经元轴突的生长。本发明CLP/GM纳米递送系统是一种相对安全的可生物降解性非病毒基因载体，具有生物降解、缓控释放、安全性较高的特性，在基因导入中有重要的应用，在基因功能研究、基因治疗研究及治疗脊髓损伤的临床应用中有很好的应用前景。本发明提供的siRNAs/CLP/GM复合物中的各种siRNA间还具有协同效应，具有很好的为治疗脊髓损伤的效果，具有很好的应用前景。
附图说明
图1(A)甲基丙烯酸酐的分子结构式；(B)明胶的分子结构式；(C)CLP结构式。
图2siRNAs/CLP/GM复合物制备过程示意图。
图3CLP阳离子纳米粒的粒径及电位分布图：(A)CLP纳米粒的电位分布图；(B)CLP纳米粒的粒径分布图。
图4CLP纳米粒的扫描透射电镜照片。
图5CLP纳米粒凝胶阻滞分析：当CLP与siRNA的质量之比为2:1时，CLP纳米粒可以完全结合siRNA。
图6CLP纳米粒细胞毒性检测：在293T细胞中，CLP纳米粒的细胞毒性低于PEI25K。
图7CLP纳米粒在RNase存在下对siRNA的保护能力:CLP能保护mRNA不被降解长达4h，而单独的siRNA很快就被降解了。
图8CLP纳米粒对NIH3T3细胞的转染效率：Cy3-siRNA质量为1μg，CLP纳米粒与Cy3-siRNA的质量比为2:1；(A)CLP纳米粒对NIH3T3细胞转染的红色荧光图；(B)CLP纳米粒对NIH3T3细胞转染的细胞核染色；(C)CLP纳米粒对NIH3T3细胞转染红色荧光和细胞核重叠图。
图9CLP纳米粒对NIH3T3细胞的转染效率：用流式检测仪检测CLP纳米粒对NIH3T3细胞的转染效率，测得转染效率为72.2％。
图10CLP纳米粒对RAW264.7细胞的转染效率：Cy3-siRNA质量为1μg，CLP纳米粒与Cy3-siRNA的质量比为2:1；(A)CLP纳米粒对RAW264.7细胞转染的红色荧光图；(B)CLP纳米粒对RAW264.7细胞转染的细胞核染色；(C)CLP纳米粒对RAW264.7细胞转染红色荧光和细胞核重叠图。
图11CLP纳米粒对RAW264.7细胞的转染效率：用流式检测仪检测CLP纳米粒对RAW264.7细胞的转染效率，测得转染效率为67.6％。
图12GelMA的形态：在光照前GelMA呈现透明液体状，在波长为405nm的蓝光照射下，GelMA水凝胶凝固，并且负载了siRNAs/CLP复合物之后并不影响GelMA的光固化性质。
图13GelMA水凝胶扫描电镜：(A)GelMA水凝胶具有多孔的、三维网状结构；(B)siRNAs/CLP/GM复合物呈现出更紧密的三维网状结构，这种稳定的网络结构能保护药物不被降解，并且缓控释释放药物，延长药效。
图14CLP纳米粒递送PTEN siRNA至DRG细胞中，48小时后，检测DRG细胞的轴突生长。其中DRG细胞用NF-160抗体染色(绿色)，细胞核用DAPI染色(蓝色)：(A)DRG绿色荧光图，能观察到轴突的数量增多；(B)DRG细胞的蓝色细胞核荧光图；(C)DRG绿色荧光与蓝色荧光的重叠图。
图15CLP纳米粒递送PTEN siRNA至DRG细胞中，48小时后，对DRG细胞的轴突生长定量分析：从图中可以看出在同一层数下，siPTEN/CLP复合物处理的DRG细胞轴突数明显增多，且具有差异。**P<0.01和***P<0.001,差异具有统计学意义。
图16siMIF/CLP复合物转染LPS刺激的RAW264.7细胞后检测炎症相关因子的QPCR结果：(A)IL-10的mRNA水平，其中siMIF/CLP复合物组中的IL-10mRNA水平增加；(B)TNF-α的mRNA水平，其中siMIF/CLP复合物组中的TNF-αmRNA水平减少；(C)IL-1β的mRNA水平，其中siMIF/CLP复合物组中的IL-1βmRNA水平减少。
图17siRNAs/CLP/GM复合物促进小鼠脊髓损伤的功能恢复，使用BMS评分细则，每三天对小鼠的后肢恢复情况进行评估，随着时间的推移，siRNAs/CLP/GM复合物能提高小鼠的BMS评分，治疗分数为3.33±1.03。
图18siRNAs/CLP/GM复合物促进小鼠脊髓损伤的运动功能恢复，在局部注射siRNAs/CLP/GM复合物三次治疗后，对小鼠后肢运动恢复情况进行评估：(A)假性手术组(sham组)小鼠后肢图，小鼠后肢能双脚撑地站立；(B)SCI组小鼠后肢图，小鼠双腿无力的向后拖至；(C)CLP/GM组小鼠后肢图，小鼠后肢无法正常双脚撑地站立；(D)siMIF/CLP/GM组小鼠后肢图，小鼠后肢无法正常双脚撑地站立；(E)siPTEN/CLP/GM组小鼠后肢图，小鼠后肢无法正常双脚撑地站立；(F)siRNAs/CLP/GM复合物治疗组小鼠后肢图，小鼠有双脚撑地站立的趋势，且能自如收缩，呈现出与健康小鼠一致的趋势。
图19siRNAs/CLP/GM复合物促进小鼠脊髓损伤的组织修复，在治疗结束后，取小鼠脊髓组织进行评估：(A)假性手术组(sham组)小鼠脊髓组织，组织完整；(B)SCI组小鼠脊髓，损伤处有明显的横断伤，横断下方脊髓组织萎缩；(C)CLP/GM组小鼠脊髓，脊髓组织不完整，横断下方脊髓组织萎缩；(D)siMIF/CLP/GM组小鼠脊髓损伤出具有较少组织修复；(E)siPTEN/CLP/GM组小鼠脊髓损伤出具有较少组织修复；(F)siRNAs/CLP/GM复合物治疗组小鼠脊髓，经过治疗后的小鼠脊髓组织完整，无横断损伤。
具体实施方式
本发明提供了通过光催化制备了一种光固化的水凝胶纳米递送系统：CLP/GM复合物，通过静电吸附作用，其中的阳离子纳米粒CLP能够将多种siRNA包裹其中，形成siRNAs/CLP/GM复合物。该复合物能保护siRNA不被降解，能缓控释的从水凝胶中释放，并且保持生物活性。该复合物具有生物降解能力，安全性较高，通过局部治疗能将靶基因有效的递送至靶细胞，以发挥促进神经元修复和运动功能恢复的功能。
本发明中采用的光固化水凝胶GelMA，是由甲基丙烯酸酐和明胶反应合成的，其中明胶中的羟基和氨基分别于甲基丙烯酸酐反应，在光敏引发剂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)的催化下交联形成光敏水凝胶GelMA。GelMA是一种具有快速从溶胶到凝胶转变的光敏水凝胶，并且添加了siRNA并不会影响这一性质；GelMA具备三位网络结构，能稳定的装载药物，是一种具有生物降解的、安全性较高的可注射光敏性水凝胶。
本发明中所采用的阳离子纳米粒CLP，是由N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基甲基硫酸铵(DOTAP)与胆固醇反应得到。
本发明中所采用的siRNA包括10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因PTEN siRNA，可简称为siPTEN；以及巨噬细胞迁移抑制因子MIF siRNA，可简称为siMIF；其中siPTEN具备促进轴突生在的作用，siMIF能与CD74受体结合，从而抑制小胶质细胞和巨噬细胞的炎症发生。
在前期纳米基因药物的制备过程中，将siRNA的含量定为1％～50％，进行凝胶阻滞分析和细胞转染实验发现，在这个比例范围内基因能够有效结合CLP阳离子纳米粒并有较好的转染效率。在前期的基础上，进一步将基因含量缩小至：将基因与阳离子纳米粒按照1：0.5；1：1；1：1.5；1：2；1：3的质量比混合，再次进行凝胶阻滞分析和细胞转染实验发现，在这个比例范围内基因能够高效的结合CLP阳离子纳米粒并有更好的转染效率。
制备CLP纳米粒所需的N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基甲基硫酸铵(DOTAP)与胆固醇优选的摩尔比为1：1。
本发明实例中得到的CLP阳离子纳米粒的平均粒径为48±4.88nm，平均电位为42±1.42mV，具备良好的siRNA结合能力，能保护siRNA不被RNase酶降解，具有较高的转染能力、保护性和较低的细胞毒性。
本发明制备的光敏水凝胶/阳离子纳米递送系统(CLP/GM复合物)属于生物可降解载体，是一种相对安全的非病毒基因载体，制备所得siRNAs/CLP/GM复合物为治疗脊髓损伤供了一种新的思路和潜在的选择。
可以采用CLP/GM复合物传递促进轴突生在的PTEN siRNA和神经炎症抑制MIFsiRNA，即采用CLP/GM复合物负载PTEN siRNA和MIF siRNA，得到siRNAs/CLP/GM复合物。
本发明还提供了一种上述siRNAs/CLP/GM复合物在治疗脊髓损伤中的用途。
在体外，通过沉默PTEN基因来评估背根神经节(DRG)的轴突再生能力，从小鼠体内分离得到DRG细胞，通过转染siPTEN/CLP复合物观察轴突生长情况。发明人发现利用CLP阳离子纳米粒介导siPTEN进入DRG细胞中，在体外siPTEN/CLP复合物明显促进神经细胞的轴突增长。
本发明通过在体内建立小鼠BALB/c小白鼠T10-T12部位完全横断的脊髓损伤模型，通过局部注射siRNAs/CLP/GM复合物，在波长为405nm的蓝光照射下，水凝胶在损伤部位凝固，每七天给一次药，共给予三次药物注射，比较各组小鼠下肢功能恢复情况。研究发现siRNAs/CLP/GM复合物可以提高小鼠的BMS评分，促进小鼠后肢运动功能的恢复，促进小鼠脊髓的组织修复，减少脊髓空洞的形成，保持脊髓的生理功能完整性。体内治疗数据表明，siRNAs/CLP/GM复合物能有效的促进损伤部位神经丝的再生、抑制小胶质细胞和巨噬细胞诱导神经炎症以及抑制星形胶质细胞诱导炎症，从而促进小鼠脊髓损伤的修复。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例1制备CLP纳米粒
CLP纳米粒通过自组装的方法制备而成：首先将DOTAP和胆固醇共溶于4mL氯仿中，两者比例为1︰1(mol/mol)。待混合物完全溶解后，连接旋蒸器，真空条件下旋蒸40分钟，除去有机溶剂，在圆底烧瓶底部形成一层透明薄膜。加适量Milli-Q水水化成所需浓度，为了提高脂质体的稳定性，使用超声波重新分散，所得溶液即为CLP纳米粒水溶液，置于4℃冰箱保存备用。
实施例2制备GelMA纳米粒
明胶、甲基丙烯酸酐和CLP的分子结构参见见图1，siRNAs/CLP/GM复合物的制备过程参见图2。
向10g明胶(G2500，sigma)中加入100mL PBS，在60℃的环境下搅拌溶解；随后，将8mL MA缓慢加入明胶溶液中，并在50℃下反应3h。接下来，在40℃下，将上述溶液用预热过的PBS进行稀释，将溶液稀释五倍来终止反应,将稀释后的溶液置于截留分子量为12-14KDa的透析袋中，以蒸馏水为透析液在40℃下透析1周以去除未反应的MA，透析后，放入冻干机冻干1周，获得具有白色多孔泡沫的GM，置于4℃冰箱保存备用。
实施例3制备siRNAs/CLP/GM复合物
将siPTEN(1μg)和CLP纳米粒(2μg)混合在一起，制备得到siPTEN/CLP复合物。
正义链5’-CAGUAGAAAUUGUCCUACA-3’,
反义链5’-UGUAGGACAAUUUCUACUG-3’
将siMIF(1μg)和CLP纳米粒(2μg)混合在一起，制备得到siMIF/CLP复合物。
正义链5’-CCGCAACUACAGUAAGCUG-3’,
反义链5’-CAGCUUACUGUAGUUGCGG-3’.
将siPTEN/CLP复合物和siMIF/CLP复合物混合在一起，制备得到siRNAs/CLP复合物。
将所需量的siRNAs/CLP/GM复合物与的GelMA材料混合在一起，得到GelMA终浓度为5％的siRNAs/CLP/GM复合物，即得。
实施例4CLP纳米粒的粒径、电位和形态学研究
1、CLP纳米粒的粒径、电位
CLP纳米粒的粒径和电位大小使用Zetasizer Nano ZS马尔文粒度仪(MalvernInstruments，Worcestershire，英国)检测，检测温度为25℃，检测前平衡2分钟。结果取3次测量的平均值。
2、CLP纳米粒的形态学研究
CLP纳米粒的形态学通过透射电子显微镜(transmission electron microsope,TEM)来观察。用毛细吸管吸取制备好的CLP纳米粒溶液滴在铜网膜上，经3-5分钟后，滴几滴磷钨酸染色30s后，用滤纸吸去余水，然后将铜膜置于扫描透射电子显微镜下进行观察形态，并摄取照片。在扫描透射电镜下，CLP纳米粒子如图4所示呈球形，表面光滑，平均直径约为50nm。CLP纳米粒的粒径分布和电位分布如图3A和3B所示，平均粒径为48±4.88nm，平均电位为42±1.42mV。
3、CLP纳米粒与siRNA结合能力的研究
用凝胶阻滞分析实验来检测CLP纳米粒与siRNA结合能力。首先把不同质量比例(0.5:1,1:1,1.5:1,2:1,3:1)的CLP纳米粒和siMIF混合，mRNA的质量为0.5μg，总体积为5μL，用加样枪轻轻吹打混合均匀,室温静置15分钟，上样前加入1μL mRNA loading dye。然后配制1％的琼脂糖凝胶，配胶过程中加入一定量的溴化乙锭染色剂。待琼脂糖凝胶形成后将静置完成后，上样，在120V电压下电泳15分钟。最后取出电泳条带在紫外灯的照射下进行观察并取图。
结果见图5。当CLP与siRNA的质量之比为2︰1，siRNA可以被CLP纳米粒完全结合。通过静电相互作用，带负电荷的siRNA被吸附在CLP纳米粒的表面，形成siRNA/CLP复合物。由于表面带强大的正电荷，所以CLP纳米粒可以有效地结合siRNA。所以，当CLP与siRNA的质量之比为2︰1时，CLP纳米粒可以完全结合siRNA。
4、CLP纳米粒的细胞毒性检测
CLP纳米粒对293T细胞的毒性作用通过细胞活力分析来检测。简单地说(1)加药前一天，取对数期生长的293T细胞，胰酶消化细胞制成细胞悬液，计数细胞，以5×103个细胞/孔接种于96孔板，每孔加样100μL细胞悬浮液，放入37℃，5％ CO2细胞恒温培养箱中孵育24小时。(2)配制100μL一系列浓度(0mg/ml、0.12mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml)的CLP纳米粒溶液和PEI 25K溶液，然后加入到96孔板中，每个浓度设6个复孔。加药完成后在37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中继续孵育48小时。(3)孵育完成后，每孔加入MTT试剂(5mg/ml)20μL，将细胞放入37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中避光孵育3-4小时后取出细胞，在倒置显微镜下观察细胞内紫蓝色结晶紫，颜色越深细胞活力越大。(4)最后弃掉培养基后，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，将96孔板置于摇床上振荡15分钟，振荡完成后将96孔板于酶标仪上在570nm波长处读取光吸收值(OD570)。
在293t细胞中，CLP纳米粒子表现出比PEI25K更高的安全性，PEI25K的IC50<25μg/mL,而CLP纳米颗粒的IC50>125μg/mL.，结果见图6。
5、CLP纳米粒在RNase存在下对siRNA的保护能力
(1)先将CLP纳米粒与siMIF按照2：1的质量比,混合均匀后，在室温下孵育15分钟，其中siMIF的用量为0.5μg，总体积为6μl。
(2)在上述溶液中加入100μg/ml的RNase 0.3μl，其中RNase的终浓度为0.25mg/mL混合后，分别在37℃水浴0h，15min，1h，2h和4h。
(3)水浴时间结束后，立即将溶液至于冰上，加入1mg/ml的SDS 2μl，在70℃水浴10min。
(4)水浴时间结束后，立即将溶液至于冰上，加入1mg/ml的肝素钠4μl，混合后，于冰上放置5分钟。上样前加入2.4ul mRNA loading dye。然后配制1％的琼脂糖凝胶，配胶过程中加入一定量的溴化乙锭染色剂。待琼脂糖凝胶形成后将静置完成后，上样，在120V电压下电泳15分钟。最后取出电泳条带在紫外灯的照射下进行观察并取图。
如图7所示，用RNase处理的裸siRNA在凝胶上没有留下任何条带，而siRNA/CLP复合物在RNase处理4小时后仍然在凝胶上产生显着的条带。这些结果表明，CLP纳米粒子不仅可以通过静电吸附完全结合siRNA，而且还可以保护siRNA不被降解。
6、CLP纳米粒转染RAW264.7细胞和NIH3T3细胞
(1)转染前一天，将对数期生长的RAW264.7细胞和NIH3T3细胞接种于24孔板中，细胞密度为3×105/孔，每孔加细胞悬浮液500μl。
(2)将1μg Cy3-siRNA稀释于50μl无血清无抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀。
(3)取制备好的CLP纳米粒2μg稀释于50μl无血清无抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀。
(4)混合稀释的Cy3-siRNA和CLP纳米粒(总体积为100μl)，注意将稀释的基因Cy3-siRNA加入到稀释的材料中，室温静置15分钟。
(5)将24孔板中的培养基吸出，用PBS洗涤细胞2次，加无血清无抗生素的DMEM培养基500μl。
(6)将Cy3-siRNA/CLP复合物加到孔板中，然后前后左右晃动混匀。
(7)将24孔板放入37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中孵育4-6小时后，移去无血清无抗生素培养基，换成有血清有抗生素的DMEM培养基500μl，放入孵箱继续孵育24小时。
(8)将细胞用Hoechst(1mg/mL)染色15分钟，并用荧光显微镜拍照。
(9)收集细胞，通过流式细胞术检测转染效率。
将转染后的NIH3T3细胞用Hoechst染色15分钟，并用荧光显微镜拍照，可以看出绝大部分细胞发出较强的红色荧光，表明CLP纳米粒成功地将Cy3-siRNA传递到了这些细胞中，结果见图8。然后将细胞收集，通过流式细胞术检测，CLP纳米颗粒在NIH3T3细胞中的转染率为72.7％，结果见图9。将转染后的RAW264.7细胞用Hoechst染色15分钟，并用荧光显微镜拍照，可以看出绝大部分细胞发出较强的红色荧光，表明CLP纳米粒成功地将Cy3-siRNA传递到了这些细胞中，结果见图10。然后将细胞收集，通过流式细胞术检测，CLP纳米颗粒在RAW264.7细胞中的转染率为67.6％，结果见图11。从这些数据中可以看出，CLP纳米粒是一种新型的非病毒基因载体，具有可降解性、细胞毒性低且转染率高的特征，在基因治疗中有潜在的应用前景。
实施例5GelMA水凝胶的理化性质表征
1、GelMA的光敏性
如图12所示，GM支架由MA与A型猪皮明胶交联而成，为透明液体，液面与桌面水平。在405nm蓝光照射下交联10s后，GM支架迅速凝固成半固体，液面与桌面不平行。加载siRNAs后，siRNAs/CLP/GM复合物可以在同一时间内固化成半固体。这些结果表明GM支架是一种具有快速溶胶-凝胶转变的光敏水凝胶，并且添加siRNA不能改变这些特性。
2、GelMA的形态学研究
使用SEM检测GM和siRNAs/CLP/GM(siMIF/siPTEN，1μg/1μg)水凝胶的微观结构。
(1)将两个样品加入500μL 5％ GM的12孔板中，然后在405nm蓝光照射下交联。
(2)将样品在不同浓度的乙醇(50％、70％、90％和100％)中每个浓度浸泡2小时进行脱水。
(3)样品通过临界点干燥(K850；Quorum Technologies Ltd.，Sacramento，CA，USA)进行干燥，并在其表面溅射镀金(YJ04K02；ZhongNuo Advanced Materia)。使用EVO10SEM系统(Zeiss，Oberkochen，Germany)观察并拍摄GM支架和siRNAs/CLP/GM纳米凝胶的形态。
结果如图13A所示，GM支架具有多孔的三维网络结构；在图13B中，而siRNAs/CLP/GM水凝胶的网络结构变得更紧密。
实施例6siRNAs/CLP/GM复合物在体外促进背根神经节的轴突生长
1、背根神经节DRG细胞的提取
(1)选择10-15天龄BALB/c小鼠，对其通过腹腔注射水合氯醛(10％，5mL/kg)，然后经心灌注生理盐水进行深度麻醉。
(2)从每只小鼠中取出脊髓和结缔组织，并将DRG收集在冰冷的含有200U/mL青霉素/链霉素的汉克平衡盐溶液(HBSS)中。
(3)DRG用HBSS洗涤3次，然后加入2mL 2.5mg/mL II型胶原酶(17101015；GibcoLaboratories)。
(4)DRG在37℃下孵育1小时，每10分钟轻轻摇动一次。然后小心地去除胶原酶并用HBSS洗涤3次。
(5)使用塑料研磨棒充分研磨DRG以获得单个细胞，并将悬浮液以160×g离心5分钟。
(6)将DRG重新悬浮在3mL F12培养基中，该培养基含有100U/mL青霉素/链霉素、10％胎牛血清和B27补充剂。
2、siPTEN/CLP复合物在体外促进背根神经节的轴突生长
(1)将DRG接种在用层粘连蛋白包被的室载玻片(Millicell四孔玻璃板；EMDMillipore)中，每个室包含5×104个细胞。
(2)细胞孵育5小时后，将培养基更换为新鲜培养基，并用CLP纳米颗粒和siPTEN(1μg)/CLP纳米颗粒转染。通过显微镜在0、24、36和48小时记录DRG的轴突生长。
(3)孵育48小时后，将细胞在室温下用多聚甲醛固定10分钟，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次。然后，细胞用0.1％ Triton X-100透化，PBS洗3次，5％牛血清37℃封闭1h，然后用anti-160kD孵育神经丝培养基抗体(NF-160,1:50,ab254348；Abcam,Cambridge,England)在4℃下过夜。
(4)用PBS洗涤后，将细胞与山羊抗兔Alexa488(1:1,000，ab150077；Abcam)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)一起孵育1小时。
(5)通过荧光显微镜(ZEN880)安装并观察DRG；量化每个分支级别的分支点数、总分支点和总神经突长度
结果如图14A、14B和14C所示，在siPTEN/CLP组中观察到48小时后大量轴突再生。此外，与对照组和CLP组相比，siPTEN/CLP组的神经突长度和分支点在24小时之后开始增加。对照组和CLP组的神经突长度和分支点在36-48小时略有增加，而siPTEN/CLP复合物组的神经突长度和分支点显着增加。
量化每个分支级别的分支点数、总分支点和总神经突长度结果如图15所示，siPTEN/CLP复合体组各水平分支点数显着高于CLP组(***P<0.001，对照组(**P<0.01)。这些结果表明siPTEN/CLP复合物转染可以显著增加轴突再生。
实施例7 siMIF/CLP/GM复合物在体外抑制炎症因子的表达
我们利用LPS刺激的小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，探究siMIF对炎症因子的影响。简单的来说，将RAW 264.7细胞(密度为5×105个/每孔)均匀的接种在6孔板中，在37℃含有5％CO2的细胞培养箱过夜，用含有1μg/mL LPS的不含有血清的DMEM替换原来的培养基刺激12小时，然后将培养基弃去换成1mL不含有血清的DMEM，随后在孔中分别加入CLP、scr(2μg)/CLP和siMIF(2μg)/CLP进行转染。72h后，采用TRIzolTMreagent(Vazyme)从转染的RAW264.7细胞中提取总RNA。，使用SuperScript II逆转录酶试剂盒(Vazyme)合成cDNA，使用SYBR GreenER定量PCR SuperMix Universal试剂盒进行QPCR。采用PCR引物检测IL-10，TNF-α，IL-1β。引物序列如下：
IL-10正义链(SEQ ID No.5)：5’-TTGTCGCGTTTGCTCCCATT-3’,
反义链(SEQ ID No.6)：5’-GAAGGGCTTGGCAGTTCTG-3’；
TNF-α正义链(SEQ ID No.7)：5’-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3’,
反义链(SEQ ID No.8)：5’-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3’；
IL-1β正义链(SEQ ID No.9)：5’-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3’,
反义链(SEQ ID No.10)：5’-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3’。
结果如图16A，16B，16C所示，相对于CLP和对照组，siMIF/CLP复合物转染LPS刺激的RAW264.7细胞的可使IL-10mRNA表达增加1.43倍(****P<0.0001)。另外，TNF-α和IL-1βmRNA的表达分别降低了0.26倍和0.6倍(***P<0.001)。这些结果表明siMIF/CLP复合物可以上调抗炎因子和下调炎症因子。
试验例1本发明siRNAs/CLP/GM复合物促进小鼠脊髓损伤的修复试验
为了评估siRNAs/CLP/GM复合物促进小鼠脊髓损伤的修复，在BALB/c小鼠建立了SCI(spinal cord injury，脊髓损伤)模型。
(1)术前腹腔注射戊巴比妥(1mg/mL)对小鼠进行深度麻醉。将小鼠背上的毛发剃掉并在皮肤上涂上碘伏。
(2)在T10-T12水平进行椎板切除术。在显微镜下，使用弹簧剪在T10水平完全横切脊髓，确保脊髓底部或侧面没有残留纤维。
(3)SCI后，将小鼠分为六组：
假手术组：注射生理盐水的SCI组，注射量为每只小鼠200ul水凝胶；
CLP/GM组：植入200ul的5％的GM，负载有70μg CLP纳米粒子；
siMIF/CLP/GM组：植入了负载有siMIF/CLP复合物的GM，GM浓度为5％，体积200ul，其中siMIF:CLP＝35μg:70μg。
siPTEN/CLP/GM组：植入了负载有siPTEN/CLP复合物的GM，GM浓度为5％，体积200ul，其中siPTEN:CLP＝35μg:70μg。
siRNAs/CLP/GM组：植入了负载有siMIF/CLP复合物和siPTEN/CLP复合物的GM，GM浓度为5％，体积200ul，其中siMIF和siPTEN各35μg。siMIF:CLP＝35μg:70μg，siPTEN:CLP＝35μg:70μg。
在405nm蓝光照射下交联后，用手术线缝合切开的皮肤。
各组每周注射一次，总共3次。将药物注射到病变部位，剂量与上述相同。手术后，让小鼠在加热的毯子上恢复，并在伤口上涂抹抗生素。此外，每天两次通过人工挤压小鼠膀胱的方式帮助小鼠排尿。
(4)用水凝胶治疗后每3天将小鼠置于空旷的场地活动4分钟，使用BMS系统对小鼠的运动功能恢复进行评估和评分。
结果如图17(第0天是从第一次注射当天开始计算)所示，假性手术组的小鼠保持健康，BMS评分为9分。SCI和CLP/GM组的得分分别为0.33±0.47和0.66±0.47分。siMIF/CLP/GM组得分为2±0.4分，siPTEN/CLP/GM组得分为1.5±0.5分。siRNAs/CLP/GM组得分为3.33±1.03分，明显高于以上几个组的得分(*P<0.05)。这些结果表明siRNAs/CLP/GM水凝胶可以提高BMS评分和运动恢复。同时，假手术组的后肢表现为脚踝运动的背踏，脚趾伸展，躯干稳定(图18)。SCI和CLP/GM组的后肢麻痹，脚趾无张力，背侧放置，踝关节无明显运动。siMIF/CLP/GM组和siPTEN/CLP/GM组的后肢能够轻微活动，但是仍然是呈无力状态。siRNAs/CLP/GM组则踝关节表现出屈曲动作，脚趾在足底放置时伸展。这表明siRNAs/CLP/GM组实现了显著的运动恢复，偶尔将爪子置于足底并有重量支撑，而SCI,CLP/GM,siMIF/CLP/GM和siPTEN/CLP/GM组均没有明显的脚踝运动，siRNAs/CLP/GM组效果远优于其他组。
处死小鼠后取各组小鼠脊髓组织进行评估，结果如图19所示，假性手术组的小鼠脊髓组织完整，然而SCI组和CLP/GM组小鼠的脊髓组织呈现明显的横断损伤，组织不完整，并且严重抑制了上行和下行神经通路的传导。相比于SCI组和CLP/GM组而言，siMIF/CLP/GM和siPTEN/CLP/GM组损伤处的脊髓组织情况略好，虽有明显的脊髓损伤，但比SCI组和CLP/GM组的脊髓还是较为完整，仍能能够观察到脊髓是连接的。siRNAs/CLP/GM治疗组的脊髓组织则外观接近完整，无明显的横断伤，说明了siRNAs/CLP/GM复合物能够有效的促进神经组织的修复功能，保护脊髓组织的完整性，保证了脊髓损伤处上行和下行的神经传导，效果明显优于siMIF/CLP/GM和siPTEN/CLP/GM，说明siMIF/CLP和siPTEN/CLP配合于GM中使用具有协同作用。
由上述实例可知：本发明提供一种光催化可注射阳离子脂质体(CLP)复合明胶-甲基丙烯酰(GelMA)纳米水凝胶递送系统，通过递送多种siRNA纳米复合物，实现缓释治疗脊髓损伤的目的。其中CLP阳离子纳米粒具有良好的siRNA结合能力，可有效地将基因质粒导入到靶细胞中，具有转染率高、细胞毒性低的优点。可注射水凝胶GelMA能在波长为405nm的蓝光照射下迅速凝固形成透明状、半固体的水凝胶，该水凝胶具有多孔性，能将药物有效的包裹在其中，同时具备可注射和生物降解能力。所制备的siRNAs/CLP/GM复合物在体外能够有效的促进背根神经节的轴突生长，在体内能够提高小鼠的BMS评分，促进小鼠后肢运动功能恢复，从而治疗小鼠脊髓损伤。综上，CLP/GM纳米水凝胶递送系统是一种相对安全的可降解性非病毒基因载体，制备所得siRNAs/CLP/GM复合物为治疗脊髓损伤提供了一种新的思路和潜在的选择。
Claims (18)
1.药物传递系统，其特征在于：由阳离子脂质体负载于可光固化的水凝胶材料中制得；所述的可光固化的水凝胶材料为甲基丙烯酸酐化明胶。
2.根据权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于：所述的甲基丙烯酸酐化明胶中的甲基丙烯酸酐与明胶质量比为：1︰20～100。
3.根据权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于：所述的明胶工作浓度范围为5％～30％(w/v)。
4.根据权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于：所述的明胶为A型猪皮明胶。
5.根据权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于：所述的可光固化的水凝胶材料能在405nm的蓝光照射下交联得到GelMA光固化水凝胶。
6.根据权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于：所述的阳离子脂质体为阳离子脂质材料DOPTAP和辅助脂质胆固醇制成的脂质体纳米颗粒。
7.根据权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于：所述的阳离子脂质材料和辅助脂质之间的配比为摩尔比1︰1。
8.根据权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于：由阳离子脂质体与可光固化的水凝胶材料的用量配比为每100ul水凝胶材料中装载35μ～160μg阳离子脂质体。
9.根据权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于：所述的阳离子脂质体中还负载有多肽或核酸作为活性成分；进一步的，所述的核酸为DNA或RNA中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于：所述的RNA为siRNA、shRNA、sgRNA、microRNA、lncRNA或mRNA中的至少一种。
11.根据权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于：所述的siRNA为10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因PTEN的siRNA或噬细胞迁移抑制因子MIF的siRNA中的至少一种。
12.根据权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于：
所述的10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因PTEN的siRNA的核苷酸序列为：
正义链5’-CAGUAGAAAUUGUCCUACA-3’,
反义链5’-UGUAGGACAAUUUCUACUG-3’；
或者，所述的噬细胞迁移抑制因子MIF的siRNA的核苷酸序列为：
正义链5’-CCGCAACUACAGUAAGCUG-3’,
反义链5’-CAGCUUACUGUAGUUGCGG-3’。
13.根据权利要求11或12任一项所述的药物传递系统，其特征在于：当所述的siRNA为10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因PTEN的siRNA和噬细胞迁移抑制因子MIF的siRNA同时使用时，前后两者的质量比为1︰0.5～1。
14.根据权利要求9～13中任一项所述的药物传递系统，其特征在于：所述的阳离子脂质体与活性物质的用量配比为按质量比为：2～10︰1～5。
15.根据权利要求9～13中任一项所述的药物传递系统，其特征在于是由以下方法制备的：
a、制备负载活性成分的纳米颗粒；
b、将a制得的负载活性成分的纳米颗粒分散于可光固化的水凝胶材料。
16.根据权利要求1所述的药物传递系统，其特征在于：所述的制备方法还包括步骤C:在405nm的蓝光照射下交联使水凝胶材料固化。
17.权利要求1～16中任一项所述的药物传递系统在制备药物中的用途。
18.权利要求9～16中任一项所述的药物传递系统在制备治疗脊髓损伤的药物中的用途。
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