CN116072258A - 膀胱癌肿瘤抗原的开发及预测膀胱癌患者指导用药和预后的装置 - Google Patents

膀胱癌肿瘤抗原的开发及预测膀胱癌患者指导用药和预后的装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了膀胱癌肿瘤抗原的开发及预测膀胱癌患者指导用药和预后的装置。本发明在临床样本数据库中筛选并验证了与抗原呈递细胞浸润相关的两个表现出危险因素的蛋白质，可作为潜在肿瘤抗原用于膀胱癌的mRNA疫苗的开发；同时基于预测性免疫相关基因，本发明在膀胱癌患者队列中定义了三种免疫亚型，并分析了三种亚型的特征及对应患者的预后和指导用药，预测了适用于mRNA疫苗的膀胱癌免疫亚型。本发明的结果可应用于膀胱癌的mRNA疫苗的开发，以及为膀胱癌患者的免疫亚型分型和用药指导选择提供参考。

Description

膀胱癌肿瘤抗原的开发及预测膀胱癌患者指导用药和预后的装置
技术领域
本发明涉及医学生物技术领域，具体涉及膀胱癌肿瘤抗原的开发及预测膀胱癌患者指导用药和预后的装置。
背景技术
膀胱癌(BLCA)是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，2020年全球新增病例超过83，000例，死亡人数估计为17，200人(1)。BLCA的风险因素包括高龄、男性、吸烟、慢性炎症、含苯染料和化工制品的职业暴露等。BLCA通常可分为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。前者肿瘤局限于尿路上皮(Ta期)和固有层(T1期)，约占膀胱癌的75％。MIBC侵入肌层(T2期)或更深(T3期和T4期)。高达15％的MIBC病患者有既往NMIBC病史，而其余患者诊断为原发MIBC病。经尿道膀胱肿瘤切除术(TURBT)联合化疗药物或免疫药物的膀胱灌注被视为NMIBC的标准治疗方法。MIBC治疗包括根治性膀胱切除术、部分膀胱切除术、新辅助治疗、化疗、免疫检查点治疗或靶向治疗。然而，尽管以上采用了多模式治疗，但膀胱癌(BLCA)的死亡率和复发率较高。相当比例的膀胱癌患者在经过治疗后依然进展为高级别或发生转移，各种研究中报道的5年进展率2022-09-092022-09-09在0.8％至45％之间(2,3)。因此，需要更有效的治疗方法来改善BLCA患者的预后。
迄今为止，癌症免疫治疗，特别是免疫检查点抑制剂(ICI)治疗作为一种癌症治疗新手段已经获得了相当大的成功。然而，并不是所有患者都受益于免疫疗法，这是因为免疫治疗存在毒副作用和高治疗成本。肿瘤疫苗是癌症免疫治疗中另一种具有良好应用前景的替代方案。肿瘤疫苗持续地诱导免疫记忆反应，在疾病复发的最初时刻重新激活患者的免疫系统以破坏癌细胞。目前，应用于膀胱癌或临床试验阶段的肿瘤疫苗包括卡介苗、MTBVAC(一种来源于结核分枝杆菌的减毒活疫苗)、VPM1002BC(一种改良的卡介苗)、PANVAC(一种基于痘病毒载体的疫苗)等。近年来，mRNA疫苗因其在抗新型冠状病毒病中的应用而备受关注。已经开发了几种基于mRNA的癌症疫苗，并已注册用于各种临床试验阶段，包括前列腺癌、成胶质细胞瘤、黑色素瘤和肾细胞癌。然而，mRNA疫苗在膀胱肿瘤中的应用仍有待探索。
肿瘤相关抗原的成功鉴定是肿瘤疫苗研制的基础。当尽管以上采用了多模式治疗，但膀胱癌(BLCA)的死亡率和复发率较高。被免疫系统识别攻击时，由肿瘤细胞中的遗传和表观遗传突变引起突变的蛋白质可被分类为肿瘤抗原。
相关文献：
1.Siegel RL,Miller KD,Fuchs HE,Jemal A.Cancer Statistics,2021.CA:acancer journal for clinicians(2021)71(1):7-33.doi:10.3322/caac.21654.
2.Lenis AT,Lec PM,Chamie K,Mshs MD.Bladder Cancer:A Review.JAMA(2020)324(19):1980-91.doi:10.1001/jama.2020.17598.
3.Downes MR,Lajkosz K,Kuk C,Gao B,Kulkarni GS,van der Kwast TH.Theimpact of grading scheme on non-muscle invasive bladder cancer progression:potential utility of hybrid grading schemes.Pathology(2022)54(4):425-33.doi:10.1016/j.pathol.2021.10.005.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何对膀胱癌患者进行指导用药和/或如何对膀胱癌患者进行预后预测和/或如何开发用于预防或治疗膀胱癌的mRNA疫苗。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种用于待测膀胱癌患者指导用药的装置，所述装置可包括如下模块：
M1)免疫分型模块：用于基于待测膀胱癌患者的128个基因的表达谱数据使用R语言程序包immcluster进行分析获得待测膀胱癌患者的免疫分型亚型；
M2)指导用药输出模块：用于基于所述免疫分型亚型输出待测膀胱癌患者的指导用药结果：
所述免疫分型亚型为免疫抑制(BIS3)亚型的待测膀胱癌患者的指导用药为免疫检查点抑制剂和/或甲氨蝶呤化疗药物；
所述免疫分型亚型为免疫耗竭(BIS2)亚型的待测膀胱癌患者的指导用药为化疗药物丝裂霉素C、吉西他滨、顺铂、长春碱及阿霉素和/或使用编码肿瘤抗原蛋白质的mRNA制备的靶向所述蛋白质的mRNA疫苗。
所述128个基因为表1所示基因。
所述蛋白质为蛋白质A和/或蛋白质B。所述蛋白质A可为如下蛋白质：
A1)氨基酸序列为序列表中序列1所示；
A2)将A1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
所述蛋白质B可为如下蛋白质：
B1)氨基酸序列为序列表中序列2所示；
B2)将B1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种预测待测膀胱癌患者预后的装置，所述装置包括如下模块：
N1)免疫分型模块：用于基于待测膀胱癌患者的128个基因的表达谱数据使用R语言程序包immcluster进行分析获得待测膀胱癌患者的免疫分型亚型；
N2)预后预测模块：用于基于所述免疫分型亚型预测待测膀胱癌患者的预后；所述免疫分型亚型为免疫抑制(BIS3)亚型的待测膀胱癌患者的预后好于所述免疫分型亚型为免疫激活(BIS1)和免疫耗竭(BIS2)亚型的待测膀胱癌患者。
所述128个基因为表1所示基因。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种用于待测膀胱癌患者指导用药的计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质可使计算机运行如下步骤：
H1)基于待测膀胱癌患者的128个基因的表达谱数据使用R语言程序包immcluster进行分析获得待测膀胱癌患者的免疫分型亚型；
H2)基于所述免疫分型亚型输出待测膀胱癌患者的指导用药结果：
所述免疫分型亚型为免疫抑制(BIS3)亚型的待测膀胱癌患者的指导用药为免疫检查点抑制剂和/或甲氨蝶呤化疗药物；
所述免疫分型亚型为免疫耗竭(BIS2)亚型的待测膀胱癌患者的指导用药为化疗药物丝裂霉素C、吉西他滨、顺铂、长春碱及阿霉素和/或使用编码肿瘤抗原蛋白质的mRNA制备的靶向所述蛋白质的mRNA疫苗。
所述128个基因为表1所示基因；
所述蛋白质可为上文中所述的蛋白质。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了预测待测膀胱癌患者预后的计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质可使计算机运行如下步骤：
I1)基于待测膀胱癌患者的128个基因的表达谱数据使用R语言程序包immcluster进行分析获得待测膀胱癌患者的免疫分型亚型；
I2)基于所述免疫分型亚型预测待测膀胱癌患者的预后；所述免疫分型亚型为免疫抑制(BIS3)亚型的待测膀胱癌患者的预后好于所述免疫分型亚型为免疫激活(BIS1)和免疫耗竭(BIS2)亚型的待测膀胱癌患者。
所述128个基因为表1所示基因。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了检测人基因组128个基因的表达谱的物质在制备预测待测膀胱癌患者指导用药和/或预后的产品中的应用。所述128个基因为表1所示基因。
上文中所述蛋白质作为肿瘤抗原在开发预防和/或治疗膀胱癌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上文中所述蛋白质的mRNA在开发预防和/或治疗膀胱癌的肿瘤疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
编码上文中所述蛋白质的mRNA在开发预防和/或治疗膀胱癌的联合用药中的应用也属于本发明的保护范围。
上文所述的装置和/或上文所述的计算机可读存储介质在开发和/或制备预防和/或治疗膀胱癌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上文所述的装置和/或上文所述的计算机可读存储介质在开发和/或制备预防和/或治疗膀胱癌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明旨在鉴定适用于mRNA疫苗的潜在肿瘤抗原和适用于膀胱癌免疫治疗的癌症亚型。
方法:从癌症基因组图谱(TCGA)、基因表达综合数据库(GEO)和ArrayExpress数据库中构建包含多个样本队列的META队列，获取基因表达谱、突变数据、甲基化数据及相应的临床信息。对微阵列进行免疫组织化学染色，以评估IGF2BP2和MMP9的蛋白表达水平。采用R软件进行差异基因分析、存活分析、相关性分析、一致性聚类分析、免疫细胞浸润分析。最后，基于Combat和eXtreme Gradient Boosting(xboost)算法来预测BLCA样本的免疫聚类，获得膀胱癌的免疫分型亚型。
结果:发现两种过度表达、扩增和突变的肿瘤抗原IGF2BP2和MMP9与临床结局和抗原呈递细胞(APC)的丰度相关。随后，在BLCA队列中定义了三种免疫亚型，包括免疫激活(BIS1)、免疫耗竭(BIS2)和免疫抑制(BIS3)亚型。与BIS3相比，BIS1和BIS2亚型肿瘤的恶性程度更高，具有免疫浸润表型，预后较差。本发明鉴定了三种免疫亚型之间差异表达的五种抗原。免疫亚型相关基因的功能富集分析表明，它们在许多免疫相关过程中富集。最后，将“immcluster”软件包应用于数据集，该软件包经过验证可准确预测许多队列中BLCA样本的免疫亚型。
结论:IGF2BP2和MMP9是开发抗BLCA的mRNA疫苗的潜在抗原。这些结果表明，靶向这两种抗原的免疫治疗将适用于BIS2亚型患者。R包“immcluster”可帮助筛选合适的BLCA患者进行抗肿瘤治疗。
本发明从过度表达、扩增和突变的基因中鉴定出五个基因，这些基因与Meta队列和其他队列中BLCA病患者的预后不良显著相关。此外，本发明发现MMP9和IGF2BP2的基因表达与几种APC的水平呈正相关，这些APC加工肿瘤抗原并将其呈递至CD8+T细胞。此外，本发明验证了这两个基因在临床样本中的表达，发现与邻近的正常组织相比，MMP9和IGF2BP2基因在膀胱癌组织中高度表达，这意味着它们具有开发肿瘤疫苗的潜力。
由于对mRNA疫苗的治疗反应可能仅限于一小部分患者，因此筛选适合接种疫苗的人群至关重要。利用预测性免疫相关基因，本发明将膀胱癌分为三种免疫亚型(BIS1、2和3)。BIS3中的患者在三种亚型中的生存率最好，而BIS2中的患者与其他亚型相比生存期缩短，这表明免疫表型可以作为BLCA病的预后因素。MMP9、IGF2BP2在BIS3中表达最低，在BIS2中表达最高。另外，在BIS3中CP和IPS的免疫表型评分结果最高，而在MHC分子中BIS1和BIS2的评分较高。
与TCGA队列中的BIS1患者相比，BIS3和BIS2亚型患者的肿瘤突变负荷(tumormutational burden,TMB)显著更高。这些结果表明，BIS2亚组患者更可能对针对MMP9和IGF2BP2的mRNA疫苗产生应答，而免疫检查点治疗更适合BIS3患者。针对MMP9、IGF2BP2高表达、TMB低表达的BIS2亚群进行疫苗接种的临床试验是一个有前途的未来方向。在实际疫苗生产中，可以将这两个基因制成二价疫苗组合物，从而扩大疫苗群体，增强免疫应答。或者，肿瘤靶向mRNA疫苗可与传统化疗药物或免疫检查点抑制剂联合应用。
总之，本发明的目的是探索用于开发mRNA疫苗的新型BLCA抗原，并绘制BLCA的免疫景观图，以确定适合接种该mRNA疫苗的BLCA患者及其预后。在临床样本数据库中鉴定并验证了与抗原呈递细胞浸润相关的两个表现出危险因素的基蛋白质，可作为潜在肿瘤抗原用于BLCA的mRNA疫苗的开发；基于预测性免疫相关基因，本发明在BLCA患者队列中定义了三种免疫亚型，并分析了三种不同亚型的特征及对应患者的预后和指导用药。本发明的结果可为BLCA的mRNA疫苗开发和BLCA患者的免疫亚型分型和用药指导选择提供参考。
附图说明
图1为BLCA与临床结局相关的肿瘤抗原鉴定。(A)与OS和DFS显著相关的肿瘤抗原，来自过表达、扩增和突变的交集基因；(B)TCGA·BLCA队列中ZIC2基因的Kaplan-Meier生存曲线分析；(C)SLC6A17基因的Kaplan-Meier生存曲线分析；(D)PCSK9基因的Kaplan-Meier生存曲线分析；(E)mmp9基因的Kaplan-Meier生存曲线分析；(F)IGF2BP2基因的Kaplan-Meier生存曲线分析。横坐标为生存时间，纵坐标为生存率；采用对数秩检验确定差异的统计学意义，P＜0.05具有统计学意义。(G)TCGA·BLCA队列中五种潜在肿瘤抗原的单因素COX分析；(H)META队列中APC与五种肿瘤抗原之间的相关性。
图2为IGF2BP2和MMP9的免疫组织化学评估。(A)BLCA和正常样本中分别出现的IGF2BP2的弱(Weak)、中(Moderate)、强(Strong)免疫组织化学染色。(B)BLCA组织中IGF2BP2与正常组织比较的H评分，纵坐标为免疫组化H-Score评分。“*”代表P＜0.05。(C)BLCA组织与正常组织比较MMP9的H评分，纵坐标为免疫组化H-Score评分。“***”代表P＜0.001。
图3为BLCA免疫亚型的鉴定。(A)变聚类数NMF分析的平方和总和(k＝1-10)，纵坐标为内平方和，横坐标为分群个数。(B)代表META队列中分群热图。(C)BLCA样本通过NMF分析划分为3个聚类后各样本的轮廓系数。(D)三种亚型通过Meta队列中的3D PCA分析进行验证。(E)免疫亚型与TCGA队列中既往研究证实的其他分子亚型的相关性。(F)META队列中三种亚型的OS生存率分析，横坐标为生存时间，纵坐标为生存率。(G)META队列中三种亚型DFS的生存率分析，横坐标为生存时间，纵坐标为生存率。采用对数秩检验确定差异的统计学意义，认为P＜0.05具有统计学意义。(H)IGF2BP2和MMP9基因分3种亚型表达，纵坐标为基因相对表达量。
图4为三种亚型的免疫特征。(A)TCGA·BLCA队列中三种亚型间免疫细胞分数的箱线图。纵坐标为免疫细胞分数，横坐标为免疫细胞类型。(B)METAMETA队列中3种亚型的免疫检查点，横坐标为不同免疫检查点，纵坐标为基因表达水平。(C)用于可视化确定免疫原性参数的免疫表型图。方框图显示了TCGA·BLCA队列中三种亚型的免疫评分(MHC:主要组织相容性复合体相关分子；EC:效应细胞；SC:抑制细胞；CP:检查点或免疫调节剂；AZ:平均z分；IPS:免疫表型评分)。纵坐标为Z-Score评分，横坐标为不同免疫功能类型；“**”代表P＜0.01；“***”代表P＜0.001。
图5为三种亚型间的多组学特征。(A)TCGA·BLCA队列中三种亚型的TMB病箱线图。(B)TCGA·BLCA队列中三种亚型和高/低TMB组的生存率分析，纵坐标为生存率，横坐标为生存时间(年)。(C)TCGA·BLCA队列中三种亚型之间的前20个突变基因的瀑布图。(D)TCGA·BLCA队列中三种亚型之间差异基因突变的三角形图。(Fisher检验，P＜0.05)(E)三种亚型中前500个高甲基化水平的基因热图。(F)TCGA·BLCA队列中三种亚型的免疫相关基因的平均甲基化水平，纵坐标为甲基化水平。
图6为不同亚型的药物敏感性比较。(A)为META队列中不同亚型免疫治疗应答样本的比例，纵坐标为对免疫治疗的不同反应类型的比例。(B)IMvigor210队列中不同亚型的免疫治疗应答样本的比例，纵坐标为对免疫治疗的不同反应类型的比例。(C)为TCGA·BLCA队列中三种亚型之间化疗药物IC50评分的箱线图。纵坐标为IC50的Z-Score评分，横坐标为不同类型化疗药物。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中的分析方法如下：
药物敏感性分析
META队列对免疫治疗的反应通过TIDE网站预测(TIDE，http://tide.dfci.harvard.edu/)。TCGA·BLCA队列中化疗的IC50通过R package"propheritage预测的。
免疫组织化学
BLCA组织及邻近正常膀胱组织微阵列(HBlaU050CS01)购自上海芯超生物科技有限公司，内含50例病例。微阵列的免疫组织化学染色由武汉赛维尔生物科技有限公司完成。使用的一抗是IGF2BP2(Proteintech，，美国，目录编号11601-1-AP；以1:1000稀释度使用)和MMP9(赛维尔，中国，GB11132-2，以1:200稀释度使用)。
组织学评分(H-score)分析用于使用AIpathwell软件(武汉赛维尔生物科技有限公司)评估染色强度。应用了以下公式:
H-score＝∑(Pi×I)＝(弱染色强度细胞百分比×1)+(中等染色强度细胞百分比×2)+(强染色强度细胞百分比×3)(其中Pi表示阳性百分比，I表示强度评分)。
统计分析
采用Mann-Whitney U检验，用非正态分布变量对两组进行比较。多组比较分别采用Kruskal-Wallis方差检验作为非参数方法，或有变量采用卡方检验或Fisher精确检验。采用Spearman检验分析基因表达与免疫细胞丰度的相关性。采用t检验比较正常组织与膀胱癌组间染色强度的差异。使用R软件(版本4.1.2，https://www.r-project.org/)和社会科学软件统计软件包(SPSS，23.0版)P＜0.05被认为具有统计学意义。
免疫和基质浸润的评估
为避免单一算法的偏倚，基于R包“immunedeconv”，采用算法“xCell”、“CIBERSORT”、“肿瘤免疫估计资源(TIMER)”、“MCP-counter”、“EPIC”和“quanTIseq”对BLCA样本的免疫细胞和基质细胞丰度进行了估计。此外，还采用单样本基因集富集分析(ssGSEA)计算了每个样本的23种免疫细胞类型、干细胞的相对丰度以及其他15种信号通路的激活水平。对应于每种免疫细胞类型和相关信号通路的基因列表可从最近的出版物中获得。
实施例1、BLCA潜在抗原的鉴定和BLCA免疫相关基因亚型的获得与分析
1.BLCA潜在抗原的鉴定
1.1数据源和数据处理
数据源来源如下：来源于癌症基因组图谱(TCGA；https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)的膀胱癌患者的基因序列数据，包括表达谱数据(mRNA计数、每百万千碱基片段数(FPKM))、基因突变数据(体细胞基因突变)和甲基化数据(DNA甲基化数据(450k甲基化阵列数据))，称为TCGA·BLCA队列数据；基因拷贝数变异(CNV)、肿瘤突变负荷(TMB)和突变计数数据来源于cBioPortal for Cancer Genomics(cBioPortal；http://www.cbioportal.org)；其他BLCA队列的基因表达谱数据(基因表达或mRNA阵列表达数据)来源于基因表达综合数据库(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)和arrayxpress(https://www.ebi.AC.uk/arrayxpress/)。为了减少批次效应的影响，本发明仅收集了具有存活信息的100份以上样本的BLCA队列(GSE13507、GSE32894和E-MTAB-4321)和TCGA·BLCA队列进行进一步分析。
接下来，本发明使用R语言程序包中的Combat算法减少所有BLCA队列之间的批次效应，并使用sva包产生一个META队列(META队列)，其中包括TCGA·BLCA(患者样本数量n＝411)队列、GSE13507(n＝140)队列、GSE32894(n＝225)队列和E-MTAB-4321(n＝476)队列。
最后，使用R包“IMvigor 210core biologies”从数据集中提取了关于BLCAPD-L1治疗的mRNA测序数据和临床信息。
1.2基因差异表达分析
为了准确选择过度表达的基因并避免数据校正偏差，本发明基于来自TCGA·BLCA(TCGA-BLCA)队列的mRNA计数数据并使用“DESeq2”算法进行了差异分析。选择1,943个以2为底对数倍数变化(Log FC)＞2且经调整的P值＜0.05的基因作为过表达基因进行进一步分析。
1.3BLCA潜在抗原的鉴定
为了检测BLCA的潜在肿瘤抗原，本发明首先鉴定了6,739个在正常组织和肿瘤组织之间过表达的基因和11,978个表现出拷贝数扩增(扩增率＞1％)的基因。然后，通过改变基因组分数和突变计数，共筛选出9,413个突变基因(突变率＞1％)。其中15个基因为最常突变基因。突变分析确定TIN、TP53、MUC16、KMT2D、SYNE1、HMCN1、ARID1A、KDM6A、PIK3CA、KMT2C、MACF1和RYR2是改变基因组部分和突变计数最常突变的基因。总体而言，在TCGA数据集中鉴定了来自Meta队列中所含的过表达、扩增和突变基因的196个交集基因，这些基因可作为潜在的肿瘤抗原。
2.与BLCA预后和抗原呈递细胞相关的肿瘤抗原的鉴定
2.1生存分析
总体生存期(OS)和无病生存期(DFS)不超过30天的样本被排除出TCGA队列。基于TCGA·BLCA队列的mRNA表达数据(log2[TPM+1]，表达量进行转换校正)，使用Kaplan-Meier法和单变量Cox来定义基因的危险比(HR)。采用对数秩检验，使用R语言程序包“survival”评估统计显著性。P值＜0.05被视为具有统计学意义。
2.2与BLCA预后相关的肿瘤抗原的鉴定
将步骤1中获得的196个交集基因用于BLCA预后存活分析，以开发预测相关抗原。结果发现八个基因与BLCA患者的总生存期(OS)相关，其中五个基因(ZIC2、SLC6A17、PCSK9、mmp9和IGF2BP2)与DFS(无病生存期)呈强相关(图1中A)。图1中B-F中的存活曲线表明，与低表达组(图1中B-F中的Low代表)相比，高表达组(图1中B-F中的High代表)肿瘤组织中ZIC2、SLC6A17、PCSK9、MMP9和IGF2BP2的表达升高(过表达)与预后不良显著相关。单因素COX回归分析结果显示，5个基因均是膀胱癌的危险因素(HR＞1)(图1中G)。总之，这五个基因在BLCA被筛选为与患者预后相关的肿瘤抗原。
2.3与BLCA抗原呈递细胞相关的肿瘤抗原的鉴定
抗原呈递细胞(APC)包括树突状细胞(DC)、B细胞和巨噬细胞，负责处理抗原并将其递送至T淋巴细胞，T淋巴细胞启动适应性免疫应答。
本发明使用六种生物信息学算法(具体为使用六种R语言程序包：ssGSEA、XCELL、EPIC、QUANTISEQ、CIBERSORT和MCPCPUNTER)评估了五种过表达基因(ZIC2、SLC6A17、PCSK9、MMP9和IGF2BP2)与抗原呈递细胞丰度之间的关系。如图1中H所示，MMP9和IGF2BP2与多种APC的水平呈正相关(如DC树突状细胞、未成熟B细胞、M0巨噬细胞等)。图2中A所示为基于组织微阵列的免疫组织化学染色结果。与邻近正常组织(图2中Normal代表)比较，IGF2BP2和MMP9在肿瘤组织(图2中Tumor代表)中的表达上调(P＜0.05)(图2中B和C)。MMP9和IGF2BP2被鉴定为具有开发抗BLCAmRNA疫苗前景的两种肿瘤抗原候选物。
其中MMP9的氨基酸序列从N端到C端如下所示：MSLWQPLVLVLLVLGCCFAAPRQRQSTLVLFPGDLRTNLTDRQLAEEYLYRYGYTRVAEMRGESKSLGPALLLLQKQLSLPETGELDSATLKAMRTPRCGVPDLGRFQTFEGDLKWHHHNITYWIQNYSEDLPRAVIDDAFARAFALWSAVTPLTFTRVYSRDADIVIQFGVAEHGDGYPFDGKDGLLAHAFPPGPGIQGDAHFDDDELWSLGKGVVVPTRFGNADGAACHFPFIFEGRSYSACTTDGRSDGLPWCSTTANYDTDDRFGFCPSERLYTQDGNADGKPCQFPFIFQGQSYSACTTDGRSDGYRWCATTANYDRDKLFGFCPTRADSTVMGGNSAGELCVFPFTFLGKEYSTCTSEGRGDGRLWCATTSNFDSDKKWGFCPDQGYSLFLVAAHEFGHALGLDHSSVPEALMYPMYRFTEGPPLHKDDVNGIRHLYGPRPEPEPRPPTTTTPQPTAPPTVCPTGPPTVHPSERPTAGPTGPPSAGPTGPPTAGPSTATTVPLSPVDDACNVNIFDAIAEIGNQLYLFKDGKYWRFSEGRGSRPQGPFLIADKWPALPRKLDSVFEERLSKKLFFFSGRQVWVYTGASVLGPRRLDKLGLGADVAQVTGALRSGRGKMLLFSGRRLWRFDVKAQMVDPRSASEVDRMFPGVPLDTHDVFQYREKAYFCQDRFYWRVSSRSELNQVDQVGYVTYDILQCPED(序列表中序列1)。
IGF2BP2的氨基酸序列从N端到C端如下所示：MMNKLYIGNL SPAVTADDLR QLFGDRKLPLAGQVLLKSGYAFVDYPDQNWAIRAIETLSGKVELHGKIMEVDYSVSKKLRSRKIQIRNIPPHLQWEVLDGLLAQYGTVENVEQVNTDTETAVVNVTYATREEAKIAMEKLSGHQFENYSFKISYIPDEEVSSPSPPQRAQRGDHSSREQGHAPGGTSQARQIDFPLRILVPTQFVGAIIGKEGLTIKNITKQTQSRVDIHRKENSGAAEKPVTIHATPEGTSEACRMILEIMQKEADETKLAEEIPLKILAHNGLVGRLIGKEGRNLKKIEHETGTKITISSLQDLSIYNPERTITVKGTVEACASAEIEIMKKLREAFENDMLAVNQQANLIPGLNLSALGIFSTGLSVLSPPAGPRGAPPAAPYHPFTTHSGYFSSLYPHHQFGPFPHHHSYPEQEIVNLFIPTQAVGAIIGKKGAHIKQLARFAGASIKIAPAEGPDVSERMVIITGPPEAQFKAQGRIFGKLKEENFFNPKEEVKLEAHIRVPSSTAGRVIGKGGKTVNELQNLTSAEVIVPRDQTPDENEEVIVRIIGHFFASQTAQRKIREIVQQVKQQEQKYPQGVASQRSK(序列表中序列2)。
3.BLCA免疫相关基因亚型的获得与特征分析
从immport数据库中共提取了1,811个免疫相关基因(https://www.immport.org/)用于TCGA·BLCA队列的Kaplan-Meier和单变量Cox分析。然后，选择128个预后免疫相关基因进行非负矩阵分解(NMF)分析。然后使用剪影系数和三维主成分分析(3D PCA)基于128个预后免疫相关基因(表1)的mRNA表达数据验证亚型分配。
表1. 128个预后免疫相关基因信息
Figure BDA0003840525750000111
3.1BLCA三种免疫亚型的定义
首先，从immport数据库中总共提取了1,811个免疫相关基因，以筛选TCGA数据库中的预测相关基因。基于META队列中的128个与膀胱癌患者预后显著相关的免疫相关基因的表达谱数据使用非负矩阵分解(NMF)分析进行一致性聚类。使用平方和内总指数(图3中A)，本发明确定了META队列中BLCA患者的最佳聚类数(n＝3)，并定义了三种免疫亚型，分别称为BIS1(免疫激活亚型)、BIS2(免疫耗竭亚型)和BIS3(免疫抑制亚型)、(图3中B)。轮廓图(平均轮廓宽度＝0.98)和3D PCA分析表明三种亚型之间有明显的区分(图3中C和D)。
3.2免疫亚型的生物学特征分析
基于3种BLCA亚型鉴定基因的差异表达，通过GSEA分析和Metascape(https://metascape.org/)进行功能富集分析，鉴定出每种免疫亚型的生物学特征。
将本发明中定义的分类与其他文献所报道的TCGA队列分类情况行了比较，结果显示，BIS1亚型膀胱癌主要富集于TP53样和MS2b1亚型；BIS2亚型样本主要富集于基底细胞和MS2b2亚型；BIS3亚型样本主要富集于Luminal、MS1b和MS2a1亚型(图3中E)。
随后，本发明探讨了生存率与BLCA亚型之间的关系。BIS3(n＝437)与更好的预后相关(对数秩检验，P＜0.001，图3中F和G)，而BIS1(n＝164)和BIS2(n＝186)在Meta队列中的生存概率更低(与BIS3相比预后较差)。此外，每个队列内部独立的统计分析结果一致(TCGA OS:对数秩检验，P＜0.001；TCGA DFS:对数秩检验，P＝0.002；GSE13507:对数秩检验，P＝0.009；GSE32894:对数秩检验，P＜0.001；E-MTAB-4321:对数秩检验，P＜0.001)，表明本发明中确定的三种免疫亚型具有很好的再现性和稳定性。
最后，本发明对三种免疫亚型的表达谱数据进行分析，探索了三种亚型中MMP9和IGF2BP2的表达水平，发现BIS3中这两种潜在肿瘤抗原最低，BIS2中最高(Kruskal-Wallis检验，P＜0.001)(图3中H)。因此，本发明分析确定的三种BLCA患者免疫亚型分型可用于预测患者预后，BIS3亚型患者可能具有比BIS1和BIS2亚型更好的预后。
3.3三种亚型BLCA肿瘤的临床、细胞和免疫浸润特征
由于对mRNA疫苗的应答与肿瘤微环境中的肿瘤免疫状态相关，因此使用CIBERSORT算法评估了三种亚型中22种免疫细胞亚群的比例(图4中A)。BIS3显示出CD8+T细胞、B细胞和单核细胞的丰度较高，而BIS3显示免疫抑制细胞(如M2巨噬细胞)的比例较低。因此得出结论，BIS3亚型表现出“活性”免疫表型，而BIS1和BIS2亚型表现出“抑制性”免疫表型。
通过分析三种亚型中某些共抑制和共刺激分子的表达(图4中B)，结果发现大多数分子在三个亚组中差异表达。
接下来，通过免疫表型评分(IPS)来表征肿瘤亚群的免疫原性。结果显示，BIS3在免疫检查点或免疫调节剂(CP)和IPS中得分较高，而BIS1和BIS2在主要组织相容性复合体相关分子(MHC分子)中得分较高(图4中C)。这些结果表明，免疫亚型反映了BLCA免疫状态，可根据是否适合mRNA疫苗接种对患者进行分层。靶向MMP9和IGF2BP2的mRNA疫苗可能在免疫“抑制性”BIS1和BIS2肿瘤患者的肿瘤微环境中诱导免疫浸润。
3.4三种亚型内BLCA肿瘤的分子和多组学特征
高肿瘤突变负荷(TMB)与新抗原表达相关，新抗原由MHC蛋白呈递至T细胞并诱导效应T细胞应答。高TMB也与免疫检查点抑制剂(ICI)和mRNA疫苗接种应答的改善相关。与TCGA队列中BIS1患者相比，属于BIS3和BIS2亚型的BLCA患者的TMB评分显著更高(图5中A；P＜0.05)。将TMB作为变量时，三种亚型之间的总生存率差异具有高度显著性(P＜0.001)；与BIS2和BIS1相比，BIS3(高TMB)预后最好(图5中B的High TMB+BIS3所代表)，与BIS3和BIS1相比，BIS2(低TMB)预后最差(图5中B的Low TMB+BIS2所代表)，与步骤3.2中的结果(图3中F-G)一致。3种免疫亚型中，BIS2突变率最高(98.39％)，其次为BIS3(95.74％)、BIS1(84.21％)，图5中C显示了三种亚型之间20个最常突变基因的情况：TP53是所有三个亚组中突变频率最高的基因(图5中C-D，P＜0.05)。总体而言，本发明发现TMB与定义的三种BLCA免疫亚型有明显关系，免疫检查点抑制剂更适合BIS3患者；BIS2免疫亚型患者更可能会针对使用MMP9和IGF2BP2作为肿瘤抗原制备的mRNA疫苗产生应答。针对MMP9、IGF2BP2高表达、TMB低表达的BIS2免疫亚型亚群患者可进行靶向MMP9和IGF2BP2的mRNA疫苗的临床试验和治疗。
相关研究发现，DNA甲基化可以影响BLCA的免疫状态。为了探索全基因组DNA甲基化与免疫亚型的关系，本发明对人类DNA甲基化水平最高的500个基因进行了NMF分析，表征了三种免疫亚型的DNA甲基化水平。结果表明，BIS3与DNA甲基化亚型的聚类2和聚类3相对应(图5中E)。与BIS1和BIS2相比，BIS3中全基因组DNA甲基化水平更低(图5中F)。该结果提示DNA甲基化可能直接影响BLCA的免疫状态。针对MMP9、IGF2BP2高表达、TMB低表达的BIS2亚群进行疫苗接种的临床试验是一个有前途的未来方向。
实施例2、预测BLCA患者免疫亚型的分类器R包“immcluster”的构建和发布
1.预测BLCA患者免疫亚型的分类器的构建:为了使本发明实施一中分析获得的免疫亚型具有可重复性和可推广性，本发明开发了一个基于XGBoost分类器来预测新样本中的免疫亚型。
首先，本发明基于1,811个免疫相关基因对训练队列(TCGA·BLCA队列)中的免疫亚型进行了成对差异分析。共有264个交集差异表达基因(P＜0.01)被优先作为免疫亚型相关基因用于进一步分析。Metascape分析显示，这些基因与细胞免疫反应性密切相关。
接下来，本发明使用XGBoost算法创建一个分类器来预测免疫亚型；使用xboost的10倍交叉验证分析，使用训练队列(TCGA·BLCA队列)优化了xboost模型的参数(最大深度＝6，ta＝0.4，nround＝100)。
随后，为了便于该模型的使用并验证所提出的免疫亚型，本发明制作了分类器的R语言程序包“immcluster”，并发布于Github网站上(相关网址：https://github.com/zylrpackage 2022/immcluster)。
并将其应用于TCGA·BLCA队列(培训队列)、Meta队列(不包括TCGA·BLCA，即试验队列)和三个独立队列(GSE13507、GSE32894或E-MTAB-4321)分别验证分类器的准确性，具体为将这些队列中的实施例1步骤3中筛选获得的128个基因(表1)的基因表达谱数据使用分类器软件包即R语言程序包“immcluster”进行BLCA免疫亚型分型分析：R语言程序包“immcluster”分型后输出的A型代表BIS1免疫亚型，B型代表BIS2免疫亚型，C型代表BIS3免疫亚型。通过与实施例1中分析获得的BLCA免疫亚型分型结果进行比较显示，R语言程序包“immcluster”输出结果的准确率分别为1.000、0.809、0.803、0.825和0.841，显示了分类器软件包的稳健性能。重要的是,“immcluster”r包可以消除多个数据集数据的批处理效应，从而提高验证数据集的准确性和预测能力。
2.有助于BLCA抗肿瘤治疗的免疫亚型和分类器
由于肿瘤的免疫特征与治疗疗效相关，本发明进一步探讨了不同免疫亚型对抗肿瘤治疗的反应性。
首先，本发明使用tid算法选择对免疫检查点阻断反应较好的患者(ICB)。结果显示，BIS3亚型患者的tid评分低于BIS1和BIS2，BIS3应答ICB的患者比例最高，其次是BIS2和BIS1(P＜0.001)，提示BIS2患者更适用于免疫检查点阻断治疗反应(图6中A)。
本发明在IMvigor210试验数据(来自于IMvigor210CoreBiologies包)中进一步验证了TIDE预测的结果，通过研究PD-L1阻断在转移性尿路上皮癌中的临床活性，发现BIS3对PD-L1反应的个体比例最高(27％)，其次是BIS2(24％)和BIS1(15％)，与tid预测一致(图6中B)。
最后，本发明预测了TCGA·BLCA队列中多种化疗药物的IC50。结果表明，BIS2亚型对丝裂霉素C、吉西他滨、顺铂、长春碱、阿霉素等药物最敏感，BIS3亚型对甲氨蝶呤治疗最敏感(P＜0.001)(图6中C)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种用于待测膀胱癌患者指导用药的装置，其特征在于：所述装置包括如下模块：
M1)免疫分型模块：用于基于待测膀胱癌患者的128个基因的表达谱数据使用R语言程序包immcluster进行分析获得待测膀胱癌患者的免疫分型亚型；
M2)指导用药输出模块：用于基于所述免疫分型亚型输出待测膀胱癌患者的指导用药结果：
所述免疫分型亚型为免疫抑制(BIS3)亚型的待测膀胱癌患者的指导用药为免疫检查点抑制剂和/或甲氨蝶呤化疗药物；
所述免疫分型亚型为免疫耗竭(BIS2)亚型的待测膀胱癌患者的指导用药为化疗药物丝裂霉素C、吉西他滨、顺铂、长春碱及阿霉素和/或使用编码肿瘤抗原蛋白质的mRNA制备的靶向所述蛋白质的mRNA疫苗；
所述128个基因为表1所示基因；
所述蛋白质为蛋白质A和/或蛋白质B；所述蛋白质A为如下蛋白质：
A1)氨基酸序列为序列表中序列1所示；
A2)将A1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；
所述蛋白质B为如下蛋白质：
B1)氨基酸序列为序列表中序列2所示；
B2)将B1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
2.预测待测膀胱癌患者预后的装置，其特征在于：所述装置包括如下模块：
N1)免疫分型模块：用于基于待测膀胱癌患者的128个基因的表达谱数据使用R语言程序包immcluster进行分析获得待测膀胱癌患者的免疫分型亚型；
N2)预后预测模块：用于基于所述免疫分型亚型预测待测膀胱癌患者的预后；所述免疫分型亚型为免疫抑制(BIS3)亚型的待测膀胱癌患者的预后好于所述免疫分型亚型为免疫激活(BIS1)和免疫耗竭(BIS2)亚型的待测膀胱癌患者；
所述128个基因为表1所示基因。
3.一种用于待测膀胱癌患者指导用药的计算机可读存储介质，其特征在于：所述计算机可读存储介质使计算机运行如下步骤：
H1)于基于待测膀胱癌患者的128个基因的表达谱数据使用R语言程序包immcluster进行分析获得待测膀胱癌患者的免疫分型亚型；
H2)基于所述免疫分型亚型输出待测膀胱癌患者的指导用药结果：
所述免疫分型亚型为免疫抑制(BIS3)亚型的待测膀胱癌患者的指导用药为免疫检查点抑制剂和/或甲氨蝶呤化疗药物；
所述免疫分型亚型为免疫耗竭(BIS2)亚型的待测膀胱癌患者的指导用药为化疗药物丝裂霉素C、吉西他滨、顺铂、长春碱及阿霉素和/或使用编码肿瘤抗原蛋白质的mRNA制备的靶向所述蛋白质的mRNA疫苗；
所述128个基因为表1所示基因；
所述蛋白质为权利要求1中所述的蛋白质。
4.预测待测膀胱癌患者预后的计算机可读存储介质，其特征在于：所述计算机可读存储介质使计算机运行如下步骤：
I1)基于待测膀胱癌患者的128个基因的表达谱数据使用R语言程序包immcluster进行分析获得待测膀胱癌患者的免疫分型亚型；
I2)基于所述免疫分型亚型预测待测膀胱癌患者的预后；所述免疫分型亚型为免疫抑制(BIS3)亚型的待测膀胱癌患者的预后好于所述免疫分型亚型为免疫激活(BIS1)和免疫耗竭(BIS2)亚型的待测膀胱癌患者；
所述128个基因为表1所示基因。
5.检测人基因组128个基因的表达谱的物质在制备预测待测膀胱癌患者指导用药和/或预后的产品中的应用；所述128个基因为表1所示基因。
6.权利要求1中所述蛋白质作为肿瘤抗原在开发预防和/或治疗膀胱癌的产品中的应用。
7.编码权利要求1中所述蛋白质的mRNA在开发预防和/或治疗膀胱癌的肿瘤疫苗中的应用。
8.编码权利要求1中所述蛋白质的mRNA在开发预防和/或治疗膀胱癌的联合用药中的应用。
9.权利要求1所述的装置和/或权利要求3所述的计算机可读存储介质在开发和/或制备预防和/或治疗膀胱癌的产品中的应用。
10.权利要求2所述的装置和/或权利要求4所述的计算机可读存储介质在开发和/或制备预防和/或治疗膀胱癌的产品中的应用。
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