CN116042817A - 一种肿瘤预后因子及免疫生物标志物的生物标记方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种肿瘤预后因子及免疫生物标志物的生物标记方法、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肿瘤预后因子及免疫生物标志物的生物标记方法、试剂盒及其应用，KIF26B蛋白作为肿瘤预后因子及免疫生物标志物在肿瘤转移诊断和/或预后评估试剂、试剂盒或检测装置中的应用；检测KIF26B蛋白表达的产品在肿瘤转移诊断和/或预后评估中的应用；一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于，包括与KIF26B蛋白特异性结合的检测物；所述检测物包括与KIF26B蛋白特异性结合的引物对、探针和抗体中的至少一种。本发明揭示KIF26B作为一种致癌基因，与多种肿瘤的诊断和预后密切相关。此外，在大多数肿瘤中，KIF26B可能影响CD8+T细胞的浸润及分子信号通路。该研究有助于更好地理解KIF26B在肿瘤发生发展中的作用机制，为更精准有效的个性化肿瘤治疗提供新的视角。

Description

一种肿瘤预后因子及免疫生物标志物的生物标记方法、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肿瘤预后因子及免疫生物标志物的生物标记方法、试剂盒及其应用。
背景技术
随着基因组学和蛋白组学的飞速发展，越来越多的致癌基因和抑癌基因进入人们的视线。肿瘤的发生及发展是由一系列复杂的机制决定的，单个基因也可以影响多个恶性肿瘤的发展。因此，综合分析各种癌症的基因谱信息及不同基因在各种癌症中的作用及机制具有重要的研究意义。
肌动蛋白家族成员26B(Elevated kinesin family member 26B，KIF26B)是驱动蛋白家族的一员，具有对间充质细胞的粘附和极化作用。已有研究表明，KIF26B在多种肿瘤，包括乳腺癌、胃癌、直肠癌和肝癌中是一种促癌基因，KIF26B高表达与肿瘤大体积、高转移风险以及不良预后密切相关。
越来越多的证据表明，肿瘤免疫微环境参与了肿瘤的发生发展。肿瘤免疫治疗联合放化疗已被广泛用于恶性肿瘤的临床治疗，但其抗肿瘤的有效性及作用机制尚未完全阐明。因此，研究靶向肿瘤免疫微环境的标志物对于评估免疫治疗及免疫治疗联合基础抗肿瘤治疗的疗效至关重要。
全面的生物信息学研究发现，KIF26B在乳腺癌和结肠癌中可作为潜在的评估疗效和预后的生物标志物。同时，KIF26B也被认为是Wnt5a-Ror通路的下游靶点，该通路可调节细胞骨架驱动的过程，包括细胞迁移、极化和粘附。然而，迄今为止，有关KIF26B在癌症中的作用的研究报道仅限于单一的肿瘤类型和特定的作用机制，尚缺乏在多个癌种中的泛癌分析。
已有不少研究报道，KIF26B是多种肿瘤预后不良的因素之一，是肿瘤增殖、侵袭、转移和耐药的驱动基因。H Zhang等报道，KIF26B可以通过VEGF信号通路参与多种恶性肿瘤的发生。然而，由于肿瘤的异质性，特定基因在不同肿瘤中的表达和功能不同。KIF26B在不同肿瘤发生发展中的分子机制有待深入探讨。目前，尚未有文献综合分析关于KIF26B在多种肿瘤中的作用机制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤预后因子及免疫生物标志物的生物标记方法、试剂盒及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明首次通过多种生物信息学工具对KIF26B进行泛癌分析，包括基因表达水平、生存分析、基因突变状态、蛋白磷酸化情况、CD8+T细胞免疫浸润、通路富集分析等，具有KIF26B对肿瘤的预后和免疫学价值。
本发明发现KIF26B在22种肿瘤中高表达，且与患者生存预后有关；基因突变是KFI26B最常见的遗传学改变，在乳腺癌、肾透明细胞癌、肺腺癌、子宫内膜癌中均表现出S977位点磷酸化；KIF26B与CD8+T细胞的免疫浸润有关；KEGG富集分析提示KIF26B与“PI3K-AKT通路”,“细胞凋亡”和“细胞周期”信号通路有关；GO分析提示KIF26B相关基因与“细胞外基质结构构成物”、“GTP结合蛋白”、“GTP活性”、“飘零核糖核酸结合”及“细胞骨架的结构成分”有关。
我们的研究结论：KIF26B是一个促癌基因，在多种肿瘤中参与CD8+T细胞的免疫浸润并与多条信号通路有关。KIF26B可作为一种肿瘤预后因子及免疫生物标志物的生物标记。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种肿瘤预后因子及免疫生物标志物的生物标记方法，其特征在于，包括
S1：对KIF26B基因表达水平进行分析；进行预后生存分析；对KIF26B相关基因富集分析；
S2：确保KIF26B影响CD8+T细胞的浸润及分子信号通路；
S3：将KIF26B蛋白作为肿瘤预后因子及免疫生物标志物，用于检测KIF26B蛋白表达的产品在肿瘤转移诊断和/或预后评估。
KIF26B蛋白作为肿瘤预后因子及免疫生物标志物在肿瘤转移诊断和/或预后评估试剂、试剂盒或检测装置中的应用。
检测KIF26B蛋白表达的产品在肿瘤转移诊断和/或预后评估中的应用。
一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于，包括与KIF26B蛋白特异性结合的检测物。
所述检测物包括与KIF26B蛋白特异性结合的引物对、探针和抗体中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明揭示KIF26B作为一种致癌基因，与多种肿瘤的诊断和预后密切相关。此外，在大多数肿瘤中，KIF26B可能影响CD8+T细胞的浸润及分子信号通路。该研究有助于更好地理解KIF26B在肿瘤发生发展中的作用机制，为更精准有效的个性化肿瘤治疗提供新的视角。
附图说明
图1为本发明KIF26B在不同肿瘤中的表达水平示意图；
图2为本发明KIF26B基因在肿瘤组织和健康组织中的表达示意图；
图3为本发明KIF26B在不同肿瘤中的生存分析示意图；
图4为本发明KIF26B在TCGA肿瘤中的基因改变情况示意图；
图5为本发明通过CPTAC数据库分析正常组织和肿瘤样本间KIF26B蛋白磷酸化水平的差异示意图；
图6为本发明KIF26B表达与内皮细胞免疫浸润的相关性分析示意图；
图7为本发明肿瘤相关成纤维细胞中KIF26B表达与免疫浸润的相关性分析示意图；
图8为本发明KIF26B基因的富集分析示意图；
图9为本发明弥漫性大B细胞淋巴瘤、胶质母细胞瘤、脑低级别胶质瘤、睾丸生殖细胞瘤与相应的正常样本差异对照图。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例
一、材料和方法
1、KIF26B基因表达水平分析：
在肿瘤免疫细胞浸润评估2(tumor immune estimation resource,version 2，TIMER2)上分析不同癌症中KIF26B的mRNA水平。阈值设置如下：log2FC(log2 fold change)≥1或≤﹣1，p值≤0.01。采用基因表达谱数据动态分析2(Gene Expression ProfilingInteractive Analysis,version 2,GEPIA2)，通过比较基因型组织表达(Genotype-TissueExpression,GITEx)数据库中的非肿瘤组织(如TCGA-DLBC,TCGA-SKCM等)，分析TCGA数据库中不含相应正常组织肿瘤的KIF26B表达水平。
通过开放数据库HPA比较KIF26B在健康组织和肿瘤组织中的蛋白表达谱。HPA网站下载KIF26B蛋白的免疫组化(IHC)染色图像。
UALCAN是一个综合型，交流式的在线平台，用于分析公开可用的TCGA癌症数据。通过临床蛋白质组肿瘤分析协会(CPTAC)验证或发现工具进行KIF26B蛋白磷酸化水平的分析。
2、预后生存分析
GEPIA2的“生存图谱”模块用于评估KIF26B在所有TCGA肿瘤中的总生存期(OS)和无病生存期(DFS)。区分低表达组和高表达组的阈值定义为高临界值(50％)和低临界值(50％)。通过GEPIA2获得生存曲线，并采用对数秩检验比较两组曲线。
3、遗传变异分析
通过cBioPortal检索KIF26B的突变频率、突变类型和拷贝数改变等遗传变异数据。总体的、无病和无进展生存的信息从“比较”模块中获得。包括根据是否有KIF26B基因改变对TCGA癌症病例进行log-rank p值的Kaplan-Meier分析。
4、免疫细胞浸润分析
我们通过TIMER2的“免疫基因”模块探讨了不同癌症中KIF26B表达水平与免疫细胞浸润(包括CD8+T细胞和肿瘤相关成纤维细胞)的关系。我们使用TIMER,CIBERSORT,CIBERSORT-ABS,QUANTISEQ,XCELL,MCPCOUNTER和EPIC算法对免疫浸润情况进行分析。p值和偏相关(cor)值由斯皮尔曼等级相关检验确定。结果以散点图和热图的形式展现。
5、KIF26B相关基因富集分析
从STRING网址获得与KIF26B相结合的蛋白。然后以所有TCGA肿瘤和正常组织表达数据为基础，利用GEPIA2对前100个KIF26B相关的靶基因进行Pearson相关性分析。
此外，我们通过TIMER2的“Gene_Corr”模块获得了所选基因的热图，包括偏相关(cor)和p值。用Venn图表分析与KIF26B结合和相互作用的基因。
二、结果
1、基因表达数据分析
应用TIMER2分析KIF26B在各种癌症中的表达水平。如图1a所示，KIF26B的表达水平在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、浸润性乳腺癌(BRCA)、宫颈癌(CESC)、胆管癌(CHOL)、结肠腺癌(COAD)、食管癌(ESCA)、多形性胶质细胞瘤(GBM)、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、HNSC-HPV+、肾嫌色细胞癌(KICH)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、肝细胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)、前列腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)、胃腺癌(STAD))、甲状腺癌(THCA)、子宫内膜癌(UCEC)中均高于癌旁组织。
为了进一步探讨KIF26B在肿瘤组织和正常组织中是否存在差异表达，使用GTEx数据库作为对照。发现在皮肤黑色素瘤(SKCM)和胸腺瘤(THYM)中，KIF26B在肿瘤组织中高表达(P<0.05)(图1b)。弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC))、胶质母细胞瘤(GBM)、脑低级别胶质瘤(LGG)、睾丸生殖细胞瘤(TGCT)与相应的正常样本均无显著性差异(图9，P<0.05)。
此外，通过HPA数据库对KIF26B的免疫组化结果进行分析，并将TCGA数据库中基因表达数据的结果作为比较。两个数据库的结果基本一致。在BRCD、CESC、COAD、LIHC、LUAD、LUSC、卵巢浆液性囊腺癌(OV)、READ、STAD、UCEC中，KIF26B表达均显著高于相应的正常组织(P<0.01)。
利用HEPIA2“病理分期图”模块观察KIF26B表达与肿瘤病理分期的关系，在BLCA、KICH、LIHC和PAAD中均有显著性差异(P<0.01)(图2)。
2、生存分析数据
采用GEPIA数据库研究KIF26B在各种癌症中的预后价值。评估TCGA和GEO数据库中样本的总生存期(OS)和无病生存期(DFS)。肿瘤患者分为KIF26B低表达组和高表达组。如图3a-d所示，在结肠癌(P＝0.018)，脑低级别胶质瘤(P＝0.0083)，间皮瘤(P＝0.0034)及卵巢浆液性囊腺癌(P＝0.039)中，KIF26B高表达组的OS明显降低，而在肾上腺皮质癌(P＝0.012)和葡萄膜黑色素瘤(P＝0.03)中，KIF26B低表达组中的DFS延长明显延长(图3e-f)。
3、KIF26B在不同癌症中的基因改变数据
本实施例分析了TCGA数据库中不同癌症患者中KIF26B基因的改变情况。
结果表明，在子宫内膜癌、浸润性乳腺癌、皮肤黑色素瘤、子宫肉瘤、肝细胞肝癌、食管腺癌、胃癌中KIF26B基因的突变频率较高(>10％)，而在浸润性乳腺癌、子宫肉瘤、肝细胞肝癌、食管腺癌、卵巢癌和胆管癌中的基因扩增频率最高(>5％)(图4a)。值得注意的是，所有CHOL病例均伴有KIF26B扩增基因改变(约7％)(图4a)。图4b显示了KIF26B基因改变的类型、位点和病例数。此外，本实施例还分析了KIF26B基因改变与不同癌症患者临床预后之间的潜在相关性。如图4c所示，KIF26B突变的子宫内膜癌患者在疾病特异性生存期(P＝0.0363)、总生存期(P＝0.0266)和无进展生存期(P<0.01)方面预后较好。
4、KIF26B蛋白磷酸化数据分析
本实施例通过使用CPTAC数据库分析了乳腺癌、肾透明细胞癌、肺腺癌和子宫内膜癌肿瘤样本与正常组织中KIF26B蛋白磷酸化水平的差异。图5a总结了KIF26B的磷酸化位点及肿瘤和正常组织之间的差异。在这四种类型的肿瘤样本中，S977位点的磷酸化水平均高于正常组织。在乳腺癌中，S1006、S1081、S1724、S1772和S1979位点的KIF26B磷酸化水平高于正常组织，LUAD中的S1953位点和UCEC中的S1773位点也高于正常组织(图5b-g)。
5、免疫浸润数据分析
本实施例采用XCELL、MCP-COUNTER、EPIC和TIDE算法研究不同免疫细胞浸润程度与不同类型TCGA肿瘤中KIF26B基因表达的潜在相关性。结果显示，在宫颈癌、结肠癌、头颈部鳞癌、肺腺癌、肺鳞癌、卵巢癌、前列腺癌、直肠腺癌、皮肤黑色素瘤、胃癌和睾丸癌中，KIF26B的表达与内皮细胞免疫浸润之间存在正相关(图6)。
此外，在TCGA肿瘤中，包括肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、浸润性乳腺癌、宫颈癌、直肠癌、食管鳞癌、头颈部鳞癌、肾透明细胞癌、肝细胞肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠腺癌、胃癌、睾丸癌，KIF26B表达与肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的浸润呈正相关(图7a)。其结果通过散点图呈现(图7b)。
例如，通过肾上腺皮质癌中MCPCOUNTER算法的相关性分析，结果显示，KIF26B表达水平与CAFs的浸润程度呈正相关(图7b,cor＝-0.331,P＝4.40e-12)。
6、KIF26B相关基因GO和KEGG富集分析
为进一步探究KIF26B在肿瘤发生发展中的分子机制，本实施例对KIF26B相关基因和其结合蛋白进行了通路富集分析。首先，通过蛋白数据库(STRING)构建了基于100个KIF26B结合蛋白蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络(图8a)。此外，利用TCGA和/或GEPIA2工具的GTEx数据库，探索与KIF26B表达相关基因。
结果显示，KIF26B表达水平与ADAM12(ADAM metallopeptide ase Domain 12)(R＝0.48)、CDH11(Cadherin 11)(R＝0.5)、COL5A2(Collagen Type V Alpha 2chain)(R＝0.47)、COL6A3(Collagen Type VI Alpha 3 Chain)(R＝0.46)和MYH9(Myosin HeavyChain 9)(R＝0.34)基因均呈正相关(P<0.001)(图8b)。如图8c所示，在多种癌症类型中，KIF26B的表达水平也与上述5个基因呈正相关。通过Venn图将上述两组数据取交集，筛选出一个共同的基因MYH9(图8d)。最后，基于这两个数据库进行KEGG和GO富集分析。KEGG富集分析结果表明，KIF26B相关基因可能通过“PI3K-AKT信号通路”、“凋亡通路”和“细胞周期”途径影响肿瘤的发生和发展；GO富集数据显示，这些基因主要与“细胞外基质结构构成物”、“GTP结合”、“GTPase活性”、“嘌呤核糖核糖苷结合”和“细胞骨架结构组成物”有关(图8f)。
本实施例通过TCGA、CPTAC和GEO等数据库总结了KIF26B基因在33种不同肿瘤中的分子特征，并预测了该基因在肿瘤发生发展中的作用机制。基因表达分析表明，KIF26B在23种类型的肿瘤组织中表达明显高于相邻正常组织，进一步的免疫组化分析在蛋白水平上也证实了这一趋势，提示KIF26B在各种肿瘤组织中普遍高表达，对其进行泛癌分析具有一定的价值。
本实施例证明了肿瘤组织中KIF26B蛋白的磷酸化水平明显高于正常组织且在不同肿瘤种具有不同的磷酸化位点。这些研究表明，明确特定癌症类型的磷酸化位点至关重要，针对KIF26B的精准治疗取决于个体化的基因诊断。
本实施例显示，除结肠癌、皮肤黑色素瘤和转移性黑色素瘤外，大多数肿瘤中CD8+T细胞的免疫浸润与KIF26B表达呈正相关。免疫治疗通过监测和清除肿瘤细胞已成为一种新的抗肿瘤策略，尤其是CD8+T细胞是抗肿瘤免疫中最重要的细胞群，是肿瘤浸润淋巴细胞的重要组成部分。因此，CD8+T细胞的功能和活性与患者对免疫治疗的反应性密切相关。在结肠癌、皮肤黑色素瘤和转移性黑色素瘤中，KIF26B的表达与CD8+T细胞免疫浸润水平呈负相关。因此，针对CD8+T细胞激活或阻断肿瘤细胞清除率可能改善这些癌症患者的预后。
最后，我们通过KEGG和GO分析来探讨KIF26B的分子机制。结果显示，KIF26B相关基因ADAM12、CDH11、COL5A2、COL6A3和MYH9主要富集在“PI3K-AKT信号通路”、“凋亡通路”和“细胞周期通路”中。富集分析表明，KFI26B可能通过促进肿瘤生长、抑制细胞凋亡和重新分配细胞周期发挥其致瘤作用。
综上所述，本实施例首次发现KIF26B作为一种致癌基因，与多种肿瘤的诊断和预后密切相关。此外，在大多数肿瘤中，KIF26B可能影响CD8+T细胞的浸润及分子信号通路。该研究有助于更好地理解KIF26B在肿瘤发生发展中的作用机制，为更精准有效的个性化肿瘤治疗提供新的视角。
附注：
图1：KIF26B在不同肿瘤中的表达水平。(a)TIMER2网站分析KIF26B在特定肿瘤类型中的表达水平；(b)与GTEx数据库中的健康组织相比，TCGA队列中皮肤黑色素瘤、胸腺瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、脑胶质瘤、脑低级别胶质瘤和睾丸生殖细胞肿瘤的箱线图数据(*P<0.05)。
图2：在TCGA数据库中，KIF26B基因在肿瘤组织和健康组织中的表达(左)；正常组织(中)和肿瘤组织(右)的免疫组化图。(a)浸润性乳腺癌；(b)宫颈癌；(c)结肠癌；(d)肝细胞肝癌；(e)肺腺癌；(f)肺鳞癌；(g)卵巢癌；(h)直肠腺癌；(i)胃腺癌；(j)子宫内膜癌。
图3：(a-d)KIF26B在不同肿瘤中的生存分析。KIF26B低表达和高表达组结肠癌、脑低级别胶质瘤、间皮瘤和卵巢癌的总生存期；(e-f)KIF26B低表达和高表达组肾上腺皮质癌和葡萄膜黑素瘤的无病生存期。
图4：KIF26B在TCGA肿瘤中的基因改变情况。使用cBioPortal分析TCGA中肿瘤的突变特征，(b)突变类型的频率；(b)突变的位点；(c)KIF26B基因改变与各种肿瘤患者临床预后的潜在关系。
图5：通过CPTAC数据库分析正常组织和肿瘤样本间KIF26B蛋白磷酸化水平的差异。(a)KIF26B磷酸化位点的总结；多种肿瘤中特定磷酸化位点的盒线图，包括乳腺癌(b)，肺腺癌(c-d)，肾透明细胞癌(e)和子宫内膜癌(f-g)。
图6：KIF26B表达与内皮细胞免疫浸润的相关性分析。XCELL、MCP-COUNTER和EPIC算法用于评估各种TCGA肿瘤中的潜在关联。
图7：肿瘤相关成纤维细胞中KIF26B表达与免疫浸润的相关性分析。XCELL、MCP-COUNTER和EPIC算法用于评估各种TCGA肿瘤中的潜在关联。
图8：KIF26B基因的富集分析。(a)利用STRING数据库分析与KIF26B相结合的基因；(b)通过GEPIA2工具检测TCGA和/或GTEx数据库中KIF26B相关基因的表达；KIF26B表达水平与ADAM12、CDH11、COL5A2、COL6A3、MYH9的表达呈正相关；(c)不同肿瘤类型这5个与KIF26B表达相关基因的热图；(d)通过韦恩图分析选择KIF26B结合基因与相互作用基因的交叉基因；(e-f)根据KIF26B结合和互作基因的数据进行KEGG和GO富集分析。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明新型精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (4)

1.一种肿瘤预后因子及免疫生物标志物的生物标记方法，其特征在于，包括
S1：对KIF26B基因表达水平进行分析；进行预后生存分析；对KIF26B相关基因富集分析；
S2：确保KIF26B影响CD8+T细胞的浸润及分子信号通路；
S3：将KIF26B蛋白作为肿瘤预后因子及免疫生物标志物，用于检测KIF26B蛋白表达的产品在肿瘤转移诊断和/或预后评估。
2.根据权利要求1所述的肿瘤预后因子及免疫生物标志物的生物标记方法，其特征在于：所述KIF26B蛋白作为肿瘤预后因子及免疫生物标志物在肿瘤转移诊断和/或预后评估试剂、试剂盒或检测装置中的应用，检测KIF26B蛋白表达的产品在肿瘤转移诊断和/或预后评估中的应用。
3.一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于，包括与KIF26B蛋白特异性结合的检测物。
4.根据权利要求3所述的肿瘤检测试剂盒，其特征在于：所述检测物包括与KIF26B蛋白特异性结合的引物对、探针和抗体中的至少一种。
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