CN116042509A - 基于密闭系统的单细胞悬液制备方法 - Google Patents

基于密闭系统的单细胞悬液制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116042509A
CN116042509A CN202310029482.2A CN202310029482A CN116042509A CN 116042509 A CN116042509 A CN 116042509A CN 202310029482 A CN202310029482 A CN 202310029482A CN 116042509 A CN116042509 A CN 116042509A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
peristaltic pump
cup
fluid
cell suspension
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310029482.2A
Other languages
English (en)
Inventor
郭翔
王雪伟
马墨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Eureka Biology Technology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Eureka Biology Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Eureka Biology Technology Co ltd filed Critical Shenzhen Eureka Biology Technology Co ltd
Priority to CN202310029482.2A priority Critical patent/CN116042509A/zh
Publication of CN116042509A publication Critical patent/CN116042509A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C12M37/04—Seals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/02—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of foam
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明提供一种基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，用于将结团的细胞重悬为单细胞悬液，所述制备方法包括：步骤A：利用流体驱动元件驱动细胞液从离心杯(110)流入产品容器(103)；步骤B：利用流体驱动元件驱动细胞液从产品容器(103)流入离心杯(110)；步骤C：多次重复步骤A和步骤B；以及步骤D：利用流体驱动元件驱动细胞液从离心杯(110)流入产品容器(103)。本发明是基于密闭系统、稳定可重复的单细胞悬液制备技术，重悬过程污染风险小，单细胞重悬效果好，且细胞生物活性不受影响。

Description

基于密闭系统的单细胞悬液制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及细胞扩增后的浓缩、洗涤、重悬，具体地，涉及一种基于密闭系统的单细胞悬液制备方法。
背景技术
细胞与基因治疗(CGT)是通过生物工程的方法获取人体中具有特定功能的细胞，经过基因修饰后，再进行体外扩增、特殊培养等处理，最后将细胞回输到人体内，达到治疗某种疾病的目的。在细胞与基因治疗过程中，体外扩增细胞的体积可以增加几十甚至几百倍，扩增后的细胞需要回输到人体内，就要将扩增后的细胞进行浓缩、洗涤，缩小细胞体积，去除培养基和代谢废物。
在浓缩收集大体积、高数量细胞时，由于处理时间较长和处理后细胞密度高，细胞易出现结团，不易重悬为单细胞悬液。结团的细胞粒径大，无法直接作为细胞治疗产品回输至病人体内。传统的细胞重悬是通过手工在生物安全柜中对细胞进行吹打、振荡等方式混匀，但是并不是在完全密闭系统中处理细胞，因此有污染的风险。对于细胞的浓缩洗涤，当前有一些密闭自动化设备处理，如Cytiva旗下的Sepax C-Pro全自动封闭式细胞处理系统等。这些全封闭自动化设备完成细胞单细胞重悬的方式是采用离心装置正反转混匀的方式，这种混匀方式无法将细胞团块彻底混匀成单细胞悬液，且细胞总数越大，细胞混匀的效果也会变得越差。综上所述，现有方法存在如下不足：1、采用手工方式重悬细胞时，由于使用的是非全封闭系统，因此细胞有污染风险；2、当前密闭自动化设备采用正反转混匀的方式重悬细胞，但是细胞无法完全重悬成单细胞悬液。
因此，期望开发一种在密闭的系统下，将高密度细胞重悬成单细胞悬液的设备和方法。
发明内容
本发明的目的在于至少部分地克服现有技术的缺陷，提供一种基于密闭系统的单细胞悬液制备方法。
本发明的目的还在于提供一种基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，能够将结团的细胞重悬为单细胞悬液。
本发明的目的还在于提供一种基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，能够在密闭系统内完成细胞的重悬，降低污染风险。
本发明的目的还在于提供一种基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，使得细胞的重悬效果更好，保证细胞更好的生物活性。
本发明的目的还在于提供一种基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，保证细胞重悬过程的稳定性和可重复性，以有效避免批次重悬效果差异过大。
为达到上述目的或目的之一，本发明的技术解决方案如下：
一种基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，用于将结团的细胞重悬为单细胞悬液，所述制备方法包括：
步骤A：利用流体驱动元件驱动细胞液从离心杯流入产品容器，所述离心杯包括入口、出口和与出口连通的导管；
步骤B：利用流体驱动元件驱动细胞液从产品容器流入离心杯；
步骤C：多次重复步骤A和步骤B；以及
步骤D：利用流体驱动元件驱动细胞液从离心杯流入产品容器。
根据本发明的一个优选实施例，在步骤A之前，所述制备方法还包括：
步骤O：对细胞样品进行浓缩和/或洗涤。
根据本发明的一个优选实施例，所述流体驱动元件包括蠕动泵和/或空气泵。
根据本发明的一个优选实施例，所述流体驱动元件包括两个蠕动泵，其中，一个蠕动泵设置在离心杯的入口侧，作为离心杯入口侧蠕动泵，另一个蠕动泵设置在离心杯的出口侧，作为离心杯出口侧蠕动泵；
在步骤O中，利用离心杯出口侧蠕动泵驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；在步骤A、步骤B、步骤C、步骤D中利用离心杯入口侧蠕动泵驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯和产品容器之间流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
根据本发明的一个优选实施例，所述流体驱动元件包括一个蠕动泵和一个空气泵，其中，所述空气泵设置在离心杯的入口侧，所述蠕动泵设置在离心杯的出口侧，作为离心杯出口侧蠕动泵；
在步骤O中，利用离心杯出口侧蠕动泵驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；在步骤A、步骤B、步骤C、步骤D中利用空气泵驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯和产品容器之间流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
根据本发明的一个优选实施例，所述流体驱动元件仅包括一个蠕动泵，其中，所述蠕动泵设置在离心杯的入口侧，作为离心杯入口侧蠕动泵；
在步骤O中，利用离心杯入口侧蠕动泵驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；在步骤A、步骤B、步骤C、步骤D中利用离心杯入口侧蠕动泵驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯和产品容器之间流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
根据本发明的一个优选实施例，所述流体驱动元件仅包括一个蠕动泵，其中，所述蠕动泵设置在离心杯的出口侧，作为离心杯出口侧蠕动泵；
在步骤O中，利用离心杯出口侧蠕动泵驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；在步骤A、步骤B、步骤C、步骤D中利用离心杯出口侧蠕动泵驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯和产品容器之间流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
根据本发明的一个优选实施例，所述制备方法还包括：
在管路上设置空气滤膜，所述空气滤膜被配置为仅允许无菌气体通过，但禁止液体通过。
根据本发明的一个优选实施例，所述制备方法还包括：
在离心杯和产品容器之间的管路上设置空气感应器，用于检测管路中是否有空气以确定液体是否排空；
其中，在步骤A中，当空气感应器确定离心杯内的液体已排空时，控制流体驱动元件停止运转；在步骤B中，当空气感应器确定产品容器内的液体已排空时，控制流体驱动元件停止运转。
根据本发明的一个优选实施例，所述制备方法还包括：
将产品容器设置在称重传感器上；
其中，在步骤A中，当称重传感器检测的产品容器内的细胞液的重量上升到第一预定重量时，控制流体驱动元件停止运转；在步骤B中，当称重传感器检测的产品容器内的细胞液的重量下降到第二预定重量时，控制流体驱动元件停止运转。
本发明的单细胞悬液制备方法是基于密闭系统实施，保证细胞重悬过程无污染风险，而且本发明通过流体驱动元件将离心后的细胞团，在离心杯和产品容器之间反复流动，对比正反混匀技术，能够更好地达到将高密度的细胞重悬为单细胞悬液的效果。采用本发明的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，在单细胞重悬过程中，可以通过空气感应器或称重传感器，控制重悬的细胞液的位置和体积，避免气泡的产生，达到更好的重悬效果，保证了细胞更好的生物活性。此外，本发明通过自动化控制单细胞重悬过程，流体驱动元件结合传感器，保证细胞重悬过程的稳定性和可重复性，能够有效避免批次重悬效果差异过大。
总而言之，本发明是基于密闭系统、稳定可重复的单细胞悬液制备技术，重悬过程污染风险小，单细胞重悬效果好，且细胞生物活性不受影响。
附图说明
图1为根据本发明的实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法的流程图；
图2为根据本发明的第一实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置的结构示意图；
图3为根据本发明的第二实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置的结构示意图；
图4为根据本发明的第三实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置的结构示意图；
图5为根据本发明的第四实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置的结构示意图；
图6为根据本发明的实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置/方法所采用的离心杯的一个示例；
图7为根据本发明的实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置/方法所采用的离心杯的另一个示例；
图8为根据本发明的第二实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置的工作状态图；
图9为采用现有技术的细胞重悬方法获得的细胞液的显微照片；以及
图10为采用本发明的实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法获得的细胞液的显微照片。
具体实施方式
下面结合附图详细描述本发明的示例性的实施例，其中相同或相似的标号表示相同或相似的元件。另外，在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。在其他情况下，公知的结构和装置以图示的方式体现以简化附图。
本发明的总体发明构思是：基于密闭系统，通过流体驱动元件使细胞液在离心处理室和离心处理室外部的储液袋(产品袋)之间反复流动，达到将离心处理室中的细胞重悬为单细胞悬液的效果。密闭系统采用细胞浓缩、洗涤系统，在该系统的基础上，配置流体驱动元件为能够双向驱动细胞液，这样细胞的浓缩、洗涤和重悬在一个系统内完成，中间不需要转移，整个操作过程中系统处于密闭状态。采用本发明的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置/方法，细胞离心收集后，细胞聚集在离心杯内，通过流体驱动元件将聚集在离心杯内的细胞排入储液袋，再通过流体驱动元件将储液袋内的细胞抽回离心杯，如此反复的流动，将离心聚集的细胞混匀成单细胞悬液。
作为一个示例，本发明的密闭系统是以如下方式实现：产品袋与废液袋是在生产时与包括离心杯在内的管路预连接的，包括离心杯、产品袋、废液袋、各种阀的管路系统经过灭菌后通过连接器在生物安全柜A级环境中或使用无菌接管机与样品液袋(对应于下文中的样品容器)和洗涤液袋(对应于下文中的洗涤液容器)连接，本发明的单细胞悬液制备装置是一个密闭系统(内部的样品不与外界空气接触，接触到的空气是通过空气过滤器过滤的无菌空气，依然可以认为是密闭的)。
下面结合附图2描述本发明的第一实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置，制备装置包括离心杯110、洗涤液容器、样品容器、产品容器103、废液容器104、空气滤膜105、离心杯入口侧蠕动泵106、管路阀107、空气感应器108、离心杯出口侧蠕动泵109。上述部件通过管路连接起来，具体地，洗涤液容器、样品容器、空气滤膜105、离心杯入口侧蠕动泵106、管路阀107设置在离心杯110的入口侧，产品容器103、废液容器104、空气感应器108、离心杯出口侧蠕动泵109设置在离心杯110的出口侧。在本发明中，离心杯的入口侧为在细胞液的浓缩、洗涤过程中向离心杯内供应样品或洗涤液的一侧，离心杯的出口侧为在细胞液的浓缩、洗涤过程中从离心杯向外排出产品或废液的一侧。
洗涤液容器、样品容器、产品容器103、废液容器104通常为袋，在它们为袋的情况下，它们分别为洗涤液袋、样品袋、产品袋、废液袋。洗涤液容器内盛放洗涤液，样品容器内为待浓缩或待洗涤的细胞液，产品容器103内用于盛放浓缩后、洗涤后或重悬后的细胞液产品，废液容器104内用于盛放浓缩过程、洗涤过程所产生的废液，例如培养基和代谢废物。洗涤液容器和样品容器分别通过洗涤液连接器101和样品连接器102连接在管路中，连接器可以为插瓶器，同样地，产品容器103和废液容器104可以分别通过产品连接器和废液连接器连接在管路中。连接洗涤液容器、样品容器的管路汇聚后接入离心杯110的入口，与离心杯110的入口连通的管路上还连接着离心杯入口侧蠕动泵106，在离心杯入口侧蠕动泵106的远离离心杯110的一侧连接着空气滤膜105，所述空气滤膜105仅允许无菌气体通过，但禁止液体通过。在离心杯的出口侧的管路上连接着空气感应器108，然后管路分叉，一路连接产品容器103，一路连接离心杯出口侧蠕动泵109后再连接废液容器104。空气感应器108可以检测管路中是否含有空气，并基于此判断管路内是否有液体，进而确定液体是否排空。
在管路上设置有多个管路阀107，管路阀107可以为管夹，在该第一实施例中，为洗涤液容器、样品容器、产品容器103、废液容器104分别设置独立的管夹，同时在离心杯入口侧蠕动泵106与离心杯110连接的管路上也设置了一个管夹。管夹的设置位置可以调整，只要它们能够实现特定管路上所需的连通和关闭功能即可，管路阀107也可以为三通阀，例如在与洗涤液连接器101和样品连接器102连接的管路上可以设置一个三通阀，代替两个管夹。
在该第一实施例中，流体驱动元件包括两个蠕动泵，即离心杯入口侧蠕动泵106和离心杯出口侧蠕动泵109，它们作为整个制备装置在浓缩、洗涤和重悬过程中的动力源。即流体驱动元件在细胞液浓缩和洗涤过程中，它被用来驱动液体在洗涤液容器、样品容器、产品容器103、废液容器104、离心杯110之间流转和分配，同时流体驱动元件也在细胞液重悬过程中使用，它使细胞液在产品容器103和离心杯110之间流动。
流体驱动元件需要实现：能够使细胞液在沿第一流动路径的流动和沿第二流动路径的流动之间交替地改变；在所述第一流动路径下，细胞液从离心杯110流入产品容器103；在所述第二流动路径下，细胞液从产品容器103流入离心杯110。
在第一实施例中，所述离心杯出口侧蠕动泵109被配置为用于驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；所述离心杯入口侧蠕动泵106被配置为用于驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯110和产品容器103之间交替地双向流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。离心杯出口侧蠕动泵109对液体的驱动是通过配合各个不同的管路阀的开闭实现的，同样地，离心杯入口侧蠕动泵106驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯110和产品容器103之间流动也需要各个不同的管路阀的配合，后面会以第二实施例为例，描述蠕动泵等是如何与各个管路阀配合工作的。
下面结合附图3描述本发明的第二实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置，第二实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置与第一实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置的不同之处在于：所述流体驱动元件包括一个蠕动泵和一个空气泵206，其中，所述空气泵206设置在离心杯的入口侧，所述蠕动泵设置在离心杯的出口侧，作为离心杯出口侧蠕动泵109；所述离心杯出口侧蠕动泵109被配置为用于驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；所述空气泵206被配置为用于驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯110和产品容器103之间交替地双向流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
下面结合附图4描述本发明的第三实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置，第三实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置与第一实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置的不同之处在于：所述流体驱动元件仅包括一个蠕动泵，其中，所述蠕动泵设置在离心杯的入口侧，作为离心杯入口侧蠕动泵106；所述离心杯入口侧蠕动泵106被配置为用于驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；并且被配置为用于驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯110和产品容器103之间交替地双向流动以使细胞液重悬为单细胞悬液；此外，离心杯110采用扁平式(飞碟型)离心杯，而在第一、第二实施例中，离心杯110为圆柱形离心杯。
下面结合附图5描述本发明的第四实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置，第四实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置与第一实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置的不同之处在于：所述流体驱动元件仅包括一个蠕动泵，其中，所述蠕动泵设置在离心杯的出口侧，作为离心杯出口侧蠕动泵109；所述离心杯出口侧蠕动泵109被配置为用于驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；并且被配置为用于驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯110和产品容器103之间交替地双向流动以使细胞液重悬为单细胞悬液；此外，离心杯110采用扁平式(飞碟型)离心杯，而在第一、第二实施例中，离心杯110为圆柱形离心杯。
第一、第二、第三和第四实施例给出了不同类型的流体驱动元件的使用、以及流体驱动元件的设置位置的改变，它们都能实现液体在不同容器和离心杯之间的流转和分配以实现细胞液的浓缩和洗涤，同时能够实现细胞液在产品容器103和离心杯110之间反复流动，以实现细胞液的重悬，只需要流体驱动元件的开启和关闭与管路阀的开启和关闭相配合即可，后面会以第二实施例为例，描述流体驱动元件是如何与各个管路阀配合工作以实现上述功能的。
图6为根据本发明的实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置所采用的离心杯的一个示例，离心杯由固定部分510和转动部分520组成，包括入口501、出口502和导管503，离心处理室与入口501和出口502均连通，出口502与离心处理室内的导管503连通，即出口502是通过导管503与离心处理室连通，导管503的末端与离心处理室底部的距离可以根据需要确定。
图7为根据本发明的实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置所采用的离心杯的另一个示例，离心杯呈飞碟型(扁平式)，飞碟型的离心杯易于将细胞样品引导至离心处理室的侧壁，这在细胞样品以较大流速供应的情况下是有利的，因为它可以防止细胞样品中的细胞没有足够的时间到达离心处理室的侧壁，从而防止它们被从导管503排出，从而提高细胞回收率。然而需要说明的是，本发明的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置所采用的的离心杯的形状不限于飞碟型，可以为其他任何形式的离心杯，也不要求离心杯具有导流件。
根据本公开的另一个方面，还提供了一种基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，所述制备方法使用如前任一实施例所述的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置。根据本发明的总体发明构思，所述单细胞悬液制备方法用于将结团的细胞重悬为单细胞悬液，所述制备方法包括：
步骤A：利用流体驱动元件驱动细胞液从离心杯110流入产品容器103；
步骤B：利用流体驱动元件驱动细胞液从产品容器103流入离心杯110；
步骤C：多次重复步骤A和步骤B；以及
步骤D：利用流体驱动元件驱动细胞液从离心杯110流入产品容器103。
本发明的制备方法优选地与细胞液的浓缩、洗涤连续地进行，因此，在步骤A之前，所述制备方法还包括：步骤O：对细胞样品进行浓缩和/或洗涤。
如前所述，本发明给出了基于密闭系统的单细胞悬液制备装置的四个实施例，其采用了不同设置的流体驱动元件，相应地，基于四种类型的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置，形成了不同的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法。
在一个制备方法的示例中，参考图2，所述流体驱动元件包括两个蠕动泵，其中，一个蠕动泵设置在离心杯的入口侧，作为离心杯入口侧蠕动泵106，另一个蠕动泵设置在离心杯的出口侧，作为离心杯出口侧蠕动泵109；在步骤O中，利用离心杯出口侧蠕动泵109驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；在步骤A、步骤B、步骤C、步骤D中利用离心杯入口侧蠕动泵106驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯110和产品容器103之间流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
在一个制备方法的示例中，参考图3，所述流体驱动元件包括一个蠕动泵和一个空气泵206，其中，所述空气泵206设置在离心杯的入口侧，所述蠕动泵设置在离心杯的出口侧，作为离心杯出口侧蠕动泵109；在步骤O中，利用离心杯出口侧蠕动泵109驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；在步骤A、步骤B、步骤C、步骤D中利用空气泵206驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯110和产品容器103之间流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
在一个制备方法的示例中，参考图4，所述流体驱动元件仅包括一个蠕动泵，其中，所述蠕动泵设置在离心杯的入口侧，作为离心杯入口侧蠕动泵106；在步骤O中，利用离心杯入口侧蠕动泵106驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；在步骤A、步骤B、步骤C、步骤D中利用离心杯入口侧蠕动泵106驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯110和产品容器103之间流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
在一个制备方法的示例中，参考图5，所述流体驱动元件仅包括一个蠕动泵，其中，所述蠕动泵设置在离心杯的出口侧，作为离心杯出口侧蠕动泵109；在步骤O中，利用离心杯出口侧蠕动泵109驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；在步骤A、步骤B、步骤C、步骤D中利用离心杯出口侧蠕动泵109驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯110和产品容器103之间流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
根据本发明的一个优选实施例，在管路上设置空气滤膜105，所述空气滤膜105被配置为仅允许无菌气体通过，但禁止液体通过。
下面结合图3中的第二实施例的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置，示例性地描述本发明的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，参考图8。
在该实施例中，细胞样品为293T细胞，体积为3L，细胞密度为2×106个/mL，细胞总数为6×109个，洗涤液为生理盐水添加0.5％的人血清白蛋白，体积为1L。
样品连续浓缩：如图8所示，首先打开第三管路阀107C和第五管路阀107E，关闭第一管路阀107A、第二管路阀107B和第四管路阀107D；样品细胞由离心杯出口侧蠕动泵109以100rpm转速驱动，使含有细胞的样品液从离心杯(容积为100mL)入口进入离心杯110，同时离心杯以500×g离心力旋转，细胞在离心力的作用下聚集在离心杯杯璧上，废液则从离心杯出口流出离心杯110，进入废液容器104。上述样品液进入离心杯的过程和废液从离心杯中排出的过程是同时且连续进行的，最终所有样品细胞浓缩至离心杯110内。
样品洗涤：样品洗涤的目的为了去除培养基和代谢废物，洗涤体积为单次300mL，洗涤次数为2次。首先打开第二管路阀107B和第五管路阀107E，关闭第一管路阀107A、第三管路阀107C和第四管路阀107D；洗涤过程由离心杯出口侧蠕动泵109以100rpm转速驱动，洗涤过程中离心杯110以300×g离心力旋转，洗涤液从洗涤液容器流入离心杯110，废液进入废液容器104，洗涤单次300mL后，离心杯110离心停止，离心杯110以375rpm的升降速度、750rpm的最高速度正反转混匀离心杯内液体；然后重复上述洗涤过程一次。
单细胞重悬：细胞浓缩洗涤后聚集在离心杯110中，此时细胞的状态为离心后的细胞团块，体积为100mL。打开第一管路阀107A和第四管路阀107D，关闭第二管路阀107B、第三管路阀107C和第五管路阀107E，由空气泵206以正210rpm转速驱动下，将离心杯110内的细胞液排至产品容器103，细胞液的排出体积可以通过空气泵的进气时间来进行控制。空气泵206再以负210rpm的转速抽气，将产品容器103内的细胞抽回离心杯110，如此的反复(反复的次数可以根据实际需要确定)，将离心杯内的细胞混匀成单细胞悬液。
在重悬过程中，为了减少气泡产生，以及更加精确的控制重悬的体积量，达到更好的重悬效果和保持细胞的生物活性，优选地，在离心杯110和产品容器103之间的管路上设置空气感应器108，用于检测管路中是否有空气以确定液体是否排空；其中，在步骤A中，当空气感应器108确定离心杯110内的液体已排空时，控制流体驱动元件(空气泵206)停止运转；在步骤B中，当空气感应器108确定产品容器103内的液体已排空时，控制流体驱动元件(空气泵206)停止运转。这样能有效避免重悬过程产生气泡，保证更好的重悬效果。
进一步地，所述制备方法还包括：将产品容器103设置在称重传感器111上；其中，在步骤A中，当称重传感器111检测的产品容器103内的细胞液的重量上升到第一预定重量时，控制流体驱动元件停止运转；在步骤B中，当称重传感器111检测的产品容器103内的细胞液的重量下降到第二预定重量时，控制流体驱动元件停止运转。例如，在重悬过程中可以将产品容器103悬挂在称重传感器111的挂钩上，称重传感器111能精准地称量实时的细胞液重量，当从离心杯110内排入产品容器103的细胞液达到设定值，控制空气泵206停止工作；同样在从产品容器103抽回到离心杯110的重量也可以通过称重传感器111称量，达到设定值后，控制空气泵206停止工作。这样能保证每次重悬重量的精确控制，达到稳定更好的重悬效果。
终产品收集：单细胞重悬完成后，打开第一管路阀107A和第四管路阀107D，关闭第二管路阀107B、第三管路阀107C和第五管路阀107E,重悬后的100mL细胞液通过空气泵206全部排入产品容器103。
对于除第二实施例的其他实施例，本领域技术人员可以结合附图中的管路阀，选择性地开启或关闭第一管路阀、第二管路阀、第三管路阀、第四管路阀、第五管路阀、离心杯入口侧蠕动泵、离心杯出口侧蠕动泵或空气泵，实现样品连续浓缩、样品洗涤、单细胞混悬和终产品收集。
本发明的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法与现有技术方法的对比：
对比现有技术的方法(离心杯正反转混匀)与本发明的方法重悬细胞的重悬效果。对比例中的两个方法使用连续流离心杯(容积100mL)作为离心杯进行上述对比。
处理细胞样品1L，细胞类型为293T，细胞密度为2×106个/mL，细胞活率为97％，细胞总数为2×109个。浓缩条件为，500×g离心力，100rpm蠕动泵流速；洗涤条件为300mL洗涤2次，100rpm蠕动泵流速；重悬条件如下：
A样品：采用离心杯正反转混匀，总细胞体积为100mL，混匀加减速度为375rpm，混匀最高速度为750rpm，正反混匀次数为5次；
B样品：采用本发明的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，在离心杯和产品容器之间反复转移的细胞液体积为80mL，总细胞体积为100mL，排出和抽回的次数为5次；终产品收获重悬细胞液100mL全部排入产品容器。
最终A样品的产品细胞密度为1.91×107个/mL，细胞得率为95.5％；B样品的产品细胞密度为1.92×107个/mL，细胞得率为96％。经过不同的重悬工艺，两个产品细胞的重悬效果对比如下：
A样品的产品细胞显微照片如图9所示，放大倍数为200倍，有明显未分散的细胞团，单细胞重悬效果不好。B样品的产品细胞照片如图10所示，放大倍数为200倍，细胞无明显细胞团，单细胞重悬效果较好。并且，通过活力对比，B样品的产品细胞活率为98％，A样品的产品细胞活率为93％。综上，使用本发明的单细胞重悬技术，在单细胞重悬效果和生物活性上，都优于使用正反转混匀重悬的细胞。
本发明的单细胞悬液制备装置/方法是基于密闭系统实施，保证细胞重悬过程无污染风险，而且本发明通过流体驱动元件将离心后的细胞团，在离心杯和产品容器之间反复流动，对比正反混匀技术，能够更好地达到将高密度的细胞重悬为单细胞悬液的效果。采用本发明的基于密闭系统的单细胞悬液制备装置/方法，在单细胞重悬过程中，可以通过空气感应器或称重传感器，控制重悬的细胞液的位置和体积，避免气泡的产生，达到更好的重悬效果，保证了细胞更好的生物活性。此外，本发明通过自动化控制单细胞重悬过程，流体驱动元件结合传感器，保证细胞重悬过程的稳定性和可重复性，能够有效避免批次重悬效果差异过大。
总而言之，本发明是基于密闭系统、稳定可重复的单细胞悬液制备技术，重悬过程污染风险小，单细胞重悬效果好，且细胞生物活性不受影响。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行变化。本发明的适用范围由所附权利要求及其等同物限定。
附图标记列表：
101洗涤液连接器
102样品连接器
103产品容器
104废液容器
105空气滤膜
106离心杯入口侧蠕动泵
107管路阀
107A第一管路阀
107B第二管路阀
107C第三管路阀
107D第四管路阀
107E第五管路阀
108空气感应器
109离心杯出口侧蠕动泵
110离心杯
111称重传感器
206空气泵
501入口
502出口
503导管
510固定部分
520转动部分。

Claims (10)

1.一种基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，用于将结团的细胞重悬为单细胞悬液，其特征在于，所述制备方法包括：
步骤A：利用流体驱动元件驱动细胞液从离心杯(110)流入产品容器(103)，所述离心杯(110)包括入口(501)、出口(502)和与出口(502)连通的导管(503)；
步骤B：利用流体驱动元件驱动细胞液从产品容器(103)流入离心杯(110)；
步骤C：多次重复步骤A和步骤B；以及
步骤D：利用流体驱动元件驱动细胞液从离心杯(110)流入产品容器(103)。
2.根据权利要求1所述的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，其特征在于，在步骤A之前，所述制备方法还包括：
步骤O：对细胞样品进行浓缩和/或洗涤。
3.根据权利要求2所述的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，其特征在于：
所述流体驱动元件包括蠕动泵和/或空气泵。
4.根据权利要求3所述的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，其特征在于：
所述流体驱动元件包括两个蠕动泵，其中，一个蠕动泵设置在离心杯的入口侧，作为离心杯入口侧蠕动泵(106)，另一个蠕动泵设置在离心杯的出口侧，作为离心杯出口侧蠕动泵(109)；
在步骤O中，利用离心杯出口侧蠕动泵(109)驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；在步骤A、步骤B、步骤C、步骤D中利用离心杯入口侧蠕动泵(106)驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯(110)和产品容器(103)之间流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
5.根据权利要求3所述的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，其特征在于：
所述流体驱动元件包括一个蠕动泵和一个空气泵(206)，其中，所述空气泵(206)设置在离心杯的入口侧，所述蠕动泵设置在离心杯的出口侧，作为离心杯出口侧蠕动泵(109)；
在步骤O中，利用离心杯出口侧蠕动泵(109)驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；在步骤A、步骤B、步骤C、步骤D中利用空气泵(206)驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯(110)和产品容器(103)之间流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
6.根据权利要求3所述的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，其特征在于：
所述流体驱动元件仅包括一个蠕动泵，其中，所述蠕动泵设置在离心杯的入口侧，作为离心杯入口侧蠕动泵(106)；
在步骤O中，利用离心杯入口侧蠕动泵(106)驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；在步骤A、步骤B、步骤C、步骤D中利用离心杯入口侧蠕动泵(106)驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯(110)和产品容器(103)之间流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
7.根据权利要求3所述的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，其特征在于：
所述流体驱动元件仅包括一个蠕动泵，其中，所述蠕动泵设置在离心杯的出口侧，作为离心杯出口侧蠕动泵(109)；
在步骤O中，利用离心杯出口侧蠕动泵(109)驱动液体流动以对细胞样品进行浓缩和/或洗涤；在步骤A、步骤B、步骤C、步骤D中利用离心杯出口侧蠕动泵(109)驱动浓缩或洗涤后的细胞液在离心杯(110)和产品容器(103)之间流动以使细胞液重悬为单细胞悬液。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：
在连接离心杯(110)的管路上设置空气滤膜(105)，所述空气滤膜(105)被配置为仅允许无菌气体通过，但禁止液体通过。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：
在离心杯(110)和产品容器(103)之间的管路上设置空气感应器(108)，用于检测管路中是否有空气以确定液体是否排空；
其中，在步骤A中，当空气感应器(108)确定离心杯(110)内的液体已排空时，控制流体驱动元件停止运转；在步骤B中，当空气感应器(108)确定产品容器(103)内的液体已排空时，控制流体驱动元件停止运转。
10.根据权利要求1-7所述的基于密闭系统的单细胞悬液制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：
将产品容器(103)设置在称重传感器(111)上；
其中，在步骤A中，当称重传感器(111)检测的产品容器(103)内的细胞液的重量上升到第一预定重量时，控制流体驱动元件停止运转；在步骤B中，当称重传感器(111)检测的产品容器(103)内的细胞液的重量下降到第二预定重量时，控制流体驱动元件停止运转。
CN202310029482.2A 2023-01-10 2023-01-10 基于密闭系统的单细胞悬液制备方法 Pending CN116042509A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310029482.2A CN116042509A (zh) 2023-01-10 2023-01-10 基于密闭系统的单细胞悬液制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310029482.2A CN116042509A (zh) 2023-01-10 2023-01-10 基于密闭系统的单细胞悬液制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116042509A true CN116042509A (zh) 2023-05-02

Family

ID=86127049

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310029482.2A Pending CN116042509A (zh) 2023-01-10 2023-01-10 基于密闭系统的单细胞悬液制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116042509A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019219295B2 (en) Bioprocessing vessel
CN216916398U (zh) 一种高通量干细胞制剂的自动灌装设备
US11371007B2 (en) System and method for fluid flow management in a bioprocessing system
CN219930100U (zh) 基于密闭系统的单细胞悬液制备装置
EP3199617B1 (en) Systems and methods for the separation of cells from microcarriers using a spinning membrane
CN116042509A (zh) 基于密闭系统的单细胞悬液制备方法
US11932842B2 (en) Bioprocessing apparatus
US20220251496A1 (en) System and method for fluid flow management in a bioprocessing system
CN115786112A (zh) 一种压差调节系统、连续收获系统及其使用方法
US20200392446A1 (en) Systems and methods for bioprocessing
CN219603580U (zh) 一种细胞无损输送系统
US11414639B2 (en) Bioprocessing vessel
AU2019219292B2 (en) Bioprocessing apparatus
CN110456033A (zh) 用于调整含有细胞的液体样品的密度和或体积的系统
US20210087511A1 (en) Bioprocessing methods for cell therapy
US20210087510A1 (en) Disposable kit for bioprocessing
CN117264751A (zh) 一种细胞无损输送系统
US20210102153A1 (en) Apparatus for fluid line management in a bioprocessing system
JP2023548714A (ja) 異なる混合物から成分を連続的に分離するための自動遠心分離装置および方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination