CN116024274A - 一种利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法，该方法包括活化培养丙酮丁醇梭菌，在梭菌培养基对丙酮丁醇梭菌进行发酵；利用秸秆丁酸预处理后残渣酶解所得的可发酵糖作为碳源，流加入发酵液中继续发酵；待丙酮丁醇梭菌生长稳定，将脱毒后的丁酸预处理上清液多次脉冲流加到发酵液中，进行发酵，生产燃料丁醇。本发明利用木质纤维素丁酸预处理后固体残渣酶解所得的可发酵糖以及含丁酸的上清液进行发酵生产燃料丁醇，生物丁醇产量得到显著提升，整个工艺路线无外源化学物质添加，既节省了成本，又可避免外源添加剂对后续丁醇发酵产生抑制，是绿色环保的发酵工艺，对生物丁醇绿色生产提供了重要思路。

Description

一种利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法。

背景技术

能源是当今世界关注的焦点，化石燃料作为全球能源的主要来源，过度使用会导致资源枯竭和全球变暖等一系列问题。利用木质纤维素等可再生资源生产液态燃料是解决上述问题的有效方法之一。丁醇作为一种高效的液态燃料，相比于乙醇，丁醇具有热值高、无腐蚀性、与汽油可任意比例混合、无需改造发动机等优点，而且使用丁醇和汽油混合可以减少有害气体排放，因此，对丁醇的绿色生产引起了人们的极大关注。

目前，生物丁醇生产的主要方式是通过厌氧的丁醇发酵过程获得。丁醇发酵(也称为丙酮-丁醇-乙醇发酵或ABE发酵)，是利用梭状芽孢杆菌(Clostridia)在严格厌氧的条件下进行丙酮、丁醇和乙醇溶剂生产的发酵过程。ABE发酵是典型的二阶段发酵，整个发酵过程可分为产酸阶段和产溶剂阶段。产酸阶段，碳水化合物主要被转化为丁酸和乙酸，随着有机酸的累积，培养基内pH值逐渐下降，发酵逐渐从产酸阶段转型至产溶剂阶段。在产溶剂阶段，有机酸被重新吸收并转化为溶剂，其中丁酸被转化为主产物丁醇。目前，丁醇发酵的主要原料是粮食作物玉米或甘蔗，该生产过程不仅存在着“与人争粮”“与粮争地”的社会问题，而且该过程原料成本高，不适合工业化放大。如何降低丁醇生产的原料成本是制约其进一步发展的瓶颈问题。

木质纤维素是地球上储量最丰富、价格最低廉的碳中性资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中纤维素是由葡萄糖单体聚合而成，若能将其转化为葡萄糖用作微生物发酵的碳源，则可以大幅度降低原料成本。然而，木质纤维素类生物质经过亿万年的进化形成了固有的致密网状结构，该结构使得微生物或酶很难对其直接降解。因此，需要有效的预处理工艺破坏木质纤维素结构，以提高后续酶解和发酵性能。当前，用于木质纤维素的预处理工艺有多种，如物理法(研磨、机械粉碎等)、化学法(硫酸、盐酸、氢氧化钠等)、生物法等，不同种预处理方法对木质纤维素结构和酶解效率的影响效果各有不同，且均存在一定的缺点，其中物理法能耗较高，化学法预处理强度大、产生的发酵抑制物种类繁多，生物法处理时间长、效率较低等。对于特定的发酵产品生产过程而言，要根据微生物细胞的特点来确定最优的预处理工艺。一般而言，理想的预处理应满足以下特点：组分分离效率高且损失少、预处理剂易于回收且可循环使用、抑制物产生量少、预处理成本低等。因此，建立一种高效的可用于生物丁醇生产的绿色预处理工艺仍具有重要的意义。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明以循环、绿色思路为指导，利用丁醇合成的前体物质丁酸作为预处理剂，将预处理后的固体残渣用于丁醇合成的发酵底物，并将预处理后含丁酸的上清液用作发酵的共底物合成丁醇，即提供一种利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法。本发明是一种利用丁酸预处理木质纤维素的各衍生组分调控丁醇发酵高效合成生物丁醇的方法，该方法利用丁酸预处理上清液和可发酵糖对发酵底物进行调控，从而达到利用木质纤维素高效合成生物丁醇的目标，解决了目前预处理剂回用困难、直接排放造成严重环境危害等现实问题，实现了原料到高附加值产物“吃干榨尽”的目标。该工艺能够有效利用木制纤维素这一储量丰富的可再生资源，对于生物质精炼有重要意义。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法，包括如下步骤：

(1)活化培养丙酮丁醇梭菌，在梭菌培养基对丙酮丁醇梭菌进行发酵；

(2)在步骤(1)中发酵后，利用秸秆酶解所得的可发酵糖作为碳源，流加入发酵液中继续发酵；

(3)待步骤(2)中丙酮丁醇梭菌生长稳定，将脱毒后的丁酸预处理上清液多次脉冲流加到发酵液中，进行发酵，生产燃料丁醇。

其中，步骤(1)所述发酵时间后为在34-40℃、静态无旋转条件下发酵10-12h。

其中，步骤(2)所述秸秆酶解所得的可发酵糖为木质纤维素丁酸预处后固体残渣酶解所得。

其中，所述木质纤维素为玉米秸秆、小麦秸秆、玉米芯或者水稻秸秆，所使用的预处理工艺为丁酸预处理，其预处理条件为：丁酸溶液浓度为40-60g/L，固液的质量体积比为1：8～1:12g/mL，处理时间为0.5～1.0h，温度为160-200℃。

作为优选，所述木质纤维素为玉米秸秆，预处理的丁酸溶液为50g/L，固液的质量体积比为1：10g/mL，处理时间为0.5h，温度为180℃。

其中，由木质纤维素如玉米秸秆经过丁酸预处理后的固体残渣通过酶解过程得到可发酵糖，其酶解过程的缓冲体系为：柠檬酸钠缓冲液，pH值为4.8～5.0；所述预处理后的固体残渣与柠檬酸缓冲液的质量体积比为1:4～1:10g/mL，使用的酶为Cellic CTec3，酶添加量为8-15FPU/g基质(酶解体系中的固体部分)。

作为优选，所述缓冲液为50mM柠檬酸钠缓冲液，pH值为4.8；所述预处理的固体残渣与柠檬酸缓冲液的质量体积比为1：5g/mL；所述的Cellic CTec3酶解以10FPU/g基质添加。

其中，丁酸预处理上清液为木质纤维素经过丁酸溶液预处理后，利用固液分离得到的含丁酸的上清液；所述丁酸预处理上清液通过脉冲式方式流加至丁醇发酵液中，每次流加0.5-1mL上清液到50mL发酵液中，流加初始时间为10-12h，流加间隔时间为4～12h。

作为优选，所述丁酸预处理上清液通过脉冲式方式流加至丁醇发酵液中，每次流加0.5mL上清液到50mL发酵液中，流加初始时间为12h，流加间隔时间为4～12h。

其中，步骤(3)所述进行丁醇发酵为34-40℃、静态无旋转条件下发酵60-80h。

所述上清液脱毒为采用活性炭和溶液质量体积比为4.5-5.5％g/mL的添加量，脱毒温度为55-65℃，时间为10-15h。

作为优选，所述上清液脱毒为采用活性炭和溶液质量体积比为5％g/mL的添加量，脱毒温度为60℃，时间为12h。

优选地，所述可发酵糖流加液为木质纤维素丁酸预处后固体残渣酶解所得，为保证微生物的正常生长代谢，提供的必要营养物质(非碳源)如下：(KH₂PO₄ 0.75g/L，K₂HPO₄0.75g/L，NaCl 1.0g/L，MnSO₄·5H₂O 0.017g/L，MgSO₄·7H₂O 0.70g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，L-天冬酰胺2.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L)。

优选地，步骤(1)的梭菌培养基(CGM)配方如下：(KH₂PO₄ 0.75g/L，K₂HPO₄ 0.75g/L，NaCl 1.0g/L，MnSO₄·5H₂O 0.017g/L，MgSO₄·7H₂O 0.70g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，L-天冬酰胺2.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，葡萄糖20g/L)。

本发明所述的利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法在提高丁醇产量中的应用。

本发明是一种可发酵糖高效合成生物丁醇的方法，包括以下步骤：(1)将预处理后秸秆酶解，(2)丙丁梭菌富集培养，(3)流加酶解可发酵糖和丁酸预处理上清液。本发明选择丁酸作为木质纤维素预处理的催化剂，该预处理工艺可以有效提高秸秆酶解效率，且预处理过程中产生的乙酸可以用于生物丁醇的合成，是一种绿色的预处理剂。但是经过实验发现，木质纤维素经过丁酸预处理后，预处理液中含有多种抑制物，若简单作为丙丁梭菌生长代谢的碳源，会导致丁醇发酵性能较差。同时，酶解后的可发酵糖混合液中抑制物浓度较低，可在产溶剂期一次性添加至发酵液中。本发明在产溶剂期以多次间歇流加的方式补充丁酸预处理液作为发酵的辅助碳源，这样可以减弱丙丁梭菌产溶剂期受到的环境胁迫，并能够有效提高菌种对于抑制物的耐受能力，生物丁醇产量得到显著提升，整个工艺路线无外源化学物质添加，既节省了成本，又可避免外源添加剂对后续丁醇发酵产生抑制，是绿色环保的发酵工艺，对生物丁醇绿色生产提供了重要思路。本发明中利用丁酸作为木质纤维素预处理的催化剂，该预处理能够有效提高秸秆酶解效率。在酶解固液比为1:5时，酶解液中葡萄糖达到70g/L。丁醇发酵期间，通过多次流加丁酸预处理上清液和可发酵糖流加液，最终丁醇溶剂产量达到10.38g/L。

本发明首次利用木质纤维素丁酸预处理后固体残渣酶解所得的可发酵糖以及经过丁酸溶液预处理后，利用固液分离得到的含丁酸的上清液进行丙丁梭菌发酵以生产燃料丁醇，过程中将木质纤维素中的纤维素和半纤维素组分酶解得到的可发酵糖作为发酵碳源，也将预处理残余含丁酸的上清液作为合成丁醇的前体物质，对丁醇的高效生物合成起到了协同增效的作用。综上，该工艺既实现了木质纤维素类生物质资源化转化的目标，也从绿色经济的角度实现了预处理剂的循环使用。

有益效果：与现有技术相比，具有如下优点：

(1)本发明以丁醇合成前体丁酸作为预处理剂，其中的丁酸目前可以通过发酵制取，该技术的创新特色在于丁酸既是预处理催化剂，还作为发酵共底物合成丁醇。其中的代谢机理是丁醇发酵的两个阶段分别是产酸期和产溶剂期，其中的产酸期主要是形成乙酸和丁酸，并在后续的产溶剂期分别合成丙酮和丁醇，即丁酸预处理上清液回收并用于丁醇生产，减少了排放所带来的环境污染问题。因此，本发明的技术路线实现了绿色预处理和原料组分综合利用生产燃料丁醇的目的。

(2)丁酸是一种温和的有机酸，在预处理过程中能够有效脱除半纤维素组分，提高纤维素的可及表面积以达到高效生产可发酵糖的目的。固液质量体积比为1:5的酶解体系下，酶解液中葡萄糖浓度可以达到70g/L，无需再进行浓缩操作即可用于丁醇发酵。

(3)在丁醇发酵12h后，通过流加方式添加可发酵糖溶液和丁酸预处理液，由于丁酸预处理上清液中含有一定的发酵抑制物，通过脉冲流加的方式可以提高丙丁梭菌对丁酸预处理液中抑制物的耐受能力并适应其环境，最终丁醇和总溶剂产量最终分别提高至10.58g/L和14.85g/L。

(4)丁醇发酵结束时的产品浓度会影响后续分离纯化成本，其中主产物丁醇的浓度越高，越有利于降低生产总成本。传统丁醇发酵的丁醇/丙酮质量比普遍为1.8～2.2，本发明获得的丁醇/丙酮质量比相较于对照组提升58.03％，也显著高于传统丁醇发酵条件下的水平，可以有效降低后续溶剂分离成本。

附图说明

图1为实施例4的丁醇发酵动力学；

图2为实施例9的丁醇发酵动力学；

图3为实施例10的丁醇发酵动力学。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。

丙酮丁醇梭菌(丙丁梭菌)为Clostridium acetobutylicum ATCC 824，是合成丁醇的野生型菌株。

Cellic CTec3为是一款商业化的纤维素酶产品，够买自诺维信公司(Novozymes)，酶活为207.4FPU/mL，FPU为滤纸酶活单位。

活性炭购买自郑州同凯活性炭有限公司(产品规格1-2mm)。

实施例1

含30g/L葡萄糖的CGM丁醇发酵(对照)

步骤一：用厌氧发酵瓶配置50mL CGM(配方如下：KH₂PO₄ 0.75g/L，K₂HPO₄ 0.75g/L，NaCl 1.0g/L，MnSO₄·5H₂O 0.017g/L，MgSO₄·7H₂O 0.70g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，L-天冬酰胺2.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，葡萄糖30g/L)。将保藏于4℃冰箱的对数期的丙丁梭菌孢子管以10％(v/v)的接种量转接至CGM中，在37℃条件下静态培养24h，获得的即为丙丁梭菌活化种子液。

步骤二：步骤一中得到的活化丙丁梭菌种子液以体积比10％的接种量接种到步骤一中的CGM中，在37℃条件下静态发酵，发酵周期72h，每间隔12h取样检测培养基中组分变化。

葡萄糖浓度的测定：待测样品利用去离子水进行稀释至0.5-1.5g/L，利用进样针吸取25μL至生物传感仪SBA-40C中，测定葡萄糖浓度。

发酵pH的测定：利用pH计测定。

溶剂测定方法：以异丁醇为检测样品的内标，色谱条件为阶段升温程序法(40-70℃，3℃/min；70-140℃，5℃/min；140-200℃，15℃/min)，进样量为0.6μL。产物出峰时间为丙酮(3.3min)、乙醇(4.1min)、异丁醇(5.6min)、丁醇(6.2min)、乙酸(9.0min)和丁酸(10.8min)。色谱柱为毛细管柱，固定相FFAP(交联)，柱型为30m×0.32mm×0.5μm。流动相为氮气。检测器为氢火焰离子化检测器。

实施例2

含30g/L葡萄糖的CGM、脉冲流加丁酸预处理液的丁醇发酵

步骤一：与实施例1中步骤一相同。

步骤二：将步骤一获得的活化丙丁梭菌种子液转接至CGM中，接种量为10％(v/v)，在37℃条件下静态发酵，发酵周期72h，操作方法同实施例1中的步骤二。

步骤三：将木质纤维素(玉米秸秆)与50g/L丁酸溶液以质量体积比1：10(g/mL)混合，于高压反应釜中180℃下反应0.5h后，通过真空抽滤方式分离预处理混合物，分别得到固体组分和丁酸预处理上清液。

步骤四：步骤三中获得的丁酸预处理上清液进行脱毒处理，添加活性炭吸附发酵抑制物，每100mL上清液中添加5g活性炭，于60℃下脱毒12h，最终通过真空抽滤将上清分离备用，其中上清液中的丁酸浓度为49.6g/L(检测方法同实施例1)。

步骤五：在步骤二丁醇发酵进行至12h时，流加步骤三中分离得到的含丁酸预处理上清液，在发酵的12h-32h期间，每间隔4h流加0.5mL至50mL的发酵液中(相当于流加了约0.5g/L的丁酸)，流加6次共计3.0g/L丁酸。

实施例3

含30g/L葡萄糖的CGM、脉冲流加丁酸预处理液的丁醇发酵

本实施例与实施例2相同，不同之处在于：步骤五中，流加时间为12h-36h期间，每间隔6h流加0.5g/L丁酸，流加5次共计2.5g/L丁酸。

实施例4

含30g/L葡萄糖的CGM、脉冲流加丁酸预处理液的丁醇发酵

本实施例与实施例2相同，不同之处在于：步骤五中，流加时间为12h-36h期间，每间隔8h流加0.5g/L丁酸，流加4次共计2.0g/L丁酸。

实施例5

含20g/L葡萄糖的CGM丁醇发酵(对照)

步骤一：配置50mL梭菌培养基配方如下：(KH₂PO₄ 0.75g/L，K₂HPO₄ 0.75g/L，NaCl1.0g/L，MnSO₄·5H₂O 0.017g/L，MgSO₄·7H₂O 0.70g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，(NH₄)₂SO₄2.0g/L，L-天冬酰胺2.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，葡萄糖20g/L)。将保藏于4℃冰箱的对数期的丙丁梭菌孢子管以10％(v/v)的接种量转接至CGM中，在37℃条件下静态培养24h，获得的即为丙丁梭菌活化种子液。

步骤二：本步骤与实施例1中步骤二相同。

实施例6

含20g/L葡萄糖的CGM，补加10g/L葡萄糖酶解液的丁醇发酵

步骤一：本步骤与实施例5中步骤一相同。

步骤二：本步骤与实施例5中步骤二相同。

步骤三：将木质纤维素(玉米秸秆)与50g/L丁酸溶液以质量体积比1：10(g/mL)混合，于高压反应釜中180℃下反应0.5h后，通过真空抽滤方式分离预处理混合物，分别得到固体组分和丁酸预处理上清液。

步骤四：步骤三中获得的丁酸预处理上清液进行脱毒处理，添加活性炭吸附发酵抑制物，每100mL上清液中添加5g活性炭，于60℃下脱毒12h，最终通过真空抽滤将上清分离备用，其中上清液中的丁酸浓度为49.6g/L。

步骤五：步骤三中固体组分酶解，用50mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.8)与固体组分以10：1的体积质量比(mL/g)混合，以10FPU/g基质添加Cellic CTec3，在50℃、150rpm条件下，酶解72h后分离酶解水解液备用，利用生物传感仪测得酶解液中葡萄糖浓度为70g/L。

配置可发酵糖流加液，以酶解液为溶剂体系，其余添加物质如下：KH₂PO₄ 0.75g/L，K₂HPO₄ 0.75g/L，NaCl 1.0g/L，MnSO₄·5H₂O 0.017g/L，MgSO₄·7H₂O 0.70g/L，FeSO₄·7H₂O0.01g/L，L-天冬酰胺2.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L。

步骤六：在步骤二中发酵12h后，向发酵瓶中流加步骤五中的可发酵糖流加液，使得最终培养基中葡萄糖浓度为30g/L，发酵条件维持不变(37℃，静态培养)，72h结束发酵。

实施例7

含20g/L葡萄糖的CGM，补加10g/L葡萄糖酶解液并脉冲流加丁酸预处理液的丁醇发酵

本实施例与实施例6相同，不同之处在于：发酵12h后向发酵瓶中流加步骤五中的可发酵糖流加液，使得最终培养基中葡萄糖浓度为30g/L，并在12h和24h分别流加含丁酸预处理上清液丁酸(即脱毒后含丁酸的预处理上清液，上清液制备参考实施例2，每次添加量为1.0g/L)，总添加量2.0g/L丁酸，发酵条件维持不变(37℃，静态培养)，72h结束发酵。

实施例8

含20g/L葡萄糖的CGM，补加10g/L葡萄糖酶解液并脉冲流加丁酸预处理液的丁醇发酵

本实施例与实施例6相同，不同之处在于：发酵12h后向发酵瓶中流加步骤五中的可发酵糖流加液，使得最终培养基中葡萄糖浓度为30g/L，并在12～36h内每间隔8h流加含丁酸预处理上清液(即脱毒后含丁酸的预处理上清液，上清液制备参考实施例2，每次流加0.5g/L)，总添加量2.0g/L丁酸，发酵条件维持不变(37℃，静态培养)，72h结束发酵。

实施例9

含20g/L葡萄糖的CGM，补加20g/L葡萄糖酶解液

本实施例与实施例6相同，不同之处在于：发酵12h后，向发酵瓶中流加步骤五中的可发酵糖流加液，使得最终培养基中葡萄糖浓度为40g/L，发酵条件维持不变(37℃，静态培养)，72h结束发酵。

实施例10

含20g/L葡萄糖的CGM，补加20g/L葡萄糖酶解液并脉冲流加丁酸预处理液的丁醇发酵

本实施例与实施例9大致相同，不同在于：发酵12h后，既向发酵瓶中流加步骤五中的可发酵糖流加液，使得最终培养基中葡萄糖浓度为40g/L；同时，在12～36h内每间隔8h流加含丁酸预处理上清液(即脱毒后含丁酸的预处理上清液，上清液制备参考实施例2，每次流加0.5g/L)，总添加量2.0g/L丁酸，发酵条件维持不变(37℃，静态培养)，72h结束发酵。

对比例1

对比例1与实施例2的方法相同，不同之处在于：在步骤二丁醇发酵进行至12h时，流加步骤三中一次性分离得到的含丁酸预处理上清液，共计3.0g/L丁酸。

对比例2

对比例2与实施例9的方法相同，不同之处在于：将含20g/L葡萄糖的CGM，补加20g/L葡萄糖酶解液，全部直接替换成40g/L葡萄糖酶解液。

对比例3

对比例3与实施例9的方法相同，不同之处在于：将含20g/L葡萄糖的CGM，补加20g/L葡萄糖酶解液，全部替换成40g/L葡萄糖的CGM。

表1为各实施例子溶剂产量以及产率一览表

实施例1为实施例1-4的对照组，该批次为30g/L葡萄糖的CGM，在发酵72h后，培养基中丁醇产量为6.84g/L，丙酮产量为3.54g/L，总溶剂产量为11.15g/L。发酵12h时，仅间歇性流加丁酸预处理上清液，丁醇产量提升到8.10-8.38g/L(实施例2-实施例4)，溶剂总产量(丙酮、丁醇和乙醇的产量之和)也提升至12.51-12.63g/L，原因是丁酸预处理上清液中的丁酸和一些游离糖在间歇流加过程中被丙丁梭菌吸收利用，从而有效提升了丁醇等溶剂产量。与此同时，溶剂的生产效率也从0.155g/L/h显著提升至0.175g/L/h。当在发酵12h后一次性流加含丁酸预处理上清液(共计流加3g/L的丁酸)时，由于高浓度丁酸造成的环境胁迫，导致丁醇产量只有4.76g/L，总溶剂生产效率也仅为0.107g/L/h(对比例1)；该结果明显低于脉冲式流加丁酸预处理上清液的发酵产量。

实施例5为实施例5-10的对照组，该批次为20g/L葡萄糖的CGM，该批次丁醇产量为4.89g/L，总溶剂产量为7.31g/L。发酵12h时，流加可发酵糖至葡萄糖浓度为30g/L-40g/L(实施例6，实施例9)，丁醇产量分别提升至7.05g/L和9.34g/L，这表明以流加方式补充可发酵糖可以减轻预处理残留抑制物对于丙丁梭菌的毒害作用，丙丁梭菌可以有效利用可发酵糖中碳源，提高丁醇产量。在此基础上，分别流加不同量的丁酸预处理上清液(实施例7，实施例8，实施例10)，30g/L葡萄糖条件下的培养基丁醇产量从7.05g/L提升至8.15-8.39g/L，总溶剂产量从9.99g/L提升至11.15-11.86g/L；40g/L葡萄糖条件下的培养基丁醇产量从9.34g/L提升至10.58g/L，总溶剂产量从13.31g/L提升至14.85g/L。由此可见，在不同糖浓度下，流加丁酸预处理上清液仍能够显著提升溶剂产量。

图1实施例4的丁醇发酵动力学，发酵48h时，葡萄糖基本消耗结束，发酵期间pH从5.50逐渐降低到4.21，36h后逐渐回升到4.44，丁酸浓度在12h达到峰值，随着丁酸预处理上清液流加，丁酸浓度逐步降低，说明丁酸被重吸收用于丁醇合成，丁醇产量最终达到8.38g/L，与实施例1相比提升了1.54g/L。以上结果证明了本发明中丁酸预处理液流加促生物丁醇合成的可行性。

图2实施例9的丁醇发酵动力学，单纯利用酶解产生的可发酵糖替换CGM中的碳源，丙丁梭菌难以生长，丁醇发酵性能较差(对比例2)，原因是酶解液组分中含有多种抑制组分。因此，本实验尝试在初始培养基发酵生长12h后，以流加方式补充可发酵糖，如图2所示，该发酵动力学可以清楚看到葡萄糖的消耗曲线，0-12h初始发酵培养基中葡萄糖浓度骤减至8.8g/L，12h后流加可发酵糖，24-60h期间葡萄糖逐渐消耗殆尽，且丁醇产量上升至9.34g/L，溶剂总产量13.31g/L。以上结果证明了流加可发酵糖可以提高丙丁梭菌对于抑制组分的耐受阈值，实现了生物质废料向生物能源的转化。实施例9的发酵性能与含有40g/L葡萄糖的CGM批次(对比例3)性能基本相当，由于实施例9使用的是玉米秸秆酶解液作为部分碳源进行丁醇发酵，该工艺可以明显降低发酵原料成本，与完全以葡萄糖为碳源的传统丁醇发酵相比更符合绿色、可持续的研究思路。

图3实施例10的丁醇发酵动力学，该发酵动力学在实施例9的基础上，间歇流加了预处理残余丁酸上清液，该批次发酵动力学中丁酸浓度在12h和48h处出现2次丁酸浓度峰值，这可能与可发酵糖流加有关，随后逐渐降低0.85g/L，丁酸被重吸收用于溶剂合成，最终丁醇产量10.58g/L，总溶剂产量达到14.85g/L。上述结果表明，在丁酸预处理上清液与可发酵糖复合流加的情况下，溶剂产量和生产效率都获得了显著提高，既实现了可发酵糖向丁醇的合成，也使得丁酸可以用来合成丁醇，起到了协同增效的目标，分别高于单一流加酶解液或丁酸预处理上清液批次的水平，该工艺可以将预处理残余组分全部消耗，对于废弃生物质资源化利用有重要意义。

Claims (9)

1.一种利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)活化培养丙酮丁醇梭菌，在梭菌培养基对丙酮丁醇梭菌进行发酵；

(2)在步骤(1)中发酵后，利用秸秆丁酸预处理后残渣酶解所得的可发酵糖作为碳源，流加入发酵液中继续发酵；

(3)待步骤(2)中丙酮丁醇梭菌生长稳定，将脱毒后的丁酸预处理上清液多次脉冲流加到发酵液中，进行发酵，生产燃料丁醇。

2.根据权利要求1所述的利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法，其特征在于，步骤(1)所述发酵为在34-40℃、静态无旋转条件下发酵10-12h。

3.根据权利要求1所述的利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法，其特征在于，步骤(2)所述秸秆酶解所得的可发酵糖为木质纤维素丁酸预处理后固体残渣酶解所得。

4.根据权利要求3所述的利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法，其特征在于，所述木质纤维素优选为玉米秸秆、小麦秸秆、玉米芯或者水稻秸秆，所使用的预处理工艺为丁酸预处理，其预处理条件为：丁酸溶液浓度为40-60g/L，固液的质量体积比为1：8～1:12g/mL，处理时间为0.5～1.0h，温度为160-200℃。

5.根据权利要求3所述的利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法，其特征在于，由木质纤维素经过丁酸预处理后的固体残渣通过酶解过程得到可发酵糖，其酶解过程的缓冲体系为：柠檬酸钠缓冲液，pH值为4.8～5.0；所述预处理后的固体残渣与柠檬酸缓冲液的质量体积比为1:4～1:10g/mL，使用的酶为Cellic CTec3，酶添加量为8-15FPU/g基质。

6.根据权利要求1所述的利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法，其特征在于，步骤(3)所述丁酸预处理上清液为木质纤维素经过丁酸溶液预处理后，利用固液分离得到的含丁酸的上清液；所述丁酸预处理上清液通过脉冲式方式流加至丁醇发酵液中，每次流加0.5-1.0mL上清液到50mL发酵液中，流加初始时间为10-12h，流加间隔时间为4～12h。

7.根据权利要求1所述的利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法，其特征在于，步骤(3)所述进行丁醇发酵为34-40℃、静态无旋转条件下发酵60-80h。

8.根据权利要求1所述的利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法，其特征在于，所述上清液脱毒为采用活性炭和溶液质量体积比(g/mL)为4.5-5.5％的添加量，脱毒温度为55-65℃，时间为10-15h。

9.一种权利要求1所述的利用木质纤维原料高效生产燃料丁醇的方法在提高丁醇产量中的应用。

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