CN116018406A - 改进的多重化抑制性rna支架 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及RNA干扰领域，更具体地说，应用于免疫疗法例如过继性细胞疗法(ACT)的RNA干扰。在这里，提出了设计成下调多个靶标的多个shRNA。还提出了编码shRNA的多核苷酸、载体和表达此类shRNA的细胞，单独地或与感兴趣的蛋白如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)组合。这些细胞特别适合用于免疫疗法。

Description

改进的多重化抑制性RNA支架
发明领域
本申请涉及RNA干扰领域，更具体地说，应用于免疫疗法例如过继性细胞疗法(ACT)的RNA干扰。在这里，提出了设计成下调多个靶标的多个shRNA。还提出了编码shRNA的多核苷酸、载体和表达此类shRNA的细胞，单独地或与感兴趣的蛋白如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)组合。这些细胞特别适合用于免疫疗法。
背景技术
在难以有效方式转导的细胞中同时下调多个靶标是一个已知问题。多重基因组工程化方法通常很麻烦。在寻求解决多重基因组工程化遇到的问题时，可以考虑提供敲低而不是基因敲除可能性的系统，这将带来更大的灵活性(例如，时间调控将成为可能)。理想情况下，这些系统也应该不那么麻烦(这样就不需要为每个靶标工程设计单独的蛋白，或者可以在单个转导步骤中实现下调)，并且应当是足够有效且特异的。
可以考虑的一种解决方案是RNA干扰(RNAi)。植物和动物中存在几种RNAi基因调节机制。第一种是通过表达小的非编码RNA，称为microRNA(微小RNA，“miRNA”)。miRNA能够靶向特定的信使RNA(“mRNA”)以进行降解，从而促进基因沉默。
由于microRNA通路在基因活性调节中的重要性，研究人员目前正在探索小干扰RNA(“siRNA”)能够介导RNAi的程度，其中小干扰RNA是人工设计的分子。siRNA可以引起靶标分子如mRNA的切割，与miRNA相似，为了识别靶标分子，siRNA依赖于碱基的互补性。
在称为siRNA的分子类别中，有短发夹RNA(“shRNA”)。shRNA是单链分子，含有有义区和能够与有义区杂交的反义区。shRNA能够形成茎环结构，其中有义区和反义区构成部分或全部茎。使用shRNA的一个优点是它们可以作为一个简单的单一实体进行递送或转录，该实体可以作为单个单元或作为多组分系统的一部分引入，当siRNA具有两条分开的链时，这些都是不可能的。然而，与其他siRNA一样，shRNA仍然基于碱基的互补性靶向mRNA。
许多病况、疾病和病症是由多种蛋白之间的相互作用引起的。因此，研究人员正在寻找将多个siRNA同时递送至细胞或生物体的有效方法。
一种递送选择是使用载体技术在细胞中表达shRNA，它们将在细胞中通过内源性miRNA通路进行处理。为每个shRNA使用单独的载体可能很麻烦。因此，研究人员开始探索使用能够表达多个shRNA的载体。遗憾的是，报道的文献描述了从单个载体表达多个shRNA时的若干挑战。研究人员遇到的问题包括：(a)载体重组和shRNA表达丢失的风险；(b)多重盒中的位置效应降低了shRNA的功能；(c)shRNA克隆的复杂性；(d)RNAi加工饱和度；(e)细胞毒性；(f)不期望的脱靶效应。
此外，虽然已表明siRNA在某些转化的哺乳动物细胞系中的短期基因抑制有效，但其在原代细胞培养物中或用于稳定转录物敲低中的应用证明更具挑战性。已知敲低功效差异很大，范围在<10％至>90％之间(例如Taxman等人，2006)，因此需要进一步优化。由于表达超过一种抑制剂时功效通常会降低，因此这种优化在这种情况下更为重要。
因此，仍然需要开发用于递送多重化RNA干扰分子的有效盒和载体。虽然一般来说对于细胞应用确实如此，但在ACT领域中对此进行的探索较少，并且在这些细胞中高度需要有效的系统。
因此，本领域需要提供允许具有多重化靶标敲低的细胞疗法的系统，其不需要多步生产方法(并因此提供相对容易的制造和降低的成本)，并提供灵活性(例如通过使变化可逆，允许敲低减弱(例如以避免毒性)，或将一个靶标换成另一个靶标)。
发明概述
令人惊讶的是，本文证明了shRNA不仅可以在细胞中、特别是在工程化免疫细胞中成功地多重化，而且还可以非常有效地下调多个靶标，利用天然存在的miRNA簇、特别是miR-106a～363簇的支架，特别是多重化支架。
因此，本发明的一个目的是提供包含编码至少一个RNA干扰分子的核酸序列的载体，所述RNA干扰分子具有选自存在于miR-106a～363簇中的支架，特别是具有选自以下的支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。根据特定的实施方案，载体适合于在真核细胞中表达，特别是在免疫细胞中表达。RNA干扰分子通常还含有天然支架序列中不存在的靶序列。通常，这是通过用选择的靶序列，例如与编码靶蛋白的mRNA的序列相匹配的靶序列，取代microRNA支架中天然存在的靶序列(通常称为成熟序列)来实现的。最特别地，靶序列具有18-23个核酸的长度。靶序列的互补链通常称为过客序列。
根据具体实施方案，一个或多个RNA干扰分子的至少一个支架是选自miR-106a支架、miR-18b支架和miR-20b支架的支架。换句话说，根据这些具体实施方案，提供了包含编码至少一个RNA干扰分子的核酸序列的载体，所述至少一个RNA干扰分子具有选自miR-106a～363簇的前三个支架中存在的一个的支架，即具有选自miR-106a支架、miR-18b支架和miR-20b支架的支架。例如，至少一个RNA干扰分子可以具有miR-106a支架，而其他RNA干扰分子可以具有独立选择的支架，例如独立地选自miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架的支架。
根据特定实施方案，载体中将存在多于一个RNA干扰分子。根据这些实施方案，至少一个RNA干扰分子则为至少两个RNA干扰分子，特别是至少两个多重化RNA干扰分子。因此，根据这些实施方案，提供了包含编码至少两个RNA干扰分子的核酸序列的载体，所述至少两个RNA干扰分子具有选自存在于miR-106a～363簇中的一个支架的支架，特别是具有选自miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架的支架。当存在至少两个多重化RNA干扰分子时，这两个或更多个分子可以具有相同或不同的支架，即可以具有选自miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架的一个或多个支架。然而，特别设想不超过三个支架是相同的，甚至更特别设想使用不超过两个相同的支架。这是为了避免相同支架序列之间的重组(参见实施例5)。
根据具体实施方案，载体中存在的支架仅选自上述六个支架(miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架)。然而，还主张将这些进一步与不同的支架序列、特别是不同的不相关序列(以避免重组)、例如miR-196a2序列组合。根据这些特定的实施方案，提供了包含编码至少两个RNA干扰分子的核酸序列的载体，并且至少一个RNA干扰分子具有选自存在于miR-106a～363簇中的一个支架的支架，特别是具有选自miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架的支架。
根据特定的实施方案，支架序列可能已经被工程化以减少茎区中的错配和/或凸起的数量。更具体地说，如果使用的支架序列之一是miR-18b支架，则可以对支架进行工程化(并且与天然序列相比进行了修饰)以减少茎区中错配和/或凸起的数量(参见实施例3)。
根据进一步的方面，本文提供了工程化细胞，其包含编码至少一个RNA干扰分子的核酸分子，所述至少一个RNA干扰分子具有选自存在于miR-106a～363簇中的一个支架的支架，特别是具有选自miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架的支架。RNA干扰分子通常还含有天然支架序列中不存在的靶序列。为此，将相应miRNA支架的成熟序列替换为所选的靶序列。靶序列通常具有18-23个核酸的长度。特别的主张是，靶序列针对工程化细胞中出现的序列，特别是靶序列。即，至少一个RNA干扰分子具有靶向(通过碱基对互补性)工程化细胞中编码待下调蛋白的序列的序列。
根据特定的实施方案，工程化细胞将包含至少两个RNA干扰分子，特别是至少两个多重化RNA干扰分子，其具有选自miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架的支架。
根据进一步的实施方案，提供了工程化细胞，其包含：
o编码感兴趣的蛋白的第一外源核酸分子
o编码至少一个RNA干扰分子的第二核酸分子，所述至少一个RNA干扰分子具有选自以下的支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。
应当理解，第一和第二外源核酸分子可以作为一种载体提供。或者，它们可以作为单独的核酸分子提供。
根据特定的实施方案，至少一个RNA干扰分子包含支架内的靶序列，其不同于支架的天然靶序列(即，不同于miRNA支架的成熟链)。靶序列的长度通常在18至23个核苷酸之间。根据特定的实施方案，RNA干扰分子通过靶序列的碱基对互补性针对工程化细胞中的靶标。
根据进一步的具体实施方案，提供了工程化细胞，其包含：
ο编码感兴趣的蛋白的第一外源核酸分子
ο编码至少两个多重化RNA干扰分子的第二核酸分子，所述至少两个多重化RNA干扰分子具有选自以下的支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。
当存在至少两个多重化RNA干扰分子时，这两个或更多个分子可以具有相同或不同的支架，即可以具有选自以下的一个或多个支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。然而，特别主张不超过三个支架是相同的，甚至更特别主张使用不超过两个相同的支架。这是为了避免相同支架序列之间的重组(参见实施例5)。
工程化细胞特别是真核细胞，更特别是工程化哺乳动物细胞，更特别是工程化人类细胞。根据特定的实施方案，细胞是工程化免疫细胞。典型的免疫细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、干细胞、祖细胞和iPSC细胞。
根据特定的实施方案，工程化细胞还含有编码感兴趣的蛋白的核酸。特别地，这种感兴趣的蛋白是受体，特别是嵌合抗原受体或TCR。嵌合抗原受体或工程化TCR可以针对任何靶标，典型的实例包括CD19、CD20、CD22、CD30、BCMA、B7H3、B7H6、NKG2D、HER2、HER3、GPC3、MUC1，但还存在更多的实例且它们也适用。根据特定的实施方案，可以存在多于一种感兴趣的蛋白。在此类情况下，第二种(或更多的)蛋白可以是受体，或者可以是例如细胞因子、趋化因子、激素、抗体、组织相容性抗原(例如HLA-E)、标签或任何其他具有治疗或诊断价值或允许检测的蛋白。
根据具体实施方案，第一和第二核酸分子存在于一种载体中，例如真核表达质粒、小环DNA(mini-circle DNA)或病毒载体(例如源自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒和仙台病毒(Sendai virus))。
至少两个多重化RNA干扰分子可以是至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或甚至更多个分子，这取决于待下调的靶标分子的数量以及在共表达多重化分子方面的实际考虑因素。根据特定的实施方案，使用至少三个多重化RNA干扰分子。根据进一步特定的实施方案，至少三个RNA干扰分子中的至少一个具有选自miR-106a支架和miR-20b支架的支架。根据备选实施方案，至少三个RNA干扰分子中的至少一个具有选自miR-106a支架和miR-18b支架的支架。
根据特定的实施方案，支架序列可能已经被工程化以减少茎区中的错配和/或凸起的数量。更具体地说，如果使用的支架序列之一是miR-18b支架，则可以对支架进行工程化(并且与天然序列相比进行了修饰)以减少茎区中错配和/或凸起的数量(参见实施例3)。
“多重体(multiplex)”是编码多个相同类型分子、例如多个siRNA或shRNA或miRNA的多核苷酸。在多重体内，当分子属于相同类型(例如，全都为shRNA)时，它们可以是相同的或包含不同的序列。在相同类型的分子之间，可能存在插入序列(intervening sequence)，例如本文所述的接头。本发明的多重体的一个实例是编码多个串联的基于miRNA的shRNA的多核苷酸。多重体可以是单链、双链或同时具有单链区域和双链区域。
根据特定的实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子受一个启动子控制。通常，这个启动子不是U6启动子。这是因为这个启动子与毒性有关，尤其是在高水平表达时。出于同样的原因，整体上可以考虑排除H1启动子(其是比U6弱的启动子)或甚至Pol III启动子(尽管它们可适用于某些条件)。根据具体的实施方案，启动子选自Pol II启动子和Pol III启动子。根据特定的实施方案，启动子是天然的或合成的Pol II启动子。根据特定的实施方案，启动子是选自以下的Pol II启动子：巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸因子1α(EF1α)启动子(核心或全长)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、具有上游CMV IV增强子的复合β-肌动蛋白启动子(CAG启动子)、泛素C(UbC)启动子、脾病灶形成病毒(spleen focus forming virus，SFFV)启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)启动子、白细胞介素-2启动子、鼠干细胞病毒(murine stem cell virus，MSCV)长末端重复序列(LTR)、长臂猿白血病病毒(Gibbon ape leukemia virus，GALV)LTR、猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)启动子和tRNA启动子。这些启动子都属于驱动mRNA表达最常用的聚合酶II启动子，也可以使用通用管家基因启动子(generic house keeping gene promoter)。
根据特定的实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子可以是shRNA分子或miRNA分子。最特别地，它们是miRNA分子。shRNA分子和miRNA分子之间的区别在于miRNA分子由Drosha处理，而常规shRNA分子则不是(这与毒性有关，Grimm等人,Nature 441:537–541(2006))。
根据具体实施方案，不同的miRNA分子受一个启动子控制。
根据特定的实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子针对同一靶标。注意到，针对相同靶标的RNA干扰分子仍然可以具有不同的支架序列和/或不同的靶标序列。根据进一步的具体实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子具有相同的支架，但具有不同的靶序列。根据备选的具体实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子具有不同的支架但相同的靶序列。根据具体实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子是相同的。
根据备选实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子中的所有多重化RNA干扰分子都是不同的。根据进一步的具体实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子中的所有多重化RNA干扰分子都针对不同的靶标。注意到，针对不同靶标的RNA干扰分子仍然可以具有相同的支架(但将具有不同的靶标序列)。
工程化细胞中存在的任何合适的分子都可以被本发明的RNA干扰分子靶向。设想的靶标的典型实例是：MHC I类基因、MHC II类基因、MHC复合受体基因(例如HLA-F、HLA-G)、TCR链、CD3链、NKBBiL、LTA、TNF、LTB、LST1、NCR3、AIF1、LY6、热休克蛋白(例如HSPA1L、HSPA1A、HSPA1B)、补体级联、调节受体(例如NOTCH4)、TAP、HLA-DM、HLA-DO、RING1、CD52、CD247、HCP5、DGKA、DGKZ、B2M、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、2B4、A2AR、BAX、BLIMP1、C160(POLR3A)、CBL-B、CCR6、CD7、CD95、CD123、DGK[DGKA、DGKB、DGKD、DGKE、DKGG、DGKH、DGKI、DGKK、DGKQ、DGKZ]、DNMT3A、DR4、DR5、EGR2、FABP4、FABP5、FASN、GMCSF、HPK1、IL-10R[IL10RA、IL10RB]、IL2、LFA1、NEAT 1、NFkB(包括RELA、RELB、NFkB2、NFkB1、REL)、NKG2A、NR4A(包括NR4A1、NR4A2、NR4A3)、PD1、PI3KCD、PPP2RD2、SHIP1、SOAT1、SOCS1、T-BET、TET2、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TIGIT、TIM3、TOX和ZFP36L2。
已经鉴定出特别合适的基于miRNA的构建体。因此，提供了包含多核苷酸的工程化细胞，所述多核苷酸包含基于microRNA的shRNA编码区，其中所述基于microRNA的shRNA编码区包含编码以下的序列：
一个或多个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列，其中每个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列包含：
οmiRNA支架序列，
ο活性序列或成熟序列，和
ο过客序列或星(star)序列，其中在每个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列中，活性序列与过客序列至少70％互补。
根据特定的实施方案，活性序列与过客序列至少80％互补，并且可以与过客序列至少90％互补或更多。
一个特别的优点是本发明的基于miRNA的shRNA核苷酸序列可以是多重化的。因此，提供了包含含有基于microRNA的多重化shRNA编码区的多核苷酸的工程化细胞，其中所述基于microRNA的多重化shRNA编码区包含编码以下的序列：
两个或更多个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列，其中每个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列包含
οmiRNA支架序列，
ο活性序列或成熟序列，和
ο过客序列或星序列，其中在每个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列中，活性序列与过客序列至少70％互补。
每个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列的活性序列和过客序列的长度通常在18至40个核苷酸之间，更特别在18至30个核苷酸之间，更特别在18至25个核苷酸之间，最特别是在18至23个核苷酸之间。活性序列也可以是18或19个核苷酸长。通常，过客序列与活性序列具有相同的长度，尽管可能存在的凸起意味着它们的长度并不总是相同。
通常，这些microRNA支架序列由接头隔开。根据特定的实施方案，至少一些5'和/或3'接头序列与其各自的支架一起使用。
人工序列可以例如是天然存在的支架(例如miR簇或其片段，如miR-106a～363簇)，其中内源性miR序列已被针对特定靶标工程化的shRNA序列替换，可以是单个miR支架(如例如miR-20b支架)的重复，其中内源性miR序列已被针对特定靶标工程化的shRNA序列替换，可以是人工miR样序列，或其组合。
如上所述，这种工程化细胞通常还包含编码感兴趣的蛋白例如嵌合抗原受体或TCR的核酸分子，并且可以是工程化免疫细胞。
至少一个RNA干扰分子的表达或多重化RNA干扰分子的共表达导致工程化细胞内至少一个基因但通常是多种基因的抑制。这能有助于获得更大的治疗功效。
还提供本文描述的工程化细胞，其用作药物。根据具体实施方案，提供工程化细胞，其用于治疗癌症。
这相当于是说提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用合适剂量的如本文所述的工程化细胞，从而改善至少一种症状。
工程化细胞可以是自体免疫细胞(从患者身上获得的细胞)或同种异体免疫细胞(从另一个受试者身上获得的细胞)。
附图简要说明
图1：聚簇支架的示意图，指示了诸如靶序列、上部茎、下部茎和支架的区域。
图2：显示了不具有(上部)或具有(下部)整合的miRNA支架的CAR表达载体(例如，CD19、BCMA、B7H3、B7H6、NKG2D、HER2、HER3、GPC3)的设计，允许来自同一载体的CAR和多个shRNA(例如，2个、4个、6个、8个……)的共表达。LTR：长末端重复序列；启动子(例如，EF1a、PGK、SFFV、CAG……)；标记物蛋白(例如，截短的CD34、CD19)；多重化shRNA。
图3：与重复的工程化的单个支架相比，使用天然mRNA簇提高了转导效率。根据图2所示的设计，使用编码CD19 CAR和3至6个多重化支架的不同载体转导T细胞。CD34用作报告基因，且转导后第4天的CD34+T细胞百分比(通过FACS测量)显示在下图中。上图显示相同的但经过纯化(从纯化柱洗脱的细胞量除以加载在纯化柱上的细胞量)。1-2：来自miR-17-92簇的支架，分别为4个(miR-19a、miR-20a、miR-19bl、miR-92al)和3个支架(miR-19a、miR-20a、miR-19bl)；3-5：来自miR-106a-363簇的支架，分别为6个(全部)、3个(最后3个)和4个(最后4个)；6：来自106b-25簇的所有3个支架；7：来自miR-23a～27a～24-2簇的所有3个支架；8-9：分别是miR-196a2支架序列的4个和3个重复序列；10：只有CD34标签的模拟载体。构建体中包括的靶基因是三重化支架的B2M、CD52和CD247，四重化支架中的TRAC作为附加基因。六重化支架针对每个靶基因两次，对每个靶标使用两个不同的靶序列。
图4：23a～27a～24-2簇和miR-106a-363簇之间的CD247(CD3ζ)敲低的比较，利用FACS通过TCR表达评价。1：只有CD34标签的模拟载体；2：来自miR-23a～27a～24-2簇的所有3个支架(miR-24-2支架中的CD247靶序列)；3-5：来自miR-106a-363簇的支架，分别为6个(全部)、3个(最后3个)和4个(最后4个)。CD247靶序列位于miR-363支架中；在3中，miR-20b支架中包含一个额外的不同序列。
图5：显示了miRNA 106a-363簇和用于图6的构建体的设计。
图6：显示了用逆转录病毒载体转导的来自健康供体的原代T细胞中的RNA表达，所述逆转录病毒载体编码第二代CD19指导的CAR、截短的CD34选择标记物以及在106a-363miRNA簇中引入的靶向CD247、B2M或CD52的3x shRNA或6x shRNA。没有shRNA(tCD34)作为对照。转导后两天，使用CD34特异性磁珠富集细胞，并在IL-2(100IU/mL)中进一步扩增6天。使用亲环蛋白作为管家基因，通过qRT-PCR评估CD247、B2M和CD52的mRNA表达。
图7：比较不同的shRNA靶序列以允许微调敲低水平。在miR-20b支架中评价了12个不同的靶序列，全部针对CD247。在激活后第12天(转导后第10天)收获T细胞。通过FACS测量TCRab水平：MFI显示为条形图。所有shRNA都实现了至少50％的敲低，其中数个效率更高。
图8：miR-18b支架中CD95的敲低。显示了从31个不同靶序列(全部针对CD95)中选择的序列，在miR-18b支架中进行了评价。在激活后第16天(转导后第14天)收获T细胞。通过FACS测量CD95水平：MFI显示为条形图。最有效的shRNA实现了约30％的敲低。
图9：miR-106a、miR-18b和miR-20b支架结构的比较。靶序列(此处长度为20bp)和过客链用矩形表示。而miR-106a和miR-20b在支架的18位(靶序列的14位)有错配，miR-18b的支架更大，在靶序列的6、11和15位有错配(分别用箭头2、3和4表示)，以及靶序列1位和2位之间的过客链中的2核酸凸起(用箭头1表示)。
图10：miR-18b支架的修饰改善了敲低效率。图10A显示了对miR-18b支架所做的修饰：去除凸起、去除个体错配以及去除凸起和前两个错配。图10B显示了CD95在这些miR-18b支架中的敲低效果：与自然序列相比，任何具有不匹配或凸起更少的构建体都实现了更高的敲低效率。以与图8中相同的方式测量敲低。
图11：靶序列长度的评价。对于针对B2M(左图)和CD247(右图)的靶序列，都评价了靶序列长度对敲低效率的影响。构建体有时标记有两个长度(19-20、21-22或22-23)，因为天然支架序列与该位置的靶标序列相同。显示了miR-106a支架的结果，对于miR-20b支架获得了类似的结果(未显示)。簇：采用不相关序列的对照；使用分别针对CD247和B2M的靶序列作为另外的对照。
图12A-C：使用支架的不同排列评价不同基因的同时敲低。A：FACS数据显示对于指示的双重化和三重化支架B2M/HLA(左图)和CD247/CD3ζ(右图)的表达。B：小图AFACS数据的MFI，此处包括三重化支架的CD95表达。C：FACS数据的MFI，显示指示构建体的B2M、CD247和CD95的表达。
发明详述
定义
本发明将结合具体实施方案并参考某些附图进行描述，但本发明不限于此，而仅受权利要求的限制。权利要求中的任何参考标记不应被解释为限制范围。所述附图只是示意性的并且是非限制性的。在附图中，为了说明的目的，一些元件的大小可能被夸大并且未按比例绘制。在本说明书和权利要求中使用术语“包含”时，它不排除其他元件或步骤。当指代单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“a”或“an”、“the”时，除非另有说明，否则包括该名词的复数形式。
此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等用于区分相似的元件，而并不一定用于描述顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在合适的情况下是可互换的，并且本文所述的本发明的实施方案能够以不同于本文所描述或说明的其他顺序进行操作。
提供以下术语或定义仅用于帮助理解本发明。
除非在本文中特别定义，否则本文所用的所有术语的含义与其对于本发明领域技术人员的含义相同。对于本领域的定义和术语，从业者尤其关注Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,,New York(2012)；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(直至增刊114),John Wiley&Sons,New York(2016)。本文提供的定义所解释的范围不应小于本领域普通技术人员理解的范围。
如本文所用，“工程化细胞”是已通过人为干预(与天然发生的突变相对)修饰的细胞。
如本文所用，术语“核酸分子”被同义地称为“核苷酸”或“核酸”或“多核苷酸”，是指任何聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。核酸分子包括但不限于单链和双链DNA、作为单链和双链区域混合物的DNA、单链和双链RNA以及作为单链和双链区域混合物的RNA，包含DNA和RNA(其可以是单链的，或更典型地是双链的或单链和双链区域的混合物)的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及骨架出于稳定性或其他原因而被修饰的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基和不常见的碱基，例如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常在自然界中发现的化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”还包括相对较短的核酸链，通常称为寡核苷酸。
“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体、粘粒或病毒，其中可以有效地插入另一个核酸区段以引起所述区段的复制或表达。“克隆”是通过有丝分裂从单个细胞或共同祖先衍生的细胞群体。“细胞系”是能够在体外稳定生长多代的原代细胞的克隆。在本文提供的一些示例中，通过用DNA转染细胞来转化细胞。
术语“表达”和“产生”在本文中同义使用，并且是指基因产物的生物合成。这些术语涵盖基因向RNA的转录。这些术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并进一步涵盖所有天然发生的转录后和翻译后修饰。
如本文所用，术语“外源的”，尤其是在细胞或免疫细胞的上下文中，是指存在于个体活细胞中并具有活性但起源于该细胞外的任何物质(与内源因子相对)。因此，短语“外源核酸分子”是指已通常通过转导或转染被引入(免疫)细胞中的核酸分子。如本文所用，术语“内源的”是指存在于个体活细胞中并具有活性且源自于该细胞内部的任何因子或物质(并因此通常也在非转导或非转染细胞中产生)。
如本文所用，“分离的”是指生物组分(例如核酸、肽或蛋白)已从该组分天然存在于其中的生物体的其他生物组分(即其他染色体的和染色体外的DNA和RNA以及蛋白)中基本上分离、从其中产生或从其中纯化。已“分离”的核酸、肽和蛋白因此包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。“分离的”核酸、肽和蛋白可以是组合物的一部分，并且如果这样的组合物不是核酸、肽或蛋白的天然环境的一部分，则可以被继续分离。所述术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白，以及化学合成的核酸。
在分子生物学的背景下，如本文所用的“多重化(multiplexed)”是指同时靶向两个或更多个(即多个)相关或不相关的靶标。如本文所用，术语“RNA干扰分子”是指通过中和所靶向的mRNA分子来抑制基因表达或翻译的RNA(或RNA样)分子。RNA干扰分子通过碱基对互补性中和所靶向的mRNA分子：在RNA干扰分子内是可以与所靶向的核酸分子杂交的靶序列(通常为18-23个核酸)。实例包括siRNA(包括shRNA)或miRNA分子。因此，本文所用的“多重化RNA干扰分子”是同时存在的用于相伴下调一种或多种靶标的两种或更多种分子。通常，每个多重化分子将针对特定靶标，但两个分子可以针对同一靶标(并且甚至可以是相同的)。
如本文所用，“启动子”是核酸的调节区，通常位于基因区附近，为受调节的基因转录提供控制点。
“多重体”是编码多个相同类型分子的多核苷酸，例如多个siRNA或shRNA或miRNA。在多重体中，当分子属于相同类型(例如，全部都为shRNA)时，它们可以是相同的或包含不同的序列。在相同类型的分子之间，可能存在插入序列，例如本文所述的接头。本发明的多重体的一个实例是编码多个基于miRNA的shRNA的多核苷酸。多重体可以是单链的、双链的或同时具有单链区域和双链区域。
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指嵌合受体(即，由来自不同来源的部分组成)，其至少具有对抗原有特异性的结合部分(其可以例如衍生自抗体、受体或其同源配体(cognate ligand))和可以在免疫细胞中传递信号的信号传导部分(例如，CD3ζ链。也可以使用其他信号传导或共信号传导部分，例如FcεRIγ结构域、CD3ε结构域，最近描述的DAP10/DAP12信号传导结构域，或来自CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP10、DAP12、CD27和CD2的结构域作为共刺激结构域)。“嵌合NK受体”是其中的结合部分衍生自或分离自NK受体的CAR。
如本文所用，“TCR”是指T细胞受体。在过继性细胞转移的背景下，这通常是指工程化的TCR，即已被工程化以识别特定抗原且最通常是肿瘤抗原的TCR。如本文所用，“内源性TCR”是指内源存在于未修饰细胞(通常为T细胞)上的TCR。TCR是一种二硫键连接的膜锚定的异二聚体蛋白，通常由高度可变的alpha(α)和beta(β)链组成，表达为包含不变的CD3链分子的复合物一部分。TCR受体复合物是可变的TCR受体α和β链与CD3复合受体(包含一条CD3γ链、一条CD3δ链和两条CD3ε链)和两条CD3ζ链(又名CD247分子)的八聚体复合物。如本文所用，术语“功能性TCR”意指能够在与其关联配体结合时转导信号的TCR。通常，对于同种异体疗法，进行工程化以减少或损害TCR功能，例如，通过敲除或敲低至少一个TCR链。当工程化细胞中的内源TCR与具有内源TCR而没有任何工程化的细胞相比保留至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％或甚至至少90％的信号传导能力(或T细胞激活)时，认为其是有功能的。用于评估信号传导能力或T细胞激活的测定是本领域技术人员已知的，并且包括测量干扰素γ的ELISA等。根据可选的实施方案，如果没有进行干扰TCR功能的工程化，则内源TCR被认为是有功能的。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指作为免疫系统(其可以是适应性或先天性免疫系统)的一部分的细胞。本文所用的免疫细胞通常是为过继性细胞转移(自体转移或同种异体转移)而制造的免疫细胞。许多不同类型的免疫细胞用于过继性疗法，因此免疫细胞可用于本文所述的方法中。免疫细胞的示例包括但不限于T细胞、NK细胞、NKT细胞、淋巴细胞、树突细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、干细胞、祖细胞或iPSC。后三个本身不是免疫细胞，但可用在过继性细胞转移中用于免疫治疗(参见例如Jiang等人,Cell Mol Immunol 2014；Themeli等人,Cell Stem Cell 2015)。通常，尽管制造从干细胞或iPSC开始(或者甚至可能从自免疫细胞至iPSC的去分化步骤开始)，但制造需要在施用前分化为免疫细胞的步骤。用于制造过继性转移用免疫细胞的干细胞、祖细胞和iPSC(即，用本文所述的CAR转导的干细胞、祖细胞和iPSC或其分化后代)被认为是本文的免疫细胞。根据特定的实施方案，所述方法中涉及的干细胞不涉及破坏人类胚胎的步骤。
特别设想的免疫细胞包括白血细胞(白细胞)，其包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞。特别涉及的淋巴细胞包括T细胞、NK细胞和B细胞，最特别涉及的是T细胞。在过继性转移的背景下，注意免疫细胞通常将是原代细胞(即，从人类或动物组织中直接分离的，不培养或仅短暂培养的细胞)，并且不是细胞系(即，已经长时间连续传代并已获得同质的基因型和表型特征的细胞)。根据具体实施方案，免疫细胞将是原代细胞(即，从人类或动物组织中直接分离的，不培养或仅短暂培养的细胞)，并且不是细胞系(即，已经长时间连续传代并已获得同质的基因型和表型特征的细胞)。根据备选的具体实施方案，免疫细胞不是来自细胞系的细胞。
如本文所用，“microRNA支架”、“miRNA支架”或甚至“支架”是指含有特定microRNA加工要求的充分表征的初级microRNA序列，其中可以插入RNA序列(通常用针对特定靶标的siRNA替换现有的miRNA序列)。microRNA支架至少由双链上部茎区(通常为18-23个核苷酸)组成，茎区的两侧由灵活的环序列连接，上部茎区通常由Dicer加工。通常，microRNA支架进一步包含下部茎区，并且任选地它进一步包含5'和3'侧翼序列或基底区段。引导序列或靶序列插入上部茎区，并且是18-23个核苷酸的单链序列。靶序列通过互补碱基配对识别其靶标，因此该序列通常与靶标或其调控区域中存在的序列相同。如本文所用，“靶标”或“靶蛋白”是指待被下调的分子(通常是蛋白，但它可以是核酸分子)(即，其在细胞中的表达应减少)。注意到，miRNA在核酸水平上起作用，因此即使它针对蛋白，miRNA靶序列也将与编码蛋白的序列(例如mRNA序列)或调控蛋白表达的序列(如例如3'UTR区域)相同。
miRNA支架的实例包括例如天然存在的miRNA簇中存在的支架，例如miR-106a、miR-18b、miR-20b、miR-19b-2、miR-92-2或miR-363，或工程化的支架，例如SMARTvectorTMmicro-RNA适应支架(Horizon Discovery,Lafayette,CO,USA)。如本文所用，“miR-106a”对应于人类基因ID 406899，“miR-18b”对应于人类基因ID 574033，“miR-20b”对应于人类基因ID 574032，“miR-19b-2”对应于人类基因ID 406981，“miR-92-2”也称为“miR-92a-2”，对应于人类基因ID 407049，“miR-363”对应于人类基因ID 574031。
如本文所用，“microRNA簇”或“miRNA簇”是指一起起作用的microRNA支架的集合。天然存在的microRNA簇已得到很好的描述，包括例如miR-106a～363簇、miR-17～92、miR-106b～25和miR-23a～27a～24-2簇。miRNA簇可以看作是组合支架。如本文所用，“组合miRNA支架(combined miRNA scaffold)”是指在一个启动子的控制下起作用的多于一个miRNA支架的组合。多于一个miRNA支架可以相同或不同，具有针对相同或不同靶蛋白的靶序列，并且如果靶标相同，则具有针对该靶标的相同或不同靶序列。当在一个启动子的控制下时，此类组合支架也称为“多重支架”、“多重化支架”或“多重miRNA支架”。有时，当确定支架的数量时，可以使用这来代替“多-(multi-)”前缀。例如。“双重支架”是指存在两个支架，“三重支架”具有三个支架，“四重(tetraplex)”或“四重(quadruplex)”具有四个，“五重”具有五个，“六重”具有六个，等等。这样，具有六个不同miRNA支架的miRNA簇(例如miR-106a-363簇)可以被认为是一个六重miRNA支架。
图1显示了如本文所用的多重化支架序列的示意性实例，其中标明了上部和下部茎区、靶序列、个体支架。
术语“受试者”是指人和非人动物，包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、小鼠、兔、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在所述方法的大多数具体实施方案中，受试者是人。
术语“治疗”是指减轻或改善损伤、病理或病况的任何成功或成功标志，包括任何客观或主观参数，例如减轻、缓解、减弱症状或使患者对病况的耐受更强、减慢退化(degeneration)或衰退的速度、使退化的最终点不那么衰弱、改善受试者的身体或精神健康、或延长生存时间。治疗可以通过客观或主观参数进行评估；包括身体检查、神经系统检查或精神评估的结果。
如本文所用，短语“过继性细胞疗法”、“过继性细胞转移”或“ACT”是指将细胞(最通常为免疫细胞)转移到受试者(例如患者)中。这些细胞可能源自受试者(在自体疗法的情况下)或源自另一个体(在同种异体疗法的情况下)。疗法的目标是提高免疫功能性和特性，以及在癌症免疫疗法中提高对癌症的免疫应答。尽管T细胞最常用于ACT，但其他免疫细胞类型也适用，例如NK细胞、淋巴细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))、树突细胞和骨髓细胞。
“有效量”或“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量。治疗剂(例如本文所述的转化的免疫细胞)的治疗有效量可根据例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及治疗剂(例如细胞)在个体中引发所需应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是治疗剂的治疗有益作用超出任何毒性或有害作用的量。
短语“移植物抗宿主病”或“GvHD”是指在同种异体移植后可能发生的病况。在GvHD中，捐献的骨髓、外周血(干)细胞或其他免疫细胞将接受者的身体视为外来物(foreign)，并且捐献的细胞会攻击身体。由于供体免疫活性免疫细胞(例如T细胞)是GvHD的主要驱动因素，因此预防GvHD的一种策略是减少这些免疫活性细胞中的(基于TCR的)信号传导，例如通过直接或间接抑制TCR复合物的功能。
为了评估在不需要基因组编辑(及其相关成本和复杂制造过程)的情况下，在过继性细胞转移(ACT)背景下靶向多个基因是否可行，决定测试多重化RNA干扰分子。
潜在的方法基于来自特定载体的RNA的转录，其通过内源RNA加工机制加工而生成活性shRNA，该活性shRNA能够通过碱基识别靶向所选择的mRNA并通过RISC复合物对该特异性mRNA进行破坏。所靶向的mRNA的特异性破坏导致相关蛋白表达的相应减少。虽然可以将RNA寡核苷酸转染到所选择的靶细胞中以实现基因表达的瞬时敲低，但从所整合的载体表达所需的shRNA能够稳定敲低基因表达。
shRNA的成功表达在很大程度上取决于与聚合酶III(Pol III)启动子(例如，H1、U6)的偶联，其产生缺乏5'帽和3'多聚腺苷酸化的RNA物质，使得能够进行shRNA双链体的加工。一旦转录，shRNA就经历加工、从细胞核输出、进一步加工并加载到RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，导致选择的mRNA靶向降解(Moore等人,2010)。PolIII启动子驱动的转录虽然有效，但由于PolIII启动子对shRNA的过度高表达导致的内源microRNA通路的饱和，转录的效率可导致细胞毒性(Fowler等人,2016)。此外，通常通过使用驱动治疗基因的聚合酶II(PolII)启动子和驱动感兴趣的shRNA的PolIII启动子，实现利用单个载体表达治疗基因和shRNA两者。该表达是功能性的，但以载体空间(vector space)为代价，导致引入的治疗基因的选择较少(Chumakov等人,2010；Moore等人,2010)。
将shRNA嵌入microRNA(mir)框架内允许在PolII启动子的控制下加工shRNA(Giering等人,2008)。重要的是，嵌入的shRNA的表达水平往往较低，从而避免了在使用其他系统(例如U6启动子)表达时观察到的毒性(Fowler等人,2015)。事实上，接受由肝特异性PolII启动子驱动的shRNA的小鼠表现出稳定的基因敲低，超过一年没有耐受性问题(Giering等人,2008)。然而，这仅针对一个shRNA，在肝细胞中完成，且蛋白水平的降低仅为15％(Giering等人,2008)，因此尚不知晓对于多于一个靶标，且尤其是在免疫细胞(其更难操作)中时，是否可以达到更高的效率。
令人惊讶的是，本文证明miR106a～363簇的元件在下调靶标方面出乎意料地有效，特别是靶标的多重化下调：针对不同靶标的多个基于microRNA的shRNA的表达(基于miR106a～363簇中出现的个体支架)在T细胞中是可行的，没有显示重组，没有显示毒性，并且同时实现多个靶标的有效下调。
因此，本发明的一个目的是提供包含编码至少一个RNA干扰分子的核酸序列的载体，其具有选自存在于miR-106a～363簇中的一个支架的支架，特别是具有选自以下的支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。根据特定的实施方案，载体适合于在真核细胞中、特别是在免疫细胞中表达。RNA干扰分子通常还含有天然支架序列中不存在的靶序列。最特别地，靶序列具有18-23个核酸的长度。
根据具体实施方案，一个或多个RNA干扰分子的至少一个支架是选自miR-106a支架、miR-18b支架和miR-20b支架的支架。换句话说，根据这些具体实施方案，提供了包含编码至少一个RNA干扰分子的核酸序列的载体，所述至少一个RNA干扰分子具有选自miR-106a～363簇的前三个支架中存在的一个的支架，即具有选自以下的支架：miR-106a支架、miR-18b支架和miR-20b支架。例如，至少一个RNA干扰分子可具有miR-106a支架，而其他RNA干扰分子可具有独立选择的支架，例如独立选自以下的支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。
根据特定的实施方案，载体中存在的至少一个RNA干扰分子是至少两个RNA干扰分子，特别是至少两个多重化RNA干扰分子。当存在至少两个多重化RNA干扰分子时，这两个或更多个分子可以具有相同或不同的支架，即可以具有选自以下的一个或多个支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。然而，特别要求不超过三个支架是相同的，甚至更特别要求使用不超过两个相同的支架。这是为了避免相同支架序列之间的重组，或其他减少miRNA加工的因素(参见实施例5)。
根据具体实施方案，载体中存在的支架仅选自上述六个支架(miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架)。然而，还要求将这些进一步与不同的支架序列组合，特别是不同的不相关序列(以避免重组)，例如miR-196a2序列。或者，它们可以与其他miRNA簇序列组合，特别是与来自miR-17-92簇、miR-106b～25簇和/或miR-23a～27a～24-2簇的支架组合。
根据特定的实施方案，支架序列可能已经被工程化以减少茎区中的错配和/或凸起的数量。如本文所用，“错配(mismatch)”是指不是互补的Watson-Crick碱基对的碱基对。如本文所用，“凸起(bulge)”是指位于核酸双链体的一条链内的未配对的核苷酸段(通常为1-5个，特别是1-3个)。更具体地说，如果使用的支架序列之一是miR-18b支架，则可以对支架进行工程化(并且与天然序列相比进行了修饰)以减少茎区中错配和/或凸起的数量(参见实施例3)。这可以通过恢复碱基对互补性(在错配的情况下)，通常是通过将过客链与靶标链匹配，或者在凸起的情况下通过去除多余的未配对核苷酸来完成。
本文公开的载体特别适用于用于ACT的细胞。因此，本发明的一个目的是提供包含编码至少一个RNA干扰分子的核酸分子的工程化细胞，所述至少一个RNA干扰分子具有选自存在于miR-106a～363簇中的一个支架的支架，特别是具有选自以下的支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。RNA干扰分子通常还含有天然支架序列中不存在的靶序列。靶序列通常具有18-23个核酸的长度。特别要求靶序列针对工程化细胞中出现的序列，特别是靶标的序列。即，至少一个RNA干扰分子具有靶向(通过碱基对互补性)工程化细胞中编码待下调的蛋白或靶蛋白的调控区的序列。
根据特定的实施方案，工程化细胞将包含至少两个RNA干扰分子，特别是至少两个多重化RNA干扰分子，其具有选自以下的支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。
含有至少一个RNA干扰分子或含有至少两个RNA干扰分子的细胞可以具有优势，特别是治疗益处。RNA干扰分子确实可以针对不期望(过度)表达的靶标。然而，通常，本文提供的工程化细胞将进一步含有至少一种感兴趣的蛋白。
根据这些实施方案，提供了工程化细胞，其包含：
ο编码感兴趣的蛋白的第一外源核酸分子
ο编码至少一个RNA干扰分子的第二核酸分子，其具有选自以下的支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。
根据进一步的特定的实施方案，提供了工程化细胞，其包含：
ο编码感兴趣的蛋白的第一外源核酸分子
ο编码至少两个多重化RNA干扰分子的第二核酸分子，所述至少两个多重化RNA干扰分子具有选自以下的支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。
当存在至少两个多重化RNA干扰分子时，这两个或更多个分子可以具有相同或不同的支架，即可以具有选自以下的一个或多个支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。然而，特别要求不超过三个支架是相同的，甚至更特别要求使用不超过两个相同的支架。这是为了避免相同支架序列之间的重组，或细胞的miRNA处理能力过载(参见实施例5)。出于同样的原因，当有多于一个靶序列指向同一靶标时，特别设想使用不同的靶序列，或者相同的靶序列用于不同的支架中。相同支架中的相同靶序列是可能的，但特别要求它们出现不超过两次。
任选的其他感兴趣的蛋白可以例如提供加和性的、支持性的或甚至协同性的作用，或者它可以用于不同的目的。例如，感兴趣的蛋白可以是针对肿瘤的CAR，并且RNA干扰分子可以干扰肿瘤功能，例如通过靶向免疫检查点、直接下调肿瘤靶标、靶向肿瘤微环境。备选地或另外地，RNA干扰分子中的一个或多个可延长治疗细胞的持久性，或以其他方式改变生理应答(例如，干扰GvHD或宿主抗移植物反应)。
感兴趣的蛋白原则上可以是任何蛋白，视情况而定。然而，通常它们是具有治疗功能的蛋白。这些蛋白可以包括分泌的治疗性蛋白，如例如，白细胞介素、细胞因子或激素。然而，根据特定的实施方案，感兴趣的蛋白不是分泌的蛋白。代替治疗性蛋白，感兴趣的蛋白可以发挥不同的功能，例如诊断或检测。因此，感兴趣的蛋白可以是标签或报告基因。通常，感兴趣的蛋白是受体。根据进一步的特定的实施方案，受体是嵌合抗原受体或TCR。嵌合抗原受体可以针对在靶细胞表面表达的任何靶标，典型的实例包括但不限于CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD38、CD44、CD56、CD70、CD123、CD133、CD138、CD171、CD174、CD248、CD274、CD276、CD279、CD319、CD326、CD340、BCMA、B7H3、B7H6、CEACAM5、EGFRvIII、EPHA2、间皮素、NKG2D、HER2、HER3、GPC3、Flt3、DLL3、IL1RAP、KDR、MET、粘蛋白1、IL13Ra2、FOLH1、FAP、CA9、FOLR1、ROR1、GD2、PSCA、GPNMB、CSPG4、ULBP1、ULBP2，但还存在有更多并且也是合适的。尽管大多数CAR是基于scFv的(即，结合部分是针对特定靶标的scFv，并且CAR通常以该靶标命名)，但一些CAR是基于受体的(即，结合部分是受体的一部分，并且CAR通常以该受体命名)。后者的一个实例是NKG2D-CAR。
工程化TCR可以针对细胞的任何靶标，包括细胞内靶标。除了上文列出的存在于细胞表面上的靶标之外，TCR的典型靶标包括但不限于NY-ESO-1、PRAME、AFP、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、gp100、MART-1、酪氨酸酶、WT1、p53、HPV-E6、HPV-E7、HBV、TRAIL、甲状腺球蛋白、KRAS、HERV-E、HA-1、CMV和CEA。
根据存在有其他感兴趣的蛋白的这些特定的实施方案，工程化细胞中的第一和第二核酸分子通常存在于一个载体中，例如真核表达质粒、小环DNA或病毒载体(例如，衍生自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和仙台病毒)。根据进一步的特定的实施方案，病毒载体选自慢病毒载体和逆转录病毒载体。尤其对于后者，载体载荷(即，构建体的总大小)是重要的，并且使用紧凑的多重盒(compact multiplex cassette)是特别有利的。
值得注意的是，本文所述的细胞可含有多于一种感兴趣的蛋白：例如受体蛋白和报告蛋白(见图2)。或受体蛋白、白细胞介素和标签蛋白。
工程化细胞特别是真核细胞，更特别是工程化哺乳动物细胞，更特别是工程化人类细胞。根据特定的实施方案，细胞是工程化免疫细胞。典型的免疫细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、干细胞、祖细胞和iPSC细胞。
至少两个多重化RNA干扰分子可以是至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或甚至更多个分子，这取决于待下调的靶分子的数目以及在共表达多重化分子方面的实际考虑因素。如本文所示，miR-106a-363簇有6个支架(图5-6)，并且可以在不损失敲低活性的情况下复制支架(实施例5)，因此原则上最多12个支架可以是多重化的，尽管在实践中通常会使用较小的数字。
“多重体”是编码多个相同类型分子的多核苷酸，例如多个siRNA或shRNA或miRNA。在多重体中，当分子是相同类型(例如，全部都为shRNA)时，它们可以是相同的或包含不同的序列。在相同类型的分子之间，可以存在插入序列，例如如本文所述的接头。本发明的多重体的一个实例是编码多个串联的基于miRNA的shRNA的多核苷酸。多重体可以是单链、双链或同时具有单链区域和双链区域两者。
根据特定的实施方案，所述至少两个多重化RNA干扰分子受一个启动子控制。通常，当表达多于一个RNA干扰分子时，这通过引入多个拷贝的shRNA表达盒来完成。这些拷贝通常携带相同的启动子序列，这会导致频繁的重组事件而去除重复序列片段。作为解决方案，通常在表达盒中使用数个不同的启动子(例如，Chumakov等人,2010)。然而，根据本实施方案，通过使用仅一个启动子而避免了重组。尽管表达通常较低，但这在毒性方面具有优势，因为过多的siRNA可能对细胞有毒性(例如，通过干扰内源siRNA通路)。使用仅一个启动子具有额外的优势，即所有shRNA被共调节并以相似的水平表达。需要注意的是，如实施例中所示，可以从一个启动子转录多个shRNA，而不显著降低功效。
根据进一步的特定的实施方案，所述至少两个多重化RNA干扰分子和感兴趣的蛋白都在一个启动子的控制下。这再次减少了载体载荷(因为未使用单独的启动子来表达感兴趣的蛋白)，并提供了共调节性表达的优势。例如当感兴趣的蛋白是靶向癌症的CAR并且RNA干扰分子想要在肿瘤根除中产生加合性或协同性作用时，这可能是有利的。有用的RNA靶标的实例包括(但不限于)CD247、TRAC(均下调TCR复合物，使细胞更适合同种异体治疗)、B2M(以扩大组织相容性)、CD52(使细胞在CD52定向化疗中存活)、CD95(使细胞对CD95诱导的细胞死亡不敏感)、检查点分子(例如PD-1、PD-L1、CTLA4)等等。
通常，用于表达RNA干扰分子的启动子不是U6启动子。这是因为这个启动子与毒性有关，尤其是在高水平表达时。出于同样的原因，整体可以考虑排除H1启动子(比U6弱的启动子)或甚至Pol III启动子(尽管它们可适用于某些条件)。因此，根据具体实施方案，用于表达RNA干扰分子的启动子不是RNAPol III启动子。RNAPol III启动子缺乏时间和空间控制，并且不允许miRNA抑制剂的受控表达。相比之下，许多RNAPol II启动子允许组织特异性表达，并且存在诱导型和阻抑型RNA Pol II启动子。尽管在本发明的上下文中通常不需要组织特异性表达(因为细胞是在工程化之前选择的)，但具有针对例如免疫细胞的特异启动子仍然是一个优势，因为已经表明，不同启动子的RNAi功效的差异在免疫细胞中尤为明显(Lebbink等人,2011)。根据具体实施方案，启动子选自Pol II启动子和Pol III启动子。根据特定的实施方案，启动子是天然或合成的Pol II启动子。合适的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸因子1α(EF1α)启动子(核心或全长)、磷酸甘油酯激酶(PGK)启动子、具有上游CMV IV增强子的复合β-肌动蛋白启动子(CAG启动子)、泛素C(UbC)启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、白细胞介素-2启动子、鼠干细胞病毒(MSCV)长末端重复序列(LTR)、长臂猿白血病病毒(GALV)LTR、猿猴病毒40(SV40)启动子和tRNA启动子。这些启动子属于驱动mRNA表达最常用的聚合酶II启动子。
根据特定的实施方案，所述至少两个多重化RNA干扰分子可以是shRNA分子或miRNA分子。最具体地，它们是miRNA分子。shRNA分子和miRNA分子之间的区别在于miRNA分子是由Drosha加工，而常规shRNA分子则不是(其与毒性有关，Grimm等人,Nature 441:537–541(2006))。
根据具体实施方案，miRNA分子可以作为在一个启动子控制下的个体miRNA支架来提供。每个选择的支架通常对应一个miRNA(图1)，该支架可以被重复或与其他支架组合以获得多个RNA干扰分子的表达(图1-2)。然而，当被重复或与其他支架组合时，通常要求所有多重化RNA干扰分子在一个启动子的控制下(即，当重复个体支架或添加另一个支架时，启动子不被重复)。
特别适合用于miRNA多重化的支架序列是在真正的多顺反子miRNA簇或其部分中发现的那些序列，其中内源性miRNA靶序列被感兴趣的shRNA靶序列取代。为此，特别合适的miR支架簇是miR-106a～363、miR-17～92、miR-106b～25和miR-23a～27a～24-2簇；最特别主张的是miR-106a～363簇及其片段(即一个或多个个体支架)。值得注意的是，为了节省载体有效载荷，还具体主张使用此类天然簇的一部分而不是整个序列(这特别有用，因为并非所有miRNA的间距都相等，并且可能不需要所有接头序列)。实际上，本文(实施例5)显示支架可以在簇背景之外使用并以不同方式组合。可以考虑其他因素，例如选取在细胞中最有效加工的miRNA。例如，miR-17～92簇由(按顺序)miR-17支架、miR-18a支架、miR-19a支架、miR-20a支架、miR-19b-l支架和miR-92-1(也是miR-92a1)支架组成，簇中特别有用的片段是从miR-19a到miR-92-1(即6个miRNA中的4个)及其接头的支架序列，或从miR-19a到miR-19b-1(6个miRNA中的3个)。同样，106a～363簇由(按顺序)miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2(也是miR-92a2)支架和miR-363支架组成(见图5)。该簇的特别有用的片段是从miR-106a到miR-20b(即6个miRNA中的3个)(参见实施例5)、miR-20b到miR-363(即6个miRNA中的4个)或来自miR-19b-2到miR-363(即6个miRNA中的3个)的支架序列(参见图6)。可以使用天然接头序列及其片段或人工接头(再次减少载体的有效载荷)。
特别主张了来自miR-106a～363簇的miRNA支架，特别主张的接头是相应支架的序列5'和3'(参见图1)。在支架每侧上接头序列可以例如为150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、90bp、80bp、70bp、60bp、50bp、40bp、30bp、20bp、10bp或更少。当使用簇中不相邻的两个支架时(如例如在实施例5中)，接头根据定义与簇中发现的那些不同。尽管如此，还是可以使用例如30、60或90bp呈现簇中一个支架的3'，并将其融合到由下一个选定支架的30、60、90bp 5'组成的接头，从而创建杂合接头。
miRNA支架特别可以原样使用：即，不对支架序列进行修饰。特别是下部的茎序列将保持与相应miRNA支架中发现的序列相同。优选地，上部茎中的环序列也不改变，但实验表明，这些主要是柔性结构，只要不影响上部茎结构，长度和序列都可以调整。尽管不是优选的，但本领域技术人员将理解具有此类修饰的环的支架在本申请的范围内。在支架的上部茎中，发现了靶序列。miR-106a-363簇的天然靶序列长22至23bp。如实施例4所示，可以缩短靶序列的大小而不会产生有害影响。靶序列的长度可以是18至23bp，特别主张了18至21bp的序列；甚至更特别主张了18至20bp的序列。当需要更短的序列时，使用18或19bp的靶序列是没有问题的。
就靶向而言，显而易见的是，靶序列是支架的一部分，其显然需要适应靶标。由于miRNA支架在其结构中存在一些错配，问题是是否应保留这些错配。如实施例3(和图9)所示，可以保留在miR-106a和miR-20b中靶序列14位发现的错配，而不会对靶标的下调产生任何负面影响，这意味着过客链并不完全与引导链互补。同样如实施例3(和图10)所示，当存在多于一个错配时(例如在miR-18b支架中)，可以使过客链与引导链更加互补，以实现更有效的敲低(需要时)。请注意，不需要此修饰来实现显著水平的敲低，但消除靶序列6、11和15位的错配(对应于支架的bp 20和70、25和65以及29和61(参见图9))确实系统地改善了敲低。对于凸起(miR-18b支架的核苷酸75和76)也可以这样说。通过去除过客链中的错配或凸起来增加靶链和过客链的互补性可能也改善其他支架中的下调，尽管这还不是必需的，因为测试不同的靶序列总是会产生令人满意的敲低水平。
本文公开的细胞通常含有多重化RNA干扰分子。这些可以针对一个或多个需要下调的靶标(如果shRNA是分泌型的，则可以是细胞内的靶标，也可以是细胞外的靶标)。每个RNA干扰分子可以靶向不同的分子，它们可以靶向相同的分子，或其组合(即，多于一个RNA分子针对一个靶标，而只有一个RNA干扰分子针对不同的靶标)。当RNA干扰分子针对同一靶标时，它们可以靶向同一区域，或者它们可以靶向不同的区域。换句话说，当针对同一靶标时，RNA干扰分子可以相同或不同。此类RNA干扰分子组合的实例显示在实施例部分中。
因此，根据特定的实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子针对同一靶标。根据进一步的特定的实施方案，这些至少两个RNA干扰分子使用相同的miRNA支架。通过使用相同的靶序列(根据这些特定的实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子是相同的)或通过使用不同的靶序列(根据这些特定的实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子具有相同的支架但不同的靶标序列)，它们可以针对同一靶标。根据备选实施方案，针对同一靶标的至少两个多重化RNA干扰分子具有不同的miRNA支架序列。在那种情况下，它们可以具有相同的靶序列，或者可以具有针对同一靶标的不同靶序列。
根据备选实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子中的全部多重化RNA干扰分子都是不同的。根据进一步的具体实施方案，至少两个多重化RNA干扰分子中的全部多重化RNA干扰分子都针对不同的靶标。
工程化细胞中存在的任何合适的分子都可以被本发明的RNA干扰分子靶向。主张的靶标的典型实例是：MHC I类基因、MHC II类基因、MHC复合受体基因(例如HLA-F、HLA-G)、TCR链、CD3链、NKBBiL、LTA、TNF、LTB、LST1、NCR3、AIF1、LY6、热休克蛋白(例如HSPAIL、HSPA1A、HSPA1B)、补体级联、调节受体(例如NOTCH4)、TAP、HLA-DM、HLA-DO、RING1、CD52、CD247、HCP5、DGKA、DGKZ、B2M、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、2B4、A2AR、BAX、BLIMP1、C160(POLR3A)、CBL-B、CCR6、CD7、CD95、CD123、DGK[DGKA、DGKB、DGKD、DGKE、DKGG、DGKH、DGKI、DGKK、DGKQ、DGKZ]、DNMT3A、DR4、DR5、EGR2、FABP4、FABP5、FASN、GMCSF、HPK1、IL-10R[IL10RA、IL10RB]、IL2、LFA1、NEAT 1、NFkB(包括RELA、RELB、NFkB2、NFkB1、REL)、NKG2A、NR4A(包括NR4A1、NR4A2、NR4A3)、PD1、PI3KCD、PPP2RD2、SHIP1、SOAT1、SOCS1、T-BET、TET2、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TIGIT、TIM3、TOX和ZFP36L2。
表述本文公开的发明的另一种方式是已经鉴定出特别合适的基于miRNA的构建体。因此，提供了包含多核苷酸的工程化细胞，所述多核苷酸包含基于microRNA的shRNA编码区，其中所述基于microRNA的shRNA编码区包含编码以下的序列：
一个或多个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列，其中每个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列均包含：
οmiRNA支架序列，
ο活性序列或成熟序列，和
ο过客序列或星序列，其中在每个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列中，活性序列与过客序列均至少70％互补。
根据特定的实施方案，活性序列与过客序列至少80％互补，并且可以与过客序列至少90％互补或更多。
一个特别的优点是本发明的基于miRNA的shRNA核苷酸序列可以是多重化的。因此，提供了包含多核苷酸的工程细胞，所述多核苷酸包含基于microRNA的多重化shRNA编码区，其中所述基于microRNA的多重化shRNA编码区包含编码以下的序列：
两个或更多个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列，其中每个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列均包含：
οmiRNA支架序列，
ο活性序列或成熟序列，和
ο过客序列或星序列，其中在每个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列中，活性序列与过客序列均至少70％互补。
基于miRNA的shRNA核苷酸序列特别选自miR-106a序列、miR-18b序列、miR-20b序列、miR-19b-2序列、miR-92-2序列和miR-363序列。每个基于miRNA的人工shRNA核苷酸序列的活性序列和过客序列的长度均通常在18至40个核苷酸之间，更特别地在18至30个核苷酸之间，更特别地在18至25个核苷酸之间，最特别地在18至23个核苷酸之间。活性序列也可以是18或19个核苷酸长。通常，过客序列与活性序列具有相同的长度，尽管可能存在的凸起意味着它们的长度并不总是相同。
通常，这些microRNA支架序列被接头隔开。在microRNA簇中，接头的长度可以为：最多500个核苷酸、最多400个核苷酸、最多300个核苷酸、最多200个核苷酸、最多150个核苷酸、最多100个核苷酸。当多重化支架序列时，目标可以是使用足够长的天然接头序列(在miRNA支架序列的5'和3'处发现的那些)以确保包括任何潜在的调节序列。例如，可以使用支架序列侧翼的50、100或150个核苷酸。另一个目标可以是减少载体有效载荷并减少接头长度，然后接头序列的长度可以例如是在30至60个核苷酸之间，尽管较短的段也可以。事实上，令人惊讶的是，接头的长度并不起重要作用，可以很短(少于10个核苷酸)，甚至可以不存在而不干扰shRNA功能。根据特定的实施方案，至少一些5'和/或3'接头序列与其各自的支架一起使用。至少一些典型地是5'和/或3'接头序列的至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少60个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少120个核苷酸、至少150个核苷酸或至少200个核苷酸。
基于miRNA的shRNA核苷酸序列被认为是人工序列，因为即使支架序列可能是天然存在的，内源性miR序列已被针对特定靶标工程化的shRNA序列替换。人工序列可以例如是天然存在的支架(例如miR簇或其片段，例如miR-106a～363簇)，其中内源性miR序列已被针对特定靶标工程化的shRNA序列替换，可以是单个miR支架(如例如miR-20b支架)的重复序列，其中内源性miR序列已被针对特定靶标工程化的shRNA序列替换，可以是人工miR样序列，或其组合。
这种工程化细胞通常还包含编码感兴趣的蛋白的核酸分子，如嵌合抗原受体或TCR，并且可以是工程化免疫细胞，如上所述。
至少一个RNA干扰分子的表达或多重化RNA干扰分子的共表达导致工程化细胞内至少一个基因但通常是多个基因的抑制。这有助于获得更大的治疗功效。
还提供了本文所述的工程化细胞，其用作药物。根据具体实施方案，提供工程化的细胞，其用于治疗癌症。可以治疗的癌症的示例性类型包括但不限于腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文肉瘤(Ewing sarcoma)、眼癌、输卵管癌、胃癌(gastric cancer)、胶质母细胞瘤、头颈癌、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、腹膜癌、鼻咽癌、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、小肠癌、腹癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌和维尔姆斯瘤(Wilmstumor)。
根据特定的实施方案，可以提供细胞用于治疗液体(liquid)癌或血癌。此类癌症的实例包括例如白血病(包括，急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性粒细胞性白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL))、淋巴瘤(包括，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤(例如，DLBCL)、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’slymphoma)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和小淋巴细胞淋巴瘤)、多发性骨髓瘤或骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)。
这等同于说提供了治疗癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用合适剂量的如本文所述的工程化细胞(即，包含编码至少两个多重化的RNA干扰分子的外源核酸分子，和任选地包含编码感兴趣的蛋白的其他核酸分子的工程化细胞)，从而改善与癌症相关的至少一种症状。治疗的癌症包括但不限于腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文肉瘤、眼癌、输卵管癌、胃癌(gastric cancer)、胶质母细胞瘤、头颈癌、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、腹膜癌、鼻咽癌、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、小肠癌、腹癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌和维尔姆斯瘤。根据进一步的具体实施方案，提供了治疗血癌的方法，包括向有此需要的受试者施用合适剂量的如本文所述的工程化细胞，从而改善癌症的至少一种症状。
根据备选实施方案，可以提供细胞用于治疗自身免疫疾病。可治疗的自身免疫疾病的示例性类型包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病(IBD)、多发性硬化(MS)、1型糖尿病、肌萎缩侧索硬化症(ALS或葛雷克氏症(Lou Gehrig’sdisease))、脊髓性肌萎缩症(SMA)、克罗恩病、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、银屑病、银屑病关节炎、阿狄森氏病、强直性脊柱炎、白塞病、乳糜泻、柯萨奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、子宫内膜异位、纤维肌痛、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、川崎病、梅尼埃病(Meniere’s disease)、重症肌无力、结节病、硬皮病、干燥综合征、血小板减少性紫癜(TTP)、溃疡性结肠炎、血管炎和白癜风。
这等同于说提供了治疗自身免疫疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用合适剂量的如本文所述的工程化细胞，从而改善与自身免疫疾病相关的至少一种症状。可治疗的示例性自身免疫疾病列于上文。
根据更进一步的实施方案，可以提供细胞用于治疗感染性疾病。“感染性疾病”在本文中指由存在于患有疾病的受试者或生物体之中或之上的外部生物体(病原体)的存在引起的任何类型的疾病。通常认为感染是由微生物或微寄生物(如病毒、朊病毒、细菌和类病毒)引起的，但较大的生物体(如大寄生虫(macroparasite)和真菌)也可以感染。可引起感染的生物体在本文中称为“病原体”(如果它们引起疾病)和“寄生虫”(如果它们以宿主生物体为代价受益，从而降低宿主生物体的生物适应性，即使不存在明显的疾病)，并且包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生生物(protist)(例如，疟原虫(Plasmodium)、疫霉属(Phytophthora))和原生动物(例如，疟原虫、内阿米巴属(Entamoeba)、贾第虫属(Giardia)、弓形虫(Toxoplasma)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、毛滴虫(Trichomonas)、利什曼原虫(Leishmania)、锥虫(Trypanosoma))(微寄生虫)和大寄生虫，例如蠕虫(例如，线虫如蛔虫、丝虫、钩虫、蛲虫和鞭虫等，或扁虫如绦虫和吸虫等)，以及体外寄生虫例如蜱和螨。拟寄生物(parasitoid)，即将宿主生物体绝育或杀死的寄生生物体包含在术语寄生虫内。根据具体的实施方案，感染性疾病由微生物或病毒生物体引起。
如本文所用，“微生物生物体”可以指细菌，例如革兰氏阳性菌(例如，葡萄球菌属、肠球菌属、芽孢杆菌属)、革兰氏阴性菌(例如，埃希氏菌属、耶尔森氏菌属)、螺旋体(例如，密螺旋体属(Treponema sp)如梅毒螺旋体(Treponema pallidum)，钩端螺旋体属(Leptospira sp.)，疏螺旋体属如伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))、柔膜体纲(mollicute)(即没有细胞壁的细菌，例如支原体属)、耐酸细菌(例如，分枝杆菌属如结核分枝杆菌、诺卡氏菌属(Nocardia sp.))。“微生物生物体”还涵盖真菌(例如酵母菌和霉菌，例如念珠菌属、曲霉属、球孢子菌属、隐球菌属、组织胞浆菌属、肺孢子菌属或毛癣菌属)、原生动物(例如，疟原虫属、内阿米巴属、贾第虫属、弓形虫属、隐孢子虫属、毛滴虫属、利什曼原虫属、锥虫属)和古细菌。引起可以用本方法治疗的感染性疾病的微生物生物体的其他示例包括但不限于金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus，MRSA))、肠球菌属(包括耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistantenterococci，VRE)、院内病原体粪肠球菌(nosocomial pathogen Enterococcusfaecalis))、食物病原体例如枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙门氏菌属和嗜肺军团菌。
“病毒生物体”或“病毒”，在本文中用作等价物，是只能在生物体的活细胞内复制的小的感染物。它们包括dsDNA病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、ssDNA病毒(例如，细小病毒)、dsRNA病毒(例如，呼肠孤病毒)、(+)ssRNA病毒(例如，小核糖核酸病毒、披膜病毒(Togavirus)、冠状病毒)、(-)ssRNA病毒(例如，正粘病毒、弹状病毒(Rhabdovirus))、ssRNA-RT(逆转录)病毒，即在生命周期中存在DNA中间物的具有(+)有义RNA的病毒(例如，逆转录病毒)以及dsDNA-RT病毒(例如，肝炎病毒)。也可以感染人类受试者的病毒的实例包括但不限于腺病毒、星状病毒、肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒)、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒2型、人巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘带状疱疹病毒、玫瑰疹病毒(roseolovirus))、乳多空病毒(papovavirus)(例如，人乳头状瘤病毒和人多瘤病毒)、痘病毒(例如，天花病毒(variola virus)、痘苗病毒、天花病毒(smallpox virus))、沙粒病毒(arenavirus)、布尼亚病毒(buniavirus)、嵌环病毒(calcivirus)、冠状病毒(例如，SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、SARS-CoV-2冠状病毒(COVID-19的致病物))、丝状病毒(例如，埃博拉病毒、马尔堡病毒)、黄病毒(例如，黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒、脑炎病毒)、正粘病毒(例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒)、副粘病毒(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒(腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、肺炎病毒，例如人类呼吸道合胞病毒)、小核糖核酸病毒(例如，脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、柯萨奇A病毒、柯萨奇B病毒、甲型肝炎病毒、ecovirus和肠道病毒)、呼肠孤病毒、逆转录病毒(例如，慢病毒，例如人类免疫缺陷病毒和人类T淋巴细胞病毒(HTLV))、弹状病毒(例如，狂犬病病毒)或披膜病毒(例如，风疹病毒)。根据具体的实施方案，待治疗的感染性疾病不是HIV。根据可选的实施方案，待治疗的感染性疾病不是由逆转录病毒引起的疾病。根据可选的实施方案，待治疗的感染性疾病不是病毒性疾病。
这等同于说提供了治疗感染性疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用合适剂量的如本文所述的工程化细胞(即，包含编码两个或更多个多重化RNA干扰分子的外源核酸分子，并且任选地包含编码感兴趣的蛋白的其他核酸分子的工程化细胞)，从而改善至少一种症状。特别指出，微生物或病毒感染性疾病是由以上列出的病原体引起的那些。
被提供用作药物的这些细胞可用于同种异体疗法。即，它们被提供用于将同种异体ACT视为治疗选择的治疗(其中将来自另一受试者的细胞提供给有此需要的受试者)中。根据具体实施方案，在同种异体疗法中，RNA干扰分子的至少一种将针对TCR(最具体地，针对TCR复合物的亚基)。根据备选实施方案，提供这些细胞用于自体疗法，尤其是自体ACT疗法(即，使用从患者获得的细胞)。
应当理解，尽管本文已经针对根据本发明的细胞和方法讨论了具体的实施方案、具体的设置以及材料和/或分子，但是在不脱离本发明的范围和精神的情况下可以在形式和细节上进行各种改变或修改。重要的是，不同载体实施方案中讨论的载体变化也适用于工程化细胞(因为载体适合在此类细胞中表达)，反之亦然：细胞的各种实施方案通常与在细胞中编码的载体相关联。提供以下实施例以更好地说明特定的实施方案，并且不应将它们视为限制本申请。本申请仅受权利要求的限制。
实施例
实施例1.多重化的优化
通过DROSHA复合物对来自转录的RNA的miRNA进行有效加工是有效敲低靶标的关键。我们之前的数据显示，基于miRNA的shRNA可以与编码CAR的载体有效共表达，并由来自载体的miRNA机制进行加工。进一步需要生成能够共表达来自同一载体的多个基于miRNA的shRNA(例如，2个、4个、6个、8个……)的CAR表达载体(图2)。然而，之前的研究显示，多个基于miRNA的shRNA的共表达会导致shRNA活性的丧失。因此，为了由单个表达载体敲低多个靶标，有效的miRNA加工是重要的。
据推测，为了实现最佳多重化并避免重组，最好从天然存在的miRNA簇开始，而不是增加单独的miRNA支架。天然存在的miRNA簇在存在的支架的大小和数量上存在显著差异。由于目标是为克隆载体使用多重化miRNA支架，我们希望鉴定出具有有前景的支架的大小与数量比率的簇。
表1列出了13个已鉴定的簇。
Figure BDA0004034750190000341
Figure BDA0004034750190000351
表1.micro-RNA簇的鉴定，指出了名称、染色体位置、大小、编码或非编码序列内的位置以及链方向。N表示簇中存在的microRNA支架的数量；大小/N是这两列的除法，并表示在所述簇中具有散布序列(接头+其他)的miRNA支架的平均大小。浅灰色阴影：在T细胞中高表达。
出于示例性目的包括这些簇中的两个簇(深灰色阴影，表1)，以显示大小的差异程度。这些簇超过85000bp，并可以立即排除，因为它们对于克隆来说太大了。根据大小和簇中存在的miRNA数量(表1中的N)选择最有前景的簇。我们评价的不是单独的总大小，而是大小除以miRNA支架的数量，以了解平均miRNA支架+接头序列。作为第一个截止值(cut-off)，选择了大小/N小于250的簇。由于这产生了足够的簇，并且目标是在工程化免疫细胞中表达载体，因此决定专注于在免疫细胞(如T细胞)中高度表达的簇。这导致了4个簇(浅灰色阴影，表1)的优先级排序，它们全都在免疫细胞中高度表达，总大小小于1000bp。此外，它们全都含有至少3个miRNA支架(N为至少三的簇有望允许多于两个miRNA的多重化)，并且每个支架的平均大小均小于200bp，使它们非常适合克隆(见表1)：miR17-92簇、miR106a-363簇、miR106b-25簇(三个旁系同源的microRNA簇)和miR23a～27a～24-2簇。
1.1选择适合的miRNA簇进行多重化
为了评价这四个miRNA簇是否适合shRNA的多重化表达，决定用具有在选定的簇中引入的不同shRNA的编码第二代CD19定向的CAR、截短的CD34选择标记物的逆转录病毒载体来转导来自健康供体的原代T细胞。为了允许比较相同数量的shRNA和截短簇的影响，还使用了miR17-92簇和miR106a-363簇的片段。片段是簇的3或4个连续的miRNA支架，以便与其他两个簇中存在的三个miRNA支架进行比较。此类载体的示意图设计如图2所示。
使用三个相同的shRNA靶序列进行比较，靶向CD247、B2M和CD52。当使用4个miRNA支架时，另外靶向TRAC。对于6个miRNA支架，三个靶标被靶向两次，但具有不同的靶序列。作为对照，使用了重复的合成shRNA支架，即miR196a2支架，该支架先前被表明非常适合单次shRNA敲低，也适用于多重化敲低(WO2020/221939)。该对照与3和4个shRNA一起使用。
尽管构建体的大小不同，但载体滴度仅受存在的shRNA的量的轻微影响(数据未显示)。然而，在每种情况中，与重复的相同支架(这里是miR-196a2支架)相比，使用来自天然miRNA簇的不同支架提高了转导效率，如图3所示。
从转导到收获的T细胞倍数增加在构建体之间没有显著差异(既不在成簇支架之间，也不在成簇支架和重复的单个支架之间)。然而，构建体之间的敲低效率确实不同。尽管所有簇都在一定程度上实现了敲低，但成簇支架之间存在明显差异，来自miR-106a-363簇的支架实现了最佳且最一致的敲低，而miR23a～27a～24-2簇的支架的有效性最低。在图4中，显示了一个实例，其比较了没有shRNA的对照，或具有在miR23a～27a～24-2成簇支架或miR106a-363成簇支架或其片段中的shRNA的对照的TCR表达。用完整支架观察到的敲低增加可以解释为CD247在该构建体中被靶向两次。作为这些实验的结果，选择了miR-106a-363簇的支架进行进一步评价。
实施例2.使用miR-106a-363簇的支架进行多重化
在难以转导的原代免疫细胞中评估多重化多达六个shRNA的可行性。为了对此进行评估，将原代T细胞用编码第二代CD19 CAR并含有在miR-106a-363簇中引入的靶向CD247、β2m和CD52的3x shRNA或6xshRNA的逆转录病毒载体转导。该载体的设计在图5中示出。
简言之，将来自健康供体的原代T细胞用编码以下的逆转录病毒载体转导：第二代CD19指导的CAR、截短的CD34选择标记物，其含有靶向CD247、B2M和CD52的3个shRNA(其引入在106a-363miRNA簇的最后三个miR(miR-19b2、miR-92a2和miR-363)中)或靶向相同的三个基因的6个shRNA(其引入在所述簇的6个miR支架中)(在这种情况下，靶向CD247的两个shRNA不同)。简言之，shRNA表达为6重(6-plex)、3重(3-plex)或作为对照的无shRNA(tCD34)。转导后两天，细胞使用CD34特异性磁珠富集，并在IL-2(100IU/mL)中进一步扩增6天。使用亲环蛋白作为管家基因，通过qRT-PCR评估CD247、B2M和CD52的mRNA表达。
结果在图6中示出。多重化shRNA对所有靶向基因均产生了高效的RNA敲低水平。与三个多重化shRNA(针对每个蛋白靶标有一个shRNA)相比，引入六个多重化shRNA(针对每个蛋白靶标有两个shRNA)导致更高的RNA敲低水平(图6)。
实施例3.miR-106a-363簇的个体支架的优化
尽管初始数据已经很有希望并且表明当使用来自miR-106a-363簇的支架时可以实现多重化，但进行了进一步的研究以查看是否可以修饰个体支架以改善所选靶标的敲低。由于按理说天然支架已经处于适应敲低的进化选择压力下(意味着下部和上部茎区通过进化被至少部分地优化)，因此决定首先评价不同的靶序列以改善靶标下调，因为这些还没有被优化。首先，选择了相同的靶蛋白。
正如之前所描述的，每个miRNA/shRNA的持续加工能力(processivity)可能取决于簇中其他miRNA/shRNA的持续加工能力并受其影响(Bofill-De Ros和Gu,2016)，因此决定测试具有不同靶标序列作为整个簇的一部分，但在其他支架序列中具有不相关的序列(以不影响靶标下调)的支架。
miR-20b支架中CD247下调的结果在图7中示出。初始支架序列已经导致约50％的下调。测试的所有其他靶序列也导致成功敲低靶标，但有些实现了远超过50％的敲低。换句话说，通过选择靶序列，可以实现最大有效的敲低，无需对miR-20b支架进行进一步工程化。
使用用于B2M靶标的不同序列，miR-106a支架序列获得了类似的结果(数据未显示)。为了排除该效应与特定靶序列-支架组合相关联，还在miR-20b支架中测试了B2M靶序列。尽管在敲低效率方面存在一些微小差异，但在miR-106a支架中实现最高敲低的三个靶序列在用于miR-20b支架时也实现了最高的敲低。这意味着一旦鉴定出有效的靶序列，它就可以跨支架使用。
对于miR-18b支架，对针对CD95的shRNA进行了优化。然而，在测试了31个靶序列后，实现的最佳敲低约为30％(参见图8)。虽然这种敲低是不可忽略的，但与其他支架一致获得的超过75％的敲低相比，它的有效性要差得多。将miR-18b支架与miR-106a或miR-20b的支架进行比较时(图9)，很明显该支架在靶序列/上部茎区中包含更多错配(三个相比于一个)，以及靠近上部茎末端的一个凸起。由于使用其他支架序列实现了高敲低，因此假设减少错配数量和/或去除凸起可能潜在地改善敲低效率。
评价的5种不同构建体在图10A中示出，结果在图10B中示出。值得注意的是，删除即使单个错配或凸起也会大大改善敲低效率。当仅保留在miR-106a或miR-20b支架中发生的单个错配时，对于同一靶序列的敲低效率从约30％增加到超过60％。因此，尽管可以原样使用miR-18b支架序列，但可以通过减少错配或凸起的数量来显著提高敲低效率。
实施例4.靶序列长度的评价
在miR-106a-363簇中发现的天然靶序列通常很长(22-23bp)。为了评价这些是否可以缩短，将不同长度的靶序列(一个针对CD247，一个针对B2M)插入支架并评价敲低效率。序列的缩短是通过将靶序列3'端的核苷酸替换为天然支架中的核苷酸来完成的。miR-106a支架的结果在图11中示出。可以看出，低至18bp的较短序列与最大长度一样起作用，甚至可能更好。对于miR-20b支架(未显示)获得了类似的结果。对于大多数实验，决定使用20bp的靶序列(如图9所示)。
实施例5.评价簇环境之外的个体支架的组合
人们普遍认为，在miRNA簇中，许多侧翼序列决定簇以及其他簇的存在被认为对于实现下调很重要。然而，我们早期的实验表明情况并非总是如此。
事实上，为了优化两个共表达的shRNA的活性，我们早些时候假设不仅大小，而且两个基于miRNA的shRNA之间的接头序列，以及miRNA支架都会影响shRNA活性。为了优化shRNA加工，我们评估了不同shRNA接头对两个靶基因CD247(CD3ζ)和CD52敲低的影响。使用了0至92bp的接头，但除了两个发夹之间没有任何间隔的构建体外，与其他构建体相比，TCR的敲低活性略低(但CD52则不是)，接头似乎没有影响敲低功效。重要的是，即使是没有接头的构建体在降低两个shRNA的表达方面仍然非常有效(数据未显示)。尽管这些实验是用miR-196a2支架完成的，但初步实验表明miR-106a-363簇的接头也可以被显著减少。
为了评价个体支架的持续加工能力和活性是否受到簇中其他支架的影响，决定测试不同排列的支架。为此，选择了非连续支架(以消除簇中相邻支架的影响)：miR-106a和miR-20b。此外，创建了双重体和三重体，而不是使用簇中的所有六个miRNA支架(与实施例2相反)。还创建了miR-106a–miR-18b–miR-20b三重体，对应于miR-106a～363簇中的前三个支架，以评价是否存在簇环境效应。对于双重体，所靶向的基因是B2M和CD247。对于三重体，添加了CD95。
总之，制成了以下构建体：
双重体：
miR-106a(靶向B2M)-miR-20b(靶向CD247)
miR-20b(靶向CD247)-miR-106a(靶向B2M)
miR-20b(靶向B2M)-miR-20b(靶向CD247)
miR-106a(靶向B2M)-miR-106a(靶向CD247)
三重体：
miR-20b(靶向B2M)-miR-20b(靶向CD95)-miR-20b(靶向CD247)
miR-106a(靶向B2M)-miR-106a(靶向CD95)-miR-106a(靶向CD247)
miR-106a(靶向B2M)-miR-18b(靶向CD95)-miR-20b(靶向CD247)
结果显示在图12A-C中。如图12所示，评价的所有双重体在下调CD247和B2M方面都非常有效。特别是CD247敲低被证明非常有效，导致几乎检测不到CD3Z水平。由于B2M更为丰富，预计敲低不是完全的，但始终实现了B2M水平降低超过80％。值得注意的是，无论双重体中支架的顺序如何，下调水平都是相同的。
当对相同的shRNA进行多重化时，众所周知会带来重组问题，导致表达低得多并最终降低敲低水平。这正是评价不同支架组合的原因。尽管如此，还是对两个和三个相同的支架进行了测试，以确定这是否切实可行。所有具有相同支架的双重体和miR-20b三重体支架实现了与具有不同支架的双重体或三重体相当的转导水平，并且全部都超过15％。然而，miR-106a三重支架产生的转导水平非常低(低于2％)，因此未进行进一步评价。miR-20b支架的双重体实现了与具有不同支架的双重体相同的靶标敲低水平(图12A-B)。miR-106a支架的双重体对CD3Z实现了相同的下调，但在B2M敲低中的效果略差，尽管水平降低了大约50％，表明这些支架可以复制并仍然实现高敲低(图12C)。值得注意的是，miR-20b三重支架实现了与具有三个不同支架的三重体相当的敲低水平，尽管使用三个不同支架确实对每个靶基因产生了略微更好的敲低，表明存在一些功效损失(图12A-B)。具有三个不同miRNA支架的三重支架实现与双重体相同的靶标下调。此外，CD95下调超过50％(图12B-C)，这与在簇环境中使用此靶序列的结果一致(图10B)。
这些实验表明，支架可以在簇环境之外很好地独立使用。支架的顺序对于实现所需的敲低似乎并不重要，并且簇中不需要所有的支架都存在才能实现敲低。事实上，单个支架就足够了，并且可以在不损失活性的情况下进行复制。虽然显示miR-20b可以用作三重体，但这似乎比使用不同支架的效率略低。尽管如此，考虑到miR-106a-363簇中有六个不同的支架序列，并且这些可以在不损失效果的情况下进行复制，多达12个靶标的多重化下调原则上是可行的。
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Claims (22)

1.一种适合在工程化免疫细胞中表达的载体，其包含编码至少一个RNA干扰分子的核酸序列，所述至少一个RNA干扰分子具有选自以下的支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。
2.根据权利要求1所述的载体，其中至少一个支架选自miR-106a支架、miR-18b支架和miR-20b支架。
3.根据权利要求1或2所述的载体，其中所述至少一个RNA干扰分子是至少两个多重化RNA干扰分子。
4.一种工程化细胞，其包含：
编码感兴趣的蛋白的第一外源核酸分子，和
编码至少一个RNA干扰分子的第二核酸分子，所述至少一个RNA干扰分子具有选自以下的支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。
5.根据权利要求4所述的工程化细胞，其中所述至少一个RNA干扰分子在所述支架内包含与其天然靶序列不同的靶序列。
6.根据权利要求5所述的工程化细胞，其中所述靶序列为18至23个核苷酸。
7.根据权利要求5或6所述的工程化细胞，其中所述RNA干扰分子通过靶序列的碱基对互补性针对工程化细胞中的靶标。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的工程化细胞，其是工程化免疫细胞。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、干细胞、祖细胞和iPSC细胞。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的工程化细胞，其中所述感兴趣的蛋白是受体，特别是嵌合抗原受体或TCR。
11.根据权利要求4至10中任一项所述的工程化细胞，其中所述至少一个RNA干扰分子是至少两个多重化RNA干扰分子。
12.根据权利要求11所述的工程化细胞，其中所述至少两个多重化RNA干扰分子是至少三个多重化RNA干扰分子。
13.根据权利要求11或12所述的工程化细胞，其中所述至少两个多重化RNA干扰分子中的至少一个具有选自miR-106a支架和miR-20b支架的支架。
14.根据权利要求11或12所述的工程化细胞，其中所述至少两个多重化RNA干扰分子中的至少一个具有miR-18b支架，并且所述支架已被修饰以减少茎区中的错配和/或凸起。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的工程化细胞，其中所述至少两个多重化RNA干扰分子中的全部多重化RNA干扰分子都包含选自以下的miR-支架：miR-106a支架、miR-18b支架、miR-20b支架、miR-19b-2支架、miR-92-2支架和miR-363支架。
16.根据权利要求3所述的载体或根据权利要求11至15中任一项所述的工程化细胞，其中所述至少两个多重化RNA干扰分子针对同一靶标。
17.根据权利要求3所述的载体或根据权利要求11至15中任一项所述的工程化细胞，其中所述至少两个多重化RNA干扰分子中的全部多重化RNA干扰分子都针对不同的靶标。
18.根据权利要求3所述的载体或根据权利要求11至17中任一项所述的工程化细胞，其中所述至少两个多重化RNA干扰分子具有相同的支架。
19.根据权利要求1至3中任一项所述的载体或根据权利要求4至18中任一项所述的工程化细胞，其中至少一个RNA干扰分子所靶向的分子选自：MHC I类基因、MHC II类基因、MHC复合受体基因(例如HLA-F、HLA-G)、TCR链、NKBBiL、LTA、TNF、LTB、LST1、NCR3、AIF1、LY6、热休克蛋白(例如HSPA1L、HSPA1A、HSPA1B)、补体级联、调节受体(例如NOTCH4)、TAP、HLA-DM、HLA-DO、RING1、CD52、CD247、HCP5、DGKA、DGKZ、B2M、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、2B4、A2AR、BAX、BLIMP1、C160(POLR3A)、CBL-B、CCR6、CD7、CD95、CD123、DGK[DGKA、DGKB、DGKD、DGKE、DKGG、DGKH、DGKI、DGKK、DGKQ、DGKZ]、DNMT3A、DR4、DR5、EGR2、FABP4、FABP5、FASN、GMCSF、HPK1、IL-10R[IL10RA、IL10RB]、IL2、LFA1、NEAT 1、NFkB(包括RELA、RELB、NFkB2、NFkB1、REL)、NKG2A、NR4A(包括NR4A1、NR4A2、NR4A3)、PD1、PI3KCD、PPP2RD2、SHIP1、SOAT1、SOCS1、T-BET、TET2、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TIGIT、TIM3、TOX和ZFP36L2。
20.根据权利要求1至3中任一项所述的载体或根据权利要求4至19中任一项所述的工程化细胞，其用作药物。
21.根据权利要求1至3中任一项所述的载体或根据权利要求4至19中任一项所述的工程化细胞，其用于治疗癌症。
22.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用合适剂量的根据权利要求4至19中任一项所述的细胞，从而改善至少一种症状。
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