CN116008564B - 检测2-nbdg阳性b细胞的试剂在制备诊断和/或预后自身免疫糖尿病制剂中的应用 - Google Patents
检测2-nbdg阳性b细胞的试剂在制备诊断和/或预后自身免疫糖尿病制剂中的应用Info
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种检测2‑NBDG阳性B细胞的试剂在制备诊断和/或预后自身免疫糖尿病制剂中的应用。目前自身免疫糖尿病尚缺乏有效的疾病标志物，早期的筛查与治疗面临巨大挑战。迫切需要寻找新的疾病标志物以提高诊疗效能。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及检测2-NBDG阳性B细胞的试剂在制备诊断和/或预后自身免疫糖尿病制剂中的应用。
背景技术
自身免疫糖尿病(AID)包括经典1型糖尿病(T1D)和成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)，是因胰岛beta细胞自身免疫破坏引起胰岛素绝对缺乏所致，患者终生依赖胰岛素注射治疗，严重危害生命健康。最新的研究数据显示，虽然相对于西方国家我国T1DM的发病率相对较低(1.01/10万/年，包括所有年龄段)，但是因人口基数大及发病率逐年增加，导致患者人数众多，给家庭和社会都带来了巨大的负担，使得糖尿病成为中国重大公共卫生问题之一。
自身免疫糖尿病是在遗传与环境因素共同作用下发生机体免疫耐受失衡，目前认为主要由T淋巴细胞介导的胰岛beta细胞破坏所致。近年来的研究显示B细胞在自身免疫糖尿病发病中扮演着不可或缺的重要角色。B细胞是重要的抗体产生细胞，产生包括胰岛素自身抗体(IAA)、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体(1A-2A)、谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)以及锌转运体-8抗体(ZnT8A)等多种抗体，这些自身抗体的检测对于预测和诊断自身免疫糖尿病具有重要价值和意义。同时，B细胞作为重要的抗原提呈细胞并表达共剌激信号分子，参与了自身反应性CD4+T细胞和CD8+细胞毒性T细胞的激活与扩增，从而引起自身免疫糖尿病的发生。拟人化NOD小鼠研究已证实去除B细胞或阻断B细胞活化都能有效降低或逆转NOD鼠T1D的发生。针对T1D患者的临床试验发现，采用利妥西单抗(抗CD20单克隆抗体)能有效减缓胰岛beta细胞功能衰退，成为治疗T1D的希望。
当免疫细胞(如T细胞)从初始状态向活化状态转变时，伴随明显的细胞生长和克隆扩增而来的是巨大的能量需求。近年来研究显示免疫细胞的能量代谢水平在免疫功能调控以及免疫反应中发挥着关键的作用，然而目前大部分的研究都集中在巨噬细胞和T细胞，对B细胞代谢的研究则相对较少。体外实验证实，受到IL-4，BAFF，LPS或BCR刺激，B细胞会迅速提高葡萄糖的摄取并加速糖酵解的进程，从而为细胞的增殖快速提供能量，提示调控B细胞的能量代谢对其发育和功能至关重要。因此，深入了解B细胞活化的特征及机制对于全面阐明其在自身免疫糖尿病发生发展中的作用、寻找新的疾病防治和干预靶点、降低死亡率和医疗负担具有重要的科学意义与社会价值。
目前临床上常用C肽及胰岛自身抗体如谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、锌转运体8抗体(ZnT8A)、胰岛细胞抗体(ICA)等来评估胰岛细胞破坏程度及1型糖尿病的患病风险，但是以此作为疾病的标志物仍存在许多局限性，例如，C肽在胰岛破坏晚期才能反映疾病的特性且缺乏特异性；胰岛自身抗体往往是陆续出现的，时间间隔数月甚至上十年，并非所有患者在诊断时抗体呈阳性，并且许多自身抗体阳性的易感者并不一定发生1型糖尿病等；这些基于蛋白分子的检测在临床常规中检测繁琐、费用昂贵且耗时，应用前景不容乐观。
发明内容
基于上述问题，本发明的首要目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一组敏感性高、特异性高的1型糖尿病诊断的标志物；即提供了检测2-NBDG阳性B细胞的试剂在制备诊断和/或预后自身免疫性糖尿病制剂中的应用。
进一步地，所述的自身免疫性糖尿病包括LADA和T1D。
更进一步地，检测2-NBDG阳性B细胞的试剂包括：检测2-NBDG阳性B细胞占B细胞比例的试剂和/或检测B细胞中2-NBDG摄取量的试剂。
本发明的第二个目的是提供一种自身免疫性糖尿病诊断或预后试剂盒，包含上述的检测试剂。
本发明的第三个目的是提供上述的检测试剂在制备自身免疫性糖尿病患者空腹C肽水平制剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述的检测试剂在制备自身免疫性糖尿病患者餐后C肽水平制剂中的应用。
本发明的第五个目的是提供上述的检测试剂在制备自身免疫性糖尿病患者糖化白蛋白水平制剂中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述的检测试剂在制备自身免疫性糖尿病患者糖化血红蛋白水平制剂中的应用。
本发明主要用于检测高代谢的B细胞，尤其是检测B细胞中2-NBDG摄入量或者2-NBDG阳性B细胞占B细胞比例，高代谢的B细胞与自身免疫糖尿病胰岛功能衰退有着强烈相关性，可以作为预测指标；本发明具有以下优点：1)适用于所有自身免疫糖尿病患者；2)检测方便，检测指标与预后有着明显相关，检测指标单一，操作简单；3)所有试剂大多较为常见，成本控制在可行范围内。
附图说明
图1A为高代谢的B细胞流式圈门示意图；
图1B为自身免疫糖尿病患者(包括T1D和LADA患者)外周血高代谢的B细胞的比例远高于健康体检者(HD)和2型糖尿病患者(T2D)结果图。
图2A为高代谢的B细胞的比例与患者空腹C肽水平呈负相关结果图；
图2B为高代谢的B细胞的比例与患者餐后C肽水平呈负相关结果图；
图2C为高代谢的B细胞和糖化白蛋白呈正相关结果图；
图2D为高代谢的B细胞和糖化血红蛋白呈正相关结果图。
图3为B细胞葡萄糖摄取较高的亚群(＞40％)的自身免疫糖尿病患者胰岛功能衰竭速度更快结果图。
图4为自身免疫糖尿病组的高代谢的B细胞的比例对自身免疫糖尿病进行预测的ROC曲线。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：
试验中所有参与者均被告知研究流程及标本用途并签署知情同意书，通过问卷采集、体格检查及抽血送检得到所有参与者人口学资料及临床数据。患者一般资料差异无统计学意义。
收集受试对象外周血，包括健康人38例、自身免疫糖尿病(AID)61例，其中的1型糖尿病(T1D)37例，LADA患者24例、2型糖尿病(T2D)24例。留取受试者抗凝血约5ml，使用密度梯度离心法分离PBMC，调整细胞3-4×106个/流式管。
染色方案如下：
1、配好100uM 2-NBDG染色抗体(无糖1640为基底)，37℃预热；
2、在每管细胞中加入1ml 2-NBDG(11046，Cayman)，涡旋混匀，37℃孵育30min；
3、另准备仅加入CD19表面抗体的FMO管1例作为对照。
4、加入3-4ml PBS终止反应，振荡混匀；
5、离心(300G，5min，20℃)；
6、每管细胞加入1ul CD19表面抗体(BD，566396)，涡旋混匀；
7、4℃孵育30min；
8、加入1ml Staining buffer中止反应，振荡混匀，离心(条件同上)；
9、去上清，加入200-500ul Staining buffer，涡旋混匀，上机；
10、收集数据后，FCS/SSC设门，以FMO管为界定2-NBDG高摄取的位置，分析2-NBDG高摄取(高代谢)细胞占CD19+B细胞的比例。
结果如图1所示，图1A为高代谢的B细胞流式圈门示意图，2-NBDG(2-(N-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑-4-氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖)是葡萄糖的类似物，细胞摄取后2-NBDG不会被代谢，2-NBDG带荧光标记，和细胞孵育一段时间根据其荧光强度可以反应细胞葡萄糖摄取能力。
即2-NBDG高摄取的B细胞亚群为葡萄糖高摄取亚群，这个亚群具有高代谢的特征，我们称之为高代谢的B细胞。从图1B可以看出，自身免疫糖尿病患者(包括T1D和LADA患者)外周血高代谢的B细胞的比例远高于健康体检者(HD)和2型糖尿病患者(T2D)，说明在自身免疫糖尿病患者外周血B细胞高代谢，可作为诊断自身免疫糖尿病以及和2型糖尿病分型的一个指标。
将高代谢的B细胞的比例与1型糖尿病患者特征性的临床资料做相关性分析，发现高代谢的B细胞的比例与患者空腹C肽水平呈负相关(图2A)，高代谢的B细胞的比例与患者餐后C肽水平呈负相关(图2B)，提示高代谢的B细胞的比例越多的患者胰岛功能越差；高代谢的B细胞和糖化白蛋白呈正相关(图2C)，糖化白蛋白可以反映患者1个月血糖控制情况，高代谢的B细胞和糖化血红蛋白呈正相关(图2D)，糖化血红蛋白可以反映患者3个月血糖控制情况，这提示高代谢的B细胞的比例越多的患者血糖控制较差。
诊断意义：高代谢的B细胞的比例可以区分健康人群和自身免疫性糖尿病患者，是诊断自身免疫糖尿病较好的分子标志物。
和预后的关系：此外，根据高代谢的B细胞的比例从高到低排列，按照其中位数将自身免疫糖尿病患者分成B细胞葡萄糖摄取较高的亚群和B细胞葡萄糖摄取较低的亚群人群，若患者2小时C肽水平小于200pmol/L说明胰岛功能衰竭，发现B细胞葡萄糖摄取较高的亚群人群(其2-NBDG阳性B细胞比例＞40％)的自身免疫糖尿病患者胰岛功能衰竭速度更快(图3)。
如图4，ROC曲线下的面积(AUC)是0.8536，表明在自身免疫糖尿病组的高代谢的B细胞的比例可以准确的对自身免疫糖尿病进行预测。ROC曲线上的最优值即为阈值，综合考虑敏感性和特异性，是指在特异性最大的基础上灵敏度尽可能的大。基于这个方法，ROC曲线的最优值为0.3892，即阈值为0.3892。在这一节点上，高代谢的B细胞的比例显示出55％的灵敏度和100％的特异性，95％的阳性预测值(置信区间为0.7788-0.9284)。可见利用高代谢的B细胞的比例可以很好的辅助诊断自身免疫糖尿病。
Claims (1)
1.检测B细胞中2-NBDG摄取量的试剂在制备自身免疫性糖尿病诊断和/或预后制剂中的应用；所述的自身免疫性糖尿病包括LADA和T1DM。
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