CN115998881A - 自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老药物中的应用。本发明以C57BL/6J小鼠与小鼠脑血管内皮细胞（bEnd.3）为研究对象，构建脑缺血再灌注损伤模型，通过β‑半乳糖苷酶染色检测细胞衰老，以及免疫荧光，蛋白免疫印迹分析自噬相关蛋白LC3B表达水平，发现在脑梗周边区存在细胞衰老与自噬，提示衰老与自噬可能是参与脑梗死后继发性损伤的靶点。通过使用自噬调节剂增强或抑制自噬，证实自噬能抑制脑缺血再灌注后衰老过程。本发明揭示自噬调节剂通过调控自噬清除受损蛋白或细胞器，具有延缓衰老的功能，是制备脑梗后抗衰老药物有效辅助成分。

Description

自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老药物中的应用。

背景技术

脑梗死是指由于颅内血管狭窄导致血液循环障碍，继而引发神经系统功能紊乱的多发性疾病。因其高发病率，高致残率，高死亡率及低预后率特点，给社会与家庭带来极大的负担，目前仍无有效的防治方法。衰老是机体随着年龄或者病程发展，出现生理性或者病理性功能衰退的病变过程。脑梗死后脑细胞衰老是指神经血管单元因缺血缺氧损伤，导致大量的细胞器或蛋白发生病变，失去原有功能的病理性衰退过程，它是导致脑梗后认知与运动功能障碍的主要原因之一，抑制衰老有助于改善脑梗患者预后，但目前缺乏有效的干预手段。衰老的机制异常复杂，目前尚无明确的分子机制及干预靶点，但及时清除病理性损伤的细胞器或蛋白，降低继发性损伤，普遍认为是抑制衰老的有效途径。

自噬是指自噬体吞噬受损的细胞器或蛋白，并在溶酶体的作用下降解所包裹的物质，以实现细胞本身的代谢所需物质与能量再利用的过程。自噬作为“细胞内免疫系统”，是真核细胞为对抗逆境而形成的内源性防御性机制。在缺血缺氧病理条件下，细胞内受损的细胞器（如线粒体，内质网等）或聚集失活的蛋白，可破坏细胞内电离平衡，产生氧自由基等细胞毒素，从而导致细胞衰老。自噬能否及时清除这些受损的细胞器或聚集的蛋白，将决定细胞是否发生衰老的关键过程。

发明内容

本发明的目的是提出一种自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老药物中的应用。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

本发明一方面提供了自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老药物中的应用。

进一步的，所述自噬调节剂包括自噬增强剂雷帕霉素和自噬抑制剂氯喹。

进一步的，所述自噬增强剂雷帕霉素抑制脑梗死后脑细胞衰老，所述自噬抑制剂氯喹促进脑梗死后脑细胞衰老。

进一步的，所述自噬调节剂对小鼠的实验给药方式为尾静脉注射，连续7天，每天注射一次，所述雷帕霉素的尾静脉注射用量为0.75 mg/kg/d，注射体积为0.20±0.02 ml；所述氯喹的尾静脉注射用量为5 mg/kg/d，注射体积为0.20±0.02 ml。

进一步的，所述脑细胞衰老的检测方法为β-半乳糖苷酶染色法。

本发明的突出效果为：

本发明以C57BL/6J小鼠与小鼠脑血管内皮细胞（bEnd.3）为研究对象，构建脑缺血再灌注损伤模型，通过β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老，以及免疫荧光，蛋白免疫印迹分析自噬相关蛋白LC3B表达水平，证实在脑梗周边区存在细胞衰老与自噬。结果证实衰老与自噬可能是参与脑梗死后继发性损伤的靶点。

通过使用自噬调节剂增强或抑制自噬，发现自噬能抑制脑缺血再灌注后衰老过程。本发明证实自噬调节剂通过调控自噬清除受损蛋白或细胞器，具有延缓衰老的功能，是制备脑梗后抗衰老药物有效辅助成分。

以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。

附图说明

图1A为本发明实施例1的C57BL/6J年轻雄性小鼠（4-6周）与老年雄性小鼠（18-20周）在脑缺血再灌注后梗死周边区脑组织衰老面积的结果图；

图1B为本发明实施例1的图1A的统计结果图；

图1C为本发明实施例1的小鼠脑微血管内皮细胞在不同OGD/R的时间阶段内衰老细胞数量的结果图；

图1D为本发明实施例1的图1C的统计结果图；

图2A为本发明实施例2的年轻雄性小鼠（4-6周）脑缺血再灌注后梗死周边区自噬相关蛋白LC3B的表达水平的结果图；

图2B为本发明实施例2的图2A的统计结果图；

图2C为本发明实施例2的老年雄性小鼠（18-20周）脑缺血再灌注后梗死周边区自噬相关蛋白LC3B的表达水平的结果图；

图2D为本发明实施例2的图2C的统计结果图；

图3A为本发明实施例2的免疫荧光方法检测bEnd.3细胞在氧糖剥夺6 h恢复氧糖6h后自噬相关蛋白LC3B的表达水平的结果图；

图3B为本发明实施例2的图3A的统计结果图；

图4A为本发明实施例3的自噬增强剂与自噬抑制剂对年轻雄性小鼠（4-6周）与老年雄性小鼠（18-20周）脑缺血再灌注后梗死周边区衰老面积的结果图；

图4B为本发明实施例3的图4A的统计结果图；

图4C为本发明实施例3的自噬调节剂对bEnd.3细胞OGD/R后衰老细胞数量的结果图；

图4D为本发明实施例3的图4C的统计结果图。

实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限本发明。

本发明上下文中所使用的试剂，均通过市售获得。本发明所使用的实验方法均为本领域的常规方法和技术。

实施例1 脑缺血再灌注后梗死周边区衰老水平

（1）MCAO/R实验

选择体重为25±2 g的年轻（4-6周）与老年（18-20周）C57BL/6J雄性小鼠，分为Sham组与MCAO/R组，每组各6只。MCAO/R组采用小鼠脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R，闭塞1.5h，再灌注24 h）方法，构建小鼠脑梗死模型。

采用异氟烷进行气体麻醉。将麻醉后的小鼠仰卧位固定于操作台上，并进行颈部脱毛。碘酒消毒皮肤后，在颈部正中处从头到尾方向切3 cm切口，用镊子分离皮下各层结缔组织与肌肉组织，暴露右侧粗大、在搏动的粉红的颈总动脉（Common carotid artery，CCA）。分离出CCA后，向上分离（远心端）分离进外颈动脉（external carotid artery，ECA），在CCA与ECA交叉处用3-0线结扎CCA。在ECA远心端与近心端用6-0线进行结扎。在ECA两线之间切个小口，将栓线从上往下插入血管内（有远心端到近心端），然后用5-0线绑住栓线。解开ECA近心端与远心端的6-0线，然后将线栓经CCA与ECA交叉处进入内颈动脉（internalcarotid artery，ICA）。注意避免进入翼腭动脉。当栓线进入ICA 大概1 cm左右后，感觉有阻力时则为阻断大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）入口。最后解开CCA远心端的3-0线。将小鼠放回温室饲养1.5 h，然后拔出栓线进行再灌注24 h。再灌注后将小鼠进行Longa评分，具体评分标准如下：0分 神经功能无缺损，运动弄能正常；1分 提尾时左前肢前伸困难；2分 向左侧转圈；3分：向左侧倒斜；4分 无自主运动，无意识反应。将1到3分的小鼠进行脱颈处死，在正中矢状位切开头皮，用镊子剥去露骨组织，获取脑组织。

（2）OGD/R实验（氧糖剥夺/恢复实验）

以小鼠脑血管内皮细胞（bEnd.3）为研究对象，采用OGD/R（缺氧：1%氧气，5%二氧化碳，94%氮气，无血清无糖培养基；恢复：5%二氧化碳，21%氧气，74%氮气，10%血清高糖培养基）方式，构建小鼠脑血管内皮细胞缺血再灌注损伤模型，用于体外模拟脑梗损伤。bEnd.3在形成单细胞层后，经OGD处理6 h然后在恢复6 h，OGD处理12 h然后再恢复12 h。

（3）衰老检测

使用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒（beyotime，C0602）分析衰老。用试剂盒提供的固定液在室温下固定组织切片或bEnd.3细胞15 min。PBS洗涤2次后，加入适量的染色液，然后孵育至指定时间（细胞在37℃孵育12 h，切片37℃孵育24 h），最后拍照。进行三次独立的实验。

（4）结果

图1A是C57BL/6J年轻雄性小鼠（4-6周）与老年雄性小鼠（18-20周）在脑缺血再灌注后梗死周边出现脑组织衰老。图1B是对图1A中脑组织衰老面积的统计结果，n：5，统计方法为T检验。图1C是小鼠脑微血管内皮细胞在不同OGD/R的时间阶段内衰老细胞数量。图1D是对图1C中衰老细胞数量的统计结果，统计方法为单因素方差分析。*<0.05，**<0.001。结果显示，经MCAO/R处理后，无论是年轻还是衰老小鼠脑组织中衰老细胞数量上升（图1A、1B）；bEnd.3内皮细胞经OGD/R处理后，衰老细胞数量上升（图 1C、1D）。

实施例2 脑缺血再灌注后梗死周边区自噬水平

为检测脑梗后自噬水平，本实施例采用免疫荧光，蛋白免疫印迹等方法在MCAO/R小鼠脑组织以及经OGD/R处理小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）中，检测LC3B的表达水平。

（1）小鼠体内实验

组织切片净4%PFA固定10 min后，PBS清洗2次，然后封闭30 min（封闭液：2%FBS，1%山羊血清，0.5%吐温20，用于pH为7.4的PBS溶液）。首先孵育一抗anti-Mouse-CD31（ThermoFisher，14-0311-82）与anti- Rabbit-LC3B（Sigma-Aldrich，L7543），接着相继孵育二抗Goat anti-Rabbit IgG，Alexa Fluor Plus 488（Invitrogen，A32731）。再用封闭液清洗5次后，使用激光共聚焦显微镜（Leica SP5）拍照。

图2A是年轻雄性小鼠（4-6周）脑缺血再灌注后梗死周边区自噬相关蛋白LC3B的表达水平。图2B是图2A中LC3B蛋白的荧光强度统计结果。图2C是老年雄性小鼠（18-20周）脑缺血再灌注后梗死周边区自噬相关蛋白LC3B的表达水平。图2D是图2C中LC3B蛋白的荧光强度统计结果。统计方法为T检验。*<0.05，**<0.001。结果显示，在MCAO/R年轻或者老年雄性小鼠脑组织中，LC3B表达上调（图2A、2C），年轻雄性小鼠MCAO/R后CD31表达水平无差异，而老年雄性小鼠在MCAO/R后CD31显著下降（图 2B，2D）。

（2）体外细胞实验

图3A是bEnd.3细胞在OGD/R（6/6）后自噬相关蛋白LC3B的表达水平。图3B是图3A中LC3B蛋白的荧光强度统计结果。统计方法为T检验。*<0.05，**<0.001。结果显示，bEnd.3细胞经OGD处理 6 （或者12）h，然后恢复6（或12）h处理后，采用免疫荧光方法检测LC3B表达水平显著上升（图3A、3B）。

实施例3自噬对缺血再灌注后梗死周边区衰老的作用。

（1）自噬调节剂预处理

小鼠在MCAO/R前一周每天尾静脉注射自噬增强剂雷帕霉素（0.75 mg/kg/d，溶于含5%聚乙二醇400以及5% 吐温 80的生理盐水中），以及自噬抑制剂氯喹（5 mg/kg/d，溶于生理盐水）。使用雷帕霉素（50 nmol/L，溶于含10%FBS的正常培养基）及氯喹（30 μmol/L，溶于含10%FBS的正常培养基）预处理bEnd.3细胞2 h，然后再进行OGD/R处理。

（2）MCAO/R实验

实验步骤与实施例1中（1）一致。

（3）OGD/R实验

实验步骤与实施例1中（2）一致。

（4）衰老检测

实验步骤与实施例1中（3）一致。

（5）结果

图4A是自噬增强剂与自噬抑制剂对年轻雄性小鼠（4-6周）与老年雄性小鼠（18-20周）脑缺血再灌注后梗死周边区衰老的作用。图4B是图4A图中中脑组织衰老面积的统计结果。图4C是在bEnd.3细胞中自噬调节剂对OGD/R诱导的衰老的作用。bEnd.3细胞在预先自噬增强剂与抑制剂处理2 h后，氧糖剥夺6 h，恢复6 h，然后通过β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老。图4D是对图4C中衰老细胞统计结果。统计方法为单因素方差分析。自噬增强剂：雷帕霉素，浓度为50 nmol/L，自噬抑制剂：氯喹，浓度为30 μmol/L。*<0.05，**<0.001。结果显示，相比MCAO/R组，自噬增强剂Rapa能抑制衰老面积（图4A，图4B）或衰老细胞数量（图4C，图4D），而自噬抑制剂CQ则能增加衰老面积（图4A，图4B），或衰老细胞数量（图4C，图4D）。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述自噬调节剂包括自噬增强剂雷帕霉素和自噬抑制剂氯喹。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述自噬增强剂雷帕霉素抑制脑梗死后脑细胞衰老，所述自噬抑制剂氯喹促进脑梗死后脑细胞衰老。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述自噬调节剂对小鼠的实验给药方法为尾静脉注射，连续7天，每天注射一次；

所述雷帕霉素的用量为0.75 mg/kg/d，所述氯喹的用量为5 mg/kg/d；

所述雷帕霉素和所述氯喹的注射体积分别为0.20±0.02 ml。

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