CN115998877A - Cmpk2抑制剂在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种CMPK2抑制剂在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。本申请提供的CMPK2抑制剂在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。其中，提供的CMPK2抑制剂能够有效靶向抑制CMPK2，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用，有利于抵抗呼吸道合胞病毒的感染，在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物方面具有极大的临床转化前景，拓展了CMPK2抑制剂作为制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物的有效成分的应用价值。
Description
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种CMPK2抑制剂在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。
背景技术
在病毒感染的细胞细胞器中，线粒体在触发抗病毒免疫中发挥关键作用。比如线粒体中活性氧的产生，线粒体DNA的释放，可以导致炎症小体的激活和炎症反应。
CMPK2是一种哺乳动物中定位于线粒体中的一种核苷单磷酸激酶，参与线粒体DNA合成。CMPK2依赖的mtDNA合成，对于NLRP3炎症小体激活后氧化mtDNA片段的产生是必要的，氧化后的mtDNA在胞质中与NLRP3炎症小体复合物相关联从而激活NLRP3。NLRP3炎症小体在许多急性和慢性疾病以及退行性疾病中发挥着重要作用。激活的NLRP3炎症小体会引起pro-caspase-1自剪切成为有活性的caspase-1，进而剪切pro-IL-1β和pro-IL-18成为成熟的IL-1β和IL-18，以及诱导形成孔蛋白Gasdermin的蛋白裂解。从而使成熟的IL-1β和IL-18释放到细胞外。Gasdermin D的活性片段在细胞膜上形成空隙，IL-1β和IL-18及DAMPs会在宿主细胞溶解和细胞死亡前通过Gasdermin D孔分泌，导致一种新的程序性细胞死亡，即细胞焦亡，又被称作细胞炎性坏死。而NLRP3炎症小体及其产物的活化在呼吸道和肺部疾病中发挥着重要作用，过度激活的NLRP3炎症小体会导致急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)，当ALI导致的低氧血症严重至肺泡氧分压/吸入氧分数(PaO2/FiO2)低于300时就被认为发生了急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，其致死率高达40％。
呼吸道病毒如严重急性呼吸综合征冠状病毒2、甲型流感、SARS冠状病毒、呼吸道合胞病毒等，感染后常见的症状，如咳嗽、打喷嚏、鼻塞、鼻塞，还可能发展成为支气管炎、肺炎甚至出现严重的并发症如感染性休克、ARDS。其中，呼吸道合胞病毒(RSV)是引发需要住院治疗儿童重症肺炎的主要病原体，也是急性下呼吸道感染(ALRI)发生的主要病因。到目前为止，关于RSV的治疗手段仍然非常有限。因此，迫切需要研制有效的抗RSV病毒药物，以满足患者的用药需求。
发明内容
本申请的目的在于提供一种CMPK2抑制剂在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用，旨在解决现有技术中暂时没有能够有效满足患者的用药需求的防治呼吸道合胞病毒感染的药物的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供CMPK2抑制剂在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。
进一步，CMPK2抑制剂选自依维莫司、异丙托溴铵中的至少一种。
进一步，依维莫司通过与CMPK2的氨基酸Glu399、Cys40、Arg303、Asn403相互作用，抑制呼吸道合胞病毒的受体CMPK2表达，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用。
进一步，异丙托溴铵通过与CMPK2的氨基酸Arg103和Arg395相互作用，抑制呼吸道合胞病毒的受体CMPK2表达，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用。
进一步，依维莫司的有效浓度为0.1～10μM。
进一步，异丙托溴铵的有效浓度为0.1～10μM。
进一步，药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步，辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂、防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味矫臭剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂中的至少一种。
第二方面，本申请提供一种防治呼吸道合胞病毒感染的药物，药物包括CMPK2抑制剂。
进一步，CMPK2抑制剂包括依维莫司、异丙托溴铵中的至少一种。
本申请第一方面提供的CMPK2抑制剂在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。其中，提供的CMPK2抑制剂能够有效靶向抑制CMPK2，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用，有利于抵抗呼吸道合胞病毒的感染，在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物方面具有极大的临床转化前景，拓展了CMPK2抑制剂作为制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物的有效成分的应用价值。
本申请第二方面提供的防治呼吸道合胞病毒感染的药物，提供的药物包括CMPK2抑制剂，提供的CMPK2抑制剂能够有效靶向抑制CMPK2，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用，有利于提高对呼吸道合胞病毒感染的治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的依维莫司与CMPK2的3D对接分析图。
图2是本申请实施例提供的异丙托溴铵与CMPK2的3D对接分析图。
图3是本申请实施例提供的CCK8检测化合物对Beas-2b细胞毒性的结果分析图。
图4是本申请实施例提供的Western blot检测依维莫司对CMPK2表达的影响的结果分析图。
图5是本申请实施例提供的依维莫司在体外的抗RSV疗效的评价分析图。
图6是本申请实施例提供的对照组、RSV感染和依维莫司治疗小鼠的病毒载量分析图。
图7是本申请实施例提供的对照小鼠、RSV感染小鼠、依维莫司处理小鼠的肺炎症组织病理学分析图。
图8是本申请实施例提供的对照小鼠、RSV感染小鼠、依维莫司处理小组小鼠中IL-1β、IL-6和TNF-α的检测分析图。
图9是本申请实施例提供的依维莫司减少小鼠肺部RSV的感染的分析图。
图10是本申请实施例提供的CCK8检测化合物对Beas-2b细胞毒性的结果分析图。
图11是本申请实施例提供的Western blot检测异丙托溴铵对CMPK2表达的影响的结果分析图。
图12是本申请实施例提供的异丙托溴铵在体外的抗RSV疗效的评价分析图。
图13是本申请实施例提供的对照组、RSV感染和异丙托溴铵治疗小鼠的病毒载量分析图。
图14是本申请实施例提供的对照小鼠、RSV感染小鼠、异丙托溴铵处理小鼠的肺炎症组织病理学分析图。
图15是本申请实施例提供的对照小鼠、RSV感染小鼠、异丙托溴铵处理小组小鼠中IL-1β、IL-6和TNF-α的检测分析图。
图16是本申请实施例提供的异丙托溴铵减少小鼠肺部RSV的感染的分析图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例第一方面提供本申请提供CMPK2抑制剂在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。
本申请实施例第一方面提供的CMPK2抑制剂在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。其中，提供的CMPK2抑制剂能够有效靶向抑制CMPK2，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用，有利于抵抗呼吸道合胞病毒的感染，在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物方面具有极大的临床转化前景，拓展了CMPK2抑制剂作为制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物的有效成分的应用价值。
在一些实施例中，CMPK2抑制剂选自依维莫司、异丙托溴铵中的至少一种。
在一些实施例中，依维莫司的化学结构式如式I所示，
在一些实施例中，依维莫司通过与CMPK2的氨基酸Glu399、Cys40、Arg303、Asn403相互作用，抑制呼吸道合胞病毒的受体CMPK2表达，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用。
在一些实施例中，依维莫司与CMPK2的对接分数为-10.3290kcal/mol，可以看出，依维莫司与CMPK2的亲和力较高；因此，依维莫司在作用过程中，能够迅速与CMPK2有效结合，有效抑制CMPK2的表达，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用。
在一些实施例中，依维莫司的有效浓度为0.1～10μM。在该浓度范围下，对细胞没有毒性，并且能够起到相应的对呼吸道合胞病毒的防治作用的效果。
在一些具体实施例中，依维莫司的有效浓度包括但不限于0.1μM、0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM。
在一些实施例中，异丙托溴铵的结构式如式II所示，
在一些实施例中，异丙托溴铵通过与CMPK2的氨基酸Arg103和Arg395相互作用，抑制呼吸道合胞病毒的受体CMPK2表达，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用。
在一些实施例中，异丙托溴铵与CMPK2的对接分数为-10.9693kcal/mol，可以看出，异丙托溴铵与CMPK2的亲和力较高。；因此，异丙托溴铵在作用过程中，能够迅速与CMPK2有效结合，有效抑制CMPK2的表达，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用。
在一些实施例中，异丙托溴铵的有效浓度为0.1～10μM。在该浓度范围下，对细胞没有毒性，并且能够起到相应的对呼吸道合胞病毒的防治作用的效果。
在一些具体实施例中，异丙托溴铵的有效浓度包括但不限于0.1μM、0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM。
在一些实施例中，药物还包括药学上可接受的辅料。
在一些实施例中，辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂、防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味矫臭剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂中的至少一种。
在一些实施例中，防治呼吸道合胞病毒感染的药物的剂型包括但不限于片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、散剂、丸剂、膏剂中的至少一种。本申请实施例对防治呼吸道合胞病毒感染的药物的剂型不做具体限定，可以是药学上可接受的任意剂型，满足不同的给药应用需求。
本申请实施例第二方面提供一种防治呼吸道合胞病毒感染的药物，药物包括CMPK2抑制剂。
本申请实施例第二方面提供的防治呼吸道合胞病毒感染的药物，提供的药物包括CMPK2抑制剂，提供的CMPK2抑制剂能够有效靶向抑制CMPK2，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用，有利于提高对呼吸道合胞病毒感染的治疗效果。
在一些实施例中，CMPK2抑制剂包括依维莫司、异丙托溴铵中的至少一种。提供的包含依维莫司和/或异丙托溴铵为活性成分的药物是一种用于预防或治疗呼吸道合胞病毒感染的药物。
在一些实施例中，CMPK2抑制剂的有效浓度为0.1～10μM。在该浓度范围下，对细胞没有毒性，并且能够起到相应的对呼吸道合胞病毒的防治作用的效果。
在一些具体实施例中，CMPK2抑制剂的有效浓度包括但不限于0.1μM、0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
确定CMPK2抑制剂在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用
试验步骤：
(1)虚拟筛选与分子对接
CMPK2蛋白晶体结构下载自RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org)，其PDB ID：6VKE(Crystal Structure of Inhibitor JNJ-40012665in Complex with Prefusion RSVF Glycoprotein)，然后通过Autodock vina tool以及Pymol工具进行CMPK2蛋白晶体结构检查。小分子药物下载自ZINC15小分子数据库(http://zinc.docking.org/)，包括1615项种FDA批准的药物和4288种已批准使用但未获FDA批准的药物。使用的软件包括AutoDockTools1.5.6(http://mgltools.scripps.edu/downloads)、AutoDock Vina1.1.2(the current version is 1.1.2，http://vina.scripps.edu/)，Open Babel 3.1.1(openbabel.org/wiki/Category:Installation)，以及以及可视化软件PyMOL(https://pymol.org/2/)。AutoDockTools1.5.6和PyMOL软件用于除水、加氢等蛋白受体和小分子配体准备操作。高通量分子对接由Autodock Vina进行。我们通过计算机对小分子数据库进行两步筛选。第一次进行刚性对接，选择对接分数<-7kJ/mol的小分子药物进行，第二次使用AutoDock Vina进行柔性对接，然后选取top6药物进行分子动力学模拟和生物活性测试。
(2)分子动力学模拟
分析配合物相互作用的结构稳定性对了解其结合亲和力至关重要。在本研究中，我们在Linux Centos7操作系统上使用GROMACS 2019.6软件(下载自www.gromacs.org/)进行分子动力学模拟。所有数据由Originlab处理(从www.originlab.com下载)。
结果分析：
(1)通过计算机药物虚拟筛选，从5903种小分子化学物(http://zinc.docking.org/)，包括1615项种FDA批准的药物和4288种已批准使用但未获FDA批准的药物)。在研究中，针对CMPK2的天然化合物药物筛选是使用基于结构的筛选方法进行的。筛选到了亲和力较高的小分子化合物依维莫司。依维莫司与CMPK2的对接分数为-10.3290kcal/mol，3D对接分析图如图1所示。
(2)通过计算机药物虚拟筛选，从5903种小分子化学物(http://zinc.docking.org/)，包括1615项种FDA批准的药物和4288种已批准使用但未获FDA批准的药物)。在研究中，针对CMPK2的天然化合物药物筛选是使用基于结构的筛选方法进行的。筛选到了亲和力较高的小分子化合物异丙托溴铵。异丙托溴铵与CMPK2的对接分数为--10.9693kcal/mol，3D对接分析图图2所示。
实施例2
体外试验分析CMPK2抑制剂依维莫司的细胞毒性以及分析小分子化合物对与CMPK2表达的影响
试验步骤：
(1)细胞培养与RSV感染
人正常肺上皮细胞系Beas-2b和Hela由中南大学基础医学院微生物系所冻存和保留。RSV(Long strain/A2 type)was stored by the Department of MedicalMicrobiology of Central South University。在无菌条件下培养细胞，并在含有10％胎牛血清(FBS；Gibco，美国)的DMEM和1640培养基(37℃培养箱，5％CO2)中培养。待细胞密度达85％左右，加入不同浓度的化合物Tannic acid(HY-B2136)，并以1x104PFU左右的RSV感染细胞,待24h后检测RSV的病毒载量。
(2)CCK8检测化合物对Beas-2b细胞毒性
细胞毒性试验采用Cell Counting Kit-8(APExBIO,USA)检测。Beas-2b在96孔细胞培养板的密度1×103个细胞，加入不同浓度的依维莫司(0.005、0.01、0.1、1、10、100μM/L)，然后，按照CCK-8试剂盒方案处理细胞。使用TECAN F50(Mannedorf，瑞士)测定每个孔在450nm处的分光光度吸收值。
(3)Western blot检测小分子化合物对CMPK2表达的影响
取细胞生长状态良好的Beas-2b细胞铺于六孔板中；细胞贴壁后，RSV感染4h后，加入不同浓度的小分子化合物依维莫司(0.01、0.1、1μM/L),作用24h后，提取细胞RNA和细胞蛋白进行进一步实验。
(4)RT-qPCR检测RSV,CMPK2的表达以及RSV病毒DNA载量
建立小分子化合物细胞组和DMSO对照组。从Hela的Beas-2b细胞中制备总RNA，并用SmartSpecTMPlus分光光度计(Bio-rad,USA)进行定量。使用Trizol试剂(Takara,Japan)从肺组织中提取总RNA.使用RR036A PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)(Takara,Japan)将每个样本逆转录为cDNA。反转录合成cDNA，按照说明书使用2×SYBRGreen qPCR Master Mix(Bimake,USA)进行扩增。采用CFX96 TouchTM深井实时荧光定量PCR检测系统(Bio-rad，美国)，在热循环条件下使用TB
Ex Taq(Takara，日本)进行定量PCR(qPCR)。
结果分析：
(1)CCK8检测化合物对Beas-2b细胞毒性的结果分析
CCK8检测化合物对Beas-2b细胞毒性的结果如图3所示，可以看出，当依维莫司的浓度为0.005～10mM时，Beas-2b细胞的活性仍保持在100％以上。
(2)Western blot检测依维莫司对CMPK2表达的影响的结果分析
Western blot检测依维莫司对CMPK2表达的影响的结果如图4所示，可以看出，依维莫司在0.01～10μM浓度显著下调了CMPK2蛋白的表达，随着浓度的增加，效果更加显著。
(3)RT-qPCR检测RSV、CMPK2的表达以及RSV病毒RNA载量的结果分析
RT-qPCR检测RSV、CMPK2的表达的结果如图5的A所示，可以看出，依维莫司在1μM抑制CMPK2 mRNA表达。
进一步分析RSV病毒RNA载量，结果如图5的B所示，可以看出，依维莫司在1μM抑制病毒的RNA。
实施例3
体内试验分析与CMPK2抑制剂依维莫司的细胞毒性以及分析小分子化合物对与CMPK2表达的影响
试验过程：
(1)提供动物模型
6-8周大雌性BALB/c小鼠体重16-20g(购自湖南Tianqin生物技术有限公司)都保存在一个无菌环境和后随机分为对照组(n＝6),和RSV组(n＝6)。RSV+Everolimus组((5mg/kg和10mg/kg)，在RSV感染前2～4h腹腔注射小分子化合物。异氟醚麻醉小鼠后，鼻内接种RSV 5×106pfu(100μl)。对于模拟感染(对照组)，小鼠给予等量的无菌PBS。感染后第7天(每组6只)检测处死小鼠，留取样本。
(2)HE染色
每只动物的肺组织在10％甲醛溶液中固定24小时，然后石蜡包埋，切成5μm薄片(Servicebio生物技术有限公司，武汉，中国)。按照常规实验程序进行苏木精-伊红染色，并在光学显微镜下观察组织形态学变化。
(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)
收集小鼠肺泡灌洗液，使用ELISA试剂盒(Elabscience，中国武汉)测定IL-1β、IL-6和TNF-α水平。小鼠肺泡灌洗液4℃1000rpm离心20min。收集上清液，使用TECAN F50(Mannedorf，瑞士)在450nm处测量OD值。
结果分析：
(1)检测对照组、RSV感染和依维莫司治疗小鼠的病毒载量。
测对照组、RSV感染和依维莫司治疗小鼠的病毒载量如图6所示，可以看出，依维莫司5mg/kg及10mg/kg均抑制病毒RNA。
(2)检测对照小鼠、RSV感染小鼠、依维莫司处理小鼠的肺炎症组织病理学分析
对照小鼠、RSV感染小鼠、依维莫司处理小鼠的肺炎症组织病理学分析如图7所示，可以看出依维莫司5mg/kg及10mg/kg显著改善肺部炎症。
(3)对照小鼠、RSV感染小鼠、依维莫司处理小组小鼠中IL-1β、IL-6和TNF-α的检测
对照小鼠、RSV感染小鼠、依维莫司处理小组小鼠中IL-1β、IL-6和TNF-α的检测如图8所示，可以看出，依维莫司5mg/kg及10mg/kg显著抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。
(4)依维莫司减少小鼠肺部RSV的感染
依维莫司减少小鼠肺部RSV的感染的分析图如图9所示，可以看出，依维莫司5mg/kg及10mg/kg显著抑制肺部RSV免疫荧光。
实施例4
体外试验分析与CMPK2抑制剂异丙托溴铵的细胞毒性以及分析小分子化合物对与CMPK2表达的影响
试验步骤：
(1)细胞培养与RSV感染
人正常肺上皮细胞系Beas-2b和Hela由中南大学基础医学院微生物系所冻存和保留。RSV(Long strain/A2 type)was stored by the Department of MedicalMicrobiology of Central South University。在无菌条件下培养细胞，并在含有10％胎牛血清(FBS；Gibco，美国)的DMEM和1640培养基(37℃培养箱，5％CO2)中培养。待细胞密度达85％左右，加入不同浓度的化合物Tannic acid(HY-B2136)，并以1x104PFU左右的RSV感染细胞,待24h后检测RSV的病毒载量。
(2)CCK8检测化合物对Beas-2b细胞毒性
细胞毒性试验采用Cell Counting Kit-8(APExBIO,USA)检测。Beas-2b在96孔细胞培养板的密度1×103个细胞，加入不同浓度的异丙托溴铵(0.005、0.01、0.1、1、10、100μM/L)，然后，按照CCK-8试剂盒方案处理细胞。使用TECAN F50(Mannedorf，瑞士)测定每个孔在450nm处的分光光度吸收值。
(3)Western blot检测小分子化合物对CMPK2表达的影响
取细胞生长状态良好的Beas-2b细胞铺于六孔板中；细胞贴壁后，RSV感染4h后，加入不同浓度的小分子化合物异丙托溴铵(0.01、0.1、1μM/L),作用24h后，提取细胞RNA和细胞蛋白进行进一步实验。
(4)RT-qPCR检测RSV,CMPK2的表达以及RSV病毒DNA载量
建立小分子化合物细胞组和DMSO对照组。从Hela的Beas-2b细胞中制备总RNA，并用SmartSpecTMPlus分光光度计(Bio-rad,USA)进行定量。使用Trizol试剂(Takara,Japan)从肺组织中提取总RNA.使用RR036A PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)(Takara,Japan)将每个样本逆转录为cDNA。反转录合成cDNA，按照说明书使用2×SYBRGreen qPCR Master Mix(Bimake,USA)进行扩增。采用CFX96 TouchTM深井实时荧光定量PCR检测系统(Bio-rad，美国)，在热循环条件下使用TB
Ex Taq(Takara，日本)进行定量PCR(qPCR)。
结果分析：
(1)CCK8检测化合物对Beas-2b细胞毒性的结果分析
CCK8检测化合物对Beas-2b细胞毒性的结果如图10所示，可以看出，当异丙托溴铵的浓度为0.005～10mM时，Beas-2b细胞的活性仍保持在50％以上。
(2)Western blot检测异丙托溴铵对CMPK2表达的影响的结果分析
Western blot检测异丙托溴铵对CMPK2表达的影响的结果如图11所示，可以看出，异丙托溴铵在0.1～10μM浓度显著下调了CMPK2蛋白的表达，随着浓度的增加，效果更加显著。
(3)RT-qPCR检测RSV、CMPK2的表达以及RSV病毒RNA载量的结果分析
RT-qPCR检测RSV、CMPK2的表达的结果如图12的A所示，可以看出，异丙托溴铵在0.1～10μM显著抑制CMPK2 mRNA表达。
进一步分析RSV病毒RNA载量，结果如图12的B所示，可以看出，异丙托溴铵在0.1～10μM显著抑制病毒RNA。
实施例5
体内试验分析与CMPK2抑制剂异丙托溴铵的细胞毒性以及分析小分子化合物对与CMPK2表达的影响
试验过程：
(1)提供动物模型
6-8周大雌性BALB/c小鼠体重16-20g(购自湖南Tianqin生物技术有限公司)都保存在一个无菌环境和后随机分为对照组(n＝6),和RSV组(n＝6)。RSV+异丙托溴铵组(0.5μg/kg和1μg/kg)，在RSV感染前2～4h腹腔注射小分子化合物。异氟醚麻醉小鼠后，鼻内接种RSV 5×106pfu(100μl)。对于模拟感染(对照组)，小鼠给予等量的无菌PBS。感染后第7天(每组6只)检测处死小鼠，留取样本。
(2)HE染色
每只动物的肺组织在10％甲醛溶液中固定24小时，然后石蜡包埋，切成5μm薄片(Servicebio生物技术有限公司，武汉，中国)。按照常规实验程序进行苏木精-伊红染色，并在光学显微镜下观察组织形态学变化。
(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)
收集小鼠肺泡灌洗液，使用ELISA试剂盒(Elabscience，中国武汉)测定IL-1β、IL-6和TNF-α水平。小鼠肺泡灌洗液4℃1000rpm离心20min。收集上清液，使用TECAN F50(Mannedorf，瑞士)在450nm处测量OD值。
结果分析：
(1)检测对照组、RSV感染和异丙托溴铵治疗小鼠的病毒载量。
对照组、RSV感染和异丙托溴铵治疗小鼠的病毒载量如图13所示，可以看出，异丙托溴铵(0.5μg/kg和1μg/kg)显著抑制肺内病毒RNA。
(2)检测对照小鼠、RSV感染小鼠、异丙托溴铵处理小鼠的肺炎症组织病理学分析
对照小鼠、RSV感染小鼠、异丙托溴铵处理小鼠的肺炎症组织病理学分析如图14所示，可以看出，异丙托溴铵(0.5μg/kg和1μg/kg)显著抑制肺部炎症。
(3)对照小鼠、RSV感染小鼠、异丙托溴铵处理小组小鼠中IL-1β、IL-6和TNF-α的检测
对照小鼠、RSV感染小鼠、异丙托溴铵处理小组小鼠中IL-1β、IL-6和TNF-α的检测如图15所示，可以看出，异丙托溴铵(0.5μg/kg和1μg/kg)显著小鼠肺内IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。
(4)异丙托溴铵减少小鼠肺部RSV的感染
异丙托溴铵减少小鼠肺部RSV的感染的分析图如图16所示，可以看出，异丙托溴铵(0.5μg/kg和1μg/kg)显著小鼠肺内RSV免疫荧光。
综上，本申请提供的提供的CMPK2抑制剂在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。其中，提供的CMPK2抑制剂能够有效靶向抑制CMPK2，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用，有利于抵抗呼吸道合胞病毒的感染，在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物方面具有极大的临床转化前景，拓展了CMPK2抑制剂作为制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物的有效成分的应用价值。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.CMPK2抑制剂在制备防治呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CMPK2抑制剂选自依维莫司、异丙托溴铵中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述依维莫司通过与CMPK2的氨基酸Glu399、Cys40、Arg303、Asn403相互作用，抑制呼吸道合胞病毒的受体CMPK2表达，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述异丙托溴铵通过与CMPK2的氨基酸Arg103和Arg395相互作用，抑制呼吸道合胞病毒的受体CMPK2表达，进而抑制呼吸道合胞病毒进入细胞，以实现对呼吸道合胞病毒的防治作用。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述依维莫司的有效浓度为0.1～10μM。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述异丙托溴铵的有效浓度为0.1～10μM。
7.根据权利要求1～6任一所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂、防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味矫臭剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂中的至少一种。
9.一种防治呼吸道合胞病毒感染的药物，其特征在于，所述药物包括CMPK2抑制剂。
10.根据权利要求9所述的防治呼吸道合胞病毒感染的药物，其特征在于，所述CMPK2抑制剂包括依维莫司、异丙托溴铵中的至少一种。
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2022
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