CN115996767A - 一种作为骨移植物的合成复合材料及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于骨移植物的合成复合材料，包括：生物惰性聚合物，其包括聚乳酸、聚D,L‑乳酸；生物活性聚合物，其由聚亚丙基富马酸酯或富马酸二酯和丙二醇(1,2‑二醇)组成；以及生物活性无机组分，其由金属氟磷酸盐玻璃粉组成，其中所述生物活性组分的量高达复合材料的30％(w/w)。所述复合材料中的生物活性无机氟磷酸金属盐玻璃粉是氟磷酸锌、氟磷酸镁或氟磷酸银中的一种。本发明涉及制作支架的方法，还涉及3D打印支架。

Description

一种作为骨移植物的合成复合材料及其方法
技术领域
本发明涉及复合材料领域。具体地，本发明涉及粉末或支架的形式的作为合成骨移植物的生物可降解聚合物和生物活性氟磷酸盐玻璃的复合材料，以及制造该复合材料的方法。
发明背景
临床医生所需的移植物的数量和类型取决于临床状况和情况。清理骨囊肿的外科医生需要大量的移植物来填充空隙，这样做可能需要颗粒填充物，以填充所有隐蔽处和角落。当外科医生面对长骨骨折不愈合的病例时，为了引入桥接愈伤组织，除了对骨折的良好固定外，他还需要对骨折末端进行修整，以将间充质细胞带出并暴露在外部，并在其上铺设髂骨移植物(菲米斯特(phemister)移植物)带以诱导和引导整个骨折部位的骨愈合。
当遇到伴有骨质流失的复合性骨折时，皮质病变需要切除一段长骨，则重建需要一定的负荷承重骨移植物，该移植物将取代丢失的骨并在短时间内生物学上转化为骨，而不会延长患者的发病率。
当骨的干骺端患病并需要切除时，在不截肢的情况下，用定制的假体进行肢体挽救手术。由于假体具有特定的寿命并且可以用于疲劳性骨折，因此通过快速原型制作制成的定制移植植入物在植入后将转化为骨骼，与现有的方法相比这对患者来说是一个福音。
随着高速事故发生率的增加，对合成骨的需求正在增加，骨病变和肿瘤的挽救手术正在增加，而由于其资源有限并且与从另一位点进行另一个切口的移植物的固定相关的发病率，外科医生的手被自动移植物的可得性所限制。同种异体移植物或骨库一直有疾病传播的风险。
最初使用的材料是陶瓷羟基磷灰石和磷酸三钙作为骨移植替代品。羟基磷灰石仅具有骨传导性，即使在多年后也很少转化为骨。它不能用于代替承重功能。磷酸三钙具有极小的骨诱导能力和骨传导，但没有生物转化能力。
为了具有生物转化的优势，某些特定的骨激素如“骨形态发生原理”(简称为BMP)开始使用。同样像“脱矿质骨基质(DMB)”也被作为骨移植替代品销售。其使用的基本问题是所涉及的巨大成本，它们具有良好的骨诱导性，但不是良好的骨导体。HENCH推出了45S5玻璃，这是一个突破，因为它是由廉价化学品制成的，具有骨传导性和骨诱导性，能够与天然骨融合并且市售可得。45S5玻璃的缺点是它们的再吸收速度非常慢，生物转化所需的时间更长，并且它们不能用作承重植入物。为了规避这些问题，无二氧化硅的磷酸盐生物玻璃和金属氧化物掺杂的生物玻璃进入了该领域。
氟化物理想摩尔百分比的标准化使氟磷酸盐玻璃得以发明，其生物活性比磷酸盐和二氧化硅玻璃高得多，并且具有更高的生物转化率。用金属氧化物掺杂氟磷酸盐玻璃可以改善其物理性质，并使弹性模量接近人体骨骼的弹性模量。构件化氟磷酸盐玻璃对于分子用于临床用途至关重要。
因此，该领域需要一种具有生物相容性并具有其他几种特性的合成复合材料，例如生物活性，可生物降解性；对接受者无毒；生物传导性；能进行生物转化，并可加工成所需的形状以及成本有效。
发明目的
本发明的目的是用于合成生物惰性聚合物、生物活性聚合物和生物活性无机组分的复合材料，所述生物惰性聚合物包括聚乳酸、聚D，L-乳酸，生物活性聚合物由聚亚丙基富马酸酯、富马酸二酯和丙二醇(1,2-二醇)组成，生物活性无机组分由金属氟磷酸盐玻璃粉组成。
本发明的另一个目的是用于颗粒、支架如条带、圆柱体和任何其他形状的复合材料及其制造方法。
本发明的另一个目的是用于通过3D打印制备支架。
发明内容概述
本发明提供一种用于骨移植物的合成复合材料，包括：生物惰性聚合物，其包括聚乳酸、聚D，L-乳酸；生物活性聚合物，其由聚亚丙基富马酸酯或富马酸二酯和丙二醇(1，2-二醇)组成；以及生物活性无机组分，其由金属氟磷酸盐玻璃粉组成，其中所述生物活性组分的量高达复合材料的30％(w/w)。
在本发明的一个方面，所述复合材料的生物活性无机金属氟磷酸盐玻璃粉是氟磷酸锌、氟磷酸镁或氟磷酸银中的一种。
在一个方面，复合材料中的聚乳酸在54％(w/w)至68％(w/w)的范围内；聚D,L-乳酸在10％(w/w)至28％(w/w)的范围内；1，2-二醇在3％(w/w)至10％(w/w)的范围内；聚亚丙基富马酸酯在3％(w/w)至10％(w/w)的范围内；复合材料中的氟磷酸无机金属盐玻璃粉在10％(w/w)至30％(w/w)的范围内。
在一些实施方式中，所述复合材料为粉末或支架的形式。所述支架在制造时是条状或圆柱体或管状物等。
在本发明的合成复合材料的一个实施方式中，通过包括以下步骤的制备方法进行制备：将复合材料在溶剂中用磁力搅拌器混合或超声处理，得到均匀的混合物；将所述混合物浇注在热玻璃板上，使溶液沸腾；并通过持续沸腾蒸发溶剂；得到复合材料组分分布均匀的相互连接的多孔支架。
所述支架的孔隙率范围为20％-40％。
此外，所述支架还通过直接墨水打印技术由定制3D打印机制成具有所需的形状和所需的孔隙率。
通过直接墨水打印技术由定制3D打印机获得支架的方法包括以下步骤：复合材料的组分均质化并冷却至10-30℃。腔室温度保持在30-40℃。将墨水装入压力控制的非粘附挤出机中。通过微芯片将输入写入细节传送到打印机。喷嘴直径固定为300μm，便于挤出。体积流量设置为5mm3/s。书写行间的间距为200微米，层数设计为10。将计算机送入的所需形状、厚度、孔隙率、层写在热板(100℃)上。热板在x、y、z方向上的移动也预先设置好，由微芯片传输命令。
附图说明
图1是描绘在各种玻璃浓度下金属氧化物掺杂FP玻璃的溶解产物的ALP活性的柱状图。
图2a和2b：FP和MgFP玻璃粉的热研究。
图2c和2d：ZnFP和TiFP玻璃粉的热研究。
图2e和2f：ZrFP和AgFP玻璃粉的热研究。
图2g：SrFP玻璃粉的热研究。
图3表示PPF的FTIR光谱。
图4表示PPF的DSC研究，图4a表示PPF的玻璃化转变温度。
图5：富马酸1，2-丙二醇的FTIR光谱。
图6：富马酸1，2-丙二醇的TG研究。
图7：PLA的表征和热分析。
图8：PDLLA的表征和热分析。
图9：通过从1200度淬火到瞬时-170℃制备氟磷酸盐玻璃。
图10：尝试通过改变聚合物的浓度来构建支架(scaffolding)。
图11：通过改变FP盐的浓度来尝试构建支架。
图12：与组分变化有关的支架的细胞粘附研究。
图13：与组分的变化以及是否存在孔隙率有关的复合材料的细胞粘附研究。
图14：通过不同的构建支架方法实现的不同支架。
图14a：凝胶压缩制成的支架的SEM图像。
图14b：在快速加热下通过凝胶泡沫铸造制备支架。
图15：支架内皮细胞的细胞毒性(MTT)测定。
图15a：支架内皮细胞的细胞毒性(MTT)测定(显微照片)。
图16：基于AgFP和ZnFP的支架的RT-PCR胶原II表达。
图17：基于AgFP和ZnFP的支架的RT-PCR骨钙素表达。
图18：基于Mg的支架的RT-PCR胶原II和骨钙素表达。
图19：支架的RT_PCR RUN_X2表达。
图20：在SaOS2细胞系中支架表达的硫酸软骨素水平。
图21：基于PPF的支架的FTIR光谱(体外评估-浸入前和浸入后)。
图21a：对基于PPF的支架的解释(体外评估-浸入前和浸入后)。
图22：基于二醇的支架的FTIR光谱(体外评估-浸入前和浸入后)。
图22a：对基于二醇的支架的解释(体外评估-浸入前和浸入后)。
图23：基于MgFP的支架的FTIR光谱(体外评估-浸入前和浸入后)。
图23a：对基于MgFP的支架的解释(体外评估-浸入前和浸入后)。
图24：AgFP,ZnFP,MgFP支架(快速加热下通过凝胶泡沫构建支架)的FTIR光谱(体外评估-浸入前和浸入后)。
图24a：对AgFP,ZnFP,MgFP支架(快速加热下通过凝胶泡沫浇注构建支架)的解释(体外评估-浸入前和浸入后)。
图25：带状支架的FTIR光谱(体外评估-浸入前和浸入后)。
图25a：对带状支架的解释(体外评估-浸入前和浸入后)。
图26：圆柱形支架的FTIR光谱(体外评估-浸入前和浸入后)。
图26a：对圆柱形支架的解释(体外评估-浸入前和浸入后)。
图27：在快速加热下通过凝胶泡沫铸造制成的带状和圆柱形支架的照片。
图28：浸入支架前和浸入支架后的SEM显微照片，采用两种不同的放大倍率。
图28a：结晶深度(来自上表面和下表面)-由SEM评估的支架内区。
图29：圆柱形样品体外前的显微CT评估。
图29a：圆柱形样品体外后的显微CT评估。
图30：圆柱形支架的SEM图像(浸入前)。
图30a：圆柱形支架的SEM图像(浸入后)。
图30b：试样体外评估前后的EDAX。
图31：带状支架的SEM图像(浸入前和浸入后)。
图32：评估支架颗粒功效的动物研究。
图33：股骨术后X射线检查。
图34：解剖样本的X射线检查。
图35：HPE中研究的样本片段。
图36：样本的组织病理学评估(EH染色和冯·科萨染色)。
图37-a-b-c-d：试样的改进四铬染色。
图38：评估带状复合材料功效的动物研究。
图39，39a，39b：第0天和第1天，第9天，第15天对三种动物(A，B，C分别为AgFP，ZnFP，MgFP)进行X射线检查。
图40,40a,40b：所有三种动物的第19天CT扫描(分别为AgFP，ZnFP，MgFP)。
图41：解剖样本的照片(分别为AgFP，ZnFP，MgFP)。
图42：解剖样本的X-射线(分别为AgFP，ZnFP，MgFP)。
图43a,b,c,d：样本的组织病理学评估(EH和Masson三色染色)。
图44a,b,c,d：通过改进的四铬染色进行样本的组织病理学评估。
图45(a)：所设计的3D打印机的控制面板。
图45(b)：压力控制、温度控制的挤出机和温度控制台面。
图45(c)：在打印过程中的打印机和打印的样本。
表图例
表1：在MG63细胞中由各种金属氧化物掺杂的FP玻璃的离子溶解产物产生的细胞外骨钙素分泌。
表2：在MG63细胞中由各种金属氧化物掺杂的FP玻璃的离子溶解产物产生的细胞内骨钙素分泌。
表3：通过改变FP玻璃的比例来制备支架。
表4：MG63细胞系中细胞粘附在支架上的影响(如表4所示)。
表5：通过增加生物活性组分PPF和FP玻璃的百分比，同时减少生物惰性成分PLA和PDLLA来制备支架。
表6：MG63细胞系中细胞粘附在支架上的影响(如表5所示)。
表7：通过改变生物惰性成分PLA和PDLLA的百分比并保持生物活性组分固定(PPF和玻璃粉)来制备支架。
表7a：通过改变生物惰性成分PLA和PDLLA的百分比并保持生物活性组分固定(1,2-二醇和玻璃粉)来制备支架。
表8：MG63细胞系中细胞粘附在支架上的影响(如表7所示)。
表8a：MG63细胞系中细胞粘附在支架上的影响(如表7a所示)。
表9：SaOS2细胞系的MTT根据组分的变化和孔隙的存在而变化。
表10a和10b：复合材料和复合材料中组分的比例。
表11：SaOS 2细胞系中12种类型的支架(不同组分，+/-PPF/XPPF，+/-孔隙)的MTT。
表12：复合材料的ALP活性。
表13：支架的软骨素水平。
表14：支架的生物活性比较图。
表15：体外研究-支架模拟体液(SBF)在21天内的pH变化。
表16：SBF浸渍后压缩成型支架的XRD结果。
表17：SBF浸渍后快速加热支架的XRD结果。
表18：在体外研究中支架结晶的百分比。
具体实施方式
本发明提供一种用于骨移植物的合成复合材料，包括：生物惰性聚合物，其包括聚乳酸、聚D，L-乳酸；生物活性聚合物，其由聚亚丙基富马酸酯或富马酸二酯和丙二醇(1，2-二醇)组成；以及生物活性无机组分，其由金属氟磷酸盐玻璃粉组成，其中所述生物活性组分的量高达复合材料的30％(w/w)。
所述复合材料中的生物活性无机金属氟磷酸盐玻璃粉是氟磷酸锌、氟磷酸镁或氟磷酸银中的一种。
所述复合材料中的聚乳酸在54％(w/w)至68％(w/w)的范围内；聚D,L-乳酸在10％(w/w)至28％(w/w)的范围内；1,2-二醇在3％(w/w)至10％(w/w)的范围内；聚亚丙基富马酸酯在3％(w/w)至10％(w/w)的范围内；复合材料中的氟磷酸无机金属盐玻璃粉在10％(w/w)至30％(w/w)的范围内。
在一个方面，所述复合材料包括聚乳酸、1,2-二醇和氟磷酸锌。
在一个方面，所述复合材料包括聚乳酸、聚D,L-乳酸、1,2-二醇和氟磷酸锌。
在一个方面，所述复合材料包括聚乳酸、聚亚丙基富马酸酯和氟磷酸锌。
在一个方面，所述复合材料包括聚乳酸、聚D,L-乳酸、聚亚丙基富马酸酯和氟磷酸锌。
在一个方面，所述复合材料包括聚乳酸、1,2-二醇和氟磷酸镁。
在一个方面，所述复合材料包括聚乳酸、聚D,L-乳酸、1,2-二醇和氟磷酸镁。
在一个方面，所述复合材料包括聚乳酸、聚亚丙基富马酸酯和氟磷酸镁。
在一个方面，所述复合材料包括聚乳酸、聚D,L-乳酸、聚亚丙基富马酸酯和氟磷酸镁。
在一个方面，所述复合材料包括聚乳酸、1,2-二醇和氟磷酸银。
在一个方面，所述复合材料包括聚乳酸、聚D,L-乳酸、1,2-二醇和氟磷酸银。
在一个方面，所述复合材料包括聚乳酸、聚亚丙基富马酸酯和氟磷酸银。
在一个方面，所述复合材料包括聚乳酸、聚D,L-乳酸、聚亚丙基富马酸酯和氟磷酸银。
所述复合材料为粉末或支架的形式。所述支架在制造时是带状或圆柱体或管状物等。
本发明的合成复合材料通过包括以下步骤的方法进行制备：将复合材料在溶剂中用磁力搅拌器混合或超声处理，得到均匀的混合物；将所述混合物浇注在热玻璃板上，使溶液沸腾；并通过持续沸腾蒸发溶剂；得到复合材料的组分分布均匀的相互连接的多孔支架。
在一个方面，在所述方法中使用的溶剂是二氯甲烷、丙酮或甲苯或氯仿中的一种。
所述支架的孔隙率范围为20％-40％。
此外，所述支架还通过直接墨水打印技术的定制3D打印机制成具有所需的形状和所需的孔隙率。
通过直接墨水打印技术由定制3D打印机获得支架的方法包括以下步骤：复合材料的组分均质化并冷却至10-30℃。腔室温度保持在30-40℃。将墨水装入压力控制的非粘附挤出机中。通过微芯片将输入写入细节传送到打印机。喷嘴直径固定为300μm，便于挤出。体积流量设置为5mm3/s。书写行间的间距为200微米，层数设计为10。将计算机送入的所需形状、厚度、孔隙率、层写在热板(100℃)上。热板在x、y、z方向上的移动也预先设置好，由微芯片传输命令。
在一个方面，氟磷酸盐玻璃的生物学评估通过其MTT，其细胞内和细胞外骨钙素分泌以及与MG63细胞系相关的ALP分泌来确定的。
在一个方面，通过钙黄绿素AM研究和MTT评估对支架中孔隙的重要性进行评价。
在一个实施方式中，具有不同组分组成的不同复合材料的生物潜力已经通过复合材料相对于SaOS2和人内皮细胞系的MTT，它们在增强碱性磷酸酶，硫酸软骨素基质在骨中分泌的效率确定。
此外，采用RT-PCR法评价复合材料在骨钙素、胶原ll、RUN_X2分泌中的能力。采用MicroCT评估对多层支架的孔隙度进行评价。
在一个实施方式中，通过将各种复合材料和各种支架浸入SBF中21天，然后通过XRD、FTIR、SEM和MicroCT进行研究来完成体外研究。
在一个实施方式中，通过兔子的体内评估来评价复合材料的骨形成功效，并通过组织病理学评估进行确认。
在一方面，所述合成复合材料具有以下特点：
a)生物相容性；b)生物活性；c)可生物降解；d)对接受者无毒；e)生物传导性；f)生物诱导性；g)生物可转换性；h)降解速度与生物转化率相匹配；i)可灭菌性；j)易于批量生产；k)可加工成所需的形状；l)成本有效。
实施例：
以下实施例仅用于说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
材料：
聚乳酸(PLA)和聚DL-乳酸(PDLLA)购自日本
Figure GDA0003887099330000081
聚亚丙基富马酸酯(PPF)和富马酸二酯和丙二醇(1，2-二醇)购自印度S.P.G.C.纳加尔，K.Vellakulam-625701，卡马拉吉工程技术学院(Kamaraj College of Engineering and Technology)聚合物技术系。
这些聚合物是在卡马拉吉工程技术学院的聚合物技术系合成的。该方法涉及在反应容器中以1.0∶3.0∶0.01∶0.002的比例加入富马酸二乙酯，1，2-丙二醇，氯化锌(催化剂)和对苯二酚(交联抑制剂)。反应容器装有双壁冷凝器，接收烧瓶与其连接以进行副产品收集。将体系保持在100℃的油浴中，并进行有效的磁力搅拌，随后施加真空(-80mmHg)。持续搅拌将温度升至150℃，发生酯化缩合反应。因此，形成中间体双(羟丙基)富马酸二酯，蒸馏出乙醇作为主要副产物。在收集预期量的乙醇后，进行酯交换反应，去除过量的作为第二副产物的1,2-丙二醇。现将合成的材料溶解在丙酮中。该溶液用冰冷的蒸馏水反复洗涤，以除去未反应的反应物和催化剂。向聚酯的丙酮溶液中加入足够量的无水硫酸钠，以使丙酮溶液干燥。过滤后，溶剂在50℃的热风烘箱中缓慢蒸发，得到PPF。
将富马酸(1.0mol)和1,2-丙二醇(2.2mol)装入圆底烧瓶中，使用对甲苯磺酸作为酯化催化剂。将干燥的甲苯加入到反应混合物中以除去酯化过程中形成的作为共沸物的水。使用Dean Stark装置用于上述目的。将反应容器浸没在油浴中，使用磁力搅拌器均匀且连续地混合。温度最初设定为100℃，并在一小时内以10℃的增量逐渐升高至140℃。当温度达到110℃(甲苯的沸点)时，开始在Dean Stark装置中收集水。使反应继续进行直到收集到规定量的水。通过施加真空以除去过量的未反应的1,2-丙二醇和水来纯化该材料。
本发明的FP玻璃组分购自马杜赖(Madurai)的骨替代公司(Bone Substitutes)。制备方法如印度专利申请5760/CHE/2013、5990/CHE/2013、5989/CHE/2013中所述，并在此引用作为制备FP玻璃的参考文献。该方法简要概述如下。取测量量的所需化学品(Na2CO3、CaCO3、CaF2、P2O5和ZnO/Ag2O/MgO)，放入球磨机中并均质化。将混合物在氧化铝坩埚中加热1小时至120℃并冷却至室温。再次球磨1小时。将组分放入铂坩埚中并保持在预热至1100℃的炉中，放置90分钟。然后将坩埚沉入装有液氮的碗中。将成型的玻璃打碎，研磨48h，得到特定氟磷酸盐玻璃的纳米粉体。FP玻璃材料在印度马杜赖的骨替代公司制备。
MG-63(
Figure GDA0003887099330000091
CRL-1427TM)购自印度普纳国家细胞科学中心(NCCS)。
Saos-2(
Figure GDA0003887099330000092
HTB-85TM)购自印度普纳国家细胞科学中心(NCCS)。
实施例1：选择无毒无机氟磷酸金属盐玻璃粉
a)MTT增殖试验
将MG-63细胞在24孔板中培养，金属掺杂的生物玻璃(氟磷酸盐(FP)、氟磷酸镁(MgFP)、氟磷酸锌(ZnFP)、氟磷酸钛(TiFP)、氟磷酸锆(ZrFP)、氟磷酸银(AgFP)和氟磷酸锶(SrFP))的离子溶解产物在接种0小时时与细胞共同处理并监测至48小时以研究细胞形态，然后用1XPBS洗涤细胞两次，然后用0.2mg/mL的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑鎓)培养2小时。然后将形成的紫色产物用异丙醇溶解，并使用ELISA读数仪(Robonik，印度)在570nm处测量光密度(图1)。图1显示所有掺杂金属氧化物的氟磷酸盐玻璃均无毒，并且在培养48小时后存活率超过80％(高达10微克/毫升)。
碱性磷酸酶(ALP)是从间充质细胞到矿化前沿的骨形成过程中必不可少的酶。因此，增强其分泌被认为是选择骨组织工程(BTE)复合材料成分的重要因素。ALP分泌的研究结果表明，AgFP、ZrFP和MgFP在0.1-100μg/mL的所有浓度下均显示出持续升高的水平。ZnFP仅在0.01和1μg/mL的较低浓度下显示出分泌增加(图1)。
b)热评估：
使用同步热分析(STA 449F3Nevio)来获得生物玻璃的热稳定性。将3.5mg氟磷酸金属盐(各自)在氮气气氛中以50K min-1加热至1000℃。(图2a-2g)。
对所有七种FP玻璃的热评估表明，它们的Tg(玻璃化转变温度)在500-550℃之间，Tc(结晶温度)在700℃左右，表明大约150℃的大窗口宽度，这可用于构建支架时的烧结(图2a-2g)。
c)ELISA法测定骨钙素(细胞内和细胞外)：
对将100μg、10μg和1μg浓度的每种氟磷酸盐生物玻璃样品的离子溶解产物添加到培养物中(细胞外以及细胞内)产生响应而由MG-63分泌的骨钙素以及响应通过ELISA进行分析。
将MG-63细胞接种到24孔板中(2X105细胞/孔)。粘附过夜之后，去除培养基并用Dulbecco的PBS进行洗涤。将各种浓度的各种氟磷酸盐生物玻璃样品的离子溶解产物添加到孔中(不含酚红、血清和抗生素的培养基)。将测定板在37℃置于含5％CO2的CO2培养箱中72小时。培养后，取上清液用于分析细胞外环境中骨钙素表达。
为了评估骨钙素的细胞内表达，使用细胞消化酶(Accutase)(Gibco)从孔中分离并收集细胞。将200μL细胞裂解液(Sigma)添加到每个孔中并培养10分钟。将裂解的细胞成分离心并取上清液用于细胞内评估。从每个样品中取出100μL，通过ELISA方法进行评估。根据制造商(DIA来源hOST-EASIA试剂盒，比利时)提供的说明书进行实验。在450nm处读取吸光度。通过绘制标准曲线计算骨钙素的表达，数值以ng/mL表示(表1和2)。
表1：在MG63细胞中由各种金属氧化物掺杂的FP玻璃的离子溶解产物产生的细胞外骨钙素分泌。
Figure GDA0003887099330000111
表2显示骨钙素的细胞外表达，以ng/mL计
Figure GDA0003887099330000112
骨是由多种胶原蛋白增强并由羟基磷灰石矿化的基础物质的复合物。尽管各种胶原蛋白存在于身体的各个部位，但骨钙素仅存在于骨骼中。它也是骨诱导的优良基因标志物。评估了各种浓度的各种FP玻璃的离子溶解产物促进骨钙素分泌的效率的能力。虽然骨钙素的细胞外表达与仅使用ZnFP和MgFP的对照相比有所增加，(表1)但大多数玻璃中的细胞内骨钙素升高，ZnFP、MgFP和AgFP玻璃中存在显著增加，并且当溶解产物的浓度为10μg/mL时增加更多(表2)。
基于上述研究和氟磷酸盐玻璃的特性，选择AgFP、ZnFP、MgFP来制备复合材料和将复合材料加工成所需的结构和形状。
实施例2：
a)生物聚合物的选择和表征
对生物惰性聚合物和生物活性聚合物的特性进行表征。PPF和1,2-二醇在印度S.P.G.C.纳加尔，K.Vellakulam-625 701，卡马拉伊工程技术学院聚合物技术系合成。医用级PLA和PDLLA购自日本
Figure GDA0003887099330000121
进行结构表征(FTIR-8400S分光光度计，日本岛津)和热评估(TA仪器DSC Q20)(图3-8)。
b)FP玻璃有效百分比的评估
通过改变复合材料中玻璃粉末的比例(0、20、33.3、50、66和75％)来评估FP玻璃的最佳百分比(图10和11)。人工检查所制备材料的强度和延展性。同样，与之前的研究一样，对复合材料中的细胞附着进行评估，以选择玻璃粉末的正确百分比(10、12.5、15和17.5％)(表3和表4)。
表3
Figure GDA0003887099330000122
表4
Figure GDA0003887099330000123
c)增加生物聚合物组成的效果
在四种生物聚合物中，PLA和PDLLA是生物惰性的，PPF和1,2-二醇以及FP玻璃是生物活性的。在最小比例减少生物惰性PLA的情况下，生物活性组分的贡献增加。PLA份额从63.69％逐步减少到53.89％。其被增加的FP玻璃代替，制成5种支架。按照前面提到的方案，将它们与MG63细胞系一起培养21天，并将粘附细胞和死细胞的数量制成表格。(表5和6)
表5
Figure GDA0003887099330000131
表6
Figure GDA0003887099330000132
Figure GDA0003887099330000141
观察到具有75％玻璃的复合材料具有韧性并在弯曲时断裂。玻璃含量较低的复合材料不破裂并且具有弹性(图10,11)。当聚合物基团中PPF/1,2-二醇的百分比很小(3％)时，复合材料不破裂，这不仅表明PPF/1,2-二醇的生物活性，还表明它具有改变复合材料物理性质的能力。
d)改变具有固定的PPF/1,2-二醇和FP玻璃的PLA和PDLLA的百分比的效果
在如下条件下制作支架：保持生物活性组分PPF/1,2-二醇和FP玻璃的比例不变并改变生物惰性组分的比例，增加PLA的同时降低PDLLA的百分比，细胞粘附研究以及活细胞和死细胞的数量按照之前所述的研究进行评估并制成表格(表7、7a和8、8a)。
表7
Figure GDA0003887099330000142
表7a
Figure GDA0003887099330000143
Figure GDA0003887099330000151
表8
Figure GDA0003887099330000152
表8a
Figure GDA0003887099330000153
对支架和下方玻璃板的细胞粘附通过1)改变FP玻璃的比例制备支架；2)增加生物活性组分PPF/1,2-二醇和FP玻璃的百分比同时减少生物惰性组分制备支架；3)改变生物惰性组分PLA和PDLLA的百分比并保持生物活性组分固定来制备支架，示于表3、5、7、8。
当生物活性组分(PPF/1,2-二醇+FP玻璃)在10-30％范围内且相对生物惰性组分(PLA+PDLLA)在54-67％范围内时，可获得最佳结果(表4、6、7a和8a)。
e)改变组分的生物效应
为了评估如何将成骨细胞样细胞系MG-63粘附到由各种聚合物的组合组成的支架上，制备1)PLA、2)PLA与PDLLA、3)PLA、PDLLA与PPF、4)PLA、PDLLA、PPF与FP玻璃的支架，用软木钻切成12mm的圆形，进行UV灭菌，用PBS洗涤并浸入无血清MEM中1小时。然后将支架转移到24孔板中，并将MG-63细胞(5X 104)接种到支架上。在37℃下将板在含5％CO2的CO2培养箱中培养1、7、14和21天。在整个实验过程中使用补充有10％胎牛血清(FBS)、50U/mL青霉素、50mg/mL链霉素和1％L-谷氨酰胺(Gibco)的最低必需培养基(MEM)。为避免养分耗尽，对于培养7、14和21天的孔，每两天更换一次培养基。培养后，使用带有相机附加软件(图形化高级分析(Magnus Analytics Mag Vision)软件；版本–x 64,3.7.6820)的相差显微镜(日本奥林巴斯)观察并记录具有支架的孔，获得最大数量的附着细胞。(图12)。
在MG63细胞系中进行的评估关注PPF和FP玻璃的生物活性。通过添加少量PPF，显然使几乎为零或可忽略不计的细胞粘附变得可能，并且通过添加FP玻璃使该可能性显著增加。该效果如图12所示。
实施例3：孔隙率评估
a)与有孔/无孔、+/-PPF/XPPF、+/-FP玻璃相关的膜完整性(钙黄绿素AM)测试
制作十二个不同的支架来评估孔隙率的重要性。通过双重染色评估细胞的膜完整性和细胞形态。用测试材料(直径12mm的支架)将1*105SaOS2细胞在37℃和5％CO2下培养24小时。吸出细胞上清培养基。支架用冰冷的PBS溶液轻轻洗涤，最后加入2μm钙黄绿素AM，37℃培养10分钟。显微镜下观察细胞。(图13)。
评估细胞壁完整性的钙黄绿素AM研究和评估细胞毒性的双重染色显示出有趣的特征。对照组细胞不仅呈亮绿色，而且呈均一的纺锤形，表明细胞壁的完整性和代谢潜力。在基础组分PLA+PDLLA中添加PPF增加了细胞壁的完整性，并且在其中添加孔增加了纺锤形细胞的数量。
在基础成分PLA+PDLLA中添加FP玻璃，无论是有孔的还是无孔的情况，都显著增加了细胞数量，但它们的质量较差，表现为圆形而不是健康细胞的纺锤形。
当添加所有组分PLA+PDLLA+PPF和FP玻璃时，荧光强度和细胞质量也都增加，当在复合材料中添加孔时更是如此。
XPPF(自聚合PPF)取代复合材料中的PPF时，只会对荧光和细胞质量产生有害影响(图13)。
b)与多孔/无孔玻璃、+/-PPF/XPPF、+/-FP玻璃相关的MTT试验
MTT试验用于评估活细胞的线粒体活性。将细胞接种在12孔板中，该12孔板在100μL完全培养基/孔中以1x105个细胞/孔的密度包含测试材料，在37℃培养24小时。培养后，吸出细胞培养基，每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，培养4h。之后，将得到的甲臜晶体溶解在100μL/孔的DMSO中，并通过珀金埃尔默微孔板读板仪(Perkin Elmer microplate reader)在550nm处测量吸光度进行定量。数据表示为对照(未处理的细胞)的百分比。(表9)。
表9
Figure GDA0003887099330000171
从上述研究可以推断，毒性最小的复合材料是PLA+PDLLA+PPF+FP玻璃(有孔的)(表9)。
实施例4：复合材料的制备和支架制造
按照四种不同的方法制备多孔支架。(盐浸、气体发泡、凝胶压制和沉淀-冷冻干燥)(图14)。
盐浸：
取计算量的PLA、PDLLA、PPF/二醇和AgFP/ZnFP/MgFP并与二氯甲烷混合。致孔剂(蔗糖-C12H22O11)在300和100μ目筛网中过筛，并以30％V/V基准添加。使用磁力搅拌器以300rpm将致孔剂与混合物混合。将该浆料倒入特氟龙薄膜涂层的培养皿中，并放置在温暖的室中24小时。干燥后，薄膜在70℃压缩10分钟。通过超声处理，使用双蒸水将致孔剂浸出。制备的支架在层流空气罩中干燥。
气体发泡
取计算量的PLA、PDLLA、PPF/二醇和AgFP/ZnFP/MgFP并与二氯甲烷混合。致孔剂(碳酸氢铵-NH4HCO3)在300和100μ目筛网中过筛，并以30％V/V基准添加。使用磁力搅拌器以300rpm将致孔剂与混合物混合。将该浆料倒入特氟龙薄膜涂层的培养皿中，并放置在温暖的室中24小时。干燥后，将薄膜浸入热水中，发生二氧化碳排放，进而产生孔。一旦所有气泡沉淀下来，将支架置于冰冷的乙醇中2分钟。将制造的支架在层流空气罩下干燥24小时。
凝胶压制
取计算量的PLA、PDLLA、PPF/二醇和AgFP/ZnFP/MgFP并与二氯甲烷混合。致孔剂(蔗糖-C12H22O11)在300和100μ目筛网中过筛，并以30％V/V基准添加。使用磁力搅拌器以300rpm将致孔剂与混合物混合。将该浆料倒入特氟龙薄膜涂层的培养皿中，并放置在温暖的室中24小时。在溶剂完全蒸发后，用二氯甲烷粘贴两层薄膜，并在70℃下压缩10分钟。通过超声处理，使用双蒸水将致孔剂浸出。制备的支架在层流空气罩中干燥。
沉淀-冷冻干燥
取计算量的PLA、PDLLA、PPF/二醇和AgFP/ZnFP/MgFP并与二氯甲烷混合。在有效搅拌下将溶液缓慢倒入冰冷的乙醇(非溶剂)中。获得原纤维状沉淀物并用双蒸水洗涤。将沉淀物装入圆柱形管中。将得到的沉淀以3000rpm离心15分钟，在冰箱中保存12h。将支架冷冻干燥8h。
快速加热下的凝胶泡沫铸造
取所需量的PLA、PDLLA、PPF/二醇和AgFP/ZnFP/MgFP，并在磁力搅拌器下以300rpm与二氯甲烷混合。一旦混合物均质化，将复合材料缓慢倒在热玻璃板上(70℃)。溶液开始沸腾并放出二氯甲烷。随着溶剂蒸发，产生随机孔。尽管四种组分的密度不同，但持续不断的沸腾使复合材料保持均匀。完全蒸发后，获得具有组分均匀分布的高度互连的多孔支架。(图14a、14b)。如此制成的支架可以制成(marsealised)粉末，或切成条状，或卷成圆柱体。用不同的溶剂丙酮、甲苯和氯仿重复相同的过程，得到相同的结果。
均化组分的基本问题是所选的所有三种聚合物均仅溶于有机溶剂，而基本的生物活性无机组分具有高度亲水性且仅溶于水。均化组分面临的另一个问题是它们的总差异密度。除均匀性外，另一个先决条件是孔隙和互连孔隙的基本需求，以实现更好的生物活性。盐浸、气体浸出、凝胶压制、沉淀和冷冻干燥等常规方法均未能达到所需的均匀性和孔隙率。高密度FP玻璃粉末沉降在复合材料的基层中(图14)。同样在所有这些程序结束时，设计为大约200微米的孔由于压缩而被挤压到大约10微米(图14a)。但当凝胶泡沫浇注和快速加热两种方法结合使用时，持续沸腾提供了所需的均匀性，溶剂的蒸发提供了所需的孔隙(图14b)。
根据上述快速加热下的凝胶泡沫浇注制备以下复合材料并进行评估。
表10a
Figure GDA0003887099330000191
Figure GDA0003887099330000201
表10b
Figure GDA0003887099330000202
实施例5：制造的复合材料用作支架的细胞毒性评估：
MTT试验：
通过Saos-2细胞系(ATCC-85)评估制造的支架的无毒性质。在补充有10％胎牛血清、200mM L-谷氨酰胺、10mM抗坏血酸、β-磷酸盐、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的对照培养基中培养5x106个第25代SaOS2细胞。将细胞培养24-48小时以达到融合。使用1X PBS洗涤融合的SaOS2细胞两次。将尺寸为2X2 cm2的支架置于6孔板中并培养48h。在倒置显微镜下观察细胞形态。小心移除支架，加入MTT并培养4小时。用DMS溶解得到的甲臜晶体。OD值用微孔板读板仪在405nm处测量，并将读数制成表格。(表11)。
表11
Figure GDA0003887099330000211
对人内皮细胞系进行相同的程序，并记录细胞形态变化的结果(图15和15a)。
通过人内皮细胞系和SaOS2细胞系的细胞毒性评估来评价复合材料的细胞毒性。对于HE细胞系，除了两种复合材料(PLA+PPF+AgFP和PLA+PPF+ZnFP)外，所有其他复合材料的存活率均超过80％(图15、15a)。SaOS2细胞系除两种复合材料(PLA+PDLLA+PPF+ZnFP和PLA+PPF+MgFP)外，其余10种细胞系的存活率均高于80％。(表11)。
实施例6：制造的复合材料用作支架的生物学评估：
1)支架的碱性磷酸酶(ALP)活性
将1*106个MG63细胞接种在培养板中，并在37℃下在5％CO2培养箱中培养48小时。一旦细胞融合，在每个孔中用2cm*2cm的各支架样品处理并进行培养。培养48小时后，细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并在50μL测定缓冲液中均质化。将不溶性物质以13,000rpm离心3分钟。将具有不同浓度渗出液的测试样品加入96孔板中，然后每孔加入10μL的ALP。然后，将50μL的5mM pNPP溶液添加到含有测试样品的各孔中。将反应混合物在黑暗条件下于25℃培养60分钟。添加20μL终止溶液以终止样品中的ALP活性。OD值用微孔板读板仪在405nm处测量，所得结果列于表中。(表12)。
表12
Figure GDA0003887099330000221
对所制造的复合材料增强SaOS2细胞系中碱性磷酸酶(ALP)分泌的能力进行评估。ALP是参与骨组织形成的大多数阶段的重要因素。所得值显示只有1,2-二醇和AgFP/ZnFP两种复合材料的分泌量高于对照组，而含PPF的复合材料与对照组的分泌量相差无几。对于含MgFP的复合材料，其4种类型均表现出低于对照的活性(表12)。
2)通过RT PCR对所制作的复合材料作为支架的骨钙素、胶原蛋白II、Run X2分泌 进行评估
该研究在SaOS2细胞系中进行。根据制造商的方案，使用TRIzolTM试剂从成骨细胞中分离总RNA。使用NanoDrop分光光度计在260/280nm处测定RNA浓度。对于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，按照提供的说明书通过SuperScriptTM第一链合成系统(赛默科学(ThermoScientific))合成cDNA。合成的cDNA保存在20℃以备后用。使用SYBR绿色方法通过RT-PCR测量胶原II(图16和18)、OCN(图17和18)和Runx2(图19)基因的同时基因表达水平。
温度和时间循环程序
Figure GDA0003887099330000231
实时PCR反应混合物(50μL)制备方案如下：25μL SYBR绿色混合物(Green Mix)(2x)、0.5μL肝脏cDNA、2μL引物对混合物(各引物5pmol/μL)和22.5μL水。
用于PCR的引物如下：
II型胶原蛋白
正向引物：CATGAGGGCGCGGTAGAGA
逆向引物：ATCCCCTCTGGGTCCTTGTT
产物长度：296
骨钙素
正向引物：TCACACTCCTCGCCCTATTG
逆向引物：CTCTTCACTACCTCGCTGCC
产物长度：132
Runx2序列(5'->3')模板链长度起始终止Tm GC％自互补性自3'互补性
正向引物：CCACCGAGACCAACAGAGTC Plus(+)
逆向引物：GTCACTGTGCTGAAGAGGCT
产物长度：119。
使用ABI
Figure GDA0003887099330000241
7000序列检测系统软件对结果进行分析，该软件能够更灵敏和准确地估计相对基因表达。结果制成表格。(表13)。
表13
Figure GDA0003887099330000242
从间充质干细胞阶段到骨细胞成熟阶段，骨合成中的三个必需基因标志物是骨钙素、胶原II和RUN-X2。将结果绘制成图表以检查与对照相比的倍数变化时，PLA+PDLLA+PPF+AgFP的胶原蛋白II的倍数增加最高，而含AgFP但与1,2-二醇而非PPF一起构成时，骨钙素的倍数增加也最高。与对照相比RUN_X2的最高倍数变化是在ZnFP与PLA+PDLLA+PPF组合时。所有基于Mg的复合材料对于所有三种类型的基因标记物都表现不佳。(表13，图16-19)
c)支架的硫酸软骨素试验：
SaOS2细胞系用各种复合材料培养48小时。将细胞在冷PBS中洗涤3次并再次悬浮在PBS(1x)中，在≤-20℃下冷冻细胞并解冻。重复冷冻/解冻循环3次。在2-8℃下以1,500xg离心10分钟，去除细胞碎片。使用竞争性ELISA方法(Robonik，印度)测量硫酸软骨素。图20(表14)。
表14
Figure GDA0003887099330000251
结果表明，与对照相比，所有十二种复合材料的CS分泌量都增加了许多倍，无论组分是否含有1,2-二醇或PPF，以及FPglass是Ag、Zn或Mg。(表14)。
实施例7：支架的体外评估：
1)按照标准kokubo方案，制备模拟体液(SBF)。将所有所制作的支架切成2*2cm2大小。将支架置于20mLSBF填充的玻璃容器中，在5％CO2培养箱(贺利氏(Heraus)-德国)中放置21天。每天使用pH计E1模型记录pH变化。21天后，支架被小心移除；在层流气流中干燥48小时。将所有样品在21天内pH值的变化绘制成图表。(表15)
表15
Figure GDA0003887099330000262
所有压塑样本的pH值变化在头2天均显示下降，这是由于磷酸的形成导致的。由于碱土金属(Na+和/或Ca2+)的释放，所有样本在第三天反弹至7。因此，离子的溶解使得阳离子(Na+和/或Ca2+)代替H+离子，导致氢氧根离子浓度增加。即使在头两天，样本均未低于6.5。之后，显示出在7和6.7之间的稳定变化。
在快速加热下通过凝胶泡沫浇注制成的支架、单层带状支架和多层圆柱体支架在前两天甚至表现出更好的pH值，并且从未低于6.8，并且最终阶段的pH值也高于压缩成型的支架。用快速加热法制成的支架带达到的最高pH为7.15。这种变化显示通过快速加热方法获得的更好的均匀性和孔隙率，避免了可能导致失败的高酸性环境(表15)。
2)XRD
对浸入前后的样本(浸入前后是指将支架浸入SBF之前和浸入SBF之后并干燥)进行XRD评估。使用PANalyticalX’PertPRO粉末X射线衍射仪获得X射线衍射图。采用Scherrer方程半定量计算沉积材料晶体尺寸。
D＝kλ/βcosθ
其中：
D是有序(结晶)域的平均尺寸，可以小于或等于晶粒尺寸，可以小于或等于粒径；(nm)
k是一个无量纲的形状因子，其值接近于一。形状因子的典型值约为0.9，但随微晶的实际形状而变化；
λ是X射线波长；λ＝0.15406nm
β是在减去仪器线展宽后，在最大强度的一半处的线展宽(FWHM)，以弧度计。
θ是布拉格角。(表16)
表16
Figure GDA0003887099330000261
Figure GDA0003887099330000271
对结合快速加热和凝胶泡沫浇注制备的三个样本的XRD进行了浸入前和浸入后状态的评估。(表17)。
表17
Figure GDA0003887099330000272
在XRD评价中，沉积材料的晶体尺寸(D)通过Schrrer方程对浸入前和浸入后的状态进行计算。在浸入前的值中，PLA+PDLLA+PPF+AgFP的晶体尺寸表现出最高值。这归因于复合材料的高亲水性以及在支架等待和评估期间它与大气湿度发生的反应(表16)。在快速加热方法下由凝胶泡沫浇注制成的支架中观察到相同的效果，并且用同样的AgFP复合材料观察到晶体的最大尺寸(表17)。
3)FITR分析：
将少量浸入前后的样本(浸入前后是指支架浸入SBF之前和浸入SBF之后并干燥)分别与溴化钾一起研磨并制成团粒。使用该团粒进行分析。使用日本岛津公司的傅里叶变换红外-8400S分光光度计在500-4000cm-1的光谱范围内进行分析。(图21-26)。
在FTIR评估中通过各自光谱范围看到的复合材料的主要官能团是醇(3200-3500cm-1)、烷烃(2850-3000cm-1)、饱和酮(1735-1750cm-1)、烯烃(1630-1680cm-1)、不对称的甲基弯曲(1450-1470cm-1)、甲基弯曲(1350-1395cm-1)。P-O弯曲(560-500cm-1)带的存在表明磷酸钙(CaO-P2O5)层的形成。碳酸盐基团(CO3)2-(1400-1550cm-1)带显示HA层的结晶性质。在3500cm-1以上观察到条带，对应于OH基团。在SBF中浸泡21天后，(CO3)2-、P-O-P拉伸和P-O弯曲基团的强强度和频移揭示了复合材料和HAp沉淀的相互作用。(图21-26,21a-26a)。
1450-1410cm-1处的肩峰加上870-875cm-1处的较弱峰对应于B型碳酸盐振动，而A型碳酸盐的振动区域为1450-1410cm-1加上880cm-1处的带。A型和B型碳酸盐在这些支架中无法区分，因为酯峰也位于同一区域。A型和B型碳酸盐都存在于这些支架中，并且在三种选定的压缩成型支架复合材料(PLA+PDLLA+PPF+ZnFP、PLA+PDLLA+PPF+AgFP、PLA+PDLLA+PPF+MgFP)中其强度最大。对于相同的复合材料，在快速加热组合凝胶泡沫浇注的情况中HAp的对应峰高于压缩成型支架的情况。
尽管在所有制造的支架中都观察到HAp沉淀，但在快速加热下的凝胶泡沫浇注的情况中，碳酸化基团(CO3)2-和磷酸盐基团(P-O-P不对称和对称拉伸，P-O弯曲)的强度明显高于那些通过压缩成型制成的相应复合材料。(图21a-26a)
4)SEM_EDAX
使用扫描电子显微镜-SEM(Ultra 55型；Zeiss，奥伯科亨，德国)与金溅射后的能量色散X射线光谱仪(ModelOxford Xmax50 EDS，牛津仪器公司，英国)联用，对压缩成型制备并糖浸法制孔的样品浸入前和浸入后的形态分析和半定量元素浓度进行检测。(图28)
将样本切成两半以暴露支架的内部。暴露的内表面用金溅射并使用相同的扫描电子显微镜进行分析。(图28a)
计算相对于样品实际宽度的结晶宽度，以百分比表示，并制成表格以评估用于生物转化的支架。(表18)。
表18
样品编码 ％结晶度
PLA+PPF+ZnFP 87.31
PLA+PDLLA+PPF+ZnFP 76.19
PLA+PPF+AgFP 49.36
PLA+PDLLA+PPF+AgFP 72.7
PLA+二醇+ZnFP 59.54
PLA+PDLLA+二醇+ZnFP 78.89
PLA+二醇+AgFP 86.88
PLA+PDLLA+二醇+AgFP 97.42
PLA+PPF+MgFP 94.62
PLA+PDLLA+PPF+MgFP 82.09
PLA+二醇+MgFP 73.33
PLA+PDLLA+二醇+MgFP 78.68
PLA+PDLLA+PPF+ZnFP(RH) 73.62
PLA+PDLLA+PPF+AgFP(RH) 81.42
PLA+PDLLA+PPF+MgFP(RH) 87.34
复合材料的单层在快速加热下通过凝胶泡沫浇注制成。用该复合材料制成内芯直径为5mm的圆柱体。在溅射金后，对快速加热凝胶发泡制备的单层样本和多层圆柱体进行SEM评价。(Ultra 55型；Zeiss，奥伯科亨，德国)(图30)
将类似标本进行体外评价，在同一台扫描电子显微镜中以相同方式分析，以评估体外研究后表面孔隙的程度和结晶度的变化(图30a)。带状复合材料和圆柱形复合材料的临床照片，都是在快速加热下通过凝聚泡沫浇注制成，显示SBF浸泡21天后形状保持不变，但颜色和质地完全变化，表明晶体转化(图27)。图28显示在体外评估之前和之后的两种不同放大倍数的压缩成型支架的SEM，其显示在体外评估之前中结晶量非常少，并且很好地展示了均匀的孔。在SBF中浸泡21天后，可以清楚地看到晶体转化，并且所有孔都几乎完全被形成的晶体堵塞。
将SEM研究后的样本分成两半，并通过SEM评估内部的厚度结晶百分比(图28a)。百分比没有显著变化，可以推断，一旦孔隙允许SBF渗透到内部，所有复合材料的转化率都接近相等，除了当PDLLA不存在时对晶体转化程度有一定影响(表18)。
体外状态之前在快速加热下通过凝胶泡沫浇注制成的带状支架的SEM研究显示结晶斑，表明支架的高亲水性(图31)，同一样本的浸入后评估显示完全转化为结晶度，证明支架的高生物可吸收性(图31a)。
快速加热制成的圆柱形支架的低倍率SEM评估显示充足的孔。这证明通过所采用的简单方法对聚合物进行均质化(图30)。体外前和体外后SEM清楚地显示已发生完全结晶(图30a)。体外前后SEM的EDX评估证名支架中高水平的碳酸化羟基磷灰石形成(图30b)。
5)显微CT评估
采用GE SRμCT分析仪在各种体素时评估单层带状支架和多层圆柱体支架的表面和内部结构，并进行3D重建。在所有三个平面(轴向、冠状和矢状)评估孔隙率。这揭示了孔隙度和孔间连接的程度。(图29)。
对样品进行体外评估(在37℃、5％CO2环境下浸入SBF中21天)，并通过照片记录变化(图27)。浸入后Micro-CT评估显示完全结晶。(图29a)
快速加热下凝胶泡沫浇注制成的圆柱形支架的MICRO-CT评估证明以下因素：a)支架没有分层，是连续的；b)有足够的孔隙率，孔径是变化的；c)孔通过间孔均很好地连接(图29)。在体外评估后，同一样本具有完全转化为结晶的性质，并保留较深的孔隙(图29a)。
实施例8：复合材料颗粒的体内评价
体内研究是在伦理委员会批准下进行的(伦理委员会批准号ABS/IAEC/18-10-2019/003-)。
从印度钦奈的国王研究院(King Institute)购买单一品种的穴兔(Orictologuscuniculus)，并在两周内进行驯化。保持昼夜节律，并喂养营养丰富的食物。两周内体重增加150克(1800-1950g)，证实有适应性。将支架粉碎制备复合材料(PLA+PDLLA+PPF+AGFP)颗粒，并用环氧乙烷气体灭菌。
在手术前30分钟，给动物预先服用二氯酰糖浆(2.5ml)。肌肉注射氯胺酮麻醉，剂量为每公斤体重45毫克，等待10分钟，以获得完全的解离麻醉效果。麻醉效果通过面罩吸入氧气和七普林(sevoprim)来维持。
用10％聚维酮碘和乙醇反复涂抹左大腿。将2％的利多卡因与肾上腺素一起注射到切口线，作为额外的镇痛剂和止血剂。将前外侧的皮肤切口向下滚动以暴露股四头肌的后缘。采用锐性分离，将肌肉切开并通过细骨刺扩大以暴露大腿骨的前外侧。使用1毫米的电动牙科钻头制作2厘米长的槽。使髓腔暴露出来。用无菌复合材料粉末装填。用开放的盐水洗涤以洗去溢出的复合材料。一旦去除尖刺，肌肉就会落回到完全覆盖骨槽的位置。使用两个3-0的维可利(vicryl)针缝合肌肉。远离工作骨的皮肤切口用3-0爱惜良(ethilon)封闭。肌内给予单剂量的头孢曲沙酮250mg(图32)。发现股骨骨折，两端分开(图34)。没有进行股骨的固定或任何形式的固定。兔子没有跛行，而且吃得很好。在术后第9天，骨折端仅出现闪烁现象，没有任何骨痂的迹象。再过一周(第16天)后，临床检查时肢体结合良好。拍摄的X光片显示，不仅骨折端有大量骨痂，而且沿着形成槽的股骨甚至下方都有大量骨痂(图33)。
动物被安乐死，切除四肢，剥落皮肤和肌肉，发现大量的骨痂非常牢固地与骨折结合。对解剖的标本进行X光检查，并将标本保存在10％福尔马林中。(图34)
制备样本并将脱钙样本轴向切开以展示有形成的介入组织的股骨的两个节段。使用常规的伊红-苏木精染色和von kossa染色对样本进行染色。(图36)。
所采用的程序已连续显示在照片中(图32)。虽然肢体骨折，但没有得到任何特殊的治疗。到了第9天，仍然很难恢复，但到了第16天，它已经完全长好了(图33)。解剖后样本的X光片显示骨痂几乎延伸到整个股骨(图34)。HPE特别关注填充有颗粒的断裂端之间的组织(图35)。重要的观察结果是a)几乎所有的颗粒都被吸收，除了偶尔的痕迹；b)末端之间形成了丰富的软骨，表明软骨骨化；c)在骨折端之间形成的编织骨证明了融合发生的速度；d)不存在多核巨细胞表明复合材料的生物相容性；e)在两种染色中观察到相似的特征(图36)。改进的四铬染色比上述两种染色提供更多的信息。可以明显看到a)随着吸收复合材料颗粒连续形成的新层状骨；b)软骨骨化形成的编织骨的声音结合；c)成骨细胞的丰度和类骨质；d)成纤维细胞中旺盛的新生血管形成(图37-a-b-c-d)。
实施例9：复合材料条带的体内评价
体内研究是在伦理委员会批准下进行的(伦理委员会批准号ABS/IAEC/18-10-2019/003-).
以与前面解释的相同方式采购并驯化三只雄性兔子。采用凝胶泡沫浇注，在快速加热下用PLA+PDLLA+PPF制备AgFP/ZnFP/MgFP复合材料。它们厚度为1mm，切割成2*20mm的尺寸。切割的样本通过环氧乙烷气体灭菌进行灭菌。
如先前研究中所述，将动物麻醉、准备肢体并暴露股骨。用与股骨成45°角的701号锥形牙钻得到窄切口，使其非常薄。用3-0维可利在股骨周围穿线，两端保持自由。将两层2*20mm的灭菌复合材料保留在切口上，使骨髓血液堵住样本。将维可利绑在样本周围，这样样本就不会滑落或移开，并且伤口会分层闭合(图38)。对每只动物的所有三个样本都进行该程序。
动物在术后期间用营养食品进行护理。第一天的X光片在任一视图中都没有显示样本，因为样本对X光片是半透明的。在第1、9和16天在镇静下进行X射线评估(图39a、39b、39c)。早在第15天就发生了临床愈合。第19天进行CT评估。(图40,40a,40b)根据方案对动物实施安乐死，并收获肢体，剥去皮肤和肌肉以及将骨骼保存在10％福尔马林中(图41)。对样本进行X射线检查(图42,42a)，然后在EH染色和伊红染色下进行组织病理学评估(图43,a,b,c,d.)。
图38中的系列照片显示了使用的程序，其中两层1毫米厚的带状物放置在股骨干中非常狭窄的皮质切开伤口上，并通过单个3-0维可利环结保持在适当位置。图39a、b、c显示没有放置复合材料片或进行皮质切开术的证据，因为复合材料不是不透射线的，而且沟很窄。但是第9天拍的X光片显示三只动物的股骨都骨折。没有对骨折进行固定或干预等特殊处理。早在第15天就发生了临床愈合，并通过在16日的X光片和在第19天的CT扫描确认(图40a、b、c)。在动物安乐死后收获的肢体显示复合材料条带粘附在下面的骨头上(图41)。样本X光片显示沿骨折处有大量骨痂(图42)，X光片中看不到复合材料条带。
组织病理学评估显示以下特征(图43a)：a)支架的两层已合并为一层；b)复合材料已附着在下方的骨骼上；c)皮质切开水平处复合材料条带下方有丰富的编织骨形成(图43b)；d)远离皮质切开术的第二层复合材料条带有大量纤维细胞浸润；(图43c，d)；e)复合材料表层的纤维转变具有丰富的新血管形成。这些变化证实复合材料的骨诱导潜力，复合材料进行生物转化的能力和复合材料的高生物活性。
具有复合材料水平横截面的样品的改良四铬染色证实了EH染色的发现并显示了额外的特征。图44a显示形成编织骨的碎片化的复合材料的转化，以使所作的皮质切开术愈合，和复合材料条带的两层的结合和靠近骨的层被成纤维细胞和类骨质斑随机浸润。在更高的放大倍数(44b)下，可以清楚地看到复合材料条带通过类骨质与下层骨的融合。在进一步的放大倍数(44c)下，新形成的类骨质层对复合材料的渗透良好，取代了复合材料的溶解区域。图44d显示复合材料条带的粘附，复合材料条带溶解和分解以形成新的编织骨，使皮质切开术愈合，在复合材料的溶解部分中出现新的类骨质的现象。
实施例10：通过3D打印制备支架
熔丝制造(FFF)3D打印机通常用于熔合塑料，在较高温度下挤出并冷却至室温以将3D模型构建成产品。
制造定制的3D打印机来制备复合材料。墨水打印机在打印机中保持在较低的温度下，从而不会丧失复合材料组分之间获得的均质性。(图45b)。为此，设计了一个特殊的冷却室。它将浆料挤出机冷却到15-20℃。将浆料挤出到加热到100℃的板上，并保持30-40℃的腔室温度(图45a)。挤出由传统的CAD软件控制，并打印所需的设计(图45c)。
优点：
所述复合材料可以制成颗粒或粉末或它们的混合物，可用作因损伤、感染、骨肿瘤而产生的骨空隙的填充物，这些骨空隙将在较短的时间内转化为骨，避免截肢，并通过减少生物转化所需的时间降低发病率。
制成条带状的复合材料可以用作唯一的移植物，类似菲米斯特移植物，菲米斯特移植物是最常见的整形外科医生使用的自体移植物类型。这将降低手术的发病率并避免第二次切口以收获自体移植物。
作为圆柱形移植物的复合材料可以用作插入移植物，并且可以保存许多由外伤或其他损伤引起的具有临界尺寸缺陷的长骨。
所述复合材料可以通过快速原型制作方法定制为移植物，以在患病时可以替换骨骼的特定部分，而不是截肢。
本发明的合成复合材料具有以下特点：
a)生物相容性；b)生物活性；c)可生物降解；d)对接受者无毒；e)生物传导性；f)生物诱导性；g)生物可转换性；h)降解速度与生物转化率相匹配；i)可灭菌性；j)易于批量生产；k)可加工成所需的形状；l)成本有效。

Claims (25)

1.一种用于骨移植物的合成复合材料，其包括：生物惰性聚合物，其包括聚乳酸、聚D,L-乳酸；生物活性聚合物，其由聚亚丙基富马酸酯或富马酸二酯和丙二醇(1,2-二醇)组成；以及生物活性无机组分，其由氟磷酸金属盐玻璃粉组成，其中生物活性无机氟磷酸金属盐玻璃粉的量高达所述复合材料的30％(w/w)。
2.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述氟磷酸金属盐玻璃选自氟磷酸锌、氟磷酸镁或氟磷酸银中的一种。
3.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述聚乳酸为54％(w/w)至68％(w/w)。
4.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述1,2-二醇为3％(w/w)至10％(w/w)。
5.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述聚D,L-乳酸为10％(w/w)至28％(w/w)。
6.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述聚亚丙基富马酸酯为3％(w/w)至10％(w/w)。
7.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料中的氟磷酸金属盐为10％(w/w)至30％(w/w)。
8.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料包括聚乳酸、1,2-二醇和氟磷酸锌。
9.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料包括聚乳酸、聚D,L-乳酸、1,2-二醇和氟磷酸锌。
10.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料包括聚乳酸、聚亚丙基富马酸酯和氟磷酸锌。
11.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料包括聚乳酸、聚D,L-乳酸、聚亚丙基富马酸酯和氟磷酸锌。
12.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料包括聚乳酸、1,2-二醇和氟磷酸镁。
13.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料包括聚乳酸、聚D,L-乳酸、1,2-二醇和氟磷酸镁。
14.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料包括聚乳酸、聚亚丙基富马酸酯和氟磷酸镁。
15.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料包括聚乳酸、聚D,L-乳酸、聚亚丙基富马酸酯和氟磷酸镁。
16.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料包括聚乳酸、1,2-二醇和氟磷酸银。
17.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料包括聚乳酸、聚D,L-乳酸、1,2-二醇和氟磷酸银。
18.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料包括聚乳酸、聚亚丙基富马酸酯和氟磷酸银。
19.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料包括聚乳酸、聚D,L-乳酸、聚亚丙基富马酸酯和氟磷酸银。
20.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述复合材料是粉末或支架中的一种。
21.如权利要求20所述的复合材料，其特征在于，所述支架是带状或圆柱形或管状等。
22.一种制备如权利要求20所述的合成复合材料的方法，所述方法包括以下步骤：
将权利要求1所述的复合材料在溶剂中用磁力搅拌器混合或超声处理，得到均匀的混合物；
将所述混合物浇注在热玻璃板上，使溶液沸腾；
通过持续沸腾蒸发溶剂；和
得到复合材料组分均匀分布的相互连接的多孔支架。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述溶剂是二氯甲烷、丙酮、甲苯或氯仿中的一种。
24.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述支架的孔隙率为20％-40％。
25.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述支架通过直接墨水打印技术由例如本文所述的定制3D打印机获得，包括以下步骤：
将组分均质化并冷却至10至30度；
将墨水装入压力控制的挤出机中，所述挤出机相对于墨水无黏性；
由计算机提供所需形状、厚度、孔隙率和层的程序设计；
获得所需的支架。
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