CN115990159B - 阿曲生坦或其药学上可接收的盐在制备治疗肌肉萎缩侧索硬化症产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及阿曲生坦或其药学上可接收的盐在制备治疗肌肉萎缩侧索硬化症产品中的应用。本发明的试验结果证明了阿曲生坦可抑制Vimentin‑Beclin1‑14‑3‑3三元复合物形成、降低TDP‑43蛋白异常修饰以及影响自噬标记物LC3蛋白和P62蛋白表达水平。此外，通过果蝇试验表明阿曲生坦能够改善TDP‑43蛋白过表达的果蝇运动能力、减少果蝇眼部黑斑生成以及在高温环境和正常环境下的生存寿命。阿曲生坦可作为一种具有开发前景的治疗肌肉萎缩侧索硬化症药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及阿曲生坦或其药学上可接收的盐在制备治疗肌肉萎缩侧索硬化症产品中的应用。
背景技术
肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，以下简称ALS）是一种成因复杂的中枢神经退行性疾病，主要表现为上运动神经元和下运动神经元退化引起的运动功能障碍，多达50%的患者还发展出认知和行为障碍。ALS分为散发型和家族遗传型，家族遗传型病人的遗传分析表明C9orf72、TDP-43、FUS和SOD1基因突变是造成患病的主要因素之一，其中TDP-43蛋白的聚集是ALS患者的主要病理特征，这些错误折叠的TDP-43蛋白聚集在细胞质中会进一步引发FUS和SOD1蛋白聚集，而大量的错误折叠蛋白聚集体又会引发细胞应激等反应，进而影响新蛋白转录翻译折叠，对神经元产生较强的毒性。
相关研究表明，自噬是治疗肌萎缩侧索硬化症的有效途径。自噬是细胞高度保守的降解机制，可以清除细胞受损或多余的细胞器和异常蛋白，维持细胞稳态，在细胞发育分化发挥至关重要的作用。对于终末分化的神经元而言，清除细胞内废物最重要的手段就是自噬。如相关研究报道了天然化合物海藻糖可以通过激活转录因子TFEB上调自噬相关因子Beclin1和Atg10等促进自噬发生，进而改善ALS在内的多种神经退行性疾病，但是其效果仍需进一步提高。此外，波形蛋白（Vimentin）和Beclin1蛋白也被认为也参与细胞的自噬过程，其中波形蛋白（Vimentin）是细胞骨架蛋白中重要的成员，广泛存在于各种非上皮细胞中，是维持细胞结构和组织完整性的关键元件，在细胞运动、细胞信号转导、细胞周期调节中也发挥着重要作用。Vimentin作为细胞骨架中间丝的重要组成部分，在星形胶质细胞中过表达，相关研究表明在肌萎缩侧索硬化症发病过程中，小鼠脑干中的神经前体细胞会分化具Vimentin的星形胶质细胞，并迁移至脑中的损伤区域，Vimentin在细胞内与14-3-3和Beclin1形成的三元复合物会抑制自噬，使得神经元中蛋白聚集体无法清除，因此开发Vimentin 抑制剂也是治疗肌萎缩侧索硬化症的有效途径之一。但目前Vimentin 抑制剂的开发仍处于起始阶段，被报道的化合物大多数属于天然产物，存在靶点多、毒性强等缺点，并且具体的机制和作用位点也尚不明确。
基于此，仍需寻求一种能够结合Vimentin的小分子化合物，且其能够诱导神经细胞的自噬以清除肌萎缩侧索硬化症疾病中发生突变、定位错误以及异常聚集的蛋白。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出阿曲生坦或其药学上可接收的盐在制备治疗肌肉萎缩侧索硬化症产品中的应用，本发明的研究表明阿曲生坦能够作用于Vimetin从而治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症，并且通过实验结果进一步证实了阿曲生坦对Vimentin-Beclin1-14-3-3三元复合物的形成有抑制作用，可以促进神经元细胞自噬的发生、帮助清除神经元细胞中定位错误的TDP-43蛋白，以及改善TDP-43蛋白过表达果蝇的运动能力、减少果蝇眼部黑斑生成并提高果蝇的在高温环境和正常环境下的生存寿命。
本发明提供了阿曲生坦或其药学上可接收的盐在制备治疗肌肉萎缩侧索硬化症产品中的应用。
根据本发明实施例的应用，至少具有如下有益效果：
（1）本发明发现阿曲生坦和Vimetin存在一定的相互作用，可作为Vimentin的抑制剂，且对Vimentin-Beclin1-14-3-3三元复合物的形成有抑制作用，能够促进神经元细胞自噬的发生并清除ALS神经元内异常聚集的TDP-43蛋白体。
（2）本发明从自噬角度开发了治疗ALS的新型小分子抑制剂阿曲生坦，并证明了其以Vimentin为靶点治疗ALS的可能性。
（3）本发明通过构建过表达TDP-43蛋白的果蝇，证实了阿曲生坦能够通过自噬降低TDP-43水平并改善过表达TDP-43蛋白果蝇的运动能力，减轻眼部变性抵抗高温环境以及延长生理寿命，并且可以减少果蝇腹侧神经索和脑部运动神经元的死亡。
在本发明的一些实施方式中，所述治疗肌肉萎缩侧索硬化症的产品包括（a）~（g）中的至少一种：
（a）作用于Vimentin蛋白的产品；
（b）抑制Vimentin-Beclin1-14-3-3三元复合物形成的产品；
（c）降低TDP-43蛋白异常修饰的产品
（d）提高自噬标记物LC3II/LC3I表达水平的产品；
（e）降低自噬标记物P62表达水平的产品；
（f）促进自噬的产品；
（g）减轻眼部变性、抵抗高温环境或延长生理寿命的产品。
在本发明的一些实施方式中，所述作用于Vimentin蛋白的产品是指能通过与Vimentin蛋白结合并抑制Vimentin-Beclin1-14-3-3三元复合物形成的产品。
在本发明的一些实施方式中，所述抑制Vimentin-Beclin1-14-3-3三元复合物形成包括降低Vimentin蛋白与Beclin1蛋白或14-3-3蛋白融合。
在本发明的一些实施方式中，所述TDP-43蛋白异常修饰包括TDP-43蛋白错误定位、TDP-43蛋白水平表达异常以及TDP-43蛋白突变中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括药物。
在本发明的一些实施方式中，所述药物还包含药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅料选自崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、表面活性剂、防腐剂中的至少一种。
优选地，所述崩解剂选自玉米淀粉、马铃薯淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲纤维素钠、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、藻酸中的至少一种；
优选地，所述稀释剂选自乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、磷酸钙、柠檬酸钙、结晶纤维素中的至少一种；
优选地，所述润滑剂选自微粉硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、滑石粉、无水硅胶中的至少一种；
优选地，所述粘合剂选自阿拉伯胶、明胶、糊精、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种；
优选地，所述湿润剂选自十二烷基硫酸钠；
优选地，所述矫味剂选自阿斯巴甜、甜菊甙、蔗糖、麦芽糖醇、柠檬酸中的至少一种；
优选地，所述助悬剂选自阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶中的至少一种；
优选地，所述表面活性剂选自卵磷脂、山梨糖醇酐单油酸酯、单硬脂酸甘油酯中的至少一种；
优选地，所述防腐剂选自对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为固体制剂、液体制剂、半固体制剂中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述固体制剂包括片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂；
在本发明的一些实施方式中，所述液体制剂包括注射剂；
优选地，所述半固体制剂包括软膏剂和霜剂。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例阿曲生坦与Vimentin相互作用的CD曲线图，其中VIM为Vimentin，A4为阿曲生坦；
图2为本发明实施例不同浓度阿曲生坦处理细胞后，细胞内Vimentin在不同温度下的熔解曲线图；
图3为本发明实施例免疫共沉淀实验结果；
图4为本发明实施例中另一免疫共沉淀实验结果；
图5为本发明实施例中不同浓度A4对三元复合物聚合影响的western blot实验结果；
图6为本发明实施例中不同浓度A4对自噬标记物LC3和P62影响的western blot实验结果；
图7为本发明实施例阿曲生坦处理神经元细胞后的透射电镜观察图；
图8为本发明实施例中不同化合物处理后的荧光显微镜观察图；
图9为检测Vimentin靶点对自噬标记物影响的western blot实验结果；
图10为检测内皮素受体A靶点对自噬标记物影响的western blot实验结果；
图11为本发明阿曲生坦和依他尼酸对TDP-43蛋白表达水平影响的荧光显微镜观察图；
图12为本发明阿曲生坦和依他尼酸处理对细胞自噬影响的western blot实验结果；
图13为本发明异常表达TDP-43细胞中阿曲生坦和依他尼酸处理对细胞自噬影响的western blot实验结果；
图14为本发明异常表达TDP-43细胞或TDP-43突变细胞中，阿曲生坦和依他尼酸处理对细胞自噬影响的western blot实验结果；
图15为本发明不同组别果蝇成虫的攀爬能力测试结果；
图16为本发明不同组别果蝇幼虫的蠕动能力测试结果；
图17为本发明不同处理条件下果蝇眼部结构的拍摄图；
图18为本发明阿曲生坦对果蝇抗高温的能力的影响统计图；
图19为不同处理条件下TDP-43过表达果蝇中hTDP43-GFP蛋白和LC3蛋白表达的western blot实验结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1 阿曲生坦作用靶点验证
本实施例采用了圆二色谱技术（Circular Dichroism，以下简称CD）和细胞热位移测定法（Cellular thermal shift assay，以下简称CETSA）对阿曲生坦（以下简称A4）作用靶点进行验证。
（一）圆二色谱方法验证
圆二色谱是考察蛋白质二级结构变化的重要方法，蛋白质二级结构的变化可以根据CD信号变化来判断，当化合物与蛋白质结合，蛋白的二级结构很可能会发生变化。本实施例通过探究阿曲生坦A4是否对Vimentin蛋白二级结构产生影响来判断化合物A4与Vimentin蛋白是否存在相互作用。
结果显示，阿曲生坦（化合物A4）与Vimentin蛋白具有一定的结合特性，与无化合物A4孵育相比，有化合物A4孵育的CD曲线表现出较大的差异，具体如图1所示，这说明阿曲生坦与Vimentin蛋白之间存在一定的相互作用。
（二）细胞热位移测定法验证
细胞热位移测定法是一种研究完整细胞中配体与蛋白结合的生物物理技术，广泛用于验证和量化药物在不同物种的细胞和组织中的靶向作用。如果阿曲生坦与Vimentin发生结合，由于阿曲生坦引起蛋白质热稳定性改变，则用阿曲生坦处理的细胞组中该蛋白在不同温度下的熔解曲线会相对于对照组的熔解曲线有所偏移。
具体实验方法为：将细胞分别接种至直径10 cm细胞培养皿中，次日进行换液，给药处理2小时，对照组用对应量DMSO进行处理。接下来1000 rpm离心5 min收集细胞，用PBS重悬细胞对其进行计数。配制适量含蛋白酶抑制剂（EDTA free）的PBS，稀释细胞至300万个/mL，吹打混匀后，分装100 μL 细胞至8联管中（边涡旋边分装），对细胞进行梯度加热 3min（Canon T100 梯度PCR仪），然后反复冻融三次使其破碎。14000 rpm 4 ℃离心20 min收集上清液。取90 μL上清液至新八联管中，加Loading Buffer 95 ℃ 变性10 min，进行Western Blot检测。所得条带用Image J进行灰度分析，GraphPad Prism软件通过非线性拟合得到熔解曲线和Tm值。
结果显示，相对于对照组，实验组的熔解曲线确实向右发生了偏移，Tm值也有所增加，具体如图2所示，通过以上数据表明，阿曲生坦（化合物A4）与Vimentin有一定的相互作用，Vimentin可能是化合物A4的一个作用靶点。
实施例2 阿曲生坦对三元复合体的影响
细胞内存在Vimentin-Beclin1-14-3-3三元复合物，其中Beclin1蛋白（自噬执行蛋白）通过S234和S295与14-3-3结合，然后14-3-3蛋白通过自身磷酸化结合位点和Vimentin相互作用进而形成三元复合物，该三元复合物会抑制自噬，使得神经元中蛋白聚集体无法清除。根据上述实施例1可知阿曲生坦（化合物A4）与Vimentin存在一定的相互作用，为此，本实施例进一步采用免疫共沉淀和Dou-link实验对阿曲生坦与Vimentin-Beclin1-14-3-3三元复合物之间的作用进行研究。
（一）免疫共沉淀实验
首先进行免疫共沉淀实验，用Vimentin蛋白抗体钓取beclin1和14-3-3蛋白，具体方法为：按照Thermo #88805产品说明书预先配制1×改良交联缓冲液（试剂盒自带），预洗磁珠两次。然后用同样的缓冲液预洗Pierce蛋白A/G 磁珠两次。然后向磁珠中加入Beclin1 抗体（5 g/100 L），室温下，在旋转器上相互结合 15分钟，然后再用1 ×改良缓冲液（试剂盒自带）洗去未结合的抗体。接下来用20 M DSS进行抗体与磁珠之间的交联，并用Elusion buffer（试剂盒自带）漂洗磁珠三次，之后用Lysis Buffer（试剂盒自带）漂洗磁珠两次。将A4处理后的细胞按照Western Blot中的蛋白收集方法进行制备并进行BCA定量。将500 g蛋白量的细胞裂解液与抗体交联后的磁珠进行4℃孵育过夜。随后用Lysis Buffer清洗磁珠两次，超纯水清洗一次。用适量的Elusion Buffer将钓取获得蛋白从磁珠上洗脱分离下来，并加入中和液中和Elusion Buffer的酸性。最后进行Western Blot 检测。
结果显示，用Vimentin蛋白抗体钓取beclin1，A4处理组的Beclin1呈现明显减少的趋势，如图3和图4所示。这说明A4能影响三元复合物的稳定从而释放出自噬执行蛋白Beclin1。
（二）蛋白质免疫印迹法
进一步的，本实施例用不同浓度A4来探究影响三元复合物的稳定是否会促进Vimentin蛋白的自我聚合。具体实验方法为：将细胞分为不同的组别进行处理，用westernblot（蛋白质免疫印迹法）来检测Vimentin蛋白自我聚合效果。
结果如图5所示，结果显示A4对Vimentin蛋白的自我聚合有一定的促进作用，表现出浓度依赖性，其中A4浓度在0.5~2.5μM时聚合作用最强。
综上结果表明，阿曲生坦能影响三元复合物的稳定，促进Vimentin蛋白的自我聚合，而且能从复合物中释放出自噬执行蛋白Beclin1，对自噬具有显著的促进作用。
实施例3 阿曲生坦在诱导神经元自噬中的应用
本实施例在细胞水平检测了阿曲生坦A4对自噬的促进能力。
（一）western blot检测细胞自噬水平
用不同浓度的A4处理神经元细胞，然后用western blot检测细胞自噬水平。具体实验方法为：
（1）用预冷的1×PBS（pH7.4）轻轻摇动清洗细胞两次，每次 1 min，然后根据细胞数量加入适量的含1 mM PMSF，1 mM 蛋白酶抑制剂和1 mM蛋白磷酸酶抑制剂的细胞裂解液，在冰上裂解 30min。裂解结束后用细胞刮取收集细胞，并将裂解产物在冷冻离心机中进行4 ℃，12,000 rpm 离心10分钟，收集上清。通过BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，使每组样品具有相同浓度的蛋白，95℃变性10 min，冷却后分装保存至-20℃备用。
（2）配制适当浓度的分离胶和浓缩胶制成 SDS-PAGE胶，蛋白上样量为10~ 20μg。用 80 V 电压使上样蛋白在浓缩胶中压缩直到到达分离胶，加大电压至120 V 恒压分离蛋白条带，约 1 h。
（3）将凝胶电泳中所得的SDS-PAGE 凝胶以海绵垫、滤纸、SDS-PAGE胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫的顺序放置于湿转夹子内，装在湿转转膜仪中进行300 mA恒流转膜2 h。用1 ×TBST缓冲液配制5% BSA溶液作为封闭液，然后将得到的PVDF膜放在封闭液中，室温孵育40-60 min。
（4）将目标条带放置在抗体稀释液稀释好的一抗溶液（1：1000）中4℃孵育过夜。然后用1×TBST溶液在室温下摇荡 1 h清洗未结合的一抗。然后将目标条带放置在对应抗原特性的二抗溶液（1：3000）中室温下孵育1 h。然后用1×TBST溶液在室温下摇荡1 h清洗未结合的二抗。最后在 PVDF 膜表面滴上适量的ECL 发光底液（1:1 配制，现配现用），在Tanon- 4200SF 凝胶成像系统中进行成像。使用Image J 软件进行条带光密度分析。
本实验以LC3和P62为自噬指标，其中LC3和P62是常用的自噬标记物，LC3蛋白会在自噬过程中被切割为LC3I和LC3II，LC3II与LC3I的比值可以反映自噬的进程，比值越高说明自噬越强。P62是一种接头蛋白，会被包裹进自噬小体中后被降解，其水平降低说明了自噬的发生。
结果如图6所示，A4能够提高LC3II/LC3I并且降低P62水平，这说明其具有一定促进自噬的能力，而且当A4的浓度为1.0~5.0μM时，对细胞的自噬水平促进作用较大。进一步的，用自噬抑制剂氯喹（CQ）与诱导剂雷帕霉素（RAPA）来验证A4对自噬流的影响，显示A4显著提高了LC3II/LC3I的水平，降低了胞内P62的积累，这表明A4影响着细胞的自噬水平。
（二）透射电镜观察
为了更加直观的检测A4对自噬水平的影响，本实施例用A4处理神经元细胞后利用透射电镜观察了胞内的自噬小体、自噬溶酶体的变化。
结果如图7所示，A4处理组相对于对照组而言，自噬小体和自噬溶酶体水平都有很明显的提高。接下来本实施例还构建了融合GFP（绿色荧光蛋白）与RFP（红色荧光蛋白）的LC3质粒，将RFP-GFP-LC3质粒转染进入细胞来检测自噬流的变化。由于GFP的荧光在强酸性的溶酶体中会淬灭而RFP不会，通过不同的发光图像可以很好的检测自噬流的变化。本实施例使用了自噬抑制剂氯喹（CQ）作为阴性对照、诱导剂雷帕霉素（RAPA）作为阳性对照。结果如图8所示，相对于对照组，A4处理24h后GFP-LC3水平略有降低，这说明A4不能改变溶酶体的pH而避免GFP的猝灭，但是RFP-LC3水平有了较明显的提高，这些数据说明A4能促进自噬，且与雷帕霉素具有相似的效果。
（三）siRNA敲除实验
上述数据说明了A4有促进自噬的能力，但促进自噬的机制是因为A4影响复合物的稳定和提高胞内Beclin1从而引起的自噬水平提高吗？为了证实这一想法，本实施例还采用了siRNA敲除实验，敲低了细胞内的Vimentin蛋白，用western blot检测其自噬水平。
结果如图9所示，显示敲低后的细胞用A4处理后自噬水平相对于未敲低组明显降低，与对照组自噬水平相当，这说明A4促进自噬的确是作用于Vimentin蛋白所引起的。
进一步的，有相关研究表明A4也可应用于心血管以及炎症的疾病，起作用的主要靶点是内皮素受体A (EDNRA)，对于A4引起的自噬是否是因为EDNRA实现的假设，本实施例依然选择敲除实验，敲低了细胞内的内皮素受体A，用western blot检测自噬水平。
结果显示无论是否敲低细胞内的内皮素受体A，用A4处理后，细胞的自噬活性均显著提高，具体如图10所示。这说明A4促进自噬的相应靶点是Vimentin蛋白而非内皮素受体A。
综上结果显示，阿曲生坦可以诱导神经元细胞的自噬水平，并且这种自噬作用是通过阿曲生坦与Vimentin相互作用而实现的。
实施例4 阿曲生坦对促进异常修饰的TDP-43蛋白清除的影响
肌萎缩侧索硬化症疾病的主要病理特征是TDP-43的异常修饰，包括蛋白错误定位、蛋白水平异常以及蛋白的突变，本实施例从这三个方面分别构建了肌萎缩侧索硬化症的细胞模型。
（一）阿曲生坦对TDP-43错误定位的影响
基于依他尼酸（Ethacrynic Acid，以下简称EA）能够通过消耗谷胱甘肽来增加细胞氧化应激，一定浓度的EA可使TDP-43由细胞核转移至细胞质使其错误定位。本实施例转染了带有绿色荧光标签的TDP-43质粒，并用EA处理，然后用激光共聚焦拍摄。
结果显示，EA在一定浓度下能够使TDP-43从细胞核转移至细胞质，接下来用免疫荧光技术检测，用A4处理后，发生错定位的细胞数量明显减少，具体如图11所示，这说明A4可以减少TDP-43的错误定位。
进一步，本实施例对错误定位的TDP-43的减少是否是由细胞自噬引起的进行了探究。用EA孵育细胞并用不同浓度的A4处理，采用western blot 检测TDP-43与自噬指标p62、LC3。
结果显示，在EA的处理条件下，细胞本身会提高自噬水平，但随着A4浓度的依次增大表现出自噬活性越强，TDP-43水平明显降低，具体如图12所示。
为了更进一步验证其是通过自噬作用而达到效果的，本实施例还使用了自噬抑制剂CQ，在不同的组别分别用EA，CQ，A4单独或者联合使用处理细胞，用western blot检测胞内TDP-43水平的变化。
结果表明在EA处理条件下，CQ能够抑制TDP-43胞内水平的降低，而A4处理组TDP-43水平有了明显的降低，这说明A4能有效地通过自噬作用清除胞内错误定位的TDP-43蛋白。
（二）阿曲生坦对TDP-43蛋白水平异常以及蛋白的突变的影响
本实施例还分别构建了连接GFP的异常表达TDP-43模型（hTDP-43-GFP）和TDP-43突变体（hTDP-43A315T-GFP），并采用了western blot检测细胞内TDP-43和TDP-43A315T的水平。
结果显示，阿曲生坦A4明显降低了TDP-43水平，并增强了细胞自噬的活性，具体如图13和图14所示。这说明A4对胞内异常积累的蛋白和突变的TDP-43蛋白有一定的清除能力。
综上结果表明，TDP-43的错定位会增强A4引起的自噬，并能够降低胞内积累的TDP-43和TDP-43A315T水平。
实施例5 阿曲生坦在改善TDP-43介导的果蝇运动能力中的应用
ALS疾病中TDP-43蛋白水平异常升高，由于异常积累的TDP-43蛋白会诱导神经毒性，导致神经元细胞的死亡与丢失，特别是对运动能力有很大的影响。本实施例以转基因果蝇为模式动物，使其过量表达TDP-43，以此来探究A4能否减轻果蝇的神经毒性。进一步地，由于过表达的TDP-43蛋白具有强烈细胞毒性，会使得果蝇的表型与行为发生变化，包括运动能力、眼部变性等一系列神经退行性变。本实施例分别设置野生组（WT）、TDP-43蛋白过表达组（Red eye）、连接GFP的异常表达TDP-43组（hTDP-43-GFP）和A4处理组（hTDP-43-GFP+A4），并统计了不同组别果蝇成虫的攀爬能力和蠕动能力。
不同组别果蝇成虫的攀爬能力测试结果如图15所示，结果表明过量表达TDP-43（hTDP-43-GFP组）使果蝇的运动能力受到很大的影响，但是用A4处理过的果蝇虽运动能力不及野生型果蝇，但相对于过表达组而言有明显的提高。
不同组别果蝇幼虫的蠕动能力测试结果如图16所示，结果表明过量表达TDP-43使得果蝇幼虫蠕动能力受到严重的影响并且降低蠕动的幅度较大，用A4处理过的幼虫蠕动能力有了明显好转。以上测试表明A4可以改善TDP-43异常积累而引起的运动能力受损。
实施例6 阿曲生坦在改善TDP-43介导的病理症状中的应用
（一）对果蝇眼部光感受器的影响
在果蝇中过表达TDP-43，果蝇眼部光感受器会有进行性变性，从而引起果蝇眼部色素减少及黑斑的形成。为了验证A4是否可以改善果蝇眼部结构的变性与受损，本实施例使用了荧光体式镜对过表达TDP-43的果蝇进行了眼部结构的拍摄，并统计分析了果蝇眼部黑色斑点的程度与数量。其中主要分组为：空白对照组（Ctrl），2.5μM A4组，10μM A4组以及雷帕霉素组（RAPA组），雷帕霉素具有一定的促进自噬的作用。
结果如17所示，过表达TDP-43确实会使果蝇眼部产生黑斑，用A4处理过的果蝇有了明显的改善，黑斑的数量有了明显的减少，黑斑的黑色程度也有了比较明显的减轻。使用不同浓度的A4处理，改善的效果略有差异且具有一定的浓度依赖性，在10μM是改善效果最好。
（二）对果蝇抗高温能力的影响
由于采用的Gal4-UAS 表达系统（果蝇中异位表达基因的常用系统，温度升高，异位表达的蛋白增加）与温度有一定的关系，随着温度的升高，转基因果蝇所表达TDP-43的量会相应的增多。为了检测阿曲生坦是否对果蝇抗高温的能力有影响，基于此，我们对果蝇进行了高温环境下的存活率测试（提高培养环境温度至32℃）。
结果显示，过表达组的果蝇在72h时就已全部死亡，而用A4处理过的果蝇108h才会表现出全部死亡，具体如图18所示。这说明随着温度的提高，果蝇表达TDP-43的量增多，进而导致了果蝇的死亡率升高，而A4处理组显著改善了果蝇的存活率。以上表明A4处理的果蝇能有效地降低TDP-43的量从而增强果蝇抵抗高温环境的能力。
（三）对果蝇寿命的影响
过表达TDP-43的果蝇会存在年龄依赖性的毒性作用，包括神经退行性症状，特别是会严重影响果蝇的寿命，本实施例对A4能否改善症状以及延长果蝇的寿命进行探究，并进行了果蝇寿命测试的实验，将果蝇分别培养在适宜的环境中（25℃），每5天检测一次存活的数量。
结果显示过表达TDP-43的果蝇在65天时全部死亡，而用A4处理的果蝇则在70天死亡。这说明A4对TDP-43介导的果蝇寿命有一定的延长。
为了进一步验证改善果蝇运动能力、减轻眼部变性、抵抗高温环境以及延长生理寿命是通过自噬作用清除hTDP-43而实现的，本实施例依然选择了western blot实验对TDP43水平进行测定，结果如图19所示，结果说明了过表达TDP-43的果蝇用A4处理后能有效降低TDP-43水平。
综上结果表明阿曲生坦可以通过自噬作用降低TDP-43水平，以此减轻眼部变性、抵抗高温环境以及延长果蝇生理寿命。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (7)
1.阿曲生坦或其药学上可接收的盐在制备治疗肌肉萎缩侧索硬化症药品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药品还包含药学上可接受的辅料。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、表面活性剂、防腐剂中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药品的剂型为固体制剂、液体制剂、半固体制剂中的一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述固体制剂为片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂中的一种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述液体制剂为注射剂。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述半固体制剂为软膏剂或霜剂。
Priority Applications (1)
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| CN202310126813.4A CN115990159B (zh) | 2023-02-16 | 2023-02-16 | 阿曲生坦或其药学上可接收的盐在制备治疗肌肉萎缩侧索硬化症产品中的应用 |
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